CN111041121A

CN111041121A - 一种银杉及其制品实时荧光pcr检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN111041121A
Application number: CN202010017137.3A
Authority: CN
Inventors: 孙涛; 孔德英; 滕少娜; 任风鸣; 陆丽华; 何玲; 李应国; 谢鑫
Original assignee: Chongqing Customs Technology Center
Current assignee: Chongqing Customs Technology Center
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2020-04-21

Abstract

本发明公开了一种用于银杉实时荧光PCR检测的引物、探针及检测方法。本发明针对银杉ITS2基因序列设计并筛选出一组特异性引物和探针，及对应的试剂盒，用于银杉的实时荧光PCR方法特异性检测鉴定。以本发明所设计的引物探针采用实时荧光PCR方法检测，具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的进行银杉种质、苗木、材质和遗传物质的鉴定，对于银杉物种资源保护、打击非法盗采、走私等有重要意义。

Description

一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要针对银杉(C.argyrophylla)ITS2基因序列设计并筛选出的一组特异引物和探针及，开发的一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒、使用方法及应用。

背景技术

银杉，松科(Pinaceae)银杉属(Cathaya)，是第三纪孑遗的珍稀树种，于19世纪50年代在我国广西龙胜县花坪和重庆市南川区金佛山首次发现，属中国特产的稀有树种，被誉为植物界的大熊猫、活化石。早在1992年和1999年银杉就被列为一级国家珍贵树种和一级国家重点保护野生植物。目前，银杉仅在中国亚热带山地的局部地区有零星残存，天然银杉林只在重庆、广西、贵州和湖南4省市发现有分布。

作为古老的残遗植物，银杉的花粉曾在欧亚大陆第三纪沉积物中发现，其形态特殊，胚胎发育与松属植物相似，对研究松科植物的系统发育、古植物区系、古地理及第四纪冰期气候等，均有较重要的科研价值。自我国首次发现以来，已引起国内外学界的浓厚兴趣和广泛关注，已对银杉的生物学特性、生态学习性、繁殖特性以及濒危原因等方面开展一系列的研究。但其苛刻的生存条件以及低下的繁殖效率，令其仍面临较大的灭绝及物种资源流失的风险。

生物物种资源是人类生存、国家生态安全和社会可持续发展的战略性资源，是生物多样性最基本的组成部分，是维持人类生存、维护国家生态安全的物质基础，生物物种资源的拥有和开发利用程度已成为衡量一个国家综合国力和可持续发展能力的重要指标之一。我国是世界上生物物种资源最丰富的国家之一，也是发达国家攫取生物遗传资源的重要地区。过去我国大量的物种及其遗传资源被国外研究人员和商业机构搜集无偿引出，其中一些重要资源在国外经生物技术改造或加工后，形成其专利技术或专利产品，造成国家利益的重大损失。出入境物种资源查验已成为物种资源保护的重要手段，然而高效查验手段的缺失是物种查验过程中面临的又一大难题。因此，为保护我国特有的银杉资源，防止资源流失，有必要建立准确快速的银杉鉴定技术。

实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术是新发展起来的一项物种特异性检测鉴定技术，其利用一组特异性的引物探针，通过检测荧光强度变化来进行检测，灵敏度高、特异性强，可从基因组层面对物种进行准确鉴定，而且在数小时内即可完成检测，提高了工作效率。通过实时荧光PCR方法鉴定银杉，特异性强，结果准确，具有良好的应用前景和推广价值。

发明内容

本发明目的在于提供用于银杉实时荧光PCR检测的引物探针序列及其检测方法。

一种用于银杉及其制品实时荧光PCR检测的引物和探针，包括一对引物，所述引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的反向引物，所述探针的苷酸序列为SEQ ID NO.3。

利用上述引物和探针进行银杉实时荧光PCR检测的检测方法，包括以下步骤：

1)制备待检模板DNA：用SDS法、CTAB法或磁珠法提取样品中的DNA，获得模板DNA。

2)PCR反应体系：

10μL 2×荧光PCR反应预混液(选用市售产品)，0.4μL 10μmol/L的核苷酸序列为SEQ ID NO.1的正向引物，0.4μL 10μmol/L的核苷酸序列为SEQ ID NO.2的反向引物，0.5μL10μmol/L的核苷酸序列为SEQ ID NO.3的TaqMan探针，2μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照或空白对照，灭菌去离子水6.7μL。

3)实时荧光PCR反应参数：第一步：95℃30s；第二步：95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。

4)结果判定：在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果Ct值≤35.0，则判定为阳性；如果Ct值≥40，则判定为阴性；如果35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值≥40，则判定为阴性。

