CN106282380A - 一种基于dna条形码技术的鱼类及其生肉制品品质监管方法及其系统 - Google Patents

一种基于dna条形码技术的鱼类及其生肉制品品质监管方法及其系统 Download PDF

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姜伟
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Abstract

本发明涉及一种基于DNA条形码技术的鱼类及其生肉制品监管方法及其系统,所叙方法包括:(1)提取鱼类及其生肉制品DNA,获取分子条形码序列,即线粒体COI同源序列(2)通过DNA条形码数据库进行物种鉴定,将分子鉴定结果与产品信息转换为二维码图像粘贴至包装表面;(3)鱼类及其生肉制品流通过程中,消费者可借助智能设备扫描商品唯一的二维码获取产地、种类、加工记录、产品检测等信息。本发明将分子生物学条形码与二维条形码技术相结合,实现了商业流通中鱼肉制品的自动化监管。

Description

一种基于DNA条形码技术的鱼类及其生肉制品品质监管方法 及其系统
技术领域
本发明分子生物学领域,具体涉及一种基于DNA条形码技术的鱼类及其生肉制品品质监管方法及其系统。
背景技术
现代商品零售业条形码编码系统是一种由计算机按一定编码规则排列的条、空符号组成的信息系统,原理是通过N个数字的排列组合得到10N种编码方式,每一种编码代表一种商品,依次区分不同类型商品,实现商品信息的自动化扫描。类似地,DNA序列作为遗产信息载体有A、T、G、C四种碱基,那么从理论上讲,只需10个碱基位点就能出现410种(大于10亿)编码方式,远大于现存物种的数目。但在现实自然界中生物的进化是要受到自然选择的影响,这就导致了在某些位点上的碱基是固定不变的,从而减少了编码组合的数量。由于分子生物学技术的应用,尤其是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术及基因测序技术的快速发展,可以短时间内获取几百个碱基甚至更长的特异性DNA序列。近代分子生物学技术的兴起,为生物分类学科注入了新的活力。
DNA条形码(Barcoding)是一种近几年刚刚兴起的新技术,它的原理是利用基因组DNA上一个标准的或者大家公认的基因片段,作为分子靶标来进行大范围扫描完成种级水平的物种鉴定。我国是鱼肉消费大国,鱼类及其生肉制品种类繁多,包括生鱼片、海鲜、冷冻加工品(鱼片或者鱼段)、烤鱼片及鱼糜制品等。近年来鱼类及其生肉制品的掺假行为频频曝光,给人们的健康造成严重威胁。目前我国的鱼类生产企业缺乏有效的信息化规范管理手段,造成鱼类产地来源不明、不同种类标价混乱,消费者对购买的鱼类产品缺乏有效的信息获取途径,这些问题制约了我国水产业的健康发展。由于产品流通环节较多、加之药物残渣、毒素等因素的存在,导致了伪劣的鱼肉制品产品质量下降,威胁着人民健康。如何快速有效的识别鱼类在生物多样性的保护、生态学调查、鱼类资源的开发利用等诸多领域至关重要且具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于DNA条形码技术的水产品商业化监管方法及其系统,可准确、高效的完成鱼类及其生肉制品的快速鉴定。
本发明技术方案:
一种基于DNA条形码技术的鱼类及其生肉制品品质监管方法,包括如下步骤:
步骤一、分子生物学手段获得鱼类制品分子条形码序列:提取样品基因组DNA、特异性引物设计、测序及数据处理;
步骤二、DNA条形码数据库鉴定:进行序列相似比对,分析遗传距离,获得鱼种类鉴定结果;
步骤三、根据步骤二鉴定鱼种类结果结合其生肉制品的商品信息输出二维码标识:基于鱼类DNA条形码数据库平台按照产品批次生成二维码图像,打印、粘贴防水标签;
步骤四、不同移动终端扫描二维码,立即可获得鱼类及其生肉制品信息,追溯任意同类产品信息。
优选地,所述步骤一鱼肉制片样品DNA条形码有效序列长度大于50bp。
优选地,所述步骤一作为DNA条形码片段为线粒体COI序列。
优选地,所述步骤一特异性引物序列为:
COI1-F:TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACR,
COI1-R:TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA;
COI2-F:TCTCAACCAACCACAAAGACATTGG,
COI2-R:GACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA;
COI3-F:TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC,
