CN101892177B - 一种含有抗真菌脂肽的皮肤擦剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物发酵生产抗真菌脂肽和其抗真菌脂肽的皮肤擦剂，属于生物技术领域。具体涉及一种发酵糖质原料生产抗真菌脂肽的微生物枯草芽孢杆菌BI1(Bacillus subtilis BI1)，保藏号为CGMCCNo.3412，同时本发明还涉及利用该微生物发酵生产的抗真菌脂肽提取物和含该提取物的涂膜剂及其涂膜剂的制备方法。采用本发明的涂膜剂治疗皮肤癣病，平均治愈时间7天，治愈率达到100％，为患者治疗皮肤癣病提供了一种良好的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种微生物发酵生产抗真菌脂肽的菌种，及其提取该抗真菌脂肽制备皮肤擦剂方法。该菌种是本发明发现的一株能有效生产抗真菌脂肽的新菌株，用该菌株发酵生产抗真菌脂肽可以有效的用于治疗皮肤癣病。
背景技术
脂肽是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的一种次生代谢产物。脂肽的分子是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，具有生物表面活性剂的特性，在医药、农业、食品及化妆品、石油开采和环境治理等领域有重要的应用前景，已引起广泛的关注。另外，大多脂肽数具有抗微生物作用，也被称为抗生素。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬荠素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。
1968年Arima等首次发现枯草芽孢杆菌(B.subtilis)能够产生抗菌脂肽surfactin以来，抗菌脂肽产生菌的筛选主要集中在枯草芽孢杆菌的不同菌株之间。近年来，进一步的研究表明，除枯草芽孢杆菌外，淀粉液化杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、地衣芽孢杆菌(B.lichemformis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、Bacillusthruingiensis、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和环状芽孢杆菌(B.circulan)等也能产生抗菌脂肽。不同种的菌株可以产生不同或相同的抗菌脂肽，同一种细菌的不同菌株也能产生几种不同的抗菌脂肽，如枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生surfactin，而有些菌株却能同时产生surfactin、fengycin和iturin或bacillomycin和plipastatin。而且，即使同一种菌株产生的同一种抗菌脂肽也不是纯的单一化合物，而是由几个或许多结构类似的同系物组成。
抗菌肽是通过在细胞膜上形成离子通道造成内容物大量外泄而致细胞死亡。Christeson等认为，抗菌肽首先通过静电作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入细胞膜中的疏水区域，通过改变膜构象，多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道，造成细胞内容物泄露致细胞死亡。Fink等认为只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的双亲螺旋只结合在膜表面。Juvvadi(1997)推测抗菌作用的第1步是抗菌肽的阳离子与膜上磷脂基团的阴离子之间相互作用，再与膜上碳氢化合物互作，然后疏水螺旋插入膜上，聚合形成孔道。Park(1997)发现蛙的1种抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌机理，它不裂解细胞膜，而是穿过膜后与DNA、RNA结合，快速导致细胞死亡。此外，人们还发现抗菌肽可通过抑制细胞呼吸、抑制细胞外膜蛋白的合成或抑制细胞壁的形成等机制来杀死细菌。目前对抗菌肽抗真菌的机理研究较少，Cavallarin(1998)发现位于Cecropins衍生物N末端螺旋区域的11个氨基酸顺序与抗真菌活力有关；Lee等(1989)则观察到真菌受抗菌肽作用后，细胞膜上有空洞形成，推测其与抑杀细菌的机理类同。本发明的抗真菌脂肽的杀菌机理主要是使细胞膜形成离子通道破坏膜结构导致细胞死亡。
皮肤癣病皮肤癣属于致病真菌感染的皮肤疾病，症状是皮肤非常痕痒，出现红疹或小红斑块，越搔皮肤越发红瘁，患处范围会进一步扩大。癣患处经常出现在出汗较多的地方，如脚部、大腿内侧等。皮肤癣病和甲癣是常见的浅部真菌病，其中包括：足癣、体癣、股癣、手癣和花斑癣等；甲癣俗称“灰指(趾)甲”，以上疾病都是由真菌感染引起的，主要是白色念球菌、红毛癣菌和须毛癣菌。在我们生活的环境中和我们的皮肤上都有包括真菌在内的数百万计的微生物的存在，一旦天气转暖，有适于真菌生长的条件时，真菌便会乘虚而入，侵害我们的皮肤，引起皮肤癣病。据统计，世界上约有1/4的人受到皮肤癣病的困扰。皮肤癣病还会在人与人之间相互传染，甚至可以在同一人的不同身体部位间传染。目前对皮肤癣病的治疗药物是含酮康唑或克霉唑的软膏剂，属于化学合成类药物，长期使用导致致病真菌的耐药性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种微生物发酵生产抗真菌脂肽的菌种，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BI1，保藏号为CGMCCNo.3412。
