CN101942500B - 大黄鱼和小黄鱼种质鉴别引物和鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大黄鱼和小黄鱼种质鉴别引物和鉴别方法，其特点是：引物序列为：F1：5’-TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC-3’；F2：5’-ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT-3’；R1：5’-ACACGCGGGGGTCTAAC-3’；R2：5’-ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA-3’。鉴别方法如下：采用酚氯仿提取法提取大黄鱼或小黄鱼样品的DNA；PCR反应体系为25μL，各种成分为Buffer、dNTP、Mg2+、4种引物、Taq、疑似大黄鱼或小黄鱼样品的DNA，用双蒸水补齐到25μL，进行PCR；PCR反应结束后，取产物用琼脂糖凝胶电泳检测，观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，进行鉴别。鉴别方法快捷、准确。
Description
技术领域
本发明涉及四种引物、大黄鱼和小黄鱼，尤其是涉及大黄鱼和小黄鱼种质鉴别的引物和鉴别方法。
背景技术
大黄鱼(Pseudosciaena crocea(Richardson)，Large Yellow Croaker)和小黄鱼(Pseudosciaena plyactis(Bleeker)，Small Yellow Croaker)隶属于鲈形目(Perciformes)，鲈亚目(Percoidei)，石首鱼科(Sciaenidae)，黄鱼属(Larimichthys)，曾占据了中国“四大渔业”的半壁江山，在过去数量多、鱼群大，形成具有首要经济意义的黄花鱼渔汛。上世纪70年代末以来，由于过度捕捞和环境变化，小黄鱼资源严重衰退，而大黄鱼资源接近枯竭。继我国政府及相关管理部门采取一系列渔政保护措施后，近10年来，大黄鱼和小黄鱼资源呈逐年恢复之势，但其群体仍表现出小型化、低龄化与早熟化等特征。为更好地保护与合理开发大黄鱼和小黄鱼种质资源，亟待准确评估二者的资源量和分布状况，而此项工作的前提是必须找到能够准确鉴别大黄鱼和小黄鱼的方法。
大黄鱼和小黄鱼亲缘关系十分相近，外形又很相似，目前，国内外对两物种的鉴别主要依据形态学特征判断：其一，大黄鱼的尾柄长度(即臀鳍基部终点至尾鳍基底之间的垂直距离)为其高度的3倍以上，而小黄鱼的尾柄长仅为其高的2倍以上；其二，大黄鱼在侧线之上的鱼鳞有8-9行，而小黄鱼只有5-6行，相形之下，大黄鱼的鱼鳞显得较小，小黄鱼反而较大，但这也仅仅是两者比较而言；如果在外形上难以区别它们时，可剖开腹腔观察其鳔侧肢的分枝的情况，大黄鱼的鳔侧肢的前小枝和后小枝一样长，小黄鱼的鳔侧肢的前小枝延长，后小枝短小。一般情况下，成熟个体大黄鱼的体形较小黄鱼大，但这并非固定特征，不能作为判断大黄鱼和小黄鱼的主要依据。由此可见，这种仅靠肉眼识别的形态学鉴定方法不仅要求具有较高水平的专业分类学知识，只有成熟的大黄鱼和小黄鱼个体才具有一定的可操作性，但也很容易发生二者混淆的现象。另外，大黄鱼和小黄鱼的鱼卵、仔稚幼鱼的形态学特征不明显，所以无法依据形态学特征对二者进行鉴别。
另外，大黄鱼和小黄鱼肉质都细嫩鲜美，营养丰富，是人们喜食的海鲜。除鲜食外，还可加工成鲞，为名贵的水产品。但加工之后，已失去原有外部形态特征，更使得二者之间的鉴别难以进行。因此，亟需一种快捷方便、准确可靠的物种鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有大黄鱼和小黄鱼鉴别形态学鉴别方法的不足，提供一种能够同时鉴别大黄鱼和小黄鱼两个物种的鉴别引物。本发明的另一目的在于利用上述鉴别引物建立大黄鱼和小黄鱼种质鉴别的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种大黄鱼和小黄鱼种质鉴别引物和鉴别方法，引物序列为：
F1：5’-TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC-3’；
F2：5’-ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT-3’；
R1：5’-ACACGCGGGGGTCTAAC-3’；
R2：5’-ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA-3’。
一种利用上述鉴别引物建立大黄鱼和小黄鱼种质鉴别的方法，其特征在于，鉴别方法步骤如下：
1)采用酚氯仿提取法提取大黄鱼或小黄鱼样品的DNA；
2)PCR扩增反应：PCR反应体系为25μL，各种成分及终浓度为Buffer10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，4种引物每种0.2mM，Taq 1U，疑似大黄鱼或小黄鱼样品的DNA 50ng，用双蒸水补齐到25μL，PCR反应程序是95℃5min，(95℃ 30sec→55℃ 30sec→72℃ 1min)×30个循环→72℃ 10min；
3)电泳染色对比图谱：PCR反应结束后，取产物用琼脂糖凝胶电泳检测，加入Genefinder，然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，如果同时出现一条大小为853bp和一条大小为371bp的两条特异性条带，则表明该样品为大黄鱼；如果同时出现一条大小为853bp和一条大小为502bp的两条特异性条带，则表明该样品为小黄鱼。详见图1。
