CN112725250A - 一株淡紫灰链霉菌2-1-2f-1及其抗生物质在蔬菜土传病害防治上的应用 - Google Patents

一株淡紫灰链霉菌2-1-2f-1及其抗生物质在蔬菜土传病害防治上的应用 Download PDF

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Abstract

一株淡紫灰链霉菌2‑1‑2F‑1及其抗生物质在蔬菜土传病害防治上的应用，保藏编号CGMCC No:19768，本发明的优点及效果：具有稳定的天然原料来源，菌株来源于土壤，筛选方法简单；发酵使用的培养基原料黄豆饼粉、葡萄糖等成本低；抗菌活性物质制备简单，操作方便；抗生物质对来自于自然界，绿色环保，防治蔬菜土传病害效果好。

Description

一株淡紫灰链霉菌2-1-2F-1及其抗生物质在蔬菜土传病害防 治上的应用
技术领域
本发明涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域，具体涉及一种新的淡紫灰链霉菌及其抗生活性物质的应用。
背景技术
随着产业结构调整与人们对新鲜蔬菜需求量的增大，设施蔬菜种植面积逐年增加，高肥、连作、多茬口种植为土壤中的植物病原菌积累和土传病害的暴发提供了可能，暴发性、毁灭性土传病害在各设施蔬菜产区时有发生。目前，对于设施蔬菜土传病害的防控主要依赖化学药剂。过频、过量的化学药剂施用，不仅造成了蔬菜品质的下降，还常引起食品安全事件和生态环境恶化，而病原菌抗药性的产生又进一步促使农药的大剂量施用。为提高蔬菜的产量与质量、维护生态环境与人类健康，使用生物农药替代化学农药进行植物病害防治成为了各国政府、人民、研究者和种植户的关注。
植物病害生物防治是利用有益微生物和微生物的代谢产物对农作物病害进行有效防治的技术与方法。近年来，随着国家和相关部门的重视，生物防治研究的深度和广度逐年增加，并取得了较好进展。目前生产上广泛应用的真菌有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁轮枝菌和菌根真菌，细菌主要有芽孢杆菌、假单胞菌，放线菌则主要为链霉菌。
蔬菜的土传病害主要有枯萎病、黄萎病、疫病、根结线虫病等，特别是枯萎病已成为葫芦科和茄科蔬菜生产上最重要的病害，这两种病害多在蔬菜的花期开始发生，随着蔬菜的坐果与果实膨大，病害逐渐加重，影响果实的产量和品质，严重的造成绝收。这两种病害的病原菌均是通过根部或茎基部伤口侵入寄主，并在寄主维管束中生长繁殖，阻塞导管，影响其水分运输，引起植株系统发病。而且这两种病害在田间常同时发生，且症状相似，较难辨别。目前生产上已有的防治枯、黄萎病的生防菌剂均为芽孢杆菌制剂，还未有放线菌剂登记。放线菌的代谢产物也仅有吸水刺孢链霉菌产生的嘧啶核苷类抗菌素被用于蔬菜枯、黄萎病的防控。但因不同作物的病原菌对药剂的敏感性不一，生产上对蔬菜土传病害的防控效果并不理想。
解决该问题的途径为：以设施蔬菜土传病害病原菌为靶标，筛选、鉴定对蔬菜土传病害，特别是枯、黄萎病病原菌均具有强拮抗作用的生防菌，并在田间加以应用。
为筛选对蔬菜枯萎病菌和黄萎病菌具强拮抗作用的放线菌，本发明采用平板对峙法和生长速率法从设施蔬菜根际土、大田作物土和林木根际土中分离纯化得500多株放线菌分离物，筛选出一株对蔬菜枯萎病菌和黄萎病菌及多种植物病原真菌具强拮抗作用的淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)2-1-2F-1，该菌发酵液与抗生物质对番茄和黄瓜枯萎病均有很好的防治效果。