本发明的另一个目的是公开了采用CGMCC No.3412菌种制备抗真菌脂肽的方法。
本发明还一个目的是公开了的采用CGMCC No.3412菌种发酵生产的抗真菌脂肽在抗真菌方面的应用。
本发明还一个目的是公开了采用CGMCC No.3412菌株制备的抗真菌脂肽提取物。
本发明还一个目的是公开了采用CGMCC No.3412菌株制备的抗真菌脂肽提取物制备的涂膜剂。
本发明还一个目的是公开了抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量的测定方法。为实现上述目的，本发明公开的技术内容如下：
一种抗真菌脂肽微生物发酵菌株，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏号为CGMCC No.3412。本发明提供的CGMCC No.3412菌株是一株能生产抗真菌脂肽的新菌株，用该菌株发酵糖质原料生产抗真菌脂肽。
抗真菌脂肽微生物发酵菌株，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏号为CGMCC No.3412，保藏日期2009年11月6日。保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌细胞为杆状，革兰染色均匀，且为阳性，产生芽孢。在肉汤培养基平板上菌落呈圆形或不规则状，表面褶皱，不透明，干燥，菌落呈浅黄色。在液体静止培养时有菌膜形成。
本发明所述采用CGMCC No.3412菌株制备的抗真菌脂肽提取物，其特征在于：
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：糖质原料5～50g，氮源2～20g，柠檬酸钠1～3g，MgSO4·7H200.1～0.2g，K2HPO42～6g，KH2PO43～9g，pH 7.0～7.2；
(2)发酵培养：按1％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。发酵液4℃，10000r/min离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心，20min得到沉淀，处理后得到抗真菌脂肽提取物。
本发明所述的提取物，其中糖质原料包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麸皮糖化液。
本发明所述的提取物，其中氮源原料包括：硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。
本发明公开了一种用于治疗真菌病的药物皮肤擦剂，该皮肤擦剂由抗真菌脂肽提取物以及药学上可接受的载体组成。其中的药物皮肤擦剂为外用皮肤擦剂、乳膏剂、涂膜剂或酊剂。
其中涂膜剂由下列成分组成：
抗真菌脂肽提取物50～150mg；药用乙醇5-15mL；羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆70～90mL；药用甘油5～15mL；其中的药用乙醇为无水乙醇。
软膏剂由下列成分组成：
单甘酯50～150g，硬脂酸50～150g，十八醇50～150g，液状石蜡50～70mL，丙三醇40～60mL，三乙醇胺6～10g，抗真菌脂肽0.5～1.5g，羟苯乙酯0.5～1.5g，蒸馏水400～650mL；
酊剂由下列成分组成：
抗真菌脂肽提取物500mg，无水乙醇100mL，药用甘油25～35mL，氮酮1～2mL，蒸馏水20～45mL。
本发明同时公开了述治疗真菌病涂膜剂的制备方法，其特征在于将抗真菌脂肽1g溶于100mL药用乙醇中，取该乙醇溶液5～15mL，加入到70～90mL羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆中，搅拌均匀，再加入药用甘油5～15mL，搅拌均匀即可；其中羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆的制备：在容器中加入100～200mL无菌蒸馏水，然后加入1～2g羧甲基纤维素钠和2～4g海藻酸钠，搅拌，加热至60℃～80℃，在转速为60～120rpm的条件下搅拌至羧甲基纤维素钠和海藻酸钠完全溶解，最后冷却至室温，得到羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆。
本发明也可以分步进行：即首先采用CGMCC No.3412菌株制备抗真菌脂肽，然后再制备抗真菌脂肽提取物同时测定抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽的含量，具体包括：
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：糖质原料5～50g，氮源2～20g，柠檬酸钠1～3g，MgSO4·7H200.1～0.2g，K2HPO42～6g，KH2PO43～9g，pH 7.0～7.2；
