CN102102110A - 枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备 - Google Patents
枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102102110A CN102102110A CN2010105777333A CN201010577733A CN102102110A CN 102102110 A CN102102110 A CN 102102110A CN 2010105777333 A CN2010105777333 A CN 2010105777333A CN 201010577733 A CN201010577733 A CN 201010577733A CN 102102110 A CN102102110 A CN 102102110A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- subtilis
- antibiotic
- bacillus subtilis
- extracellular products
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 13
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title abstract 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 abstract description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 240000003978 Ipomoea coccinea Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000233647 Phytophthora nicotianae var. parasitica Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开一种枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备方法。具体为将枯草芽孢杆菌发酵液超滤浓缩，沉淀制备的粗提物经Sephadex G-100柱层析，以金黄色葡萄球菌为指示菌检测其抗菌活性，收集活性峰。本发明分离提纯工艺具有简单、快速、高效、操作条件温和等特点。提取出的肽类抗菌物质对多种烟草病原真菌具有很好的抑制效果，且具有对温度、pH稳定等优点。
Description
技术领域
本发明属于农用微生物领域，具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，抗菌肽是其中重要的一类，它们是一类具有抗菌活性的小分子多肽(相对分子质量通常在1×104D以下)，具有很强的抗菌活性，具有广谱的杀菌、抑菌活性，不仅作用于革兰氏阳性细菌，而且也作用于真菌、昆虫和某些病毒和肿瘤。该类抗菌物质性质稳定，对高温、酸碱、蛋白酶均具有很好的耐受性，并且低毒、低残留。由于抗菌肽具有普通抗生素所不具有的一系列优点如不易产生抗性突变等而成为当前国内外学术和应用研究的一个热点。
枯草芽孢杆菌目前也有作为微生物抗菌剂使用，其成份为枯草芽孢杆菌发酵液的粗提物，由于杂质较多，限制了其使用范围，对其活性成分进行分离提取，可以解决杂质污染带来的问题，使其有效成分能更好的发挥作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种操作简单、快速高效分离纯化枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌肽的方法，其操作条件温和、制备工艺合理简单、对试剂和仪器设备要求低、适合工业化生产。
枯草芽孢杆菌能分泌对多种农作物有害病原真菌具有抑制杀伤作用的抗菌肽。这类抗菌肽具有热稳定性高，对蛋白酶水解的耐受力强，且不易产生耐药性。根据以上的特点，本发明所采用的技术方案为：
1、枯草芽孢杆菌发酵液的超滤浓缩：将枯草芽孢杆菌的发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩，截留分子量在1000D以上的物质。
2、粗提液的制备：将步骤1中所得浓缩液以6000-8000r/min离心10min，取上清液并加入浓缩液2-3倍体积的乙醇，0-4℃沉淀12h；然后再以10000-12000r/min离心15-20min收集上清，所得上清液经60℃旋转蒸发浓缩5-10mL，备用。
3、Sephadex G-100柱层析：将步骤2的浓缩液经Sephadex G-100层析柱层析，用去离子水进行洗脱，流速为0.15-0.2mL/min，收集具有抗菌活性的洗脱峰，浓缩后备用。
本发明所具有的优点
本发明提供的方法可快速有效分离提取枯草芽孢杆菌发酵液中肽类抗菌物质，其中膜过滤的方法自动化程度高，减少了人力成本，且不需要使用过滤剂进行过滤，本发明的制作方法成本低，制备工艺简单快速，操作条件温和，对试剂、仪器设备要求低，更适合于工业化生产。分离提取得到的肽类抗菌物质可用于烟草黑胫病、青枯病、赤星病等烟草真菌病害的防治；同时，该肽类抗菌物质也可做为饲料添加剂用于防治黄曲霉等真菌引起的霉变，另外它们在抗病毒、抗肿瘤方面也具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是抗菌胞外产物对金黄色葡萄球菌的抑制作用；
图2是抗菌胞外产物浓缩液经sephadex-G 100柱层析图；
具体实施方案
枯草芽孢杆菌发酵液的制备：将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基，在37℃，180r/min摇床振荡培养24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液。所述LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，水1000mL，pH7.2-7.4。
粗提液的制备：取上述制备的枯草芽孢杆菌发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩后(截留分子量为1000D)，以6000-8000r/min离心10min，取上清液并加入浓缩液2-3倍体积的乙醇，0-4℃沉淀12h；然后再以10000-12000r/min离心15-20min收集上清，所得上清液经60℃旋转蒸发浓缩5mL，备用。
Sephadex G-100柱层析：称取Sephadex G-100凝胶20g，充分溶涨，常规装柱，床体积为200mL(
1.6cm×100cm)，取0.5mL浓缩液加至Sephadex G-100层析柱上，用去离子水洗脱，流速为0.2mL/min，用部分收集器每15min收集一管，收集30管，每管3mL。以金黄色葡萄球菌作指示菌，采用牛津杯法检测每管的抗菌活性(见图1)。共获得两个峰(I、II)(见图2)，其中峰II具有抗菌活性，收集并浓缩具有抗菌的活性峰(15-19管)。
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备方法，其特征是该抗菌胞外产物是通过以下步骤制备的：
(1)枯草芽孢杆菌发酵液的制备：将枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)接种于LB培养基，摇床振荡培养，得到枯草芽孢杆菌发酵液；
所述LB培养基配制方法是：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，水1000mL，pH 7.2-7.4，固体培养基需加琼脂20g，121℃灭菌20min，备用；
(2)粗提液的制备：取上述制备的枯草芽孢杆菌发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩后，以6000-8000r/min离心10min，取上清液并加入浓缩液2-3倍体积的乙醇，0-4℃沉淀12h；然后再以10000-12000r/min离心15-20min收集上清，所得上清液经60℃旋转蒸发浓缩至5mL，备用；
(3)Sephadex G-100柱层析：称取Sephadex G-100凝胶20g，充分溶涨，常规装柱，床体积为200mL，柱子规格1.6cm×100cm，取0.5mL浓缩液加至Sephadex G-100层析柱上，用去离子水洗脱，流速为0.2mL/min，用部分收集器每15min收集一管，收集30管，每管3mL；以金黄色葡萄球菌作指示菌，采用牛津杯法检测每管的抗菌活性，收集并浓缩具有抗菌的活性峰。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述的摇床振荡培养的温度是37℃。
3.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述的摇床振荡培养的转速是180r/min。
4.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述摇床振荡培养的时间是24h。