发明内容
本发明的目的是提供一株拮抗性能好的生防微生物菌株，针对防治病害化学药剂使用量大、次数多、容易引起抗药性和农药残留问题，应减少化学药剂的使用，增强生物防治措施。
实现上述本发明目的的具体技术方案如下：
一株拮抗黄瓜和番茄枯萎病菌的淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)2-1-2F-1(以下简称2-1-2F-1菌株)，已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期是2020年05月06日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为：CGMCC No.19768。
本发明从全国大田作物田土、林下土、蔬菜田土和果园土中分离获得的500株放线菌中筛选出的8株对黄瓜和番茄枯萎病菌有强拮抗作用的放线菌，2-1-2F-1菌株拮抗作用最强。研究表明，2-1-2F-1菌株具有较强的拮抗黄瓜枯萎病和番茄枯萎病病原真菌的能力，对其它病菌如辣椒疫病菌、棉花枯萎病菌、茭白胡麻叶斑病菌、草莓灰霉病菌、葡萄炭疽病菌、小麦赤霉病菌、水稻恶苗病菌和猕猴桃溃疡病菌等也有较好的拮抗作用。2-1-2F-1菌株具有良好的传代抑菌稳定性。
2-1-2F-1菌株具有以下特征：
①菌落形态
在高氏一号固体培养基上生长良好，气生菌丝与基内菌丝均生长丰富，菌落呈圆形，为同心圆环，菌丝呈粉状，边缘菌丝放射状，多分枝。随着孢子丝和孢子的分化与成熟，气生菌丝由白色逐渐变为淡紫灰色，基内菌丝初期白色，后期逐渐变为乳黄色，不产生可溶性色素。
②孢子形态
孢子丝直形与螺旋形并存，多直线形孢子丝；有的孢子丝顶端卷曲至大螺旋状，具有长柄；孢子表面光滑，圆形至椭圆形，呈串珠状，大小为1.2～4.7×0.6～1.2μm。
③生理生化
2-1-2F-1菌株能液化明胶，能产生淀粉酶、凝乳酶、蛋白酶和纤维素水解酶，不产生硫化氢，在含有5％NaCl的培养基上正常生长，能利用葡萄糖、果糖、肌醇、鼠李糖、阿拉伯糖，不能利用蔗糖、木糖、甘露醇、棉子糖。
④2-1-2F-1菌株的16S rDNA序列淡紫灰链霉菌(GenBank登录号：KC752433.1的16S rDNA序列同源性达100％，序列覆盖率100％。
通过2-1-2F-1菌株菌落特征、菌丝与孢子特征、生理生化特性及16SrDNA序列同源性分析结果，确定其为淡紫灰链霉菌(S.lavendulae)。
本发明还有一个目的是提供菌株2-1-2F-1的发酵菌液，由下列方法制备而成：将于高氏一号培养液中培养2d的种子液200μL均匀展布于高氏一号培养基平板表面，28℃培养5d后，取5块直径6mm的菌饼，用无菌玻棒碾碎，接入100mL发酵培养基中(每升发酵培养基中，黄豆饼粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨3.0g，NaCl2.5g，CaCO32.0g，pH 7.0)30℃，180r/min摇瓶培养5d，即得发酵菌液。
本发明还有一个目的是提供2-1-2F-1菌株的抗生物质，由下列方法制备而成：将收集的发酵液于室温5000r/min离心20min，取上清，加入4倍体积丙酮，颠倒混匀，-20℃过夜。4℃条件下5000r/min离心30min，去上清，沉淀即为抗菌活性物质。
