CN102206586A - 虫生真菌菌核的培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

针对分生孢子作为昆虫病原真菌杀虫剂的繁殖体存在的缺陷，本发明提供了一种液体培养虫生真菌菌核的技术，所述虫生真菌可以是蜡蚧轮枝菌。本发明所提供的虫生真菌菌核的液体培养方法，需要将液体培养成分和培养条件控制在一定的范围内。培养出的菌核经过真空干燥后，可以长期贮藏，在适宜的条件下仍然能萌发出菌丝和有致病力的分生孢子。该技术成本低，菌核贮藏期长，非常适合推广普及。

Description

虫生真菌菌核的培养方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及虫生真菌菌核的培养方法及其在防治害虫方面的应用。

背景技术

随着化学农药的大量使用导致环境污染和害虫抗药性等问题日益突出，生物防治越来越受到人们的重视。西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)(Thysanoptera：Thripidae)是世界性的多种经济作物上的一种重要害虫。西花蓟马通过锉吸取食和传播植物病毒对作物造成严重为害。西花蓟马的生活史包括地上取食阶段(成虫，1龄和2龄若虫)和土栖阶段(2龄若虫末期，预蛹和蛹)。大部分西花蓟马的老熟2龄若虫都表现出正趋地性和负趋光性，从植物上转移到土壤或盆栽介质中化蛹。依据寄主植物种类的不同，最多有98％的蓟马在地下化蛹，并分布在1.5～2.0cm深的土层中，直到发育为成虫后从土壤中羽化出来再转移到地上为害。此外，由于反复频繁地施用化学药剂，该虫已发展出对多种化学杀虫剂具抗性的种群。利用昆虫病原真菌防治害虫是生物防治的重要手段之一。蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)是地理分布和寄主范围极广的病原真菌，具有极大的生防潜力。在对害虫高致病力的虫生真菌菌株商品化过程中，通常是将分生孢子加工成各种剂型或者制成有保护性外壳的微胶囊等。然而，无论是通过改变培养条件来增强孢子的抗逆性，还是通过添加某种化合物使其稳定性增加等手段，都不能从根本上改变分生孢子易失活，货架期短这样一个现状。因此，在害虫生防的实际应用中，有必要发展和应用真菌分生孢子以外的其它发育阶段作为侵染源。

菌核(microsclerotia，MS)是由真菌菌丝聚集、绞缠而形成的坚硬的休眠结构，具有极端耐旱等特性。微菌核本身是没有侵染性的。但是经过复水后，能产生菌丝或萌发出对靶标寄主有侵染性的分生孢子。到目前为止，还没有蜡蚧轮枝菌在自然条件下或实验室内形成(微)菌核的任何报道。以昆虫病原真菌菌核防治西花蓟马等害虫，可以简化抗虫制剂的生产工艺，降低成本，并对环境没有污染，因此，具有广阔的应用前景。

发明内容

针对分生孢子作为昆虫病原真菌杀虫剂的繁殖体存在的缺陷，本发明提供了一种液体培养虫生真菌菌核的技术，所述虫生真菌优选为蜡蚧轮枝菌。本发明所提供的虫生真菌菌核的液体培养方法，需要将液体培养成分和培养条件控制在一定的范围内。培养出的菌核经过真空干燥后，可以长期贮藏，在适宜的条件下仍然能萌发出菌丝和有致病力的分生孢子，该技术成本低，菌核贮藏期长，非常适合推广普及。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种虫生真菌菌核的培养方法，其特征是包括以下步骤：1)一级平板菌种培养；2)液体种子培养；3)液体培养菌核；4)菌核的干燥。

所述虫生真菌包括任何昆虫病原真菌，优选为蜡蚧轮枝菌。

所述一级平板菌种培养是将分离纯化的菌种接种于PDA培养基平板上，待菌丝长满平板并产孢时，转入摇瓶培养。培养条件按照真菌常规标准进行，例如，可放入25℃培养箱，培养10-14天。

