CN116496357A

CN116496357A - 一种伊枯草菌素a抗菌脂肽及其制备方法

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Publication number: CN116496357A
Application number: CN202310755941.5A
Authority: CN
Inventors: 牟海津; 任昕淼; 付晓丹; 李萌
Original assignee: Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd
Priority date: 2023-06-26
Filing date: 2023-06-26
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2043-06-26
Also published as: CN116496357B

Abstract

本发明提供一种伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制备方法，方法包括采用以豆粕为基质，通过优化固态培养基发酵产生抗菌脂肽，采用水提及酸沉淀、两步超滤法纯化，得到高纯度组分。通过优化豆粕固体发酵的培养基及发酵条件，使优化后的发酵培养基产的抗菌脂肽含量达到782.36 mg/kg，为优化前纯豆粕固体发酵的3.2倍，抗菌脂肽对恶臭假单胞菌的抑菌率能够从优化前的64.21%提高到90.01%。本发明的发酵底物成本低廉，固态发酵设备简单，单位发酵基质浓度高，生产能耗低，同时两步超滤法降低了纯化成本。得到的高纯度脂肽为未曾报道过新的伊枯草菌素A，能够有效抑制恶臭假单胞菌，在水产养殖业及人类临床等的疾病防治方面具有广阔的应用前景。

Description

一种伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体为一种伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制备方法。

背景技术

芽孢杆菌属（Bacillus）是一类兼性厌氧或好氧的革兰氏阳性杆菌，能够产生不同结构的多肽类抗菌物质，是工业化生产抗菌脂肽的常用菌株之一。抗菌脂肽的分子结构由疏水性脂肪酸链及亲水性肽链构成，其氨基酸可与烃链上的羟基或氨基以酰胺键或内酯结合形成环状结构。抗菌脂肽的抗菌活性及表面活性剂的性质，使其在医药、农业、石油开发等方面具备巨大开发潜力。目前研究及应用较多的脂肽主要是伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin）、及丰原素（fengycin）这三大家族。其中Iturin可使细菌或真菌的细胞膜上形成小孔，改变细胞膜的渗透性，同时可与甾醇形成iturin/磷脂复合物或iturin/甾醇发挥抑菌作用。Iturin主要有Iturin A，C，D，E，其中Iturin A应用最为广泛。Iturin A具有高的抑菌活性、表面活性及溶血作用，其抗菌谱广、毒性低及致敏反应低。

脂肽具有表面活性强、抑菌效果好、易被生物降解、环境友好等特点，并且其稳定性好，酸碱耐高温，符合目前生物替抗产业要求及绿色环保发展理念。目前液态发酵为制备脂肽的主要发酵方式，但液态发酵成本高，设备要求及造价高，同时发酵过程中因为脂肽的表面活性特性会出现起泡及跑料的问题。固态发酵设备简单，单位发酵基质浓度高，生产能耗低。且固态发酵后产物的提取工艺简单、生产用水及提取溶剂使用量少。目前已有研究证明，以小麦麸皮、啤酒糟或者大豆渣料作为底物进行固态发酵，其抗菌脂肽产量要高于液态发酵。因此，以低廉原料为发酵基质的固态发酵制备抗菌脂肽的方式具有的巨大的开发潜力。

发明内容

本发明目的在于提供一种伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制备方法，能够有效抑制恶臭假单胞菌，在水产养殖业及人类临床等的疾病防治方面具有广阔的应用前景。

为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：一种伊枯草菌素A抗菌脂肽，伊枯草菌素A抗菌脂肽的肽结构为：

。

伊枯草菌素A抗菌脂肽的氨基酸序列为：

β-NH-fatty acid-Asp-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asn-Pro。

一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将保藏号为CGMCC No. 19541的枯草芽孢杆菌N-2 接入豆粕半固态培养基富集得到菌液，以菌液混合豆粕和营养因子制成的固体发酵培养物进行发酵，获得发酵产物；其中，保藏号为CGMCC No. 19541的枯草芽孢杆菌N-2在公开号为CN111713607A的专利中已经公开，其菌株命名为枯草芽孢杆菌(拉丁学名Bacillus subtilisN-2)，其保藏编号为CGMCCNo.19541，保藏日期为2020年3月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

