CN101225370A - 具毒杀植物线虫活力的链霉菌的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株具毒杀植物线虫作用的链霉菌的培养方法及其代谢物制备方法和应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的链霉菌菌株Snea253为委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae，已于2008年1月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2348。该链霉菌菌株Snea253的分类地位是放线菌门，放线菌纲，放线菌目，链霉菌属，委内瑞拉链霉菌。通过液体发酵培养制备，其代谢产物对植物寄生线虫，特别是对大豆胞囊线虫、根结线虫和水稻干尖线虫具有很高毒力，杀线虫效果明显。该菌株的发酵液对大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)二龄幼虫具有较高的毒杀活性并显著抑制胞囊孵化，不同稀释浓度发酵液的处理和无菌水处理有显著差异，发酵原液的杀线虫效果可达到90％以上，温室防效试验效果明显。同时该菌株对根结线虫(Meloidogyne spp.)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)有显著的毒力作用，具良好的应用开发前景。
Description
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种毒杀植物寄生线虫的放线菌及其制备方法和应用。
背景技术：
植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物病原线虫学.北京：中国农业出版社，p1-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3％，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意(王寿华.果树线虫学.北京：中国农业科技出版社，1994.P.1-5)，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等。根结线虫是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后，一般减产10％左右，严重的高达75％以上，甚至绝收(A.G.Whitehead，1998.Plant Nematode Control.ISBN0851991882 CAB International)。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视(张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生物.3：55-66)，21世纪称为环保世纪，一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。
放线菌广泛分布在土壤中的优势微生物类群，是一类比其他微生物更为丰富的生物活性物质资源，大多数是离体腐生型微生物。在目前已经发现的数万种微生物来源的生物活性物质中，约有70％是由放线菌所合成的各种次生代谢产物，其中仅聚酮类就有一万种。放线菌中又以链霉菌产生的种类最多，占总数的52％。放线菌作为抗生素的重要产生菌，被用以筛选具有杀线虫活性的菌株，目前国际上广泛用于防治昆虫、螨类和线虫的阿维菌素(Avermectins)就是一种放线菌的代谢产物。Dicklow(1993)等从线虫的抑制性土壤中分离得到菌株CR-43能抑制秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的繁殖。温室试验表明：该菌对防治马铃薯和辣椒根部的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，草莓根部的短体线虫(Pratylenchus penetrans)，同时对草莓黑腐病具有较好的抑制作用。Jopseph(1995)鉴定CR-43是链霉菌的新种Streptomyces costaricanus。Chubachi等将6株链霉菌其发酵液经丙酮萃取后，能抑制南方根结线虫J2的活动性。在黄瓜温室防效试验中，6株菌均有利于根的伸长生长，增加根的鲜重；其中NA-494易于定殖，对黄瓜的防治效果显著。Tian等(2001)报道了S.violaceusniger能防治大豆胞囊线虫病和南方根结线虫病；Annette试验表明：S.lavendulaedui对南方根结线虫有一定毒杀活性。Deborah(2000)等人报道：放线菌S93和S63的发酵液在接种6周后，能显著减少紫花苜蓿抗病和感病品种根部短体线虫(P.penetrans)的虫口密度。Susan(2005)报道，链霉菌S99-60的发酵液在实验室测定能减少哈密瓜根结线虫卵孵化和J2的活动性。日本K.Otogur等人检测已知的抗生素对拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)的毒杀活性筛选到IC50低于10μg/mL的8种化合物，它们是粘菌素A(Colistin A)、多粘菌素B1(Polymyxin B1)、短杆菌肽S(Gramicidin S)、干蠕孢菌素(Siccanin)、星形孢菌素(Staurosporine)、世田霉素Setamycin)、抗霉素A(Antimycin A)和阿维菌素(Avermectin B1a)。抗霉素A9(Antimycin A9)是日本北里研究所从放线菌的发酵液中分离得到甲基酯类化合物，是人们第一次发现含有8-酰基芳香族结构的抗生素，具有很强的开发利用价值。
放线菌产生的次生代谢产物具有丰富的结构多样性，因此放线菌作为线虫的生防因子展现出巨大的发展前景。本发明正是基于上述理论，以植物寄生线虫为靶标，从放线菌代谢产物中寻找具有高效杀线虫活性物质，拟为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。
发明内容