所述液体种子培养是在培养瓶中装入液体种子培养基，接入平板菌种，接种后于恒温摇床培养。培养条件为：温度22-28℃，摇床震荡频率150-300rpm，培养时间3-4天；优选为培养温度25℃，摇床震荡频率150rpm。

所述液体培养菌核是将步骤2中培养好的摇瓶种子接入液体培养基中培养。培养条件为：温度22-28℃，摇床震荡频率150-300rpm，培养时间3-4天；优选为培养温度25℃，摇床震荡频率300rpm。

所述菌核的干燥是将液体发酵好的产物抽真空过滤到滤纸上，将其放入抽真空干燥仪中干燥。条件为：温度22-25℃，干燥2小时后取出，测得含水量为2.5-7.5％，优选5.0％。

一级菌种培养所用培养基为微生物培养时常用的PDA培养基，其成分和含量均是公知的，可通过教科书或实验手册查得。

液体种子培养时所用的液体种子培养基组成包括玉米粉30-40g，酵母浸膏5-15g，KH₂PO₄2-6g，MgSO₄·7H₂O 0.4-0.8g，FeSO₄·7H₂O 12-16mg，ZnSO₄·7H₂O 12-16mg和1000ml水，优选玉米粉35g，酵母浸膏10g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄ 0.6g，FeSO₄ 14mg，ZnSO₄ 14mg和1000ml水。

液体培养菌核时所用的液体培养基组成包括葡萄5-10g、小于500μm的麦麸10-15g、KH₂PO₄ 2-6g，MgSO₄·7H₂O 0.4-0.8g，FeSO₄·7H₂O 12-16mg，ZnSO₄·7H₂O 12-16mg和1000ml水，优选7.5g葡萄糖、小于500μm的麦麸12.5g、KH₂PO₄ 4g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，FeSO₄·7H₂O 14mg，ZnSO₄·7H₂O 14mg和1000ml水。

本发明还涉及通过上述培养方法获得的虫生真菌菌核在制备防治害虫的生防制剂中的应用，所述虫生真菌优选蜡蚧轮枝菌，所述害虫优选西花蓟马。

本发明还进一步涉及一种防治害虫的生防制剂，其特征在于，包括：通过上述培养方法获得的虫生真菌菌核和辅料。所述虫生真菌菌核优选蜡蚧轮枝菌菌核，所述害虫优选西花蓟马；所述辅料是抗虫制剂制备领域常用的辅助试剂，本领域的技术人员完全可以根据制剂的类型选择相应的辅料类型。

本发明所用的真菌菌株和虫源，如蜡蚧轮枝菌和西花蓟马，均属于公知公用的实验材料，可通过常规的途径获得，如商业途径等。例如，实施例中所用的蜡蚧轮枝菌购自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。

本发明首次用液体深层发酵法能产生虫生真菌菌核。干燥制备的微菌核能够保持活力，复水后能够萌发出菌丝和孢子，增加了上述真菌作为西花蓟马土栖阶段防治因子的潜力。该生产过程工艺简单，成本低廉，生产过程中无污染性废料产生，十分环保。用该方法获得的虫生真菌防治西花蓟马等害虫，可以减少化学农药对植物和环境的污染，对人和动物没有伤害，因此，本发明具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1在摇床上液体深层培养时蜡蚧轮枝菌菌核的发育。

(A)48h内，菌丝密度增加；(B)72h时，菌丝开始聚集形成菌核；(C)92h时，菌核聚集更加紧密。

具体实施方式

本发明所用的真菌菌株和虫源，如蜡蚧轮枝菌和西花蓟马，均属于公知公用的实验材料，可通过常规的途径获得，如商业途径等。实施例中所用的蜡蚧轮枝菌购自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。

实施例1蜡蚧轮枝菌菌核的培养：

1.方法1：

1.1一级平板菌种培养

将分离纯化的菌种接种于PDA培养基平板上，放入25℃培养箱，培养10-14天，待菌丝长满平板并产孢时，转入摇瓶培养。

1.2液体种子培养

在1000ml三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，接入平板菌种，接种量为1000ml三角瓶接入1/8体积培养好的一级平板菌种，接种后置于恒温摇床，培养条件为25℃，150rpm，培养3-4天；

