CN101892176A - 产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用 - Google Patents

产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101892176A
CN101892176A CN 201010129805 CN201010129805A CN101892176A CN 101892176 A CN101892176 A CN 101892176A CN 201010129805 CN201010129805 CN 201010129805 CN 201010129805 A CN201010129805 A CN 201010129805A CN 101892176 A CN101892176 A CN 101892176A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
lipopeptid
antifungal lipopeptid
antifungal
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 201010129805
Other languages
English (en)
Other versions
CN101892176B (zh
Inventor
王德培
徐进
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN2010101298058A priority Critical patent/CN101892176B/zh
Publication of CN101892176A publication Critical patent/CN101892176A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101892176B publication Critical patent/CN101892176B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用。其中微生物发酵生产抗真菌脂肽的菌种分类属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BI1，保藏号为CGMCC No.3412。本发明还涉及发酵抗真菌脂肽的制备方法，它是采用发酵菌株BI1，按1％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。本发明还公开了抗真菌脂肽在制备治疗皮肤癣病方面的应用。

Description

产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用。更具体的说是：一种微生物发酵生产抗真菌脂肽的菌种，该菌种是本发明发现的一株能有效生产抗真菌脂肽的新菌株，用该菌株发酵生产抗真菌脂肽可以有效的用于治疗皮肤癣病。
背景技术
脂肽是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的一种次生代谢产物。脂肽的分子是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，具有生物表面活性剂的特性，在医药、农业、食品及化妆品、石油开采和环境治理等领域有重要的应用前景，已引起广泛的关注。另外，大多脂肽数具有抗微生物作用，也被称为抗生素。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬荠素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。
抗菌肽是通过在细胞膜上形成离子通道造成内容物大量外泄而致细胞死亡。Christeson等认为，抗菌肽首先通过静电作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入细胞膜中的疏水区域，通过改变膜构象，多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道，造成细胞内容物泄露致细胞死亡。Fink等认为只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的双亲螺旋只结合在膜表面。Juvvadi(1997)推测抗菌作用的第1步是抗菌肽的阳离子与膜上磷脂基团的阴离子之间相互作用，再与膜上碳氢化合物互作，然后疏水螺旋插入膜上，聚合形成孔道。Park(1997)发现蛙的1种抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌机理，它不裂解细胞膜，而是穿过膜后与DNA、RNA结合，快速导致细胞死亡。此外，人们还发现抗菌肽可通过抑制细胞呼吸、抑制细胞外膜蛋白的合成或抑制细胞壁的形成等机制来杀死细菌。目前对抗菌肽抗真菌的机理研究较少，Cavallarin(1998)发现位于Cecropins衍生物N末端螺旋区域的11个氨基酸顺序与抗真菌活力有关；Lee等(1989)则观察到真菌受抗菌肽作用后，细胞膜上有空洞形成，推测其与抑杀细菌的机理类同。本发明的抗真菌脂肽的杀菌机理主要是使细胞膜形成离子通道破坏膜结构导致细胞死亡。
皮肤癣病皮肤癣属于致病真菌感染的皮肤疾病，症状是皮肤非常痕瘁，出现红疹或小红斑块，越搔皮肤越发红瘁，患处范围会进一步扩大。癣患处经常出现在出汗较多的地方，如脚部、大腿内侧等。皮肤癣病和甲癣是常见的浅部真菌病，其中包括：足癣、体癣、股癣、手癣和花斑癣等；甲癣俗称“灰指(趾)甲”，以上疾病都是由真菌感染引起的，主要是白色念球菌、红毛癣菌和须毛癣菌。
在我们生活的环境中和我们的皮肤上都有包括真菌在内的数百万计的微生物的存在，一旦天气转暖，有适于真菌生长的条件时，真菌便会乘虚而入，侵害我们的皮肤，引起皮肤癣病。据统计，世界上约有1/4的人受到皮肤癣病的困扰。皮肤癣病还会在人与人之间相互传染，甚至可以在同一人的不同身体部位间传染。目前对皮肤癣病的治疗药物是含酮康唑或克霉唑的软膏剂，属于化学合成类药物，长期使用导致致病真菌的耐药性。
