CN103421703B

CN103421703B - 反式乌头酸产生菌及应用

Info

Publication number: CN103421703B
Application number: CN201210390568.XA
Authority: CN
Inventors: 孙明; 曹诗云; 都萃颖; 聂相涛; 施祥雨; 彭东海; 阮丽芳
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2032-10-12
Also published as: CN103421703A

Abstract

本发明属于微生物生物技术领域，与生物农药领域相关。本发明从苏云金芽胞杆菌中筛选到两株反式乌头酸产生菌即：苏云金芽胞杆菌YBT-1501和YBT-1520，利用该两菌株发酵产物得到反式乌头酸粗纯品，通过生物测定，表明对南方根结线虫、大豆孢囊线虫和甘薯茎线虫具有毒杀活性，对棉铃虫和家蝇具有抑制生长的活性，本发明可开发为一种新型的生物杀虫农药，并对现有的防治策略提供一种新的防治途径。本发明分离筛选的苏云金芽胞杆菌YBT-1501已保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012236。

Description

反式乌头酸产生菌及应用

技术领域

本发明属于生物农药领域。具体涉及一种反式乌头酸（trans-aconitic acid，简称TAA）产生菌，该菌的发酵液对南方根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫有毒杀活性，对棉铃虫、家蝇有抑制生长的活性，可用于防治对农业生产危害巨大的植物病原线虫等农业害虫。

背景技术

线虫属于动物界线虫门(Nematode)，是一类两侧对称原体腔无脊椎动物。线虫种类繁多，在种类和数量上仅次于昆虫，大约有10%的线虫寄生在植物上，称为植物病原线虫(Plant-parasitic nematode,PPN)。植物病原线虫体形很小，虫体透明，通常只有在显微镜或解剖镜下才能看见。植物线虫是一类重要的病原生物，其中许多种是国际公认的毁灭性有害生物。植物病原线虫主要生活在土壤中或寄生于植物体内，危害隐蔽，防治比较困难。据估计，植物病原线虫造成全球主要农作物的年损失率约为12.3%，每年直接经济损失超过1000亿美元，在整个农业害虫造成的损失里几乎占到了一半。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种在土壤等自然环境中广泛存在的能形成芽胞的杆状细菌。苏云金芽胞杆菌能产生多种杀虫、抗病活性物质，如杀虫晶体蛋白、营养期杀虫蛋白、苏云金素、双效菌素、免疫抑制因子、辅助蛋白、自身诱导物抑制蛋白、溶血素等等。苏云金芽胞杆菌杀虫剂是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂，在生物杀虫剂中所占的市场份额超过90%，广泛应用于农业、林业、卫生和贮藏害虫的生物防治。此外，苏云金芽胞杆菌的杀虫基因也已成功用于许多转基因植物，如棉花、玉米、水稻、土豆等，由于其对害虫特异的防效，大大降低了传统化学农药的使用量，产生了巨大的经济、社会和生态效益。

苏云金芽胞杆菌对植物病原线虫的作用，最早报道于上世纪70年代。1972年Prasad等首先发现Bt产生的小分子化合物苏云金素对根结线虫(Root-knot nematode,RKN)的卵和幼虫有较高的毒杀活性。20世纪80年代中期Bone等首次证实了Bt伴胞晶体蛋白对线虫具有杀虫活性。随着研究的不断深入，Bt防治植物病原线虫的效果不断得到肯定。美国Mycogen公司筛选到多株对植物病原线虫有活性的Bt，并申请了多项专利。

由于抗线虫资源具有巨大的开发前景，国际上这方面的研究成果基本上都申请了专利，而公开发表的文献非常少，我们可利用的资源非常有限。我国目前在杀线虫资源的发掘方面取得的进展也非常的有限，因此加快防治植物病原线虫资源的发掘显得非常的迫切。

自上世纪90年代以来，本申请人所在农业微生物学国家重点实验室的课题组致力于筛选对植物病原线虫有较高毒力的Bt菌株，并寻找这些菌株产生的新型杀线虫活性物质，希望发现新的防治植物病原线虫的活性物质和活性菌株，为在农业生产上对植物病原线虫的防治提供新的资源。