所用液体种子培养基组成：玉米粉35g，酵母浸骨10g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄·7H₂O 0.6g；FeSO₄·7H₂O 14mg，ZnSO₄·7H₂O 14mg和1000ml水。121℃高压灭菌15分钟，待冷却至室温后接种。

1.3液体培养菌核

在1000ml三角瓶中，装入200ml的液体培养基，将步骤2中培养好的100ul摇瓶种子接入培养，培养条件为温度25℃，摇床震荡频率为300rpm，培养时间为4天。

所用液体培养基组成：7.5g葡萄糖、小于500μm的麦麸10、12.5或15g三个梯度、KH₂PO₄，4g，MgSO₄·7H₂O，0.6g；FeSO₄·7H₂O 14mg，ZnSO₄·7H₂O，14mg 和1000ml水。121℃高压灭菌15分钟，待冷却至室温后接入液体种子。

1.4菌核的干燥

将液体发酵好的产物抽真空过滤到滤纸上，将其放入抽真空干燥仪中干燥，温度为室温(22-25℃)，干燥2小时后取出，测得含水量为5.0％。

结果：在液体菌核培养步骤中，所用液体培养基中小于500μm的麦麸用量分别存在三个梯度，上述不同梯度下菌核产量分别为2.9×10⁵，3.1×10⁵和33×10⁵个菌核/克菌。生产周期为4天。

2.方法2：

2.1一级平板菌种培养：与实施例1中所述方法相同。

2.2液体种子培养：与实施例1中所述方法相同。

2.3液体发酵培养：与实施例1中所述方法相同，不同的是摇床震荡频率为150rpm。

2.4菌核的干燥：方法与实施例1中所述方法相同。

结果：在液体菌核培养步骤中，所用液体培养基中小于500μm的麦麸用量分别存在三个梯度，上述不同梯度下菌核产量分别为2.8×10⁵，2.9×10⁵和3.1×10⁵个菌核/克菌。生产周期为4天。

3.菌核观察：蜡蚧轮枝菌液体种子接到培养液中后培养物的形成遵循这样一个模式(图1)：48h内，菌丝密度增加；72h时，菌丝开始聚集形成菌核；92h时，菌核聚集更加紧密。形成的蜡蚧轮枝菌微菌核大小不同，直径范围为50～300μm。

实施例2生测试验(生测效率的检测)：

西花蓟马的饲养：在0.5L的筒形玻璃容器中放入3～4根豆荚，将蓟马成虫转移到容器内产卵，容器放置在生长箱中，培养条件设置为温度26℃，相对湿度60％～70％，光周期为L∶D＝13∶11，产卵12h后去除成虫以确保幼虫龄期的一致。8d后收集2龄2d的幼虫(L2)备用。

将蛭石、粘壤土和营养土按2∶1∶1的比例混合。将MS-DE颗粒均匀加入到混配的土壤中，混合比率为100μg/100g土。将上述混合物装入塑料花盆中，并均匀喷洒无离子水，直到盆底有水份渗出为止。将花盆放入塑料托盘中，经常加水保持托盘中持续有水，并能被虹吸到塑料盆中。对照土壤同样处理，但不加入MS-DE颗粒。

菌核混合到土壤中7d(以充分产孢)后，用细毛刷将30头L2蓟马幼虫转移到一小段豆荚上(作为食物)，豆荚放到上述装盆土壤的表面。盆上扣透明的两端开放的圆筒形塑料容器，塑料容器上端罩有防蓟马尼龙纱(120目)。在塑料容器内壁上端加有一块黄色粘虫板以诱捕羽化的成虫。罩有塑料容器的塑料盆放在生长箱中培养，培养条件设置同上。每个处理重复次，整个实验重复2次，2次重复分别记为实验1和2。