步骤2：将发酵产物离心，采用水提及酸沉淀法提取抗菌脂肽；

步骤3：采用两步法超滤进行脂肽的分离纯化，并利用反相高效液相色谱法进行测定，得到伊枯草菌素A抗菌脂肽。

优选的，步骤1中所述豆粕半固态发酵培养基为：豆粕、LB培养基，LB培养基包括10g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L 氯化钠，其中豆粕和LB培养基的料液比5:1-10:1，对培养基在121℃下灭菌20 min，接种量0.5%，温度27-38℃，时间6-12 h，获得菌液；

所述固体发酵培养物包括菌液5-10%、豆粕、水、葡萄糖1-2%、谷氨酸钠0.8-1.8%、脯氨酸0.5-1.5%、天冬氨酸0.5-1.5%、KCl 0.1-0.25%、(NH₄)₂SO₄0.1-0.25%、Na₂HPO₄0.05-0.2 %，温度 27-38℃，时间24-60h，其中豆粕和水的料液比5:1-10:1。

优选的，步骤2中水提及酸沉淀的过程为：发酵结束后，按照发酵底物：蒸馏水= 1:8-1:10（w/v）加入蒸馏水，室温搅拌1-2 h后静置30-60 min，4000 r/min离心20-30 min后除去不溶物，上清用5 mol/L盐酸调节pH至2.0-2.5，4℃ 静置6 h后，4000 r/min低温离心20-30 min获得沉淀，沉淀用甲醇按照1∶6(w/v)复溶，萃取4 h后旋转蒸发除去甲醇获得脂肽提取物。

优选的，所述步骤3中两步法超滤过程为：将步骤2中获得的脂肽提取物用超纯水按照 1:5-1:12 (w/v) 复溶, 并用0.22μm微孔滤膜过滤去除杂质，滤过液使用分子量10kDa超滤膜截留大分子物质，大分子物质包括脂肽胶束，截留物使用蒸馏水复溶，并加入等体积甲醇，用NaOH调节pH至6.0-7.0后低温搅拌1.5-3 h，随后用分子量10 kDa超滤膜收集分子量小于10 kDa的滤过液，再用冻干后即为纯化脂肽粉。

优选的，所述步骤3中反相高效液相色谱测定的过程为：制备型液相柱，AgilentZorbax SB-Aq C18；

流动相含0.1 %甲酸的乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；

洗脱模式，30% A （0 min）— 45% A （10 min）— 55% A （20min）—55% A （35min）；流速5 mL/min，柱温30 °C，检测波长210 nm，本发明所得伊枯草菌素A抗菌脂肽粉中伊枯草菌素纯度大于70%。

有益效果，本申请的技术方案具备如下技术效果：

1、本发明以枯草芽孢杆菌N-2 （CGMCC No. 19541）为脂肽生产菌株，通过优化发酵培养基及发酵条件，使优化后的发酵培养基产的抗菌脂肽与纯豆粕发酵培养相比，含量达到782.36mg/kg，为优化前的3.2倍。同时，优化后的抗菌脂肽对恶臭假单胞菌的抑菌率能够从优化前的64.21%提高到90.01%，显示出良好的抑菌活性。

2、本研究提供了两步法超滤，极大减少了脂肽纯化成本，得到了具有新的氨基酸结构的伊枯草菌素A，纯度在95%以上，通过一级和二级质谱，鉴定出脂肽的序列结构为β-NH-fatty acid-Asp-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asn-Pro，这种新肽未曾报道过，该伊枯草菌素A能够破坏恶臭假单胞菌菌体细胞形态、增加细胞膜的通透性并导致细胞破裂，有效抑制恶臭假单胞菌增殖。得到的新的伊枯草菌素A的牛津杯抑菌试验显示，其抑菌圈直径可达24.42mm，对恶臭假单胞菌的最小抑菌浓度为70 μg/mL，最小杀菌浓度为300 μg/mL。