对上述技术方案的改进：PCR反应结束后，取8μL产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果：
本方法是国内外首次基于分子生物学技术原理建立的一种大黄鱼和小黄鱼种质鉴别新方法，它利用来自大黄鱼和小黄鱼线粒体基因组设计合成了4条特异性引物，建立了一个PCR反应就可以实现鉴别大黄鱼和小黄鱼种质的新方法。本方法无需依赖专业的分类学背景，也不要求具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验，不仅可以鉴别大黄鱼和小黄鱼的完整个体，还可以鉴别其加工产品，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。且可用于研究黄鱼鱼卵、仔稚幼鱼的群落结构、产卵场位置及其扩散路径，了解其早期生活史，评估海洋黄鱼资源，查明海产品市场上存在的标识错误问题等方面。
附图说明
图1为大黄鱼和小黄鱼的特征谱带，M是DNA marker(DL2000)，S是小黄鱼的特征谱带，L是大黄鱼的特征谱带。
图2为大黄鱼与小黄鱼样品电泳检测结果，其中M是DNA marker(DL2000)，S1-S5是小黄鱼样品，L1-L5是大黄鱼样品。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一：本发明一种能够同时鉴别大黄鱼和小黄鱼两个物种的鉴别引物，引物序列为：
F1：5’-TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC-3’；
F2：5’-ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT-3’；
R1：5’-ACACGCGGGGGTCTAAC-3’；
R2：5’-ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA-3’。
实施例二：本发明一种利用上述鉴别引物建立大黄鱼和小黄鱼种质鉴别的方法，各选用5尾成熟个体的大黄鱼和小黄鱼，根据专业形态学鉴定后，按照常规方法采用酚/氯仿抽提法(参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002年9月)提取大黄鱼或小黄鱼的DNA，利用本方法中提供的4种引物，对其基因组进行扩增。PCR反应体系为25μL，各种成分及终浓度为Buffer 10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，4种引物每种0.2mM，Taq 1U，大黄鱼或小黄鱼样品DNA 50ng，用双蒸水补齐到25μL，PCR反应程序是95℃ 5min，(95℃ 30sec→55℃30sec→72℃ 1min)×30个循环→72℃ 10min。
PCR反应结束后，取8μL产物用琼脂糖凝胶电泳检测，加入Genefinder，然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，结果发现5份形态学鉴定为大黄鱼的样品均同时出现一条大小为853bp和一条大小为371bp的两条特异性条带，表明样品为大黄鱼；5份形态学鉴定为小黄鱼的样品均同时出现一条大小为853bp和一条大小为502bp的两条特异性条带，表明样品为小黄鱼。这一结果与形态学鉴定的结果完全一致，详见图2。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种大黄鱼和小黄鱼种质鉴别引物，引物序列为：
F1：5’-TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC-3’；
F2：5’-ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT-3’；
R1：5’-ACACGCGGGGGTCTAAC-3’；
R2：5’-ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA-3’。
2.一种利用权利要求1所述鉴别引物建立大黄鱼和小黄鱼种质鉴别的方法，其特征在于，鉴别方法步骤如下：
1)采用酚氯仿提取法提取大黄鱼或小黄鱼样品的DNA；
2)PCR扩增反应：PCR反应体系为25μL，各种成分及终浓度为Buffer10mM，dNTP 0.2mM，Mg2+1.5mM，4种引物每种0.2mM，Taq 1U，疑似大黄鱼或小黄鱼样品的DNA 50ng，用双蒸水补齐到25μL，PCR反应程序是95℃5min，(95℃ 30sec→55℃ 30sec→72℃ 1min)×30个循环→72℃ 10min；
3)电泳染色对比图谱：PCR反应结束后，取产物用琼脂糖凝胶电泳检测，加入Genefinder，然后在紫外透射反射分析仪下观察、照相和记录，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，如果同时出现一条大小为853bp和一条大小为371bp的两条特异性条带，则表明该样品为大黄鱼；如果同时出现一条大小为853bp和一条大小为502bp的两条特异性条带，则表明该样品为小黄鱼。
3.按照权利要求2所述的大黄鱼和小黄鱼种质鉴别的方法，其特征在于，PCR反应结束后，取8μL产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
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