CN109536618A - 一种鉴定鮈亚科鱼类的方法 - Google Patents

一种鉴定鮈亚科鱼类的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，利用从NCBI下载的已发表鮈亚科线粒体COI序列，比对并设计鮈亚科鱼类的特异性COI引物并合成；用特异性引物对常见的鮈亚科鱼类DNA样本分别进行扩增；根据PCR产物确认得到目的长度电泳条带，条带经纯化回收测序，之后对测序结果进行BLAST比对分析，确认获得鮈亚科鱼类的COI序列；依据产物的测序结果和已发表相近物种和同种序列比对，并构建邻接法系统发育关系树，同时通过MEGA软件估算已知物种和欲鉴定物种之间的遗传距离，同时结合形态特征进一步确认分子鉴定结果的可靠性。本发明公开的鉴定鮈亚科鱼类的方法，具有检测速度快，识别精确度高，通量高，人为影响小等优点。

Description

一种鉴定鮈亚科鱼类的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种鉴定鮈亚科鱼类的方法。
背景技术
鱼类是人类的伙伴，为人类提供了许多人体所必须的元素和物质，也是人类食物来源之一，因而保护鱼类的多样性，变得越来越重要。
鮈亚科鱼类生活在江河小支流和池塘等小水体中，栖息条件为静水或微流水环境的浅水地带，喜栖息于水体的中、下层，主要分布于各水系，生殖期为5月，主要摄食水生昆虫，其次为藻类和水生高等植物。但部分种分布区窄，为分布地特有种，其数量甚稀少，为临近濒危的偶见种类。
目前，鱼类鉴别的主要方法仍然是传统的形态分类方法，根据鱼体的形态特征，对鱼的种类进行鉴定，但在不同来源的动物志及鱼类志中缺乏统一的鉴定特征或者是鉴别征存在中间类型而难于区分。且该种方法需要大量的工作经验，同时也需要丰富的专业知识，对于鱼体的完整性要求也比较高。对于一些体型较小的鱼类或者身体被破坏的鱼类，可能无法进行鉴定。因此，提供一种鉴定鮈亚科鱼类的分子生物学方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种鉴定鮈亚科鱼类的特异性引物和方法，该方法具有检测速度快，识别精确度高，通量高，人为影响小等优点，可用于鮈亚科鱼类的分子鉴定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鉴定鮈亚科鱼类的引物，所述引物序列为：
F：5’-TACCTGTGGCA ATTACRCGCTGAT-3’；SEQ ID NO：1；
R：5’-TAAGARTAAAATGGTCCYAAACC-3’；SEQ ID NO：2；
序列中根据国际生物化学联合会(IUB)规定兼并密码子:R＝A/G；Y＝C/T；R代表A或者G；Y代表C或者T；
F为上游引物序列，R为下游引物序列，F与R形成引物对，用于鮈亚科鱼类的鉴定。
进一步，一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，具体步骤如下：
(1)确定鮈亚科鱼类的特异性引物：
①从NCBI数据库下载部分鮈亚科不同种鱼类的线粒体COI基因序列，通过不同种鮈亚科鱼类的COI序列比对，选取不同序列之间的保守片段；
②根据步骤①选取的保守片段，设计并筛选出鮈亚科鱼类的特异性引物；
③利用步骤②获取的特异性引物，对鮈亚科鱼类及其他鱼类的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
④将步骤③获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，鮈亚科鱼类能够扩增出条带，其他鱼类不能扩增出条带；回收条带，进行测序；
⑤将步骤④测序所得峰图文件用LASERGENE软件包中Seqman软件组装为一个contig文件，用NCBI中的BLAST软件进行比对，下载相似度高及其近源种序列，用MEGA 7.0构建系统发育树，计算遗传距离，当序列间遗传距离小于0.02时，初步确定该序列为鮈亚科鱼类序列，从而确定鮈亚科鱼类的特异性引物；
(2)鉴定鮈亚科鱼类：
①利用步骤(1)获得的特异性引物，对需要鉴别的鱼类DNA样本进行PCR扩增，获得扩增产物；
②将步骤①获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的条带，回收目的条带，进行测序；
③将步骤②测序所得序列进行比对，下载相似度高及其近源种序列，构建系统发育树，计算遗传距离；
④根据步骤③获得的遗传距离鉴定鮈亚科鱼类。
优选地，所述鮈亚科鱼类为多纹颌须鮈、点纹银鮈、犬首鮈、长体小鳔鮈、乐山小鳔鮈或中间银鮈。
优选地，所述鱼类基因组DNA的提取方法如下：取在55℃条件下烘干4小时的酒精浸泡的鱼类组织或新鲜的鱼类组织，置于1.5ml离心管，加入DNA提取液和蛋白酶K，消化过夜，用酚-氯仿法提取基因组DNA。
优选地，所述鱼类组织为鱼的肌肉、鱼鳍或卵。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μL，ddH2O 11μL，Mix 15μL，上下游引物(F，R)各1.5μL，终反应体系为30μL；；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。
优选地，进行所述琼脂糖凝胶电泳检测时，将3μL PCR扩增产物加入到制作完成的2％琼脂糖凝胶中，(琼脂糖凝胶中加入溴化乙锭，每100ml琼脂糖凝胶溶液中加入10μL11‰的溴化乙锭)，电泳时的电压为120V，电泳时间为20min。