(2)发酵培养：按1％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。
(3)将进一步控制发酵液温度在4℃，10000r/min，离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心，20min得到沉淀，将沉淀刮下与适量的甲醇，充分抽提，蒸发去掉甲醇，得到的褐色油状固体即为抗真菌脂肽提取物。
本发明进一步公开了抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量的检测方法：
将1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL无水乙醇中，10000r/min离心20min弃去沉淀，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂质。利用Hydrosphere C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为含有0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈，流动相B为含有0.05％TFA的水溶液，流动相比例A∶B＝45∶55(体积比)；流速：0.5mL/min；检测波长：265nm；每次进量为10μL，测定抗真菌脂肽提取物中真菌脂肽的含量；测定结果表明抗真菌脂肽提取物中真菌脂肽纯度为85％-98％(w/v)。
本发明进一步还公开了抗真菌脂肽微生物发酵菌株在发酵生产抗真菌脂肽用于制备治疗皮肤癣病方面的应用。本发明更加详细的描述如下：
(1)微生物菌株的筛选与鉴定：
本发明中，建立了一个快速有效的筛选高产抗真菌脂肽菌株的方法，根据产抗真菌脂肽菌株的细胞产物特点，设计以白色念球菌为指示菌的YEPD平板，挑选抑菌圈直径大的菌株，即为产抗真菌脂肽较好的菌株。
本发明从从青贮秸秆饲料中取样，采用肉汤培养基30℃富集培养2-3次，再涂布于白色念球菌为指示菌的YEPD选择性平板，挑选抑菌圈直径大的菌株，经过对多个青贮秸秆饲料样品的大量菌株筛选工作，从分离出来的近数百株细菌中初步筛选出近30株具有抗白色念球菌的菌株，最后复筛得到抑菌圈直径达2cm以上，经15次传代后遗传稳定性好的菌株BI1菌株。
本发明筛选得到的能抑制白色念球菌的菌株BI1，经16S rDNA基因序列测定与以公布的枯草芽孢杆菌16S rDNA基因序列相似性达99.7％，BI1菌株能氧化葡萄糖产酸，需氧，V-P反应呈阳性，能还原硝酸盐和水解淀粉(表1)，BI1菌株的生理生化特征均与布坎南和吉本斯等(1984)编著的《伯杰细菌鉴定手册》第八版和东秀珠、蔡妙英(2001)编著的《常见细菌鉴定手册》中描述的枯草芽孢杆菌相同。认为属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)，芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BI1专利保存号：CGMCC3412。该菌细胞为杆状，革兰染色均匀，且为阳性，产生芽孢。在肉汤培养基平板上菌落呈圆形或不规则状，表面褶皱，不透明，干燥，菌落呈浅黄色。在液体静止培养时有菌膜形成。
表1芽孢杆菌BI1和标准枯草芽孢杆菌生理生化特征比较
| 实验项目 | BI1 | 枯草芽孢杆菌BacillusSubtilis | 实验项目 | BI1 | 枯草芽孢杆菌BacillusSubtilis |
| 酪素水解试验 | + | + | 柠檬酸盐利用实验 | + | + |
| NO3-转化为NO2- | + | + | VP反应试验 | + | + |
| 淀粉水解实验 | + | + | 厌氧洋菜中生长试验 | - | - |
| 木糖发酵 | + | + | 蔗糖发酵 | + | + |
| 乳糖发酵 | + | + | 阿拉伯糖发酵 | + | + |
| 棉子糖发酵 | + | + | 甘露糖发酵 | + | + |
| 麦芽糖发酵 | + | + | 山梨糖发酵 | - | - |
| 甘露醇发酵 | + | + | 半乳糖发酵 | - | - |
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性
本发明菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BI1的抑菌图谱见表2。
表2BI1的抑菌谱
芽孢杆菌BI1对丝状真菌均有拮抗作用，而对细菌及非丝状的酵母菌没有作用。表明BI1对丝状真菌有专一性的抑制作用。
(2)微生物菌株的培养与生产抗真菌脂肽的发酵：
肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.2～7.4；固体培养基需加20.0琼脂。
YEPD培养基(g/L)：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，葡萄糖20.0；固体培养基需加20.0琼脂。
斜面和种子培养基的组成：(g/L)：葡萄糖1～3，胰蛋白胨5～10，酵母浸出粉3～6，NaCl 6～12，去离子水配制，pH 7.2～7.5；固体培养基需加15g琼脂粉。