本发明所述2-1-2F-1菌株产生的抗菌活性物质经成分分析、全波长扫描与核磁共振分析显示，抗性物质可能为含酰胺键的糖类小分子物质。
本发明所述2-1-2F-1菌株在土壤和蔬菜根际有很好的定植能力。
本发明所述2-1-2F-1菌株对黄瓜有很好的促生长和抗性诱导作用。
本发明还有一个目的是提供淡紫灰链霉菌2-1-2F-1菌株发酵液在蔬菜土传病害防治中的应用，尤其是在防治黄瓜枯萎病中的应用。
本发明还有一个目的是提供淡紫灰链霉菌2-1-2F-1菌株抗生物质在蔬菜土传病害防治中的应用，尤其是在防治黄瓜枯萎病中的应用。
本发明还有一个目的是提供淡紫灰链霉菌2-1-2F-1菌株发酵液及其抗生物质在防治其它农作物病害中的应用。
本发明的优点及效果：具有稳定的天然原料来源，菌株来源于土壤，筛选方法简单；发酵使用的培养基原料黄豆饼粉、葡萄糖等成本低；抗菌活性物质制备简单，操作方便；抗生物质对来自于自然界，绿色环保，防治蔬菜土传病害效果好。
附图说明
图1为本发明2-1-2F-1菌株对几种植物病原菌的抑制作用图；
图2为本发明2-1-2F-1菌株的形态图；
图3为本发明2-1-2F-1菌株的遗传发育分析；
图4为本发明2-1-2F-1菌株抗生物质的溶解性；
图5为本发明2-1-2F-1菌株的抗生物质抑菌活性；
图6为本发明2-1-2F-1菌株的抗生物质抑菌活性稳定性；
图7为本发明2-1-2F-1菌株的抗生物质的全波长扫描与核磁共振谱图；
图8为本发明2-1-2F-1菌株在黄瓜植株与土壤中的定殖效果图；
图9为本发明2-1-2F-1菌株对黄瓜的促生长与抗性诱导作用图；
图10为本发明2-1-2F-1菌株对黄瓜枯萎病的田间防治图。
具体实施方式
实施例1：对黄瓜和番茄枯萎病菌具强拮抗活性的放线菌的分离。
随机采集江苏各地土壤样本，采样方法为铲去表层5cm土层，取新鲜土样50g，用保鲜袋保存，并记录取样地点和日期；
取0.5g土样加水1mL，振荡制成土壤悬浮液，梯度稀释103～105倍，各取100μl稀释液涂板，28℃培养箱中培养48h；
挑取单菌落于高氏一号培养基上划线培养、纯化后保存备用；
以黄瓜和番茄枯萎病菌为靶标菌，采用对峙培养法测定分离菌株的拮抗性，24℃培养4～5d，测定抑菌带宽。结果表明，菌株2-1-2F-1对黄瓜和番茄枯萎病菌均有较强的抑制作用；抑菌谱测定发现，除对黄瓜和番茄枯萎病菌外，2-1-2F-1对辣椒疫病菌、棉花枯萎病菌、茭白胡麻叶斑病菌、草莓灰霉病菌、葡萄炭疽病菌、小麦赤霉病菌、水稻恶苗病菌和猕猴桃溃疡病菌亦有较好的抑制效果(图1)。
实施例2：菌株2-1-2F-1的分类鉴定
(1)菌株2-1-2F-1的形态特征
菌株2-1-2F-1在高氏一号固体培养基上生长良好，气生菌丝与基内菌丝均生长丰富(图2中A)，菌落呈圆形，为同心圆环，菌丝呈粉状，边缘菌丝放射状，多分枝，随着孢子丝和孢子的分化与成熟，气生菌丝由白色逐渐变为淡紫灰色(图2中B)，基内菌丝初期白色，后期逐渐变为乳黄色，不产生可溶性色素(图2中C)。菌株2-1-2F-1在光学显微镜下观察发现，孢子丝直形与螺旋形并存，多直线形孢子丝，有的孢子丝顶端卷曲至大螺旋状，具有长柄(图2中D-E)；孢子表面光滑，圆形至椭圆形，呈串珠状，大小为1.2～4.7×0.6～1.2μm(图2中F)。
(2)菌株2-1-2F-1的培养性状
