CN113773991B - 一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株sk2021-1及其防控旱地蜗牛应用 - Google Patents

一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株sk2021-1及其防控旱地蜗牛应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021‑1，所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其分类命名为解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021‑1，保藏编号为CGMCC No.22783；还涉及如前所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021‑1在防控旱地蜗牛的应用，将所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021‑1制成防控菌剂后用于旱地蜗牛的防控。本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021‑1具有营养简单、繁殖速度快、有效活菌数量高、性能稳定等优势，由其制成的防控菌剂相对于传统的旱地蜗牛防治方法，更简便、安全且高效。

Description

一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1及其防控旱地蜗牛应用
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1及其防控旱地蜗牛应用。
背景技术
旱地蜗牛一般指陆生的蜗牛，生活于灌木丛、低矮草丛、农田及住宅附近阴暗潮湿地区及果园、山坡草丛之中。蜗牛昼伏夜出，多在黄昏以后开始活动、取食，在晚上20-23时期间达到高峰，午夜后摄食量逐渐减少，至清晨陆续停止取食，并潜入土中或隐蔽处。蜗牛喜阴暗、潮湿的环境，阴雨天或浇水后可昼夜活动、取食。
旱地蜗牛觅食范围非常广泛，主食众多农作物的叶、茎、芽、花及多汁的果实，一般在4-5月和9-10月期间大量活动，对农作物造成很大的危害，是农业重要有害生物。目前防治旱地蜗牛的主要措施包括：
(1)农业防治：如采用地膜覆盖栽培，合理密植，疏枝整叶，清除田间杂草，秋季深耕、晒地，通过降低环境的潮湿度，从而不利于蜗牛的生活，以达到防治蜗牛的效果，但这中方法需要耗费大量劳动力，防治效果低。
(2)人工诱捕：在傍晚时，将树叶、杂草、菜叶等堆放在田间，每隔3-5米放置1堆，制造潮湿环境以吸引蜗牛，天亮前揭开堆积物，人工捕捉加以消灭，这种方法同样需要耗费大量人力。
(3)药剂防治：每亩用6％密达杀螺颗粒剂0.5-0.6千克、30％聚醛·甲萘威颗粒剂300克、10％四聚乙醛颗粒剂500克等化学农药，拌适量细土或细沙，于傍晚在田间均匀撒施，这种方法有一定的防治效果，但是化学农药会可能会造成人、畜中毒，同时也会造成环境的污染。
综上可见，目前常见的旱地蜗牛防治措施虽然有一定的防治作用，但存在不够简便、低效、安全性差的等不足，因此，研发一种简便、高效且安全的生物防控技术及制剂很有必要。
发明内容
鉴于上述内容，有必要提供一种解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)菌株SK2021-1及由其制成的发酵液在防控旱地蜗牛应用，由该菌株制成的发酵液对旱地蜗牛的防控效果很好。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1，其于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类命名为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)菌株SK2021-1，保藏编号为CGMCCNo.22783。
本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1从云南农业大学后山农场玉米地自然死亡的蜗牛体内分离获得，于不同是时间段分离得到的菌株生理特性相同，该菌株的生物学特性如下：生长最适温度为37℃；在LB平板培养基上，菌落呈圆形、凸起、灰白色、较大、具有光泽，呈黏液状；菌体具有较厚的荚膜，有菌毛，球杆形，大小0.3-1.0×0.6-6μm，常呈单个、成双或短链状排列，革兰氏染色阴性，不运动，好氧，兼性厌氧；
氧化酶阴性，细胞生长在肉汁培养基上，接触酶阳性，可利用柠檬酸盐和葡萄糖作为唯一碳源，用葡萄糖发酵产酸和气，发酵葡萄糖产生2，3-丁二醇作为最终产品，V-P检测阳性。经对所分离菌株SK2021-1的16SrDNA基因序列测定，结果发现本发明提供的菌株SK2021-1的16SrDNA基因序列与解鸟氨酸拉乌尔菌菌株172117885的同源性最高，相似性达99％，结合生理生化测定从而确定分离出的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)菌株SK2021-1。
通过试验研究解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1对旱地蜗牛的防治效果，发现用菌株SK2021-1对旱地蜗牛进行药剂喷雾处理，蜗牛出现了部分死亡和中毒的现象，表现出优良的蜗牛防治效果。
一种如上述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，将所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成防控菌剂后用于旱地蜗牛的防控，所述防控菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)先制备培养基，接着将制备好的培养基分装于三角瓶中，并置于121℃的条件下进行灭菌30min，再降温至37℃，得到备用瓶；