接入L2幼虫4d后，蓟马成虫开始羽化，并粘到塑料容器内的粘虫板上，或者在土壤表面或者在塑料容器的内边，每天用放大镜观察成虫羽化，连续7d直到再也没有蓟马成虫出现。从土壤表面或塑料容器内边收集到的蛹和成虫都放到粘虫板上，连同诱到成虫的粘虫板一起放在衬有湿滤纸的培养皿中培养(25℃)以检测它们是否是被蜡蚧轮枝菌侵染致死。统计被真菌感染致死的僵虫和健康成虫。

统计分析：

用对照的土壤中羽化出的成虫数减去处理的土壤中得到的羽化成虫数，得到蓟马累积死亡数。所得的死亡率进行正弦转换。培养液中生物量，芽孢和MS产量，干燥的MS-DE颗粒的分生孢子产量以及蓟马死亡率的平均数均采用单一变量方差分析——最小显著差测验(SPSS 10.0，One-Way ANOVA：LSD tests)。

结果：用蜡蚧轮枝菌微菌核处理的土壤中西花蓟马土栖阶段的死亡率明显高于对照(表1)，表明蜡蚧轮枝菌微菌核具有杀虫的潜力。

表1用蜡蚧轮枝菌微菌核处理的土壤中西花蓟马土栖阶段的死亡率(平均数±标准误)

注：同行不同字母表示在0.05水平差异显著(p＜005)。

Claims (13)

1.一种虫生真菌菌核的培养方法，其特征是包括以下步骤：1)一级平板菌种培养；2)液体种子培养；3)液体培养菌核；4)菌核的干燥。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征是：所述虫生真菌为蜡蚧轮枝菌。

3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征是：所述一级平板菌种培养是将分离纯化的菌种接种于PDA培养基平板上，待菌丝长满平板并产孢时，转入摇瓶培养。

4.根据权利要求1-3之一所述的培养方法，其特征是：所述液体种子培养是在培养瓶中装入液体种子培养基，接入平板菌种，接种后于恒温摇床培养，培养条件为：温度22-28℃，摇床震荡频率150-300rpm，培养时间3-4天；优选为培养温度25℃，摇床震荡频率150rpm。

5.根据权利要求1-4所述的培养方法，基特征是：所述液体培养菌核是将步骤2中培养好的摇瓶种子接入液体培养基中培养，培养条件为：温度22-28℃，摇床震荡频率150-300rpm，培养时间3-4天；优选为培养温度25℃，摇床震荡频率300rpm。

6.根据权利要求1-5所述的培养方法，其特征是：步骤(2)中的液体种子培养基组成包括：玉米粉30-40g，酵母浸膏5-15g，KN₂PO₄ 2.6g，MgSO₄·7H₂O 0.4-0.8g，FeSO₄·7H₂O 12-16mg，ZnSO₄·7H₂O 12-16mg和1000ml水；优选为包括玉米粉35g，酵母浸膏10g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄·7H₂O0.6g，FeSO₄·7H₂O 14mg，ZnSO₄·7H₂O 14mg和1000ml水。

7.根据权利要求1-6所述的培养方法，其特征是：步骤(3)中的液体培养基组成包括5-10g葡萄糖，小于500μm的麦麸10-15g，KH₂PO₄ 2-6g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.8g，FeSO₄·7H₂O12-16mg，ZnSO₄·7H₂O 12-16mg和1000ml水；优选为包括7.5g葡萄糖，小于500μm的麦麸12.5g，KH₂PO₄，4g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，FeSO₄·7H₂O 14mg，ZnSO₄·7H₂O 14mg和1000ml水。

8.用上述权利要求1-7所述培养方法获得的虫生真菌菌核在制备防治害虫的生防制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，基特征是：所述虫生真菌为蜡蚧轮枝菌。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征是：所述害虫为西花蓟马。

11.一种防治害虫的生防制剂，其特征是，包括：通过上述权利要求1-7所述培养方法获得的虫生真菌菌核和辅料。

12.根据权利要求11所述的生防制剂，其特征是，所述虫生真菌菌核为蜡蚧轮枝菌菌核。

13.根据权利要求11或12所述的生防制剂，其特征是，所述害虫为西花蓟马。

Images