1968年Arima等首次发现枯草芽孢杆菌(B.subtilis)能够产生抗菌脂肽surfactin以来，抗菌脂肽产生菌的筛选主要集中在枯草芽孢杆菌的不同菌株之间。近年来，进一步的研究表明，除枯草芽孢杆菌外，淀粉液化杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、地衣芽孢杆菌(B.lichemformis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、Bacillusthruingiensis、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和环状芽孢杆菌(B.circulan)等也能产生抗菌脂肽。不同种的菌株可以产生不同或相同的抗菌脂肽，同一种细菌的不同菌株也能产生几种不同的抗菌脂肽，如枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生surfactin，而有些菌株却能同时产生surfactin、fengycin和iturin或bacillomycin和plipastatin。而且，即使同一种菌株产生的同一种抗菌脂肽也不是纯的单一化合物，而是由几个或许多结构类似的同系物组成。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种微生物发酵生产抗真菌脂肽的菌种，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BI1，保藏号为CGMCCNo.3412。
本发明的另一个目的是公开了采用CGMCC No.3412菌种制备抗真菌脂肽的方法。
本发明还一个目的是公开了的采用CGMCC No.3412菌种发酵生产的抗真菌脂肽在抗真菌药物方面的应用。为实现上述目的，本发明公开的技术内容如下：
一种抗真菌脂肽微生物发酵菌株，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏号为CGMCC No.3412。
本发明提供的CGMCC No.3412菌株是一株能生产抗真菌脂肽的新菌株，用该菌株发酵糖质原料生产抗真菌脂肽。
抗真菌脂肽微生物发酵菌株，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏号为CGMCC No.3412，保藏日期2009年11月6日。保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌细胞为杆状，革兰染色均匀，且为阳性，产生芽孢。在肉汤培养基平板上菌落呈圆形或不规则状，表面褶皱，不透明，干燥，菌落呈浅黄色。在液体静止培养时有菌膜形成。
本发明公开的采用CGMCC No.3412菌株制备抗真菌脂肽的方法，其特征在于：
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：糖质原料5～50g，氮源2～20g，柠檬酸钠1～3g，MgSO4·7H200.1～0.2g，K2HPO42～6g，KH2PO43～9g，pH 7.0～7.2；
(2)发酵培养：按1％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。
本发明所述的制备方法，其中糖质原料包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麸皮糖化液。
本发明所述的制备方法，其中氮源原料包括：硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。
本发明进一步公开了抗真菌脂肽微生物发酵菌株在发酵生产抗真菌脂肽用于制备治疗皮肤癣病方面的应用。
本发明更加详细的描述如下：
(1)微生物菌株的筛选与鉴定：
本发明中，建立了一个快速有效的筛选高产抗真菌脂肽菌株的方法，根据产抗真菌脂肽菌株的细胞产物特点，设计以白色念球菌为指示菌的YEPD平板，挑选抑菌圈直径大的菌株，即为产抗真菌脂肽较好的菌株。
本发明从青贮秸秆饲料中取样，采用肉汤培养基30℃富集培养2-3次，再涂布于白色念球菌为指示菌的YEPD选择性平板，挑选抑菌圈直径大的菌株，经过对多个青贮秸秆饲料样品的大量菌株筛选工作，从分离出来的近数百株细菌中初步筛选出近30株具有抗白色念球菌的菌株，最后复筛得到抑菌圈直径达2cm以上，经15次传代后遗传稳定性好的菌株BI1菌株。
本发明筛选得到的能抑制白色念球菌的菌株BI1，经16S rDNA基因序列测定与以公布的枯草芽孢杆菌16S rDNA基因序列相似性达99.7％。BI1菌株能氧化葡萄糖产酸，需氧，V-P反应呈阳性，能还原硝酸盐和水解淀粉(表1)。BI1菌株的生理生化特征均与布坎南和吉本斯等(1984)编著的《伯杰细菌鉴定手册》第八版和东秀珠、蔡妙英(2001)编著的《常见细菌鉴定手册》中描述的枯草芽孢杆菌相同。认为属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)，芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BI1专利保存号：CGMCC3412。该菌细胞为杆状，革兰染色均匀，且为阳性，产生芽孢。在肉汤培养基平板上菌落呈圆形或不规则状，表面褶皱，不透明，干燥，菌落呈浅黄色。在液体静止培养时有菌膜形成。
表1芽孢杆菌BI1和标准枯草芽孢杆菌生理生化特征比较
  实验项目   BI1   枯草芽孢杆菌BacillusSubtilis   实验项目   BI1   枯草芽孢杆菌BacillusSubtilis
  酪素水解试验   +   +   柠檬酸盐利用实验   +   +
  NO3-转化为NO2-   +   +   VP反应试验   +   +
  淀粉水解实验   +   +   厌氧洋菜中生长试验   -   -
  木糖发酵   +   +   蔗糖发酵   +   +
  乳糖发酵   +   +   阿拉伯糖发酵   +   +
  棉子糖发酵   +   +   甘露糖发酵   +   +
  麦芽糖发酵   +   +   山梨糖发酵   -   -
  甘露醇发酵   +   +   半乳糖发酵   -   -