发酵培养基的组成(g/L)：糖质原料5～50g，氮源2～20g，柠檬酸钠1～3g，MgSO4·7H200.1～0.2g，K2HPO42～6g，KH2PO43～9g，pH 7.0～7.2。种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为113～121℃，20min。
将该菌株BI1自斜面接菌于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，30～40℃、140r/min摇床培养12～16h。按1％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。纯度为85％～98％(w/v)。
(3)抗真菌脂肽的提取：
将发酵液4℃，10000r/min离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心20min得到沉淀，将沉淀刮下与适量的甲醇，充分抽提，蒸发去掉甲醇，得到的褐色油状固体即为抗真菌脂肽提取物。
(4)抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽的含量测定：
将1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL无水乙醇中，10000r/min离心20min弃去沉淀，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂质。利用Hydrosphere C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为含有0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈，流动相B为含有0.05％TFA的水溶液，流动相比例A∶B＝45∶55(体积比)；流速：0.5mL/min；检测波长：265nm；每次进量为10μL，测定结果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽纯度为85％～98％(w/v)。
本发明用于发酵的糖质原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮糖化液。
本发明用于发酵的氮源可以是硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、大豆粉。
(5)含抗真菌脂肽的涂膜剂制备
羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆的制备：在容器中加入100～200mL无菌蒸馏水，然后加入1～2g羧甲基纤维素钠和2～4g海藻酸钠，放在磁力搅拌器中加热至60℃～80℃，在转速为60～120rpm的条件下搅拌至羧甲基纤维素钠和海藻酸钠完全溶解，最后冷却至室温，得到羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆。
配制成品：将抗真菌脂肽含量为85％～90％(w/v)的抗真菌脂肽提取物1g溶于100mL无水乙醇中，取该乙醇溶液5～15mL，加入到70～90mL羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆中，再加入药用甘油5～15mL，搅拌均匀即可。
本发明进一步公开了采用CGMCC No.3412菌种发酵生产的抗真菌脂肽在抗真菌方面的应用以及不同原料糖化液发酵产脂肽的情况。
1.将正常的白色念珠菌和经过BI1发酵提取的抗真菌脂肽处理的白色念珠菌，用原子力显微镜扫描成像，见图1和图2。由图1可以看出，未被处理的白色念珠菌表面非常光滑。而被脂肽处理过的白色念珠菌(见图2)，在原子力显微镜下观察，表面有明显的凹陷及穿孔。有研究表明，脂肽是作用于菌体细胞膜，使细胞膜的通透性改变而发挥抗菌活性的。因此推测，脂肽可能改变白色念珠菌细胞膜的通透性，使细胞内物质外泄，导致菌体死亡。
2.以裸皮小白鼠于皮肤表面接种白念球菌纯培养稀释液，连续接种三天，每天接种一次。观察裸皮小白鼠皮肤接种处表面出现红斑或鳞屑状损害，用含有本发明的真菌脂肽涂抹剂与2％克霉唑软膏作病例治疗对比试验，早中晚3次/天涂于患处皮肤。
2.将3g/L蔗糖、麦芽糖、果糖代替3g/L葡萄糖，接入培养好的枯草芽孢杆菌BI1种子，发酵60h，提取发酵液中抗真菌脂肽。结果如表3。
表3枯草芽孢杆菌以不同糖发酵产脂肽结果
| 葡萄糖 | 蔗糖 | 麦芽糖 | 果糖 | |
| 脂肽产量g/L | 2.04 | 1.87 | 1.84 | 1.91 |
3.将20g/L可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液、麸皮糖化液代替3g/L葡萄糖，接入培养好的枯草芽孢杆菌BI1种子，发酵60h，提取发酵液中抗真菌脂肽。结果如表4。
表4枯草芽孢杆菌以不同原料糖化液发酵产脂肽结果
| 葡萄糖 | 可溶性淀粉糖化液 | 玉米粉糖化液 | 麸皮糖化液 | |
| 脂肽产量g/L | 2.04 | 1.57 | 1.64 | 1.69 |
本发明公开的技术内容与现有技术相比所具有的积极效果表现在以下方面：
1、发现了一株产抗真菌脂肽的新菌枯草芽孢杆菌BI1，其代谢产物抗真菌脂肽只对丝状真菌有抗性，对细菌和乳酸菌没有抑菌活性，因此作为皮肤擦剂既可以杀灭致病真菌，又不破坏皮肤表面存在的益生细菌。
2、枯草芽孢杆菌BI1，其代谢产物抗真菌脂肽产量较高达到1-2g/L。
