CN108004159A - 一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌、筛选方法及应用 - Google Patents

一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌、筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌、筛选方法及应用，所述克雷伯氏菌为抗烟草黑胫病菌的拮抗菌株，该拮抗菌株已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：M2017672。通过本发明提供的技术方案筛选得到所述拮抗菌株，能有效拮抗烟草黑胫病菌，进而达到防治烟草黑胫病的作用。

Description

一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌、筛选方法及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌、筛选方法及应用。
背景技术
我国烟区辽阔，自然条件迥异，烟草本身可塑性强，容易受环境影响而变异，经过人们长期的栽培和选择，形成了各具特色的众多品种，加之不断地从国外引进新品种，形成了类型俱全、数量丰富的烟草资源。虫害和病害是影响烟草农艺性状和经济性状的威胁因子，如烟草黑胫病(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)，分布面积广，危害严重，在烟草上又被称为“黑秆疯”“黑根”。首次报道是在印度尼西亚爪哇，之后在世界范围内陆续被发现，我国是在山东省首次发现，之后在各个植烟区屡见报道。有关调查统计显示，烟草黑胫病发病率为5％～12％，发病严重的地区最高可达75％；我国每年烟草黑胫病平均发病面积约为10万hm2，产量损失高达3000万kg，产值损失超过1.23亿元人民币。现有的防治办法大多使用化学药剂，而连年使用化学药剂，不仅使黑胫病病菌的抗药性有所增强，而且对环境还造成巨大污染。
因此，有必要提供一种生物防治烟草黑胫病菌的方法。
申请内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌、筛选方法及应用，以解决现有烟草黑胫病采用化学药剂污染环境的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌，所述克雷伯氏菌为抗烟草黑胫病菌的拮抗菌株，该拮抗菌株已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO： M2017672。
本发明还提供了一种如前述的拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取烟草根部土壤，加入无菌水，震荡后制成菌悬液；
步骤2，将所述步骤1制备的菌悬液用无菌水梯度稀释后均匀涂布在培养基上，在28～32℃条件下培养1～2天，将长出的菌落接种于PDA固体培养基中分离纯化；
步骤3，将所述步骤2中分离纯化的菌株和烟草黑胫病菌接种在R2A固体培养基上对峙培养，判断有无拮抗作用，对有拮抗作用的菌株进行鉴定分类，即得拮抗菌株。
本发明还提供了一种如前述的拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌在防治烟草黑胫病的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的所述克雷伯氏菌能有效抑制烟草黑胫病病原菌的生长；本发明对筛选的到的所述拮抗菌株鉴定为克雷伯氏菌，为防治烟草黑胫病病原菌提供了新的选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明拮抗菌株与烟草黑胫病菌的拮抗对比图；
图2为本发明提供的拮抗菌株在R2A固体培养基的菌落形态图；
图3为本发明提供的拮抗菌株形态图；
图4为本发明提供的拮抗菌株16srDNA序列在NCBI上的比对结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
为描述方便，以下将本发明提供的拮抗菌株命名为B44R。本领域技术人员可以理解的是，以下实施例中的菌株B44R与所述拮抗菌株为同一菌株。
本发明提供了一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌的筛选方法，包括以下步骤：
步骤S1，取烟草根部土壤，加入无菌水，震荡后制成菌悬液；
具体地，取多种烟草根部的土壤，每种土壤取10g，分别加到装有90ml 无菌水的三角瓶中，加入若干玻璃珠，震荡1h后制成菌悬液。