菌株2-1-2F-1在9种不同培养基上气生菌丝呈白色至紫灰色，基内菌丝多数乳黄色，在马铃薯块上呈黑褐色。除在马铃薯块培养基上能产生黑褐色的可溶性色素外，在其它培养基上均不产生可溶性色素。菌株2-1-2F-1在不同培养基上菌落形态差异大，在马铃薯葡萄糖琼脂、淀粉铵琼脂、燕麦琼脂、葡萄糖天门冬素琼脂和葡萄糖天门冬素琼脂培养基上菌丝呈辐射状，有同心圆；在葡萄糖天门冬素琼脂和蔗糖察氏琼脂培养基上呈辐射状，无同心圆；在葡萄糖酵母膏和淀粉琼脂培养基上菌丝生长密集，辐射状不明显
(3)菌株2-1-2F-1的生理生化特征
菌株2-1-2F-1能液化明胶，具有产生蛋白酶、淀粉酶、凝乳酶、纤维素的能力，不产生硫化氢，能在含有5％NaCl的培养基上正常生长，能利用葡萄糖、果糖、肌醇、鼠李糖、阿拉伯糖，不能利用蔗糖、木糖、甘露醇、棉子糖。
(4)菌株2-1-2F-1的遗传学鉴定
用通用引物27F/1492R扩增菌株2-1-2F-1的16S rDNA，并经克隆测序后进行序列分析，发现其与淡紫灰链霉菌(GenBank登录号：KC752433.1)的16S rDNA序列覆盖率和同源性均为100％(图3)。依据《链霉菌鉴定手册》中对链霉菌的描述，结合菌株2-1-2F-1形态特征、培养特征、生理生化特征以及16Sr DNA序列，将菌株2-1-2F-1鉴定为淡紫灰链霉菌(S.lavendulae)。
实施例3：菌株2-1-2F-1产生的抗生活性物质的性质与组分分析
菌株2-1-2F-1于4号发酵液、30℃、180r/min条件下发酵5d后，5000r/min离心20min，取上清，并向上清中加入4倍体积-20℃预冷的丙酮，颠倒混匀，过夜。4℃条件下5000r/min离心30min，去上清，0℃条件下通风晾干。分别用不同极性有机溶剂进行复溶，发现抗生物质除微溶于二甲亚砜外，不溶于乙腈、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚等有机溶剂，但可完全溶解于水(图4)。用原体积1/100的PBS溶解抗生物质，对峙培养法测定抗生活性物质的抑菌能力发现，沉淀物还原至原浓度后抑菌活性(图5中C)与发酵滤液(图5中B)相当，将沉淀溶解物浓缩5倍和50倍后，抑菌活性可分别提高38％(图5中D)和140％(图5中E)，以空白培养液丙酮提取物作对照(图5中A)。抗生物质有很好的稳定性，经高温、氯仿、蛋白酶和强酸强碱处理后，其抑菌活性不变(图6)。油红-O反应和双缩脲反应呈阴性，班氏试剂反应呈弱阳性，说明其不含脂类与蛋白质，但含有糖或还原性醛基。全波长扫描显示，活性物质的最大吸收波长为222nm，且其紫外特征光谱与酷氨酸和色氨酸残基叠加的峰图相似(图7中A)，但核磁共振谱并未发现有某些化学物质的特征峰(图7中B)。据以上结果，可以初步判断菌株2-1-2F-1产生的抗生物质可能是含有酰胺键的糖类小分子物质。
实施例4：菌株2-1-2F-1在黄瓜植株及其根际的定殖能力
使用氨苄青霉素(Amp)对菌株2-1-2F-1进行抗性标记(Amp浓度100μg/mL)。将50mL标记的2-1-2F-1菌株发酵液(2×107cfu/mL)灌根接种于黄瓜根部，每7d取样测定黄瓜根区、根际和根表的放线菌量。以浓度为2×107cfu/mL的放线菌2-1-2F-1的孢子悬浮液喷施黄瓜叶片正面与背面，直至叶表完全湿润，每7d取样测定叶表的放线菌量。结果表明，放线菌2-1-2F-1菌株在黄瓜根区、根际和根表均有很强的定殖能力，在初始菌量107cfu/g土壤的基础上，处理后28d活菌数仍达106cfu/g土壤；但在黄瓜叶片表达的定殖能力相对较弱，在初始菌量近105cfu/g黄瓜叶片的基础上，21d后已检测不到放线菌2-1-2F-1的活菌(图8)。