(2)取1μL解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1接种到步骤(1)得到的备用瓶内的培养基中，得到接种培养瓶；
(3)将步骤(2)得到的接种培养瓶置于转速为160r/min、温度为37℃的摇床中进行培养24h，得到解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液；
(4)将步骤(3)得到的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液按发酵罐中培养基体积的1％的量接种于发酵罐中，并置于转速为120r/min、温度为37℃的条件下发酵34h，得到发酵物料；
(5)往步骤(4)得到的发酵物料中添加氮酮、吐温20、黄原胶和十二烷基二苯醚二磺酸钠，并搅拌均匀得到防控菌剂；其中所述防控菌剂中氮酮占总质量的0.2％，吐温20 占总质量的2％，黄原胶占总质量的2％、十二烷基二苯醚二磺酸钠占总质量的10％。
在本发明中，进一步的说明，所述防控菌剂的制备方法中，每1L步骤(1)至步骤(4)中所述的培养基主要由以下质量的原料制成：黄豆粉14g、玉米粉15g、蔗糖3g、鱼粉2g、蛋白胨3g、碳酸钙6g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸锰0.2g、氢氧化钠0.25g。
在本发明中，进一步的说明，所述防控菌剂的制备方法中，步骤(1)及步骤(4)中所述培养基的制备方法为：先按制备1L所述培养基的量分别称取各原料，并加入1L灭菌水中，混合均匀得到混合物料；接着将得到的混合物料置于121℃、0.15大气压的条件下进行灭菌30min即可。
在本发明中，进一步的说明，所述防控菌剂的制备方法中，步骤(1)所述三角瓶的容积为200mL，其内加入所述培养基的量为100mL。
在本发明中，进一步的说明，所述防控菌剂的制备方法中，步骤(3)得到的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液中的菌量为1×105-5×105CFU/mL。
在本发明中，进一步的说明，所述防控菌剂的制备方法中，步骤(5)得到的防控菌剂的菌量为2×1010-3×1010CFU/mL。
由本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成的防控菌剂的使用方法如下：
将防控菌剂用清水稀释至100-1000倍后，于非雨天傍晚太阳落山后0.5-1.5h或清晨太阳起山前0.5-1.5h，喷施于植物基部及中上部各器官。本发明制成的防控菌剂稀释至3×107CFU/mL对旱地蜗牛的防治效果最好。
由于采用上述方案，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1具有营养简单、繁殖速度快、有效活菌数量高、性能稳定、储存期长等优势，为其产业化应用提供良好的基础；本发明中解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1通过发酵制成发酵液后，喷施于田间，对旱地蜗牛具有很好的防控效果，具体为，解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1能够产生表面活性素类物质，该类物质渗入蜗牛体内后能够结合蜗牛体内的酶蛋白和脂类聚合物，形成不可逆脂多糖复合物，从而使旱地蜗牛罹病而死亡，另外，未被蜗牛吸收的活性菌体在田间能借风雨以及蜗牛间接触而传播，从而增加被蜗牛吸收概率，进一步增强本发明对旱地蜗牛的防控有效性。由该菌株发酵而成的防控菌剂，在使用时直接喷施于田间，相对于传统的农业防治及人工诱捕，节省了大量的劳动力，相对于化学药物防治的方法，本发明更环保安全，不会对环境或人畜造成危害，而且相对于传统的方法，防控效果更佳，是一种真正的绿色环保高效生物防控菌剂。经试验，本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成的防控菌剂稀释至3×107CFU/mL后，喷施于试验区第2天对同型巴蜗牛、灰巴蜗牛和条华蜗牛的防治效果分别高达70.04％、76.44％和79.29％，随着时间的推移，防治效果越来越好，喷施第30天对同型巴蜗牛、灰巴蜗牛和条华蜗牛的防治效果分别高达98.63％、98.90％和99.21％，防治效果显著。
【生物保藏信息】
解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)菌株SK2021-1，于2021年06月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.22783。
【附图说明】
图1为解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1的平板培养特征。
【具体实施方式】
本发明提供了提供一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1及其防控旱地蜗牛应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1从云南农业大学后山农场玉米地自然死亡的蜗牛体内分离获得，于不同是时间段分离得到的菌株生理特性相同，该菌株的生物学特性如下：生长最适温度为37℃；在LB平板培养基上，菌落呈圆形、凸起、灰白色、较大、具有光泽，呈黏液状。菌体具有较厚的荚膜，有菌毛，球杆形，大小0.3-1.0×0.6-6μm，常呈单个、成双或短链状排列，革兰氏染色阴性，不运动，好氧，兼性厌氧；氧化酶阴性，细胞生长在肉汁培养基上，接触酶阳性，可利用柠檬酸盐和葡萄糖作为唯一碳源，用葡萄糖发酵产酸和气，发酵葡萄糖产生2，3-丁二醇作为最终产品，V-P检测阳性；经对所分离菌株SK2021-1的16SrDNA基因序列测定，结果发现本发明提供的菌株SK2021-1的16SrDNA基因序列与解鸟氨酸拉乌尔菌菌株172117885的同源性最高，相似性达99％，结合生理生化测定从而确定分离出的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)菌株SK2021-1。
