CN108315286B - 一种短杆菌、应用及其发酵液的制备方法 - Google Patents

一种短杆菌、应用及其发酵液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短杆菌、应用及其发酵液的制备方法，所述短杆菌为抗烟草黑胫病病菌的拮抗菌株，该短杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:M 2018003。通过本发明提供的所述短杆菌，能有效拮抗烟草黑胫病病菌，进而达到防治烟草黑胫病的作用。

Description

一种短杆菌、应用及其发酵液的制备方法
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种短杆菌、应用及其发酵液的制备方法。
背景技术
我国烟区辽阔，自然条件迥异，烟草本身可塑性强，容易受环境影响而变异，经过人们长期的栽培和选择，形成了各具特色的众多品种，加之不断地从国外引进新品种，形成了类型俱全、数量丰富的烟草资源。虫害和病害是影响烟草农艺性状和经济性状的威胁因子，如烟草黑胫病(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)，分布面积广，危害严重。烟草黑胫病是由烟草疫霉菌引起，有关调查统计显示，烟草黑胫病发病率为5％～12％，发病严重的地区最高可达75％；我国每年烟草黑胫病平均发病面积约为10万hm2，产量损失高达3000万kg，产值损失超过1.23亿元人民币。传统的化学防治方法对抗黑胫病的效果不佳，并且连年使用化学药剂，不仅使黑胫病病菌的抗药性有所增强，而且对环境造成巨大污染。
因此，有必要提供一种生物防治烟草黑胫病病菌的方法。
申请内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种短杆菌、应用及其发酵液的制备方法，以解决现有烟草黑胫病采用化学药剂防治，致使污染环境的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：提供一种短杆菌，所述短杆菌为抗烟草黑胫病病菌的拮抗菌株，该短杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2018003。
优选地，所述短杆菌的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种如前述的短杆菌在防治烟草黑胫病上的应用。
本发明还提供了一种短杆菌发酵液的制备方法：
步骤一，挑取如前述的短杆菌的单菌落于装有15ml LB液体培养基的三角瓶中，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养24h～48h，制备得到所述短杆菌发酵液；
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的所述短杆菌能有效抑制烟草黑胫病病菌的生长，并在一定时间段内，持续具有显著的抑制作用，为防治烟草黑胫病病菌提供了新的选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的拮抗菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图；
图2为本发明提供的拮抗菌株的形态图；
图3为本发明提供的拮抗菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明提供的短杆菌在PDA固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图；
图5为本发明提供的短杆菌在NB固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
为描述方便，以下将本发明提供的拮抗菌株命名为L113。本领域技术人员可以理解的是，以下实施例中的L113与所述拮抗菌株为同一菌株。
本发明提供一种拮抗烟草黑胫病病菌的微生物菌株的筛选方法，具体包括以下步骤：
分离纯化：称取多年施用于烟草田间的饼肥5g于50ml离心管中，加入15ml无菌水中，用震荡器充分震荡，2000rpm离心2min，取菌悬液10μl，加入无菌水，依次稀释成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分别涂布于LB(Luria-Bertani)固体培养基和PDA固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，倒置放置于30℃下培养，待其长出微生物，对平板上长出的单菌落进行划线分离纯化，得到待选菌株，加甘油，于-80℃保存；
拮抗实验：将烟草黑胫病病菌加入PDA培养基中进行活化，待长出菌丝后，用打孔器打一菌饼置于另一新鲜的PDA固体培养基平板中央，倒置放置于30℃下继续培养。将分离出的所述待选菌株接种于菌饼周围，每个平板接种4个，30℃恒温下培养，根据有无抑菌带和/或抑菌圈的大小来判断其拮抗效果；
二次拮抗实验：参照前述拮抗实验，对具有拮抗作用的待选菌株进行第二次拮抗实验，筛选出一株拮抗能力较强的菌株，命名为L113。
本发明采用以下方法对L113进行鉴定。
请参阅图1，图1为本发明提供的拮抗菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图。具体为将L113接种于LB固体培养基上，进行划线培养，倒置于30℃条件下，培养14～16小时。由图1可看出，L113的菌落呈圆形，平坦光滑，产生黄色色素，不透明，边缘整齐。请参阅图2，图2为本发明提供的拮抗菌株的形态图。
对L113进行分子实验鉴定。
挑取一个单菌落，放入预先装有10μL无菌水的PCR管中，枪头吸打混匀，作为PCR所用的菌液模板。参照以下扩增体系进行PCR扩增。
其中2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)购至北京全式金生物技术有限公司，其中预含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液、电泳缓冲液等PCR扩增所需的常用试剂，本领域技术人员可根据需要直接选择其他PCR扩增试剂盒，或是根据需要自行采用独立的DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液进行PCR扩增。本实施例中，上下游引物采用27F和1492R，上下游引物的具体序列为：
27F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
1492R：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。
扩增条件为：
98℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，重复30个循环；72℃10min。
请参阅图3，图3为本发明提供的拮抗菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。经过PCR扩增得到的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，在1500bp附近有明显的条带。对扩增产物进行双向测序，测序得到的基因序列，即16s rDNA如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的基因序列与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的核苷酸序列进行比对，结果显示，L113与菌株Brevibacterium strain JC439相似性高达99％。
结合L113的形态结构特征及生理生化特性，确定L113具体为短杆菌(Brevibacterium sp.L113)。所述短杆菌为抗烟草黑胫病病菌的拮抗菌株，所述短杆菌已于2018年1月2日在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:M2018003。
对L113抗烟草黑胫病病菌的拮抗能力进行测定。