COI3-R:TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。
优选地,所述步骤一鱼肉制片的样品来源为鱼类组织样本或血液样本,所述组织样本包括鳍条、肌肉、鳞片和粘液。
优选地,所述步骤二相似性比对获得鱼类物种名,相同种类鱼类DNA条形码相似性比对相似度高达99%,不同种类鱼类及其生肉制品间的遗传距离>2%。
优选地,所述步骤三中DNA条形码数据库作为整个系统的工作平台,实现基因条形码与商品信息一一对应,自动生成一个唯一的二维码。
进一步优选地,所述二维码包含物种图像、DNA条形码图解、物种序列、产品名称、单位规格、储藏方法、流通表单、鱼类产地、养殖情况、生产操作记录、产品加工记录、产品检测记录或其他详细溯源信息,实现鱼类质量溯源信息的管理。
进一步优选地,所述二维码防水标签粘贴在商品包装表面或者固定在鱼类尾部鳍条,所述二维码采用的材料为可食用油墨,所述可食用油墨包括按重量份计的以下组分:食用色素色剂10-35份;食用连接料20-85份;魔芋葡聚糖0.001-0.05份;食用纳米SiO2 0.5-5份。
更进一步优选地,所述的食用连接料包括下述重量份的组分:水20-80份;油20-80份;乳化剂0.01-20份。
更进一步优选地,所述的油为大豆油,甘油,氢化大豆油,氢化蓖麻油、精制玉米油或橄榄油的其中之一或者任意组合。
更进一步优选地,所述的乳化剂卵磷脂、黄原胶,聚山梨酯80或阿拉伯胶的其中之一或者任意组合。
将食用色素色剂、魔芋葡聚糖加入水中,搅拌溶解,再一次加入食用连接料、魔芋葡聚糖、食用纳米SiO2溶解,研磨得到食用油墨。
优选地,所述步骤三二维码防水标签可以通过智能手机可以是GPRS网络、3G网络、4G网络和WiFi网络中的任意一种查看产品的信息。
本发明有益效果如下:
1、本发明能在缺乏专业鉴定人员情况下对鱼类及其生肉制品不同大小或者残缺个体进行准确鉴定,具有准确、迅速、便捷和费用低的特点。
2、本发明鉴定方法对使用的仪器要求较低,一般分子生物学实验室均可进行,测序长度要求较短,在满足准确鉴定鱼类种类前提下,大大节约测序成本。
3、本发明中鱼类及生肉制品独有一个二维码,不同种类、个体和批次产品间均有差异,不易伪造和仿造。此信息具备唯一可靠性,具备“一物一码,全程追溯”特征,避免张冠李戴。
4、本发明形成了现代化水产品信息服务系统生产者-产品-消费者之间的生态链,鱼类制品二维码与生产、流通和销售等环节相关联,养殖、加工、销售的各个环节相关联的个人、企业或者相关部门都被完整记录下来,这种现代化水产品信息服务系统利于有关部门对鱼类及其生肉制品生产经营活动的监督管理。
5、二维码具有储存量大、安全性高的特点,包含除了文字和数字外大量可供消费者参考的信息。
6、防水标签粘贴在商品表面或者固定在鱼类尾鳍,可防止商品流通过程中信息的损失。二维码具备自动错误纠正能力,即使商品二维码变脏或破损,也可自动恢复数据,适应产品流通中标签一定程度的损坏。
7、二维码信息中包含了DNA条形码图解,不同颜色标识不同碱基,更直观的反映鱼的基因信息,可追溯的信息更加准确、全面。二维码是可以脱离数据库而单独使用可以用以消费者扫码印制条件要求不高,可被多种阅读设备识读。
8、DNA条形码有效序列长度大于50bp,已包含足够的信息用于鱼肉制品鉴定。
9、本发明采用的条形码片段为线粒体COI(线粒体细胞色素C氧化酶I),具备以下三个特点:一是与整个基因组DNA相比要短得多;二是在细胞内的拷贝数高,获得技术简单;三是序列非常保守,在物种内不同个体之间只有1-2%的差异,而近缘种间的差异大,非常适合作为DNA条形码技术的分子标记。对于鱼类具有较高的物种识别能力,可大范围进行种类扫描,减少鱼类鉴定的工作量。
10、本发明仅采用三对特异性引物序列就完成常见鱼类DNA条形码PCR扩增,鉴定出鱼的种类,减少工作量,节约人力物力。
11、本发明采用的二维码材料为可食用的油墨,通过食用色素色剂、食用连接料、魔芋葡聚糖作为结构助剂、食用纳米SiO2组合,得到的食用油墨材料流动性与润滑性好,可达到更好的分散悬浮和稳定,且用量少、遮蔽力好、光泽优、粒度细腻、成膜连续、均匀光滑、膜层薄、印刷图像清晰、印刷适应性好;完全符合食用及药用标准;腐蚀性小,无毒无害;耐油耐酸性,固色性能好。
附图说明
图1为本发明的实现水产品商业化监管的步骤流程图;
图2为本发明二维码图片;
图3为本发明二维码图片扫描后显示的信息。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明,但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
1、材料