3、本发明的发酵底物成本低廉，固态发酵设备简单，单位发酵基质浓度高，生产能耗低，同时两步超滤法降低了纯化成本。得到的高纯度脂肽为未曾报道过新的伊枯草菌素A，能够有效抑制恶臭假单胞菌，在水产养殖业及人类临床等的疾病防治方面具有广阔的应用前景。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：

图1为伊枯草菌素A抗菌脂肽纯度色谱图。

图2 为伊枯草菌素A抗菌脂肽质荷比分布图。

图3为伊枯草菌素A抗菌脂肽质荷比分布图。

图4 为伊枯草菌素A抗菌脂肽对恶臭假单胞菌生长曲线的影响。

图5 为扫描电镜观察伊枯草菌素A抗菌脂肽对恶假形态结构的影响，其中图中A图为空白组；图中B图为脂肽处理组。

图6为伊枯草菌素A抗菌脂肽对温度的稳定性。

图7为伊枯草菌素A抗菌脂肽对温pH的稳定性。

图8 为伊枯草菌素A抗菌脂肽对蛋白酶的稳定性。

图9 为伊枯草菌素A抗菌脂肽对有机溶剂的稳定性。

图10为伊枯草菌素A抗菌脂肽分子（m/z 995.4）结构图。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定义在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。

实施例1

一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法，或者说是枯草芽孢杆菌N-2（CGMCC No.19541）产抗菌脂肽的固态发酵法，包括以下过程：

将保存在斜面上的枯草芽孢杆菌N-2菌种挑取一环接种于豆粕半固态培养基于37℃富集12 h得到菌液。豆粕半固态培养基为豆粕、LB培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L 氯化钠），其中豆粕和LB培养基的料液比10:1，121℃灭菌20 min。以获得的菌液混合豆粕和营养因子制备固体发酵培养物进行发酵，获得发酵产物。固体发酵培养物为：菌液8%（10³cfu/mL）、豆粕、水（其中豆粕和水的料液比10:1）、葡萄糖1%、谷氨酸钠0.8%、脯氨酸1%、天冬氨酸1%、KCl 0.1%、(NH₄)₂SO₄0.1%、Na₂HPO₄0.1%，温度 37℃，时间48 h。

以菌液混合豆粕和营养因子制成固体发酵培养物进行发酵，获得发酵产物；

采用水提及酸沉淀法提取抗菌脂肽。发酵结束后，按照发酵底物重量的10倍（w/v）加入蒸馏水，室温条件下搅拌1.5 h后静置30 min，随后4000 r/min离心20 min。收集上清，使用5 mol/L 盐酸调节pH至2.0，于4℃ 静置6 h。随后4000 r/min低温离心20 min获得沉淀。按照沉淀质量的6倍(w/v)加入甲醇进行复溶，搅拌均匀后萃取4 h，随后利用旋转蒸发除去甲醇获得干燥的粗脂肽提取物。粗脂肽提取物用超纯水按照 1:9 (w/v)复溶, 并用0.22μm微孔滤膜过滤去除杂质及菌体，得到脂肽水溶液。

使用两步法超滤进行脂肽纯化。超滤过程选择膜截留分子量为10 kDa的聚醚砜超滤膜分离装置进行。第一步使用超滤膜分离装置处理脂肽水溶液，并收集包含脂肽胶束等分子量大于10 kDa的截留物，将截留物从超滤离心管中取出，用蒸馏水溶解并加入等体积的甲醇至终浓度为50%以分散胶束。随后用1 mol/L NaOH将复溶的脂肽溶液的pH调节至pH7.0，低温磁力搅拌2 h，使脂肽胶束完全分散。第二步，将搅拌后的溶液继续用10 kDa的聚醚砜超滤膜分离装置进行超滤，舍弃截留液，收集下层包含脂肽单体等分子量小于10 kDa的滤过液，滤过液用真空冷冻干燥得到纯化后的脂肽粉。