3、枯草芽孢杆菌BI1，发酵产抗真菌脂肽所需碳源和氮源较广泛，其中多数为农产品加工副产无，因此生产原料成本低。
4、抗真菌脂肽涂膜剂制备方法简单，无毒性。涂抹在皮肤上易成膜，附着力强，膜弹性好且不易脱落，能使药物长时间发生作用。
附图说明：
图1为正常的白色念珠菌表面形态；
图2经脂肽处理过的白色念珠菌形态。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述。
实施例1
(1)微生物菌株的培养与产抗真菌脂肽的发酵
斜面和种子培养基的组成：(g/L)：葡萄糖3，胰蛋白胨5，酵母浸出粉6，NaCl 6，去离子水配制，7.5；固体培养基需加15g琼脂粉。
发酵培养基的组成(g/L)：糖质原料(葡萄糖)5g，氮源(硝酸铵)15g，柠檬酸钠1g，MgSO4·7H200.5g，K2HPO42～6g，KH2PO45g，pH 7.0～7.2。种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115，20min。
(2)将该菌株BI1自斜面接菌于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，40℃、140r/min摇床培养16h。按2％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度40℃，发酵通气量为8m3/h，罐压0.05MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间60小时。酵过程通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液的pH在7，发酵液中抗真菌脂肽产量为1.5L。
(3)将进一步控制发酵液温度在4℃，10000r/min，离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心，20min得到沉淀，将沉淀刮下与适量的甲醇，充分抽提，蒸发去掉甲醇，得到的褐色油状固体即为抗真菌脂肽提取物。
(4)将1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL无水乙醇中，10000r/min离心20min弃去沉淀，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂质。利用Hydrosphere C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为含有0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈，流动相B为含有0.05％TFA的水溶液，流动相比例A∶B＝45∶55(体积比)；流速：0.5mL/min；检测波长：265nm；每次进量为10μL，测定结果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽纯度为89％(w/v)。
实施例2
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖5g，氮源硫酸铵2g，柠檬酸钠3g，MgSO4·7H200.2g，K2HPO42g，KH2PO43g，pH 7.0；
(2)发酵培养：按10％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30℃，发酵通气量为13m3/h，罐压0.03MPa，搅拌速度120转/分钟，发酵时间30h，发酵过程中通入无菌空气，用氨水维持发酵液pH在7.5，种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为121℃，20min。发酵液中抗真菌脂肽产量为1.5g/L。
(3)将进一步控制发酵液温度在4℃，10000r/min，离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心，20min得到沉淀，将沉淀刮下与适量的甲醇，充分抽提，蒸发去掉甲醇，得到的褐色油状固体即为抗真菌脂肽提取物。
(4)将1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL无水乙醇中，10000r/min离心20min弃去沉淀，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂质。利用Hydrosphere C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为含有0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈，流动相B为含有0.05％TFA的水溶液，流动相比例A∶B＝45∶55(体积比)；流速：0.5mL/min；检测波长：265nm；每次进量为10μL，测定结果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量为90％(w/v)。
实施例3
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：玉米粉糖化液3.5氮源蛋白胨15，檬酸钠1，MgSO4·7H200.8，K2HPO44，KH2PO46，pH 7.2。