进一步，Seqman使用默认设置组装，MEGA 7.0系统发育树构建采用邻接法(neighbor-joining method，NJ))原理的Kimura双参模型，1000个重复抽样，其他采用默认设置，计算遗传距离时采用默认设置。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种鉴定鮈亚科鱼类的引物和分子生物学方法，利用鮈亚科鱼类线粒体COI基因序列的保守性以及转录间隔种间的变异，设计出鮈亚科鱼类的特异性引物，从而可以快速、准确、直观地对鮈亚科鱼类进行鉴别，另外该方法易于操作，在提取鱼类DNA后，进行PCR扩增，随后进行电泳检测、测序和比对计算遗传距离即可。本发明的方法具有检测速度快，识别精确度高，通量高(单次PCR反应可识别96个样品)，人为影响小等优点，可用于鮈亚科鱼类的分子鉴定。本发明的方法可以对鱼类形态学等方法无法鉴定的鱼类组织、鱼类卵子等样本进行准确快速的鉴别；同时该方法对鱼类样本的需求量较小，很小的一块肌肉即可鉴定出鮈亚科鱼类的种类。该方法对于鱼类形态学分类不擅长的非专业人士来说具有很强的实用价值；同时，为打击非法捕捞、走私等提供了技术方面的支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明利用引物F和R进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M：DL2000Marker；1(MK241580)、2(MK241582)、3(MK241581)为乐山小鳔鮈肌肉组织的COI基因目的条带；4(MK241574)、5(MK241575)、6(MK241579)为犬首鮈肌肉组织的COI基因目的条带；7(MK241576)、8(MK241577)、9(MK241578)为似铜鮈肌肉组织的COI基因目的条带；10(MK241571)、11(MK241572)、12(MK241573)为长体小鳔鮈肌肉组织的COI基因目的条带；13(MK241583)、14(MK241584)、15(MK241570)为大鼻吻鮈肌肉组织的COI基因目的条带；16(MK234899)、17(MK234898)、18(MK234897)为中间银鮈肌肉组织的COI基因目的条带；19(MK234896)、20(MK234895)为多纹颌须鮈肌肉组织的COI基因目的条带；21(MK234893)、22(MK234892)、23(MK234891)为短须颌须鮈肌肉组织的COI基因目的条带；24(MK234894)为银鮈肌肉组织的COI基因目的条带。(括号内为提交至NCBI数据库线粒体COI基因序列登录号)
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，具体步骤如下：
(1)确定鮈亚科鱼类的特异性引物：
①从NCBI数据库下载部分鮈亚科不同种鱼类的线粒体COI基因序列(麦穗鱼Pseudorasbora parva登录号：KJ135626.1；点纹银鮈Squalidus wolterstorffi登录号：AP011392.1；小鳈Sarcocheilichthysparvus登录号：AP011332.1；唇Hemibarbus labeo登录号：DQ347953.2；长背小鳔鮈Microphysogobio longidorsalis登录号：AP011394.1；蛇鮈Saurogobio dabryi登录号：KU314696.1；太湖似刺鳊鮈Paracanthobrama guichenoti登录号：KU323961.1；似鮈Pseudogobio vaillanti登录号：KU314695.1；片唇鮈Platysmacheilus nudiventris登录号：KM502565.1；平口鮈Ladislavia taczanowskii登录号：KF441551.1等)，通过不同种鮈亚科鱼类的COI序列比对，选取不同序列之间的保守片段；
②根据步骤①选取的保守片段，设计并筛选出一对鮈亚科鱼类的一条正向特异性引物F和一条反向特异性引物R；
其中，F和R的引物序列为：
F：5’-TACCTGTGGCA ATTACRCGCTGAT-3’；SEQ ID NO：1；
R：5’-TAAGARTAAAATGGTCCYAAACC-3’；SEQ ID NO：2；
其中，序列中根据国际生物化学联合会(IUB)规定兼并密码子:R＝A/G；Y＝C/T；
R代表A或者G；Y代表C或者T；
③利用步骤②获取的特异性引物，对鮈亚科鱼类及其他鱼类的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
④将步骤③获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现鮈亚科鱼类能够扩增出条带，其他鱼类不能扩增出条带；回收条带，进行测序；
⑤将步骤④测序所得峰图文件用LASERGENE软件包中Seqman软件组装为一个contig文件，用NCBI中的BLAST软件进行比对，下载相似度高及其近源种序列，用MEGA 7.0构建系统发育树，计算遗传距离，当序列间遗传距离小于0.02时，初步确定该序列为鮈亚科鱼类序列，从而确定鮈亚科鱼类的特异性引物为F和R；
(2)鉴定鮈亚科鱼类：
①取鮈亚科鱼类多纹颌须鮈、点纹银鮈、犬首鮈、长体小鳔鮈、乐山小鳔鮈、中间银鮈等新鲜的肌肉组织或者酒精浸泡的肌肉组织3mg，酒精样品需55℃烘干4h，过夜消化后，用酚-氯仿法提取基因组DNA，待酒精风干后，加入双蒸水-20℃保存备用；
②采用F和R引物对，对步骤①获得的DNA模板进行PCR扩增；PCR反应体系为：DNA样本(1μL)，上下游引物(F,R)各1.5μL，ddH2O(11μL)，市售Mix酶(15μL)；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，循环次数为30次；72℃延伸10min。将扩增产物送公司进行测序，测序结果经过Seqman组装，NCBI Blast后下载近源物种序列，以及MEGA 7.0遗传距离计算后，确定F和R引物为鮈亚科鱼类的特异性引物；
③采用F和R，对待鉴别的DNA模板(鮈亚科鱼类乐山小鳔鮈、犬首鮈、似铜鮈、长体小鳔鮈、大鼻吻鮈、中间银鮈、多纹颌须鮈、短须颌须鮈、银鮈的肌肉组织提取的基因组DNA)进行PCR扩增；PCR反应体系为：DNA样本(1μL)，上下游引物(F,R)各1.5μL，ddH2O(11μL)，市售Mix酶(15μL)；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，循环次数为30次；72℃延伸10min；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用引物F和R进行电泳检测的结果如图1所示；表明待鉴别的物种均为鮈亚科鱼类。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种鉴定鮈亚科鱼类的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tacctgtggc aattacrcgc tgat 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
taagartaaa atggtccyaa acc 23