本发明的目的是选择对大豆胞囊线虫具高杀虫活性的放线菌菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，从代谢产物中提取具杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫生物农药，其中，所述的植物线虫是大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)。
本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的放线菌菌株Snea253是委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae，已于2008年1月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2348。Snea253是从大量土壤放线菌菌株中筛选出的一株对大豆胞囊线虫具有良好杀线虫活性的链霉菌菌株。
本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的放线菌代谢物，其是由本发明的放线菌Snea253 Streptomyces venezuelae经过常规的液体发酵培养后提取制备的。本发明的放线菌菌株Snea253是通过试管斜面菌种培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：
1.试管斜面菌种培养
培养基配方为高氏合成一号琼脂(GA)培养基，即KNO3 1g；K2HPO4 0.5g；MgSO4 0.5g；NaCl 0.5g；FeSO4 0.01g；可溶性淀粉20g；琼脂17g；水1000mL；pH为7.2-7.4。
2.液体发酵培养
其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有黄豆饼粉15％、可溶性淀粉10％、葡萄糖20％、硫酸铵2.5％、K2HPO4 0.2％、CaCO3 1％、NaCl 4％，余下为水，pH为7.2。
将试管斜面菌种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min-1～200r·min-1、发酵240h。
本发明还涉及一种杀线虫制剂，其包含有效量的本发明所述的放线菌菌株Snea253或其代谢物作为有效活性成分。
本发明的放线菌菌株Snea253或其代谢物具有杀线虫活性物质，可用于植物寄生线虫的生物防治，特别是大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)。
具体实施方式：
为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。
首先对Snea253菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性试验，确定其对线虫的作用。
实施例1：菌株Snea253的培养
Snea253的单菌落接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为GA培养基，即KNO3 1g；K2HPO4 0.5g；MgSO4 0.5g；NaCl 0.5g；FeSO4 0.01g；可溶性淀粉20g；琼脂17g；水1000mL。28℃培养5d，获得试管斜面菌种。
再将试管斜面菌种接种到250mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，培养基配方为(重量百分比)：含有黄豆饼粉15％、可溶性淀粉10％、葡萄糖20％、硫酸铵2.5％、K2HPO4 0.2％、CaCO3 1％、NaCl 4％，余下为水，pH为7.2。25℃～28℃下，摇床转速以150r·min-1～200r·min-1、发酵240h。将发酵液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。
实施例2：菌株Snea253的杀线虫活性：
将发酵液原液的基础上依次稀释为1×、5×、10×、15×、20×、，分别对大豆胞囊线虫二龄幼虫、南方根结线虫进行杀线虫活性试验和大豆胞囊线虫胞囊孵化抑制试验。
1.制备试验用制剂
按前述液体发酵培养方法制备的放线菌菌株Snea253，用不同倍数的发酵液进行杀线虫活性试验。
2.制备试验用线虫
2.1大豆胞囊线虫卵和二龄幼虫的获得
大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)：大豆胞囊线虫3号生理小种采自沈阳农业大学北方线虫学研究所试验地繁殖保存，采用改良淘洗-过筛法从采取的土样中分离胞囊，在体视镜下用自制的玻璃挑针挑出新鲜饱满成熟的胞囊。胞囊在0.5％NaOCl溶液中消毒3min，无菌水反复冲洗3次后，在25℃、0.5mmol·L-1 ZnSO4·7H2O溶液中孵化二龄幼虫。每天及时更换处理液并收集新孵化出的二龄线虫。
2.2根结线虫和水稻干尖线虫二龄幼虫的获得
根结线虫(Meloidogyne spp.)：采自沈阳浑南地区受南方根结线虫侵染的番茄。将番茄根系取出，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在0.5％NaOCl中消毒3min、再用无菌水冲洗3次，放在内有少量无菌水的培养皿里，25℃恒温箱中培养，每隔24h收集一次新孵化的南方根结线虫J2。水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)：采自受水稻干尖线虫侵染严重的水稻稻粒。取发病严重的稻粒放在盛有无菌水的培养皿中，在25℃下，24h后用贝曼漏斗收集活的线虫。
3.试验方法：
3.1 Snea253代谢物对线虫的作用：在经灭菌的特制的贝氏小皿内中加入不同浓度的试验用发酵液各1mL，以加1mL无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入100μL线虫悬浮液(约含线虫100条)，放入25℃培养箱中，24h后记录线虫死亡率，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复3次。
3.2 Snea253代谢物对大豆胞囊线虫胞囊孵化的影响：