上述引物和探针在制备银杉实时荧光PCR检测用试剂盒中的用途。

本发明的有益技术效果是：1)灵敏度高：采用本发明的引物和探针进行实时荧光PCR检测，相比于普通PCR方法，灵敏度要高1-2个数量级；2)特异性更强：3)检测时间短：整个检测能控制在2个小时内完成，大大缩短检测时间。4)应用方便：相较于形态鉴定方法，操作简便，检测难度较低，准确定高。本方法特异性强，灵敏度高，结果准确，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。5)具有巨大应用前景：本发明可快速、方便、高效的进行银杉种质、苗木、材质和遗传物质的鉴定，对于银杉物种资源保护、打击非法盗采、走私等有重要意义。

附图说明

图1为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR特异性实验检测图；

图2为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR灵敏度实验检测图。

具体实施方式

实施例1试剂盒的制备

引物、探针的设计和合成

通过对银杉及其近似种的ITS2、Psba-trnh、Matk、rbcl基因测序和比对分析，同时参考GenBank中银杉属物种基因序列，筛选出种内保守、种间特异的ITS2基因序列，针对该基因，在种属间序列比对分析的基础上，人工设计引物及探针，最后经过比较筛选确定的引物和探针的序列。其中，正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。以上引物和探针为委托生物公司合成，参见核苷酸序列表。

其中，荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3的核苷酸序列为：SEQ ID NO.3：FAM-TGTTCCGTGCCTATGCATCGGC-BHQ1。

实施例2：检测银杉样品的具体操作

1)配制反应液：根据上述发明内容2所述，在试剂准备区配制PCR反应体系，各物质浓度体积如下：10μL 2×荧光PCR反应预混液，0.4μL引物SEQ ID NO.1(10μmol/L)，0.4μL引物SEQ ID NO.2(10μmol/L)，0.5μL TaqMan探针SEQ ID NO.3(10μmol/L)，灭菌去离子水6.7μL。试验设置两次重复，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。

2)加模板：在样本区，每个反应加2μL模板DNA，阳性对照用银杉基因组DNA，阴性对照用马尾松基因组DNA，空白对照用灭菌去离子水。盖上反应管盖。

3)实时荧光PCR检测：在检测区，将配制好的PCR反应管放到实时荧光PCR仪上，循环程序参数设定为：第一步：95℃30s；第二步：95℃5s，60℃30s，40个循环。60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。

实施例3：特异性试验

以银杉近缘种以及常见伪混品的DNA作为模板，包括：樟子松、水杉、雪松、海南五针松、油杉。结果显示，只有银杉DNA检测为阳性，其余均为阴性，证明本发明的引物探针特异性良好。结果见附图1，扩增曲线为银杉样品DNA。

实施例4：灵敏度试验

用灭菌去离子水将提取的银杉基因组DNA(初始浓度为50ng/μL)10倍梯度稀释成7个系列梯度，稀释后浓度分别为50ng/μL至5×10^-5ng/μL，取2μL作为模板进行灵敏度检测。结果如附图2显示，梯度稀释的银杉基因组DNA可检测到5×10^-4ng/μL，最低检测限是1pgDNA/反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆海关技术中心

<120> 一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒及应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID No.1

<400> 1

tgtggtcgcc tgaaatgcta 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> SEQ ID No.2

<400> 2

ccctgcatcg acaaacacc 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> SEQ ID No.3

<400> 3

tgttccgtgc ctatgcatcg gc 22

Claims

1.一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒，包括、荧光探针、荧光PCR反应预混液，其特征在于：所述荧光探针的苷酸序列为SEQ ID NO.3。

2.权利要求1所述的一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的反向引物。

3.权利要求1、2所述一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒的使用使用方法，包括以下步骤：制备待检模板DNA，PCR反应体系，实时荧光PCR反应参数，结果判定等步骤；其特征在于：所述PCR反应体系为：添加10μL 2×荧光PCR反应预混液，0.4μL 10μmol/L的正向引物，0.4μL 10μmol/L的反向引物，0.5μL 10μmol/L荧光探针，2μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照或空白对照，灭菌去离子水6.7μL。

4.根据权利要求3所述的一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒的使用使用方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应参数为：第一步：95℃30s；第二步：95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。

5.根据权利要求3所述的一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒的使用使用方法，其特征在于：所述制备待检模板DNA中获取DNA的方法为SDS法、CTAB法或磁珠法中的一种。

6.根据权利要求3所述的一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒的使用使用方法，其特征在于：所述结果判定为在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果Ct值≤35.0，则判定为阳性；如果Ct值≥40，则判定为阴性；如果35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值≥40，则判定为阴性。

7.根据权利要求6所述的一种银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒的使用使用方法，其特征在于：所述阳性对照用银杉基因组DNA，阴性对照用马尾松基因组DNA，空白对照用灭菌去离子水。

8.权利要求1、2、3任一项所述银杉及其制品实时荧光PCR检测试剂盒在快速检测银杉及其制品中的应用。