Claims (6)

1.一种鉴定鮈亚科鱼类的引物，其特征在于，所述引物序列为：
F：5’-TACCTGTGGCAATTACRCGCTGAT-3’；SEQ ID NO：1；
R：5’-TAAGARTAAAATGGTCCYAAACC-3’；SEQ ID NO：2；
其中，R代表A或者G；Y代表C或者T。
2.一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)确定鮈亚科鱼类的特异性引物：
①根据鮈亚科不同种鱼类线粒体COI基因序列，选取不同序列之间的保守片段；
②根据步骤①选取的保守片段，设计并筛选出鮈亚科鱼类的特异性引物；
③利用步骤②获取的特异性引物，对鮈亚科鱼类及其他鱼类的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
④将步骤③获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，鮈亚科鱼类能够扩增出条带；回收条带，进行测序；
⑤将步骤④测序所得序列进行比对，下载相似度高及其近缘种序列，构建系统发育树，计算遗传距离，当序列间遗传距离小于0.02时，初步确定该序列为鮈亚科鱼类序列，从而确定鮈亚科鱼类的特异性引物；
(2)鉴定鮈亚科鱼类：
①利用步骤(1)获得的特异性引物，对需要鉴别的鱼类DNA样本进行PCR扩增，获得扩增产物；
②将步骤①获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的条带，回收目的条带，进行测序；
③将步骤②测序所得序列进行比对，下载相似度高及其近缘种序列，构建系统发育树，计算遗传距离；
④根据步骤③获得的遗传距离鉴定鮈亚科鱼类。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，其特征在于，所述鮈亚科鱼类为多纹颌须鮈、点纹银鮈、犬首鮈、长体小鳔鮈、乐山小鳔鮈或中间银鮈等鮈亚科鱼类代表种。
4.根据权利要求3所述的一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，其特征在于，所述鱼类基因组DNA的提取方法如下：取在55℃条件下烘干4h的酒精浸泡的鱼类组织或新鲜的鱼类组织，置于1.5ml离心管，加入DNA提取液和蛋白酶K，消化过夜，用酚-氯仿法提取基因组DNA。
5.根据权利要求4所述的一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，其特征在于，所述鱼类组织为鱼的肌肉、鱼鳍或鱼卵。
6.根据权利要求5所述的一种鉴定鮈亚科鱼类的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μL，上下游引物(F,R)各1.5μL，ddH2O 11μL，Mix 15μL，终反应体系为30μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。
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