将冻干脂肽粉用超纯水溶解至浓度为5 mg/mL，利用制备型反相高效液相色谱柱Agilent Zorbax SB-Aq C18进行纯度测定。上样量为1-2 mL；流动相为含0.1 %甲酸的乙腈（A）和含0.1%甲酸水溶液（B）；洗脱模式为30% A （0 min）— 45% A （10 min）— 55% A（20min）—55% A （35 min）；流速5 mL/min，柱温30 °C，检测波长210 nm。冻干后得到脂肽峰型单一，纯度可达到70%以上（图1）。对纯化的样品进行结构解析，根据二级质谱离子碎片，确定m/z995.4其一级结构为β-NH-fatty acid-Asp-Tyr-Asn-Pro-Ser-Asn-Pro（如图2和图3），结构如图10，m/z 1023.4 与典型的IturinA结构相比，氨基酸种类未发生变化，仍属于Iturin A，为新的未报导过的肽段（伊枯草菌素A抗菌脂肽）。

实施例2

1、新Iturin A（伊枯草菌素A抗菌脂肽）对恶臭假单胞菌的抑菌活性。

采用牛津杯法进行抑菌试验的测定。首先活化恶臭假单胞菌，将种子液用无菌的生理盐水稀释到菌体量为10⁷cfu/mL，NA平板上取0.1mL进行均匀涂布。随后在平板上用灭菌的镊子放置牛津杯，在牛津杯中加入200 μL抗菌脂肽溶液（过0.22 μm滤膜除菌），在37°C进行培养24 h，同时以无菌水作为空白对照，观察并记录抑菌圈直径。制备得到的新IturinA抑菌圈直径可达24.42 mm，证明有很好的抑菌效果。

采取倍比稀释法测定新Iturin A对恶臭假单胞菌恶假的最小抑菌浓度（MIC）。无菌试管中分别加入200 μL 用NB培养基配制的500、300、150、90、50、20 μg/mL脂肽溶液，未加入脂肽的NB培养液作为空白。向每管中加入1 mL恶臭假单胞菌菌液（浓度~10⁴cfu/mL）。37°C恒温培养20-24 h，恶臭假单胞菌不生长的最低浓度为最小抑菌浓度。从最小抑菌浓度的和高于MIC浓度的各试管中取混合液接种培养于营养琼脂培养基，37°C恒温培养，观察无菌生长的浓度为最小杀菌浓度（MBC）。其中新Iturin A对恶臭假单胞菌的最小抑菌浓度为70±0.1 μg/mL，最小杀菌浓度为300±0.2 μg/mL。

2、新Iturin A对恶臭假单胞菌的生长曲线的影响。

活化后的恶臭假单胞菌种按3%接种量接种于NB液体培养基中，37°C、170 r/min培养24 h，分别取不同时间时间点样品测定OD₆₀₀nm吸光值，绘制生长曲线。其中空白组只加无菌水，实验组分别于培养的0 、2、3、4、6 h 按照最终浓度为1×MIC 添加Iturin A。在0 h添加新Iturin A，吸光度值基本不变化，说明纯化脂肽可以完全控制菌体的生长；在2、3、4、6h添加脂肽，吸光度值不再增加，并且存在一定程度降低，说明新IturinA有溶菌效果，如图4。

3、新Iturin A对恶臭假单胞菌细胞形态的影响。

将培养至对数生长期的恶臭假单胞菌，按10%接种量分别接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中。实验组加入最终浓度为1×MIC的脂肽，空白对照组加入无菌水，37°C培养2 h后离心收集菌体，扫描电镜下观察其形态特征。未经脂肽处理，细菌细胞完整而均匀，形态饱满（图5中的A图）。经过脂肽处理后，菌体形态扭曲、细长、干瘪和不规则；细菌菌体表面粗糙且发生折叠（图5中的B图）。

实施例3

新Iturin A稳定性。

取200 μL纯化后新Iturin A脂肽溶液，分别在25°C、45°C、65°C、85°C、105°C、125°C的温度条件下处理30 min，待温度恢复至室温，按照牛津杯法抑菌试验检测其抑制活性，以未做温度处理的作为对照，记录抑菌圈直径，平行试验三次。