发明内容

本发明的目的在于筛选获得一株能产反式乌头酸的微生物，该微生物是从苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)YBT-1501，和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520中筛选得到，其共同特征是这些细菌都能产生反式乌头酸。

申请人将上述反式乌头酸产生菌，即苏云金芽胞杆菌YBT-1501；Bacillus thuringiensis YBT-1501，于2012年6月19日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏编号为CCTCCNO：M2012236。

本发明还涉及另一株产反式乌头酸的产生菌苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520（中国发明专利号：95106749.4，中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M94067（参见：中国发明专利审定说明书，专利号：95106749.4；公开号：CN1118375，公开日：1996年3月13日）。

本发明对上述产反式乌头酸的微生物的活性进行了研究，结果显示不仅现有的反式乌头酸标准品对南方根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫有毒杀活性，对棉铃虫、家蝇有抑制生长的活性，而且从细菌例如本发明的苏云金芽胞杆菌YBT-1501和YBT-1520得到的发酵液中提取的反式乌头酸粗纯品对南方根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫同样具有毒杀活性，对棉铃虫、家蝇具有抑制其生长的活性。

由此可见，本发明筛选的反式乌头酸产生菌的发酵产物均可用于防治植物病原线虫、棉铃虫和家蝇。

附图说明

图1：YBT-1501产生的TAA的HPLC检测图谱。

图2：YBT-1520产生的TAA的HPLC检测图谱。

具体实施方式

以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1:反式乌头酸产生菌YBT-1501的分离筛选及鉴定

本实施例从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1501和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520得到两株反式乌头酸产生菌，具体筛选步骤如下所述：

1.苏云金芽胞杆菌YBT-1501的分离筛选

采用醋酸盐选择培养基（简称BPA培养基），从中国湖北省武汉市洪山区狮子山地区华中农业大学的土壤中分离，并用高效液相色谱（HPLC）进行TAA的检测，筛选获得本发明菌株。

筛选及分离培养基如下：

1）BPA培养基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，醋酸钠34g；补蒸馏水至1L，调pH值至7.2-7.4。

2）分离方法

称取上述所指的1g土壤样品于BPA培养基中，充分振荡后，置30℃摇床培养4h，取出于75-80℃水浴热处理10-15min，稍静置后，吸取0.5mL至于BPA平板（BPA平板按常规方法配制并添加2%琼脂）培养基上，涂布均匀，倒置于30℃培养箱中培养24h，挑选3-5个类似苏云金芽胞杆菌的菌落接种到BPA斜面（BPA斜面按照常规方法配制并添加2%琼脂）上，于30℃培养72h以上，用石碳酸复红染色镜检，将有伴胞晶体的分离体确定为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)（微生物的分离筛选、分类及鉴定方法参照：喻子牛，《苏云金芽胞杆菌》，科学出版社，1990年版）。

3）TAA的分离纯化及检测

挑取苏云金芽胞杆菌YBT-1501单菌落至含5ml LB液体培养基（成分：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，补蒸馏水至1000mL；调pH至7.0-7.2）的PA瓶中，于28℃，200r/min，振荡培养12h。按1/100(v/v)的接种量转接至50ml新鲜的LB液体培养基中，于28℃，200r/min发酵32h。取1mL菌液至1.5mL离心管，10000r/min离心2min。取100μL上清液至1.5mL离心管，加入900μL丙酮，使丙酮终浓度为90%，充分混匀，10000r/min离心6min，倒掉上清，保留沉淀，自然晾干。用150μL去离子水溶解沉淀，加100μL乙腈，使乙腈终浓度为40%，混匀，10000r/min离心6min。取200μL上清至另一1.5mL离心管，加入1mL乙腈，使乙腈终浓度为90%，混匀，10000r/min离心6min。倒掉上清，保留沉淀，自然晾干，该沉淀即为TAA粗纯品。将TAA粗纯品溶于流动相，利用常规的HPLC方法检测。

HPLC检测条件：

色谱柱：安捷伦TC-C18柱（规格25cm×4.6mm，5μm）；进样量：10μl；检测波长：260nm；流速：1ml/min；流动相：4.65g/L乙酸铵+10%甲醇，用乙酸调pH 3.5。