步骤S2，将所述步骤S1制备的菌悬液用无菌水梯度稀释后均匀涂布在培养基上，在28～32℃条件下培养1～2天，将长出的菌落接种于PDA固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)中分离纯化；
具体地，将步骤S1制备的菌悬液用无菌水稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、 10-6。稀释后均匀涂布在培养基上，可采用细菌培养基、真菌培养基和放线菌培养基进行分别培养。在30℃下培养48h，选取形态、大小、色泽不同的菌落，进行纯化，-80℃保存。
步骤S3，将步骤S2中分离纯化的菌株和烟草黑胫病菌接种在R2A固体培养基上对峙培养，判断有无拮抗作用，对有拮抗作用的拮抗菌进行鉴定分类，即得拮抗菌株。
具体地，将烟草黑胫病菌接种在PDA固体培养基上，待菌丝长大后取一个菌饼接种在新鲜PDA固体培养基的中央，制成烟草黑胫病菌拮抗试验平板。将步骤S2中分离纯化的菌株在R2A固体培养基上面划线培养得到单菌落，用接种环挑取一个单菌落围绕烟草黑胫病菌拮抗试验平板的菌饼2-3cm处划线，总共划四条线形成一个正方形，三个重复，培养3d后观察一次，5d后观察一次拮抗距离的形成情况。
请参阅图1，为本发明拮抗菌株与烟草黑胫病菌的拮抗对比图。图1a为处理组，有菌株B44R划线，其中心为烟草黑胫病菌；图1b仅为烟草黑胫病菌。由图1a和图1b可以看出菌株B44R可以有效的拮抗烟草黑胫病菌。
本发明提供了一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌，所述克雷伯氏菌(Raoultella sp.)为拮抗烟草黑胫病的拮抗菌株，该菌已于2017年11月10 日，在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO： M2017672。
请参阅图2，为本发明提供的拮抗菌株在R2A固体培养基的菌落形态图。由图2可知，本发明的菌株B44R30℃条件下在R2A平板上呈白色半透明菌落，有光泽，边缘整齐，菌落较光滑，正面突起。
请参阅图3，为本发明提供的拮抗菌株形态图。对菌株B44R进行显微镜观察，菌株B44R为革兰氏染色阴性，菌体有鞭毛，无荚膜，无芽孢，菌体呈细长的杆状。
对菌株B44R进行生理生化特性实验，具体实验方法可参照《微生物学检验》中的实验方法，具体结果如下表：
淀粉水解 阴性
纤维素分解 阴性
甲基红(M.R.) 阳性
乙酰甲基甲醇(V.P.) 阳性
过氧化氢酶 阴性
明胶液化 阳性
产硫化氢 阴性
硝酸盐还原 阳性
吲哚 阴性
对菌株B44R进行16S rDNA序列检测。提取菌株B44R的基因组DNA，采用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，扩增片段由铂尚生物技术(上海)有限公司测序，测得的序列于NCBI(National Center forBiotechnology Information)上进行同源性比较。请参阅图4，为本发明提供的拮抗菌株 16srDNA序列在NCBI上的比对结果图。通过对菌株B44R的16SrDNA序列进行分析，结果显示其16S rDNA序列与克雷伯氏菌同源性最高，达到99％以上。结合形态观察，确定本发明菌株为克雷伯氏菌(Raoultella sp.)的一新种，命名为克雷伯氏菌(Raoultella sp.)菌株B44R
本发明还提供了一种如前述的拮抗烟草黑胫病的克雷伯氏菌在防治烟草黑胫病的应用。
具体地，可制成含有该拮抗菌株的生物药剂、或生物肥料等。

Claims (3)

1.一种拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌，其特征在于，所述克雷伯氏菌为抗烟草黑胫病菌的拮抗菌株，该拮抗菌株已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：M2017672。
2.一种如权利要求1所述的拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取烟草根部土壤，加入无菌水，震荡后制成菌悬液；
步骤2，将所述步骤1制备的菌悬液用无菌水梯度稀释后均匀涂布在培养基上，在28～32℃条件下培养1～2天，将长出的菌落接种于PDA固体培养基中分离纯化；
步骤3，将所述步骤2中分离纯化的菌株和烟草黑胫病菌接种在R2A固体培养基上对峙培养，判断有无拮抗作用，对有拮抗作用的菌株进行鉴定分类，即得拮抗菌株。
3.一种如权利要求1所述的拮抗烟草黑胫病菌的克雷伯氏菌在防治烟草黑胫病的应用。
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