通过试验研究解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1对旱地蜗牛的防治效果，发现用菌株SK2021-1对旱地蜗牛进行药剂喷雾处理，蜗牛出现了部分死亡和中毒的现象，表现出优良的蜗牛防治效果。
以下实施例制成的防控菌剂的使用方法如下：
将防控菌剂用清水稀释至100-1000倍后，于非雨天傍晚太阳落山后0.5-1.5h或清晨太阳起山前0.5-1.5h，喷施于植物基部及中上部各器官。
实施例
一种解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1，其于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，分类命名为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)菌株SK2021-1，保藏编号为CGMCCNo.22783。
一种如上述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，将所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成防控菌剂后用于旱地蜗牛的防控，所述防控菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)先制备培养基，接着将制备好的培养基分装于三角瓶中，并置于121℃的条件下进行灭菌30min，再降温至37℃，得到备用瓶；
(2)取1μL解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1接种到步骤(1)得到的备用瓶内的培养基中，得到接种培养瓶；
(3)将步骤(2)得到的接种培养瓶置于转速为160r/min、温度为37℃的摇床中进行培养24h，得到解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液；
(4)将步骤(3)得到的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液按发酵罐中培养基体积的1％的量接种于发酵罐中，并置于转速为120r/min、温度为37℃的条件下发酵34h，得到发酵物料；
(5)往步骤(4)得到的发酵物料中添加氮酮、吐温20、黄原胶和十二烷基二苯醚二磺酸钠，并搅拌均匀得到防控菌剂；其中所述防控菌剂中氮酮占总质量的0.2％，吐温20 占总质量的2％，黄原胶占总质量的2％、十二烷基二苯醚二磺酸钠占总质量的10％。
其中，上述所述防控菌剂的制备方法中，每1L步骤(1)及步骤(4)中所述的培养基主要由以下质量的原料制成：黄豆粉14g、玉米粉15g、蔗糖3g、鱼粉2g、蛋白胨3g、碳酸钙6g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸锰0.2g、氢氧化钠0.25g。
上述步骤(1)至步骤(4)所述培养基的制备方法为：先按制备1L所述培养基的量分别称取各原料，并加入1L灭菌水中，混合均匀得到混合物料；接着将得到的混合物料置于121℃、0.15大气压的条件下进行灭菌30min即可。
在本发明中，按上述方法制备所述防控菌剂，步骤(3)中得到的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液中的菌量为1×105-5×105CFU/mL；步骤(5)得到的防控菌剂中的菌量为2×1010-3×1010CFU/mL。
效果验证
为了进一步说明本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成的防控菌剂的推广应用价值，按实施例的方法制成防控菌剂后，对其防控旱地蜗牛效果进行评定。
(1)验证方法如下：
以上述方法制成的防控菌剂作为试验品，选取6个玉米拔节期的玉米地作为试验地，每一个试验地30平方米，以每两块试验地为一个区组，其中一块试验地作为实验组，另一块试验地作为对照组，分为3个区组，分别用于评定防控菌剂对同型巴蜗牛、灰巴蜗牛和条华蜗牛的防控效果，每个区组的试验方法具体为：
于非雨傍晚太阳落山后1小时或清晨太阳起山前1小时，取上述制成的防控菌剂3mL稀释至浓度为3×107CFU/mL后，均匀喷施于实验组玉米植株基部及中上部各器官，对照组喷施与稀释后的防控菌剂等量的清水，以上试验重复4次，每次试验在两个月内未进行过蜗牛防控的玉米地进行。
(2)评价方法如下：
分别于喷施前、喷施后的第2天、第3天、第5天、第7及第30天，于清晨太阳出山前调查统计各区组内试验区中对应评定的蜗牛种类活体数量，分别记录于表1-3中，并对各个区组的试验区中喷施试验品的药效进行评价，试验品的药效以蜗牛虫口减退率和防治效果作为参考，计算统计每个试验区的蜗牛虫口减退率和防治效果，分别记录于表1-3中。其中，药效计算方法如下：
药效按式(1)、式(2)、式(3)计算：
虫口减退率(％)＝[施药前虫数-施药后虫数]×100/施药前虫数(1)
防治效果(％)＝[1-(CK0×PT1)/(CK1×PT0)]×100 (2)
防治效果(％)＝[PT-CK]×100/[100-CK] (3)
式中：