将烟草黑胫病病菌接种在PDA固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜PDA固体培养基的中央，取L113的单菌落在距离烟草黑胫病菌饼2.5cm处划线，形成平行线，30℃下培养。设置3个重复试验，分别在第4天、第6天测量抑菌带的长短，然后计算平均值。请参阅图4，图4为本发明提供的拮抗菌株在PDA固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图，其中，左图为拮抗平板，同时接种了L113和烟草黑胫病病菌；右图为空白平板，仅接种了烟草黑胫病病菌，由图4和表1可观察到，L113对烟草黑胫病病菌具有良好的拮抗作用，并且L113对烟草黑胫病病菌的抑制能力在4天内都保持较高的水平。
表1 L113在PDA固体培养基上拮抗烟草黑胫病病菌的抑制距离值
实验一 实验二 实验三 平均值
第一次测量(mm) 9 7 7 7.6
第二次测量(mm) 0 0 0 0
将烟草黑胫病病菌接种在PDA固体培养基上活化，待长出菌丝后用打孔器打一个菌饼，将菌饼接种在新鲜NB固体培养基的中央，其中，NB固体培养基包括蛋白胨1％(W/V)，牛肉膏0.3％(W/V)，氯化钠0.5％(W/V)，调整pH值为7.0～7.2。将L113的单菌落在距离黑胫菌饼2.5cm处划线，形成平行线，30℃下培养。设置3个重复试验，分别在第4天、第6天测量抑菌带的长短，然后计算平均值。请参阅图5，图5为本发明提供的拮抗菌株在NB固体培养基上与烟草黑胫病病菌的拮抗实验图，其中，左图为拮抗平板，同时接种了L113和烟草黑胫病病菌；右图为空白平板，仅接种了烟草黑胫病病菌，由图5和表2，可得到L113对于烟草黑胫病具有较好的拮抗作用，L113对烟草黑胫病病菌的抑制在一周内都保持更高的抑制效果。
表2 L113在NB固体培养基上拮抗烟草黑胫病病菌的抑制距离值
实验一 实验二 实验三 平均值
第一次测量(mm) 11 11 15 12.3
第二次测量(mm) 2 3 8 4.3
本发明还提供了一种如前述的短杆菌在防治烟草黑胫病的应用。
具体地，可制成含有该短杆菌的生物药剂、生物土壤或生物肥料等。
本发明还提供了一种短杆菌发酵液的制备方法：
步骤S1，挑取如前述的短杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8制备得到种子液；
具体地，挑取如前述的拮抗菌株的单菌落于装有15ml LB液体培养基的的三角瓶中，在温度为30℃下，180r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8制备得到种子液；
步骤S2，将所述步骤S1中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养24h～48h，制备得到所述短杆菌发酵液；
具体地，将所述步骤S1中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为5％，在温度为30℃下，180r/min恒温培养24h～48h，制备得到所述短杆菌发酵液；
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。优选地，所述胰蛋白胨的浓度为10g/L，所述酵母提取物的浓度为5g/L，所述氯化钠的浓度为1g/L。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一种短杆菌、应用及其发酵液的制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1421
<212> DNA
<213> Brevibacterium sp. L113
<400> 1
ggggtgtctg ctacctgcag tcgaacgctg aagccgacag cttgctgttg gtggatgagt 60
ggcgaacggg tgagtaacac gtgagtaacc tgcccctgat ttcgggataa gcctgggaaa 120
ccgggtctaa taccggatac gaccatccct cgcatgaggg ttggtggaaa gtttttcgat 180
cggggatggg ctcgcggcct atcagcttgt tggtggggta atggcctacc aaggcgacga 240
cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggggaa accctgatgc agcgacgcag 360
cgtgcgggat gacggccttc gggttgtaaa ccgctttcag cagggaagaa gcgaaagtga 420
cggtacctgc agaagaagta ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg 480
tacgagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggtggttgg tcacgtctgc 540
tgtggaaacg caacgcttaa cgttgcgcgt gcagtgggta cgggctgact agagtgcagt 600
aggggagtct ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg 660
tggcgaaggc gggactctgg gctgtaactg acactgagga gcgaaagcat ggggagcgaa 720
caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgttgg gcactaggtg tgggggacat 780
tccacgttct ccgcgccgta gctaacgcat taagtgcccc gcctggggag tacggtcgca 840
aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat 900
tcgatgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca ctggaccgtt ctggaaacag 960
ttcttctctt tggagctggt gtacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgttct atgttgccag cacgtgatgg 1080
tgggaactca taggagactg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1140
atcatgccct ttatgtcttg ggcttcacgc atgctacaat ggctggtaca gagagaggcg 1200
aacccgtgag ggtaagcgaa tcccttaaag ccagtctcag ttcggatcgt agtctgcaat 1260
tcgactacgt gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcaacgctgc ggtgaatacg 1320
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcaa gtcacgaaag tcggtaacac ccgaagccgg 1380
tgtcccaacc cttgtggagg gggccgtcta aggtgacgag t 1421

Claims (3)

1.一种短杆菌，其特征在于，所述短杆菌(Brevibacterium sp.)为抗烟草黑胫病病菌的拮抗菌株，该短杆菌已在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:M 2018003。
2.一种如权利要求1所述的短杆菌在防治烟草黑胫病上的应用。
3.一种短杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤一，挑取如权利要求1所述的短杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养24h～48h，制备得到所述短杆菌发酵液；
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。
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