苏云金芽胞杆菌YBT-1501产生的TAA的HPLC检测图谱见附图1。本发明的生物测定及应用实验均以该得到的TAA粗纯品（简写为TAA-2）为实验材料，阳性对照为商购的TAA标准品（简写为TAA-1），阴性对照为去离子水（CK），实验方法见表1。

申请人将筛选获得的反式乌头酸产生菌，即苏云金芽胞杆菌YBT-1501；Bacillus thuringiensisYBT-1501，于2012年6月19日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2012236。

4）苏云金芽胞杆菌YBT-1501菌株的菌落及细胞形态

苏云金芽胞杆菌YBT-1501的菌体直杆状，营养体呈链状或单生，革兰氏染色阳性，芽胞呈椭圆状。在LB固体培养基上菌落形状为圆形，菌落呈凸透镜状隆起，边缘完整，白色至淡黄色的不透明菌落。菌落表面干燥呈蜡质状，生长温度10-45℃，最适生长温度26-32℃，适宜pH 6.8-7.4。

2.苏云金芽胞杆菌YBT-1520的分离筛选

本发明还涉及另一个产反式乌头酸的产生菌，即苏云金芽胞杆菌YBT-1520，该菌株在申请日前已经公开，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M94067。相关信息请参见中国发明专利审定说明书，专利号：95106749.4（公开号：CN1118375，公开日：1996年3月13日）。

上述苏云金芽胞杆菌YBT-1520产生的TAA的分离纯化及检测方法与如上所述的苏云金芽胞杆菌YBT-1501菌株的方法相同。苏云金芽胞杆菌YBT-1520产生的TAA的HPLC检测图谱见附图2。

注：以下实施例中用于生物测定的TAA样品有两种形式:

一种为TAA标准品（购自TCI公司，公司网址：www.tcichemicals.com/zh/cn），纯度为98%，记为TAA-1。另一种为按实施例1中的方法从苏云金芽胞杆菌YBT-1501发酵液中提取得到的TAA粗纯品，记为TAA-2。

实施例2:反式乌头酸（TAA）对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的生物测定

从中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学温室采集被南方根结线虫(Meloidogyne incognita)侵染的番茄植物的根，用无菌蒸馏水清洗番茄根，从根部取下上述根结线虫卵块放于冰上的培养皿中，无菌操作台中用1%H₂O₂和0.025%KI消毒2次，每次15min。把消毒的卵块转移到另一灭菌的培养皿中，然后用无菌蒸馏水洗4-5次，每次5min，加入20mL无菌蒸馏水，于25℃培养箱孵化3～5天。

孵化出的2龄南方根结线虫(Meloidogyne incognita)可用作生物测定的目标生物。在常用的96孔板上进行生物测定：每孔吸入大约40头2龄南方根结线虫(Meloidogyne incognita)幼虫，加入已知浓度的TAA（具体浓度见表1），空白处理加入等量的无菌去离子水，每孔总体积为200μl，用无菌去离子水补足至总体积，3天后统计死亡头数，实验结果见表1。

表1.TAA对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的生物测定

生测结果表明：TAA-1（标准品）和TAA-2（本发明制备的粗纯品）对南方根结线虫均具有很好的毒杀作用。

实施例3:反式乌头酸（TAA）对大豆孢囊线虫（Heterodera glycine Ichinohe）的生物测定

从大豆孢囊线虫（Heterodera glycine Ichinohe）发病较重的土壤中用漂浮法分离孢囊，将孢囊置于ZnSO₄溶液中浸泡24h，待大豆孢囊线虫幼虫在常温下孵化后，稀释至镜检每1ml悬浮液中约有200头左右2龄幼虫，备用。

孵化出的2龄大豆孢囊线虫（Heterodera glycine Ichinohe）用作生物测定的目标生物。在常用的24孔板上进行毒力的生物测定：每孔吸入大约200头2龄大豆孢囊线虫（Heterodera glycine Ichinohe）幼虫，加入已知浓度的TAA（具体浓度见表2），空白处理加入等量的无菌去离子水，每孔总体积为2ml，用无菌去离子水补足总体积，1天后统计死亡头数，实验结果见表2。