取新鲜饱满的胞囊，无菌水浸泡过夜，0.5％NaOCl表面消毒5min，无菌水冲洗3次，放入自制的孵化池。每个孵化池放10个胞囊，孵化池为2mL的Eppendorf管，上端为300mm绵纶筛网，盖紧中央中空的盖子，下端锯断，保留7-8mm。将孵化池置于灭菌的24孔细胞培养板中，向其加入无菌水作为对照，3次重复，25℃下孵化。9d后观察计数孵化出的J2数量。
3.3 Snea253的温室防效试验
将已萌发的大豆种子种到高温灭菌的沙及土中，出苗7天后每株大豆苗根际接种卵悬液2000粒。设置以下处理：2d后分别加入1×、5×、10×、15×、20×的菌液10mL，每个处理3次重复。以20μg/mL的阿维菌素作为药剂对照，清水作为空白对照。大豆胞囊线虫生长发育突破大豆根表后进行调查单株大豆根系胞囊着生量。
3.4计算方法
4试验结果
4.1 Snea253代谢物对大豆胞囊线虫的杀线虫效果
表1 Snea253发酵液不同稀释倍数对大豆胞囊线虫的杀线虫效果
| 处理 | 死亡率(％) | 药效(％) | |||
| 重复I | 重复II | 重复III | 平均 | ||
| 1×5×10×15×20×CK | 95.0080.0056.2541.6712.505.00 | 90.4881.8247.3733.3328.579.09 | 96.0073.6854.1737.509.090.00 | 93.83Aa78.50Bb52.60Cc37.50Dd16.72Ee4.07 | 93.5277.4250.2534.4212.62 |
结果表明，Snea253代谢物对大豆胞囊线虫具有良好的杀线虫活性，其5×液处理24h后，线虫的死亡率达77.42％，其1×液处理24h后，线虫的死亡率高达93.52％。
4.2 Snea253代谢物对大豆胞囊胞囊孵化的作用
结果表明，Snea253代谢物对大豆胞囊线虫胞囊孵化具有强烈的抑制作用，其15×液对胞囊的孵化抑制作用达53.37％，5×液对胞囊的孵化抑制作用达76.68％以上，1×液对胞囊的孵化抑制作用高达87.61％。
通过对两种线虫杀线虫和对胞囊孵化的抑制作用试验结果表明，Snea253是一株极具有应用价值的放线菌，特别是对大豆胞囊线虫的杀线虫作用和对其胞囊孵化的抑制作用，显示出其良好的应用开发前景。
表2 Snea253发酵液不同稀释倍数对大豆胞囊胞囊孵化的作用
| 处理 | 孵化出的线虫数(条) | 药效(％) | |||
| 重复I | 重复II | 重复III | 平均 | ||
| 1×5×10×15×20×CK | 9405290110201 | 26514988120160 | 33376178124188 | 22.67Dd42.67CDc54.00Cc85.33Bb118.00Aa183.00 | 87.6176.6870.4953.3735.52 |
4.3 Snea253代谢物对南方根结线虫和水稻干尖线虫的杀线虫效果
结果表明，Snea253代谢物对南方根结线虫2龄幼虫具有很强的杀线虫活性，其5×液处理24h后，线虫的死亡率达59.85％，其1×液处理24h后，线虫的死亡率高达86.50％。
表3 Snea253发酵液不同稀释倍数对南方根结线虫和水稻干尖线虫的杀线虫效果
| 处理 | 南方根结线虫 | 水稻干尖线虫 | ||
| 平均 | 药效(％) | 平均 | 药效(％) | |
| 1×5×10×15×20×CK | 86.50Aa59.85Bb28.53Cc11.97Cd10.75Cd0.00 | 86.5059.8528.5311.9710.75 | 67.37Aa52.08Ab51.78Ab30.36Bc12.60Cd2.34Cd | 66.5950.9350.6328.6910.50 |
4.4 Snea253代谢物对温室防效试验调查结果
试验结果表明：菌株Snea253代谢产生的杀线虫活性物质对大豆胞囊线虫具有一定的防治效果，但不同稀释倍数的防治效果有所不同。其中5×发酵液的防治效果最好，达到85.71％和阿维菌素相当。
表4 接种35天后调查结果
| 调查指标 | 处理 | ||||||
| 1× | 5× | 10× | 15× | 20× | CK1 | CK2(水) | |
| 胞囊数(个)防效(％) | 3.0078.57 | 2.0085.71 | 4.3369.05 | 6.6752.38 | 8.3340.48 | 1.6788.1 | 14 |
Claims (7)
1.一种具有杀线虫活性的放线菌，其特征在于：该菌株为Streptomyces venezuelae，已于2008年1月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2348。
2.一种防治植物寄生线虫的放线菌代谢物，其特征在于，是由权利要求1所述的放线菌经过常规的液体发酵提取制备的，液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有黄豆饼粉15％、可溶性淀粉10％、葡萄糖20％、硫酸铵2.5％、K2HPO4 0.2％、CaCO3 1％、NaCl 4％。
3.根据权利要求2所述的放线菌代谢物，其特征在于，pH为7.2～7.4。
4.权利要求1所述的具有杀线虫活性的放线菌的制备方法，包括生产菌株经过常规的液体发酵后制备杀线虫制剂，其特征在于：该放线菌的液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有黄豆饼粉15％、可溶性淀粉10％、葡萄糖20％、硫酸铵2.5％、K2HPO4 0.2％、CaCO31％、NaCl 4％。根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，pH为7.2。
5.一种杀线虫制剂，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的放线菌或权利要求2所述的放线菌代谢物作为活性成分。
6.权利要求1所述的放线菌或权利要求2所述的放线菌代谢物或权利要求4所述的杀线虫制剂在植物寄生线虫生物防治中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物寄生线虫为大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、根结线虫(Meloidogyne spp.)和水稻干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20100707 Termination date: 20210225 |