市场上采集红鳍东方鲀、草鱼、鲤鱼、黄颡鱼等4种各一条(表1),全部样本均由中华鲟研究所进行形态学鉴定。
表1鱼类及生肉制品样本及引物统计表
2、基因组DNA提取
取10mg左右的组织于1.5mL的离心管中,加入494μL的DNA裂解液和6μL的蛋白酶K(20mg/mL);将离心管于56℃恒温水浴锅中裂解3小时,水浴完后,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),摇匀至乳浊液,离心10min,12000r/min;吸取上清,转入新的1.5mL离心管中,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),摇匀至乳浊液,离心10min,12000r/min。吸取上清,转入新的1.5mL离心管中,加入两倍体积无水乙醇(提前预冷),颠倒混匀,-20℃静置30min,离心10min,12000r/min;弃去上清,75%乙醇洗涤2次;烘干后加入50μL dH2O,溶解DNA;取2μL制备1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,同时吸取1μL稀释后使用紫外分光光度计进行检测;将原液存放于-20℃冰箱保存。
3、PCR扩增和测序
PCR反应体系25μL:10×PCR Buffer 2.5μL,dNTPs(2.5Mm)1.0μL,TaKaRa Taq(5U/μL)0.5μL,引物各0.25μL,DNA模版1.0μL,去离子水19.0μL。PCR反应程序:95℃、3min;94℃、30s,52℃、40s,72℃、1min,35个循环;72℃、10min。PCR扩增完成后,以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,挑选扩增成功且条带单一的产物送测。
4、序列比对及分析
采用Chromas v2.3查看序列波峰图,将测序成功的序列应用BioEdit 7.0软件人工比对拼接,将处理过的DNA条形码序列进行BLAST相似性比对,完成物种鉴定,MEGA分析序列间的K2P遗传距离(见表2)。
表2 4种鱼类K2P遗传距离表
5、条形码信息输出
鉴定后的物种信息连同采集的生产信息在线制作二维码图标,输出二维码图标见图2。其中条形码或二维条形码包括产地、生成日期、商品流通等信息(图3)。
6、条形码信息查询
利用一体机将鱼肉制品的二维码打印到防水标签纸上,其中二维码图像为1.0cm*1.0cm,带500万分辨率摄像头的智能手机经测试可轻易扫描识别。商品二维码信息在超市购物平台、智能手机、扫描设备等读取设备均可获取,此信息具备唯一可靠性,不会与其他鱼类混乱,具备“一物一码,全程追溯”特征。非科研人员也可以直接通过扫描二维码获得该鱼的具体信息。
所述二维码防水标签粘贴在商品包装表面或者固定在鱼类尾部鳍条,所述二维码采用的材料为可食用油墨,所述可食用油墨包括食用色素:
实施例2
实施例1中的所述二维码采用的材料为可食用油墨,所述可食用油墨包括按重量份计的以下组分:包括食用色素色剂10份;食用连接料20份;魔芋葡聚糖0.05份;食用纳米SiO2 0.5份。
所述的食用连接料包括下述重量份的组分:水20份;油20份;乳化剂10份。
所述的油为大豆油。
所述的乳化剂卵磷脂。
将食用色素色剂、魔芋葡聚糖加入水中,搅拌溶解,再一次加入食用连接料、魔芋葡聚糖、食用纳米SiO2溶解,研磨得到食用油墨。
实施例3
实施例1中的所述二维码采用的材料为可食用油墨,所述可食用油墨包括按重量份计的以下组分:食用色素色剂35份;食用连接料85份;魔芋葡聚糖0.03份;食用纳米SiO23份。
所述的食用连接料包括下述重量份的组分:水40份;油60份;乳化剂15份。
所述的油为氢化蓖麻油。
所述的阿拉伯胶。
将食用色素色剂、魔芋葡聚糖加入水中,搅拌溶解,再一次加入食用连接料、魔芋葡聚糖、食用纳米SiO2溶解,研磨得到食用油墨。
实施例4
实施例1中的所述二维码采用的材料为可食用油墨,所述可食用油墨包括按重量份计的以下组分:食用色素色剂22份;食用连接料34份;魔芋葡聚糖0.02份;食用纳米SiO20.8份。
所述的食用连接料包括下述重量份的组分:水50份;油65份;乳化剂15份。
所述的油为氢化蓖麻油。
所述的乳化剂为卵磷脂与黄原胶按1:2的比例组合。
将食用色素色剂、魔芋葡聚糖加入水中,搅拌溶解,再一次加入食用连接料、魔芋葡聚糖、食用纳米SiO2溶解,研磨得到食用油墨。
实施例5
实施例1中的所述二维码采用的材料为可食用油墨,所述可食用油墨包括按重量份计的以下组分:食用色素色剂65份;食用连接料75份;魔芋葡聚糖0.03份;食用纳米SiO23份。
所述的食用连接料包括下述重量份的组分:水70份;油70份;乳化剂15份。