PT。——药剂处理区药前虫数；
PT1——药剂处理区药后虫数；
CK0——空白对照区药前虫数；
CK1——空白对照区药后虫数；
PT——药剂处理区虫口减退率；
CK——空白对照区虫口减退率。
(3)试验结果
防控菌剂对同型巴蜗牛的防控效果评价结果如下：
表1防控菌剂对同型巴蜗牛的防控效果
由上表1数据可看出，由本发明公开的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成的防控菌剂对同型巴蜗牛具有显著的防治效果，在施用第2天，防治效果便可达到70.04％，第5天的防治效果便可达92.26％，至第30天防治效果达98.63％，表现出明显的防治效果。
防控菌剂对灰巴蜗牛的防控效果评价结果如下：
表2防控菌剂对灰巴蜗牛的防控效果
由上表2数据看出，由本发提供的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成的防控菌剂喷施于试验区第2天后，对灰巴蜗牛的防治效果便可达到76.44％，喷施后第五天的防控效果便达到93.38％，而至第30天防控效果高达98.90％，表现出对灰巴蜗牛优异的防治效果。
防控菌剂对条华蜗牛的防控效果评价结果如下：
表3防控菌剂对条华蜗牛的防控效果
以上表1-3的数据可知，由本发明公开的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成的防控菌剂喷施试验区第2天、第5天和第30天后，对条华蜗牛的防治效果分别高达79.29％、93.26％和99.21％，防治效果显著。
由上述结果看出，本发明防控菌剂稀释至浓度为3×107CFU/mL后，对同型巴蜗牛、灰巴蜗牛和条华蜗牛等旱地蜗牛的具有显著的防治效果，且随着时间后推，防控效果越好，表明防控菌剂在喷施后未被蜗牛吸收的活性菌体在田间能借风雨以及蜗牛间接触而传播，从而增加被蜗牛吸收概率，进一步增强本发明对旱地蜗牛的防控有效性。
以上证明本发明具有较高的推广应用价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)菌株SK2021-1，其特征在于：所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22783。
2.一种如权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，其特征在于：将所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1制成防控菌剂后用于旱地蜗牛的防控，所述防控菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)先制备培养基，接着将制备好的培养基分装于三角瓶中，并置于121℃的条件下进行灭菌30min，再降温至37℃，得到备用瓶；
(2)取1μL解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1接种到步骤(1)得到的备用瓶内的培养基中，得到接种培养瓶；
(3)将步骤(2)得到的接种培养瓶置于转速为160r/min、温度为37℃的摇床中进行培养24h，得到解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液；
(4)将步骤(3)得到的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液按发酵罐中培养基体积的1％的量接种于发酵罐中，并置于转速为120r/min、温度为37℃的条件下发酵34h，得到发酵物料；
(5)往步骤(4)得到的发酵物料中添加氮酮、吐温20、黄原胶和十二烷基二苯醚二磺酸钠，并搅拌均匀得到防控菌剂；其中所述防控菌剂中氮酮占总质量的0.2％，吐温20占总质量的2％，黄原胶占总质量的2％、十二烷基二苯醚二磺酸钠占总质量的10％。
3.根据权利要求2所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，其特征在于：所述防控菌剂的制备方法中，每1L步骤(1)至步骤(4)中所述的培养基主要由以下质量的原料制成：黄豆粉14g、玉米粉15g、蔗糖3g、鱼粉2g、蛋白胨3g、碳酸钙6g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸锰0.2g、氢氧化钠0.25g。
4.根据权利要求3所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，其特征在于：所述培养基的制备方法为：先按制备1L所述培养基的量分别称取各原料，并加入1L灭菌水中，混合均匀得到混合物料；接着将得到的混合物料置于121℃、0.15大气压的条件下进行灭菌30min即可。
5.根据权利要求2所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，其特征在于：所述防控菌剂的制备方法中，步骤(1)所述三角瓶的容积为200mL，其内加入所述培养基的量为100mL。
6.根据权利要求2所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，其特征在于：所述防控菌剂的制备方法中，步骤(3)得到的解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1种子发酵液中的菌量为1×105-5×105CFU/mL。
7.根据权利要求2所述解鸟氨酸拉乌尔菌菌株SK2021-1在防控旱地蜗牛的应用，其特征在于：所述防控菌剂的制备方法中，步骤(5)得到的防控菌剂中的菌量为2×1010-3×1010CFU/mL。
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