实施例5：菌株2-1-2F-1对黄瓜的促生长和抗性诱导作用
使用50mL菌株2-1-2F-1发酵液灌根施于2叶1心期黄瓜根部，分别于接种后0、1、3、5、7d取样，测定黄瓜体内防御酶活性；于接种后14d取样，测定黄瓜形态与物质积累量相关指标。结果表明，菌株2-1-2F-1能显著提高黄瓜植株的株高、茎粗、叶片数、总叶面积、地上部分鲜重和干重，也能增加黄瓜光合色素的积累，促进光合作用(表1)。放线菌液灌根后，黄瓜体内防御酶活性快速上升，在1～7d内均显著高于对照(图9)。
表1菌株2-1-2F-1对黄瓜的促生作用
Figure BDA0002969806100000061
实施例6：菌株2-1-2F-1对黄瓜枯萎病的盆栽防治试验
采用活体接种方法，处理分为预防处理和治疗处理，以只接枯萎病菌的黄瓜作对照。接种前用无菌刀片在黄瓜茎1～2cm处插入土壤约2cm做伤根处理，每株黄瓜根部灌根为黄瓜枯萎病菌1×106cfu/mL孢子液10mL，放线菌2-1-2F-1菌株发酵液5mL，接种后14d调查病级，并计算死苗率、病情指数和防效。结果表明，预防和治疗处理均对黄瓜枯萎病有一定防效，且以预防效果较好，相对防效可达48.98％，治疗处理相对防效则为34.01％(表2，图10)。
表2菌株2-1-2F-1对黄瓜枯萎病的防治效果
处理 死苗率/％ 病情指数 防效/％
黄瓜枯萎病菌 25.00 51.04 -
治疗 4.17 33.68 34.01
预防 4.17 26.04 48.98

Claims (7)

1.淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）2-1-2F-1,已于2020年05月06日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号:CGMCC No. 19768。
2.权利要求1所述淡紫灰链霉菌2-1-2F-1的发酵菌液，其特征在于，由下列方法制备而成：将于高氏一号培养液中培养2 d的种子液200 μL均匀展布于高氏一号培养基平板表面，28℃培养5 d后，取5块直径6 mm的菌饼，用无菌玻棒碾碎，接入100 mL发酵培养基中，30℃，180 r/min摇瓶培养5 d，即得发酵液；
所述的发酵培养基每升含黄豆饼粉10 g，葡萄糖10 g，蛋白胨3.0 g，氯化钠2.5 g，碳酸钙2.0 g，pH 7.0。
3.权利要求1所述淡紫灰链霉菌2-1-2F-1的抗菌活性物质，其特征在于，由下列方法制备而成：将收集的发酵液于室温5000 r/min离心20 min，取上清，加入4倍体积丙酮，颠倒混匀，-20℃过夜，4℃条件下5000 r/min离心30 min，去上清，沉淀即为抗菌活性物质。
4.权利要求2所述淡紫灰链霉菌2-1-2F-1的发酵菌液在蔬菜土传病害防治中的应用。
5.权利要求3所述淡紫灰链霉菌2-1-2F-1的抗菌活性物质在蔬菜土传病害防治中的应用。
6.权利要求2所述淡紫灰链霉菌2-1-2F-1的发酵菌液在农作物病害防治中的应用。
7.权利要求3所述淡紫灰链霉菌2-1-2F-1的抗菌活性物质在农作物病害防治中的应用。
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