取新Iturin A脂肽冻干粉与pH值分别为2、4、6、8、10、12的超纯水混合，静置10min，8000 r/min离心5 min保留上清，再用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调回初始pH，检测其抑制活性，以未做pH处理的样品定容至相同体积为对照，观察其抑菌活性变化，记录抑菌圈直径，平行试验三次。

取200 μL新Iturin A脂肽溶液，按照体系的1%加入蛋白酶，并调整至各自酶的最适pH，在37°C的条件下处理1 h，并沸水浴灭酶10 min，冷却至室温后进行牛津杯的抑菌试验，以经过沸水浴未做蛋白酶处理的样品作为对照，观察其抑菌活性变化，记录抑菌圈直径，平行试验三次。

取新Iturin A脂肽冻干粉与不同的有机溶剂溶解处理30 min，8000 r/min离心5min，取上清液采用牛津杯实验法检测其抑菌活性，以未做有机溶剂处理的样品为对照，记录抑菌圈直径，平行试验三次。

脂肽经过不同温度的处理，在100°C的处理下仍能保持好的抑菌活性。在125°C处理后活性降低，仍保留61.2%的残留抑菌活性，说明其样品对温度还是有较好的稳定性（图6）。脂肽样品在酸性和中性的环境条件下仍能够保持很好的抑菌活性，在pH 12条件下仍保留85.10%的残留活性（图7）。经过中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的处理，脂肽抑菌活性降低，但仍然保留了大部分活性（图8）。脂肽样品能够溶于乙腈、乙醇、丙酮、甲醇四种有机溶剂，并在甲醇中的抑菌活性最大，其次是乙醇，丙酮和乙腈，脂肽样品对有机溶剂的较好的稳定性（图9）。

实施例4

1、新Iturin A对鲫鱼生长性能的影响。

选取大小一致的健康鲫鱼，随机分为1个对照组和2个实验组，每组3个重复，每个重复6尾。实验中使用曝气48 h的水，水温控制在18°C左右，实验采用饲喂方法，基础日粮为鱼粉12％，豆粕25％，菜粕20％，棉粕7％，玉米胚芽饼20％，次粉麸皮16％；对照组CK不添加抗菌肽，试验A组日粮中添加新Iturin A 50 mg/kg，试验B组日粮中添加新IturinA 100mg/kg，饲料的投喂量为体重的2％左右，每日2次，实验持续30 d。

养殖试验30 d，将鲫鱼空腹饥饿24 h，捞出用滤纸轻轻吸干鱼体表面水分后进行称重，计算增重率、日摄食量及饲料系数。

增重率(Weight gain rate, WGR)，是反映使用饲料投喂动物后生长效果的一项指标，指一定时期内养殖动物的增重量与其初重量之比，通常以百分数表示，其能够直观地反应出动物增重情况和生长情况，其计算公式为：

增重率(Weight gain rate, WGR，%）= [(Wt-W0)/W0]×100

摄食量(Food intake, FI)，通常是指一次投喂动物所吃的食物量。摄食量又分为绝对摄食量和相对摄食量。绝对摄食量是指动物一次摄食的数量（g），以日摄食量为测定指标，其计算公式为：

摄食量(Food intake, FI，g）= C/t；

饲料系数(Feed conversion rate, FCR)，指每增重1 kg，所需饲料的数量。又被称为“饲料报酬”、“饲料转化率”，在水产养殖业中又称“饵料系数”。它是一个可以对饲料报酬进行评价的重要指标，其数值越低，表示饲料吸收转化效果越好，饲料质量越高，其计算公式为：

饵料系数(Feed conversion rate, FCR）= C/(Wt-W0) ；

其中，W0为试验鲫鱼的初始体重，Wt为试验鲫鱼的终末体重，t为试验天数，C为总摄食量。

新Iturin A对鲫鱼生长性能的影响见表1。对实验鲫鱼进行30 d的饲养，结果表明，与CK组相比，B组高剂量新Iturin A可提高鲫鱼的增重率，并显著降低其饵料系数。