(2)发酵培养：按2％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30℃，发酵通气量为8m3/h，罐压0.05Pa，搅拌速度150转/分钟，发酵时间60h，发酵过程中通入无菌空气，用氨水维持发酵液pH在7.2发酵液中抗真菌脂肽产量为1.4g/L。
(3)将进一步控制发酵液温度在4℃，10000r/min，离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心，20min得到沉淀，将沉淀刮下与适量的甲醇，充分抽提，蒸发去掉甲醇，得到的褐色油状固体即为抗真菌脂肽提取物。
(4)将1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL无水乙醇中，10000r/min离心20min弃去沉淀，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂质。利用Hydrosphere C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为含有0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈，流动相B为含有0.05％TFA的水溶液，流动相比例A∶B＝45∶55(体积比)；流速：0.5mL/min；检测波长：265nm；每次进量为10μL，测定结果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量为95％(w/v)。
实施例4
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为(g/L)：糖质原料(糖化液)40g，氮源(牛肉膏)20g，柠檬酸钠3g，MgSO4·7H20.1g，K2HPO45g，KH2PO47g，pH 7.2；
(2)发酵培养：按8％(v/v)的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度35℃，发酵通气量为9m3/h，罐压0.09MPa，搅拌速度100转/分钟，发酵时间40小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5～7.5，种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为125℃，20min，发酵液中抗真菌脂肽产量为2g/L。
(3)将进一步控制发酵液温度在4℃，10000r/min，离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心，20min得到沉淀，将沉淀刮下与适量的甲醇，充分抽提，蒸发去掉甲醇，得到的褐色油状固体即为抗真菌脂肽提取物。
(4)将1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL无水乙醇中，10000r/min离心20min弃去沉淀，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂质。利用Hydrosphere C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为含有0.05％三氟乙酸(TFA)的乙腈，流动相B为含有0.05％TFA的水溶液，流动相比例A∶B＝45∶55(体积比)；流速：0.5mL/min；检测波长：265nm；每次进量为10μL，测定结果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽纯度为90％(w/v)。
实施例5
治疗真菌病的涂膜剂成分组成：
抗真菌脂肽提取物150mg；
药用乙醇15mL；
羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆90mL；
药用甘油15mL；
其中的药用乙醇为无水乙醇。
制备方法，将抗真菌脂肽1g溶于100mL药用乙醇中，取该乙醇溶液15mL，加入到90mL羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆中，搅拌均匀，再加入药用甘油15mL，搅拌均匀即可；其中羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆的制备：在容器中加入100mL无菌蒸馏水，然后加入2g羧甲基纤维素钠和4g海藻酸钠，搅拌，加热至80℃，在转速为120rpm的条件下搅拌至羧甲基纤维素钠和海藻酸钠完全溶解，最后冷却至室温，得到羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆。
实施例6
治疗真菌病的涂膜剂成分组成：
抗真菌脂肽提取物50mg；
药用乙醇5mL；
羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆70mL；
药用甘油5mL；
其中的药用乙醇为无水乙醇。