表2.TAA对大豆孢囊线虫（Heterodera glycine Ichinohe）的生物测定

生测结果表明：TAA-1（标准品）和TAA-2（本发明制备的粗纯品）对大豆孢囊线虫具有很好的毒杀作用。

实施例4:反式乌头酸（TAA）对甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）的生物测定

甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保存。在常用的24孔板上进行毒力的生物测定：每孔吸入大约50头甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor），加入已知浓度的TAA（具体浓度见表3），空白处理加入等量的无菌去离子水，每孔总体积为2ml，用无菌去离子水补足总体积，3天后统计死亡头数，实验结果见表3。

表3.TAA对甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）的生物测定

生测结果表明：TAA-1（标准品）和TAA-2（本发明制备的粗纯品）对甘薯茎线虫均具有很好的毒杀作用。

实施例5:反式乌头酸（TAA）对棉铃虫（Heliothis armigera）的生物测定

将制备好的人工饲料（配方：酵母粉12g、黄豆粉24g、维生素C 1.5g、苯甲酸钠0.42g、36％乙酸3.9ml、蒸馏水300ml，自然pH，即pH不作调整）倒入常用的24孔板，每孔加入量为1ml，凝固后备用。每孔饲料表面加入已知浓度的TAA0.1ml（具体浓度见表4），轻轻晃动使药液分布均匀。静置3小时待表面药液干燥，然后接入棉铃虫（Heliothis armigera）初孵幼虫，每孔接入1头。每个浓度和空白对照皆放48头虫，饲养至第10天，随机挑取20条测量总重，计算均重，最后算出生长抑制率。生长抑制率计算公式为：生长抑制率%=（CK组体重-实验组体重）/CK组体重，实验结果见表4。

表4.TAA对棉铃虫（Heliothis amigera）的生物测定

生测结果表明：TAA-1（标准品）和TAA-2（本发明制备的粗纯品）对棉铃虫幼虫的生长均具有很好的抑制作用。

实施例6:反式乌头酸（TAA）对家蝇（Musca domestica）的生物测定

取已知浓度的TAA 1ml（具体浓度见表5），加去离子水至25ml，再加入麦麸10g，搅拌均匀，空白处理不加TAA，直接用25ml去离子水，加入麦麸10g，搅拌均匀。分别接种同一天的家蝇（Musca domestica）卵50粒左右，置于常温黑暗条件下饲养，饲养至第7天，随机挑取20条测量总重，计算均重，最后算出生长抑制率。生长抑制率计算公式为：生长抑制率%=（CK组体重-实验组体重）/CK组体重，实验结果见表5。

表5.TAA对家蝇（Musca domestica）的生物测定

生测结果表明：TAA-1（标准品）和TAA-2（本发明制备的粗纯品）对家蝇幼虫的生长均具有一定的抑制作用。

主要参考文献

1、中国发明专利审定说明书，发明名称：苏云金芽胞杆菌高毒力菌株YBT-1520及发酵工艺与产品，专利号：95106749.4；公开号：CN1118375，公开日：1996年3月13日。

2、喻子牛，《苏云金芽胞杆菌》，科学出版社，1990年版。

Claims

1.一株反式乌头酸产生菌，其特征在于，该反式乌头酸产生菌为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1501，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012236。

2.如权利要求1所述的反式乌头酸产生菌，其特征还包括对南方根结线虫、大豆孢囊线虫和甘薯茎线虫具有毒杀活性，对家蝇具有抑制生长的活性。

3.权利要求1或2所述的反式乌头酸产生菌在防治南方根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫和家蝇中的应用。

4.一种反式乌头酸产生菌在制备防治南方根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫和家蝇的生物农药中的应用，其特征在于，所述的反式乌头酸产生菌为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1501，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012236。

5.一种利用反式乌头酸产生菌生产反式乌头酸的方法，其特征在于，将保藏编号为CCTCC NO：M2012236的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1501在LB培养基中培养，从获得的发酵培养物中分离出反式乌头酸；所述的LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，补蒸馏水至1000mL；调pH至7.0-7.2。