表1 不同剂量Iturin A对鲫鱼增重率、摄食量、饵料系数影响表

2、新Iturin A对鲫鱼生长性能的影响、新Iturin A对鲫鱼抗病性的影响。

将普通饲喂30 d的鲫鱼注射感染恶臭假单胞菌后分为两组，一组继续饲喂普通饲料，一组饲喂添加新Iturin A的饲料，连续观察7 d记录鲫鱼的存活情况。如表2所示，对照组中鲫鱼死亡率为50%，而施用新Iturin A能够及时控制感染，降低鲫鱼死亡率。

表2 高剂量Iturin A对恶臭假单胞菌感染鲫鱼的保护能力

本发明的发酵底物成本低廉，固态发酵设备简单，单位发酵基质浓度高，生产能耗低，同时两步超滤法降低了纯化成本。得到的高纯度脂肽为未曾报道过新的伊枯草菌素A，能够有效抑制恶臭假单胞菌，在水产养殖业及人类临床等的疾病防治方面具有广阔的应用前景。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims

1.一种伊枯草菌素A抗菌脂肽，其特征在于：伊枯草菌素A抗菌脂肽的肽结构为：

。

2.一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：将保藏号为CGMCC No. 19541的枯草芽孢杆菌N-2 接入豆粕半固态培养基富集得到菌液，以菌液混合豆粕和营养因子制成的固体发酵培养物进行发酵，获得发酵产物；

3.根据权利要求2所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：步骤1中所述豆粕半固态发酵培养基为：豆粕、LB培养基，LB培养基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L 氯化钠，其中豆粕和LB培养基的料液比5:1-10:1，对培养基在121℃下灭菌20min，接种量0.5%，温度27-38℃，时间6-12 h，获得菌液；

所述固体发酵培养物包括菌液5-10%、豆粕、水、葡萄糖1-2%、谷氨酸钠0.8-1.8%、脯氨酸0.5-1.5%、天冬氨酸0.5-1.5%、KCl 0.1-0.25%、(NH₄)₂SO₄0.1-0.25%、Na₂HPO₄ 0.05-0.2%，温度 27-38℃，时间24-60 h，其中豆粕和水的料液比5:1-10:1。

4.根据权利要求3所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：步骤2中水提及酸沉淀的过程为：发酵结束后，按照发酵底物：蒸馏水= 1:8-1:10（w/v）加入蒸馏水，室温搅拌1-2 h 后静置30-60 min，4000 r/min离心20-30 min后除去不溶物，上清用5mol/L 盐酸调节pH至2.0-2.5，4℃ 静置6 h后，4000 r/min低温离心20-30 min获得沉淀，沉淀用甲醇按照1∶6 (w/v)复溶，萃取4 h后旋转蒸发除去甲醇获得脂肽提取物。

5.根据权利要求4所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中两步法超滤过程为：将步骤2中获得的脂肽提取物用超纯水按照 1:5-1:12 (w/v) 复溶, 并用0.22μm微孔滤膜过滤去除杂质，滤过液使用分子量10 kDa超滤膜截留大分子物质，大分子物质包括脂肽胶束，截留物使用蒸馏水复溶，并加入等体积甲醇，用NaOH调节pH至6.0-7.0后低温搅拌1.5-3 h，随后用分子量10 kDa超滤膜收集分子量小于10 kDa的滤过液，再用冻干后即为纯化脂肽粉。

6.根据权利要求5所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中反相高效液相色谱测定的过程为：制备型液相柱，Agilent Zorbax SB-Aq C18；

流动相含0.1 %甲酸的乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；

洗脱模式，30% A （0 min）— 45% A （10 min）— 55% A （20min）—55% A （35 min）；流速5 mL/min，柱温30 °C，检测波长210 nm，所得伊枯草菌素A抗菌脂肽粉中伊枯草菌素纯度大于70%。