食用色素色剂为食用级炭黑、食用级辣椒红、甜菜红、红曲红、铁红,食用级栀子黄、姜黄素,食用级栀子蓝、靛蓝的其中其中之一或任意组合。
所述的油橄榄油。
所述的乳化剂为黄原胶。
将食用色素色剂、魔芋葡聚糖加入水中,搅拌溶解,再一次加入食用连接料、魔芋葡聚糖、食用纳米SiO2溶解,研磨得到食用油墨。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案,而不应视为对于本发明的限制,本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下,可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案,包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进,也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于DNA条形码技术的鱼类及其生肉制品品质监管方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、分子生物学手段获得鱼类制品分子条形码序列:提取样品基因组DNA、特异性引物设计、测序及数据处理;
步骤二、DNA条形码数据库鉴定:进行序列相似比对,分析遗传距离,获得鱼种类鉴定结果;
步骤三、根据步骤二鉴定结果结合其生肉制品的商品信息输出二维码标识:基于鱼类DNA条形码数据库平台按照产品批次生成二维码图像,打印、粘贴防水标签;
步骤四、不同移动终端扫描二维码,立即可获得鱼类及其生肉制品信息,追溯任意同类产品信息。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤一鱼肉制片样品DNA条形码有效序列长度大于50bp。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤一作为DNA条形码片段为线粒体COI序列。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤一特异性引物序列为:
COI1-F:TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACR,
COI1-R:TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA;
COI2-F:TCTCAACCAACCACAAAGACATTGG,
COI2-R:GACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA;
COI3-F:TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC,
COI3-R:TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤一鱼肉制片的样品来源为鱼类组织样本或血液样本,所述组织样本包括鳍条、肌肉、鳞片和粘液。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤二相似性比对获得鱼类物种名,相同种类鱼类DNA条形码相似度高达99%,不同种类鱼类及其生肉制品间的遗传距离>2%。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤三中DNA 条形码数据库作为整个系统的工作平台,实现基因条形码与商品信息一一对应,自动生成一个唯一的二维码。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述二维码包含物种图像、DNA条形码图解、物种序列、产品名称、单位规格、储藏方法、流通表单、鱼类产地、养殖情况、生产操作记录、产品加工记录、产品检测记录或其他详细溯源信息,实现鱼类质量溯源信息的管理。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述二维码防水标签粘贴在商品包装表面或者固定在鱼类尾部鳍条,所述二维码采用的材料为可食用油墨,所述可食用油墨包括按重量份计的以下组分:食用色素色剂10-35份;食用连接料20-85份;魔芋葡聚糖0.001-0.05份;食用纳米SiO2 0.5-5份。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤三二维码防水标签被智能手机任意扫描,通过GPRS 网络、3G 网络、4G 网络和WiFi网络中的任意一种查看产品的信息。
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