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性
本发明菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BI1的抑菌图谱见表2。
表2BI1的抑菌谱
  供试菌   抑菌效果
  白色念球菌(Candida albicans)   +
  红毛癣菌(T.purpureatum)   +
  须毛癣菌(T.mentagrophytes)   +
  酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)   -
  金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)   -
  耳葡萄球菌(Ear Staphylococcus)   -
  大肠杆菌(Escherichia coli)   -
  产气杆菌(Enterobacter aerogenes)   -
  黑曲霉(Fungi Imperficti)   +
  米曲霉(Aspergillus oryzae)   +
  根霉(rhizopus spp.)   +
  黄曲霉(Aspergillus flavus)   +
  番茄叶霉病菌(Botryosporrium pulchrum Corda) +
  黄瓜枯萎病菌(Fusarium Oxysporum f.sp.Cucumerinum) +
  黄瓜枯萎病菌(Fusarium Oxysporum f.sp.Cucumerinum) +
  大豆根腐病菌(Fusarium Oxysporum)   +
  小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)   +
  水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)   +
  玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)   +
  番茄早疫病菌(Alternaris solani)   +
  辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici Leon)   +
  瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum(Eds.)Fitzp) +
  黄瓜炭疽病菌(Colletrichum orbiculare)   +
  番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Persoon)   +
  大豆菌核病菌(Sclerotiria sclerotiorum)   +
  宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)   +
  新型隐球酵母(Cuyitococcus Neofonmans)   -
  短乳杆菌(Lactobacillus brevis)   -
  乳酸杆菌(Lactobacilli)   -
  乳酸球菌(Micrococcus acidi lactici)   -
  嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)   -
  植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)   -
  纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)   -
芽孢杆菌BI1对丝状真菌均有拮抗作用，而对细菌及非丝状的酵母菌没有作用。表明BI1对丝状真菌有专一性的抑制作用。
(2)微生物菌株的培养与生产抗真菌脂肽的发酵
肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.2～7.4；固体培养基需加20.0琼脂。
YEPD培养基(g/L)：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，葡萄糖20.0；固体培养基需20.0琼脂。
斜面和种子培养基的组成：(g/L)：葡萄糖1～3，胰蛋白胨5～10，酵母粉3～6，NaCl 6～12，去离子水配制，pH 7.2～7.5；固体培养基需加15g琼脂粉。
发酵培养基的组成(g/L)：糖质原料5～50g，氮源2～20g，柠檬酸钠1～3g，MgSO4·7H2O 0.1～0.2g，K2HPO42～6g，KH2PO43～9g，pH 7.0～7.2。种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为113～121℃，20min。
将该菌株BI1自斜面接种于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，30～40℃、140r/min摇床培养12～16h。按1％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时。
本发明用于发酵的糖质原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮糖化液。
本发明用于发酵的氮源可以是硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、大豆粉。发酵过程通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液的pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。
本发明进一步公开了采用CGMCC No.3412菌种发酵生产的抗真菌脂肽在抗真菌方面的应用以及不同原料糖化液发酵产脂肽的情况。
1.将正常的白色念珠菌和经过BI1发酵提取的抗真菌脂肽处理的白色念珠菌，用原子力显微镜扫描成像，见图1和图2。由图1可以看出，未被处理的白色念珠菌表面非常光滑。而被脂肽处理过的白色念珠菌(见图2)，在原子力显微镜下观察，表面有明显的凹陷及穿孔。有研究表明，脂肽是作用于菌体细胞膜，使细胞膜的通透性改变而发挥抗菌活性的。因此推测，脂肽可能改变白色念珠菌细胞膜的通透性，使细胞内物质外泄，导致菌体死亡。