5.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备方法，其特征是：步骤(2)中的切向流超滤系统的超滤膜孔径为1000D。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105777333A CN102102110A (zh) | 2010-12-01 | 2010-12-01 | 枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105777333A CN102102110A (zh) | 2010-12-01 | 2010-12-01 | 枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102102110A true CN102102110A (zh) | 2011-06-22 |
Family
ID=44155179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105777333A Pending CN102102110A (zh) | 2010-12-01 | 2010-12-01 | 枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102102110A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102860580A (zh) * | 2011-07-05 | 2013-01-09 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 提高烤烟上部烟叶质量的生物制剂及其制备方法和应用 |
| CN104762353A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-07-08 | 光明乳业股份有限公司 | 一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法和应用 |
| CN104762352A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-07-08 | 光明乳业股份有限公司 | 一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法及其应用 |
| CN110982734A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-04-10 | 枣庄市杰诺生物酶有限公司 | 一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1611511A (zh) * | 2004-03-27 | 2005-05-04 | 中国科学院等离子体物理研究所 | 枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法 |
-
2010
- 2010-12-01 CN CN2010105777333A patent/CN102102110A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1611511A (zh) * | 2004-03-27 | 2005-05-04 | 中国科学院等离子体物理研究所 | 枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士) 农业科技辑》 20061015 赵瑞 枯草芽孢杆菌TU100的发酵条件以及抗菌物质的研究 , 第10期 * |
| 沈锦玉 等: "枯草芽孢杆菌B115 抗菌蛋白的分离纯化及部分性质", 《水生生物学报》 * |
| 赵瑞: "枯草芽孢杆菌TU100的发酵条件以及抗菌物质的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士) 农业科技辑》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102860580A (zh) * | 2011-07-05 | 2013-01-09 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 提高烤烟上部烟叶质量的生物制剂及其制备方法和应用 |
| CN104762353A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-07-08 | 光明乳业股份有限公司 | 一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法和应用 |
| CN104762352A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-07-08 | 光明乳业股份有限公司 | 一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法及其应用 |
| CN104762353B (zh) * | 2015-04-13 | 2018-04-27 | 光明乳业股份有限公司 | 一种类芽孢杆菌细菌素提取物及其制备方法和应用 |
| CN104762352B (zh) * | 2015-04-13 | 2018-07-20 | 光明乳业股份有限公司 | 一种类芽孢杆菌细菌素制剂的制备方法及其应用 |
| CN110982734A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-04-10 | 枣庄市杰诺生物酶有限公司 | 一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用 |
| CN110982734B (zh) * | 2019-11-21 | 2022-01-14 | 枣庄市杰诺生物酶有限公司 | 一株海洋来源的枯草芽孢杆菌2713、抗菌物质及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103333937B (zh) | 一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法 | |
| CN101297821B (zh) | 桑黄菌丝体活性糖蛋白及其用途和制备方法 | |
| CN102060934B (zh) | 一种黑木耳多糖的酶法提取方法 | |
| CN102153618B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法 | |
| CN103320370B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌c3及其抗单增李斯特菌细菌素的制备方法 | |
| CN101372502A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法 | |
| CN102102110A (zh) | 枯草芽孢杆菌抗菌胞外产物的制备 | |
| CN106244658A (zh) | 一种甘薯蛋白多肽的制备方法 | |
| CN103709235B (zh) | 一种减少溶媒使用的提取高纯度恩拉霉素的方法 | |
| CN103194499B (zh) | 利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法 | |
| CN101434981B (zh) | 一种微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法 | |
| CN101654697B (zh) | 一种混菌发酵制备菜籽肽的方法 | |
| CN103911420A (zh) | 菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法 | |
| CN104130310A (zh) | 一种谷胱甘肽的分离纯化方法 | |
| CN103695325B (zh) | 一种热带假丝酵母及一种微生物法制备l-缬氨酸的方法 | |
| CN104211754A (zh) | 一种从紫花苜蓿茎中制备多糖及糖蛋白的方法 | |
| CN104277099A (zh) | 一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用 | |
| CN101654693B (zh) | 微生物发酵制备菜籽肽的方法 | |
| CN1611511A (zh) | 枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法 | |
| CN101280333B (zh) | 一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法 | |
| CN104694614A (zh) | 一种l-色氨酸的提取新工艺 | |
| CN104726515A (zh) | 一种富含岩藻糖的细菌胞外多糖的提取方法 | |
| CN102994408B (zh) | 一种卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用 | |
| CN103602652A (zh) | 一种食品级中性蛋白酶的提纯方法 | |
| CN101654696B (zh) | 一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110622 |