制备方法，将抗真菌脂肽1g溶于100mL药用乙醇中，取该乙醇溶液10mL，加入到70mL羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆中，搅拌均匀，再加入药用甘油15mL，搅拌均匀即可；其中羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆的制备：在容器中加入150mL无菌蒸馏水，然后加入1g羧甲基纤维素钠和4g海藻酸钠，搅拌，加热至60℃，在转速为100rpm的条件下搅拌至羧甲基纤维素钠和海藻酸钠完全溶解，最后冷却至室温，得到羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆。
实施例7
含抗真菌脂肽的涂膜剂制备
CMC-Na和海藻酸钠胶浆的制备：在容器中加入100mL无菌蒸馏水，然后加入1gCMC-Na和4g海藻酸钠，放在磁力搅拌器中加热至60℃，在转速为120rpm的条件下搅拌至CMC-Na和海藻酸钠完全溶解，最后冷却至室温，得到CMC-Na和海藻酸钠胶浆。
配制成品：将抗真菌脂肽含量为90％(w/v)的抗真菌脂肽提取物1g溶于100mL无水乙醇中，取该乙醇溶液15mL，加入到70mL CMC-Na和海藻酸钠胶浆中，再加入药用甘油15mL，搅拌均匀即可。
实施例8
含抗真菌脂肽的软膏剂制备
软膏剂配方：单甘酯50g，硬脂酸150g，十八醇50g，液状石蜡70mL，丙三醇60mL，三乙醇胺6g，抗真菌脂肽1.5g，羟苯乙酯1.5g，蒸馏水400mL。
配制方法：
油相液：将硬脂酸、单甘酯、十八醇于水浴状态加热熔化，再加入液状石蜡，加热到85℃。
水相液：另将三乙醇胺、丙三醇与蒸馏水混匀然后加入抗真菌脂肽，加热至85℃。
在85℃热水浴条件下，将水相液缓缓加入到油相液中，边加入边搅拌，直至乳化完全，从水浴中拿出，放置冷却即得。
实施例9
含抗真菌脂肽的酊剂制备
抗真菌脂肽提取物500mg溶于100mL无水乙醇中，取该乙醇溶液30～45mL，再加入药用甘油35mL，氮酮2mL，蒸馏水45mL，搅拌均匀即可。
本发明在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。
Claims (9)
1.一种抗真菌脂肽微生物发酵菌株，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BI1，保藏号为CGMCC No.3412。
2.一种采用权利要求1所述菌株制备的抗真菌脂肽提取物，其特征在于：
(1)采用的发酵菌株为CGMCC No.3412，发酵培养基组成为：糖质原料5～50g/L，氮源2～20g/L，柠檬酸钠1～3g/L，MgSO4·7H200.1～0.2g/L，K2HPO4 2～6g/L，KH2PO4 3～9g/L，pH7.0～7.2；
(2)发酵培养：按1％-10％体积比的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30～40℃，发酵通气量为5～13m3/h，罐压0.02～0.09MPa，搅拌速度100-150转/分钟，发酵时间30～60小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水维持发酵液pH在6.5～7.5，发酵液中抗真菌脂肽产量为1～2g/L。发酵液4℃，10000r/min离心20min去菌体，得到的除菌发酵液用6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃静置过夜；次日，4℃，10000r/min离心20min得到沉淀，将沉淀刮下与适量的甲醇，充分抽提，蒸发去掉甲醇，得到的褐色油状固体即为抗真菌脂肽提取物。
3.权利要求2所述的提取物，其中糖质原料包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麸皮糖化液。
4.权利要求2所述的提取物，其中氮源原料包括：硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。
5.权利要求2所述抗真菌脂肽提取物在制备治疗皮肤癣病药物方面的应用。
6.一种用于治疗皮肤癣病的皮肤擦剂，该皮肤擦剂由权利要求2所述的抗真菌脂肽提取物以及药学上可接受的载体组成。
7.权利要求6所述的皮肤擦剂，为外用皮肤擦剂包括涂膜剂或酊剂。
8.权利要求7所述的皮肤擦剂，其中涂膜剂或酊剂分别由下列成分组成：
(1)涂膜剂由下列成分组成：
抗真菌脂肽提取物50～150mg；药用乙醇5-15mL；羧甲基纤维素钠和海藻酸钠胶浆70～90mL；药用甘油5～15mL；其中的药用乙醇为无水乙醇；
(2)酊剂由下列成分组成：
抗真菌脂肽提取物500mg，无水乙醇100mL，药用甘油25～35mL，氮酮1～2mL，蒸馏水20～45mL。
9.权利要求2所述抗真菌脂肽提取物含量的测定方法，其特征在于：将1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL无水乙醇中，10000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液用0.45μm的滤膜过滤除去杂质，用4.6mm×250mm Hydrosphere C18分析柱检测；其中流动相A为：含有0.05％三氟乙酸的乙腈，流动相B为：含有0.05％TFA的水溶液；流速0.5mL/min；检测波长265nm，每次进量为10μL，测定抗真菌脂肽提取物中真菌脂肽的含量；其中流动相比例A∶B的体积比＝45∶55。
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