2.以裸皮小白鼠于皮肤表面接种白念球菌纯培养稀释液，连续接种三天，每天接种一次。观察裸皮小白鼠皮肤接种处表面出现红斑或鳞屑状损害，用含有本发明的真菌脂肽涂抹剂与2％克霉唑软膏作病例治疗对比试验，早中晚3次/天涂于患处皮肤。
本发明的涂抹剂治愈率达到100％，平均治愈时间7天。2％克霉唑软膏治愈率达到90％，平均治愈时间10天。
  组别   用药剂量   用药时间   症状   治愈率
  对照组   2％克霉唑软膏   早中晚3次/天   足癣的瘙瘁   90％
  实验组   真菌脂肽涂抹剂   早中晚3次/天   足癣的瘙瘁   100％
结论：
采用2％克霉唑软膏和含2％真菌脂肽涂抹剂治疗皮肤癣病，平均治愈时间7天。试验结果统计：本发明的涂抹剂治愈率达到100％，2％克霉唑软膏治愈率达到90％。说明本发明的真菌脂肽涂抹剂可以杀灭致病真菌，治愈率达100％。
3.将3g/L蔗糖、麦芽糖、果糖代替3g/L葡萄糖，接入培养好的枯草芽孢杆菌BI1种子，发酵60h，提取发酵液中抗真菌脂肽。结果如表3。
表3枯草芽孢杆菌以不同糖发酵产脂肽结果
  葡萄糖   蔗糖   麦芽糖   果糖
 脂肽产量g/L   2.04   1.87   1.84   1.91
4.将20g/L可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液、麸皮糖化液代替3g/L葡萄糖，接入培养好的枯草芽孢杆菌BI1种子，发酵60h，提取发酵液中抗真菌脂肽，结果如表4。
表4枯草芽孢杆菌以不同原料糖化液发酵产脂肽结果
  葡萄糖   可溶性淀粉糖化液   玉米粉糖化液   麸皮糖化液
  脂肽产量g/L   2.04   1.57   1.64   1.69
本发明公开的技术内容与现有技术相比所具有的积极效果表现在以下方面：
1、发现了一株产抗真菌脂肽的新菌枯草芽孢杆菌BI1，其代谢产物抗真菌脂肽只对丝状真菌有抗性，对细菌和乳酸菌没有抑菌活性，因此作为皮肤擦剂既可以杀灭致病真菌，又不破坏皮肤表面存在的益生细菌。
2、枯草芽孢杆菌BI1，其代谢产物抗真菌脂肽产量较高达到1-2g/L。
3、枯草芽孢杆菌BI1，发酵产抗真菌脂肽所需碳源和氮源较广泛，其中多数为农产品加工副产物，因此生产原料成本低。更适合大规模的工业化生产。
附图说明：
图1为正常的白色念珠菌表面形态；
图2经脂肽处理过的白色念珠菌形态。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述。
实施例1
(1)微生物菌株的培养与产抗真菌脂肽的发酵
[肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.2；固体培养基需加20.0琼脂。
YEPD培养基(g/L)：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，葡萄糖20.0；固体培养基需加20.0琼脂。]此处为公知内容可删去。
斜面和种子培养基的组成：(g/L)：葡萄糖3，胰蛋白胨5，酵母浸出粉6，NaCl6，去离子水配制，pH 7.5；固体培养基需加15g琼脂粉。
发酵培养基的组成(g/L)：糖质原料(葡萄糖)5g，氮源(硝酸铵)15g，柠檬酸钠1g，MgSO4.7H20，0.5g，K2HPO42～6g，KH2PO45g，pH 7.0～7.2。种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115℃，20min。
将该菌株BI1自斜面接菌于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，40℃、140r/min摇床培养16h。按2％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度40℃，发酵通气量为8m3/h，罐压0.05MPa，搅拌速度100～150转/分钟，发酵时间60小时。酵过程通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液的pH在7，发酵液中抗真菌脂肽产量为1.5L。
实施例2
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖10g，氮源20g，柠檬酸钠3g，MgSO4·7H20，0.2g，K2HPO42g，KH2PO43g，pH 7.0；
(2)发酵培养：按2％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30℃，发酵通气量为5m3/h，罐压0.03MPa，搅拌速度80转/分钟，发酵时间30小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水维持发酵液pH在7.5，种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为121℃，20min。发酵液中抗真菌脂肽产量为1.5g/L。
实施例3
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：玉米粉35，氮源蛋白胨15，檬酸钠1，MgSO4·7H20，0.8，K2HPO44，KH2PO46，pH 7.2。
(2)发酵培养：按2％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30℃，发酵通气量为5m3/h，罐压0.05Pa，搅拌速度60转/分钟，发酵时间45h，发酵过程中通入无菌空气，用氨水维持发酵液pH在7.2，发酵液中抗真菌脂肽产量为1.4g/L。
实施例4
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：糖质原料40g，氮源(牛肉膏)20g，柠檬酸钠3g，MgSO4·7H20.1g，K2HPO45g，KH2PO47g，pH 7.2；
(2)发酵培养：按8％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度35℃，发酵通气量为8m3/h，罐压0.09MPa，搅拌速度100转/分钟，发酵时间50小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为125℃，20min，发酵液中抗真菌脂肽产量为2g/L。
实施例5
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：麦芽糖35g，氮源(胰蛋白胨)15g，柠檬酸钠3g，MgSO4·7H20，0.15g，K2HPO44.5g，KH2PO46.5g，pH 7.2；
(2)发酵培养：按4.5％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度35℃，发酵通气量为10m3/h，罐压0.06MPa，搅拌速度80转/分钟，发酵时间40小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1.2g/L。
本发明在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims (5)

1.一种抗真菌脂肽微生物发酵菌株，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏号为CGMCC No.3412。
2.一种采用权利要求1所述CGMCC No.3412菌株制备抗真菌脂肽的方法，其特征在于：
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：糖质原料5～50g，氮源2～20g，柠檬酸钠1～3g，MgSO4·7H2O0.1～0.2g，K2HPO42～6g，KH2PO43～9g，pH 7.0～7.2；
(2)发酵培养：按1％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。
3.权利要求2所述的制备方法，其中糖质原料包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麸皮糖化液。
4.权利要求2所述的制备方法，其中氮源原料包括：硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。
5.采用权利要求2所述方法制备的抗真菌脂肽在制备治疗皮肤癣病药物方面的应用。
CN2010101298058A 2010-03-23 2010-03-23 产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用 Expired - Fee Related CN101892176B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010101298058A CN101892176B (zh) 2010-03-23 2010-03-23 产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010101298058A CN101892176B (zh) 2010-03-23 2010-03-23 产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101892176A true CN101892176A (zh) 2010-11-24
CN101892176B CN101892176B (zh) 2012-07-04

Family

ID=43101524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010101298058A Expired - Fee Related CN101892176B (zh) 2010-03-23 2010-03-23 产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101892176B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004693A (zh) * 2014-06-17 2014-08-27 江南大学 一种短小芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用
CN105166323A (zh) * 2015-09-25 2015-12-23 广东海洋大学 一种复合饲料添加剂
CN107142226A (zh) * 2016-03-01 2017-09-08 中国科学院武汉病毒研究所 一种枯草芽胞杆菌atr2及制备方法和应用
CN109762762A (zh) * 2019-01-11 2019-05-17 江苏大学 一种脂肽的高产菌株及其制备方法和用途
CN112741113A (zh) * 2021-02-20 2021-05-04 东北农业大学 一种防治马铃薯早疫病的微生物制剂及其应用
CN113846037A (zh) * 2021-11-11 2021-12-28 天津元汇科技有限公司 多类型有机湿垃圾微生物原位水化菌剂及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6417163B1 (en) * 1997-05-09 2002-07-09 Agraquest, Inc. Compositions and methods for controlling plant pests
CN101372502A (zh) * 2007-08-22 2009-02-25 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6417163B1 (en) * 1997-05-09 2002-07-09 Agraquest, Inc. Compositions and methods for controlling plant pests
CN101372502A (zh) * 2007-08-22 2009-02-25 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种枯草芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的分离提取方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《中国生物防治》 20091130 徐杨，等 海洋枯草芽孢杆菌3512A 抗真菌脂肽 328－333 1－5 第25卷, 第4期 2 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004693A (zh) * 2014-06-17 2014-08-27 江南大学 一种短小芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用
CN104004693B (zh) * 2014-06-17 2016-08-17 江南大学 一种短小芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用
CN105166323A (zh) * 2015-09-25 2015-12-23 广东海洋大学 一种复合饲料添加剂
CN105166323B (zh) * 2015-09-25 2019-01-22 广东海洋大学 一种复合饲料添加剂
CN107142226A (zh) * 2016-03-01 2017-09-08 中国科学院武汉病毒研究所 一种枯草芽胞杆菌atr2及制备方法和应用
CN107142226B (zh) * 2016-03-01 2020-09-22 中国科学院武汉病毒研究所 一种枯草芽胞杆菌atr2及制备方法和应用
CN109762762A (zh) * 2019-01-11 2019-05-17 江苏大学 一种脂肽的高产菌株及其制备方法和用途
CN112741113A (zh) * 2021-02-20 2021-05-04 东北农业大学 一种防治马铃薯早疫病的微生物制剂及其应用
CN113846037A (zh) * 2021-11-11 2021-12-28 天津元汇科技有限公司 多类型有机湿垃圾微生物原位水化菌剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101892176B (zh) 2012-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Silva et al. Antimicrobial activity of broth fermented with kefir grains
CN101892176B (zh) 产生抗真菌脂肽的微生物及其抗真菌脂肽制备方法与应用
CN103333819B (zh) 一株产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌及其应用
KR100439635B1 (ko) 가축의 생산성 향상 및 축산 분뇨의 악취 발생 감소에효과적인 신규 미생물, 이를 포함하는 복합 미생물제 및이의 제조방법
CN103243044B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN110272854A (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN108441436B (zh) 一种副干酪乳杆菌及其应用
CN109456921B (zh) 一种多粘类芽孢杆菌、应用及微生物菌剂、粉剂和颗粒剂
CN110172429A (zh) 一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及培养方法
CN103098981A (zh) 一种提高柑橘渣饲料蛋白水平的脱水固态组合菌剂及其制作方法
WO2016150152A1 (zh) 一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法
CN103667106B (zh) 一种植物乳杆菌、其细菌素以及培养与分离纯化方法
CN107981034A (zh) 一株布氏乳杆菌hew-a666及其应用
CN102204571B (zh) 链格孢菌代谢产物在防治西瓜枯萎病菌中的应用
Peng et al. Fungichromin production by Streptomyces sp. WP-1, an endophyte from Pinus dabeshanensis, and its antifungal activity against Fusarium oxysporum
CN114381403B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌loh112及其应用
Vehapi et al. Production of Bacillus subtilis soil isolate as biocontrol agent under bioreactor conditions
Angeli et al. Production of Ampelomyces quisqualis conidia in submerged fermentation and improvements in the formulation for increased shelf-life
CN103525725A (zh) 一株丁香假单胞菌及其在番茄灰霉病防治中的应用
CN102796672A (zh) 一种蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基及其制备方法和应用
CN103210961B (zh) 防治人参灰霉病和黑斑病的生物农药
CN112175871A (zh) 一种万寿菊鲜花复合发酵剂及其应用
CN104745510B (zh) 一种发酵乳杆菌及其在植物真菌病害防治中的应用
CN101892177B (zh) 一种含有抗真菌脂肽的皮肤擦剂及其制备方法
Aamod et al. Evaluation of bacillus circulans in imparting aerobic stability to silage

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120704

Termination date: 20180323