CN109468391B - 应用于青鱼亲缘关系鉴定的双重pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种应用于青鱼亲缘关系鉴定的双重PCR方法，包括如下步骤：（1）提取青鱼样本的基因组DNA；（2）利用5组微卫星引物进行双重PCR；（3）PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；（4）统计PCR扩增产物的基因型，分析个体之间的亲缘关系。所述的5组微卫星引物均为多态性高、条带清晰的位点，可以实现对青鱼的遗传多样性检测、个体识别，还可以鉴定个体之间的亲缘关系的远近，避免青鱼个体之间近亲繁殖，所用时间和成本均比传统的PCR反应减少了一半。经试验验证，采用本方法对30尾青鱼进行亲缘关系鉴定，可以准确鉴定出每个样本之间的亲缘关系，根据鉴定结果可以计算出样本之间遗传距离的远近。

Description

应用于青鱼亲缘关系鉴定的双重PCR方法
技术领域
本发明属于动物分子遗传学领域，具体涉及一种应用于青鱼亲缘关系鉴定的双重PCR方法。
背景技术
青鱼(拉丁学名：Mylopharyngodon piceus；英文名：Black carp)，硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，青鱼属。青鱼别称黑鲩、乌鲩、螺蛳鲩，在安徽俗称“乌混”、“黑混”或“螺蛳混”，因其体黑、喜食螺蛳而得名。
体色青黑，鳍灰黑色。头宽平，口端位，无须，下咽齿1行，呈臼齿状。栖息中下层，主食螺蛳、蚌、虾和水生昆虫。分布于中国各大水系，主要分布于我国长江以南的平原地区，长江以北较稀少。青鱼是长江中、下游和沿江湖泊里的重要渔业资源和各湖泊、池塘中的主要养殖对象，与草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)并称“四大家鱼”。4-5龄性成熟，在河流上游产卵，可人工繁殖。青鱼个体大，生长迅速，最大个体达70kg，体长达1m余。在中国境内，2005年在南京六合区金牛湖捕获的，长1.86米、重114公斤，被制成最大的青鱼标本，经鳞片鉴定约四十岁。
微卫星DNA，又被称作短串连重复(Short Tandem Repeats,STRs)或简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSRs)，每单元长度在1～6bp之间，根据重复单元的构成与分布，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型(pure)，复合型(compound)和间断型(interrupted)。微卫星标记多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性等优点。有关青鱼的微卫星标记多重PCR国内外未见报道。本发明提供了一种利用青鱼微卫星双重PCR体系鉴定个体之间的亲缘关系的方法，实现了对青鱼个体之间的亲缘关系的测量进而确定个体之间的亲缘关系，为青鱼的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于青鱼亲缘关系鉴定的双重PCR引物组合及其方法，5组微卫星引物均为多态性高、条带清晰的位点，可以快速鉴定个体之间的亲缘关系，避免青鱼之间近亲繁殖，省时省力，可广泛应用于青鱼种质鉴定、增殖放流评估等。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于青鱼亲缘关系鉴定的双重PCR引物组合，包括5组微卫星引物，引物序列如下：
Figure BDA0001929493520000021
用于青鱼亲缘关系鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)提取青鱼样本的基因组DNA；
(2)利用上述引物组合进行双重PCR；
(3)PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；
(4)统计PCR扩增产物的基因型，分析个体之间的亲缘关系。
优选地，各组PCR的退火温度为60℃。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
本发明提供的5组微卫星引物均为多态性高、条带清晰的位点，可以实现对青鱼的遗传多样性检测、个体识别，还可以鉴定个体之间的亲缘关系的远近，避免青鱼个体之间近亲繁殖。同时，本方法所用时间和成本均比传统的PCR反应减少了一半，具有巨大的实用价值，可广泛应用于青鱼种质鉴定、增殖放流评估等。
附图说明
图1为个体之间的聚类分析图。
具体实施方式
实施例1：
通过转录组测序设计1000对微卫星标记引物，用青鱼DNA为模板，检测这1000对微卫星标记引物的质量，筛选条带清晰，多态性高的微卫星标记引物，最终获得了52对多态性高并能稳定扩增的微卫星标记。然后根据筛选获得的微卫星标记引物扩增的PCR产物大小进行两两配对，筛选稳定性较高的组合，最终获得5组青鱼微卫星标记的双重PCR反应体系，引物如下所示：
Figure BDA0001929493520000031
实施例2：
一种双重PCR体系在青鱼亲缘关系鉴定中的实际应用，其步骤是：
1.从青鱼养殖场的4个青鱼种群内随机取30尾青鱼，第一个种群取一条鱼，第二个种群取2条鱼，第三个种群取3条鱼，第四个种群取24条鱼，每条鱼进行打标做标记，然后采集青鱼的鳍条，为了防止实验结果人为干预，所以把样本顺序打乱，根据实验结果验证本方法的准确性。打乱后的顺序为：第9条鱼取自第一个种群，第1条和第11条来自第二个种群，第10、13和19条鱼来自第三个种群，其余的来自第四个种群。提取青鱼的基因组DNA，提取方式采取试剂盒抽提途径。
2.利用本发明提供的应用于青鱼亲缘关系鉴定的双重PCR方法对30个青鱼个体进行PCR反应，PCR反应体系是15ul：10×PCR Buffer 1ul，2.5mmol/L dNTP 1ul，MgCl2 1ul，每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板1ul，超纯水6.5ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度60℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用10％的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。
3.用软件BIO-PROFIL判断聚丙烯酰胺胶显示的各个个体的等位基因片段的大小。
4.根据每个个体的在每个微卫星位点上的等位基因大小用NTsys软件画出各个个体之间的聚类分析图，如下图1所示。根据聚类分析结果可以判断各个个体之间的亲缘关系。
利用本方法可以准确判断这30个个体之间的亲缘关系。这30个个体分为4个群体，第一个群体为9号个体，第二个群体为1和11号个体，第三个群体为10、13和19号个体，剩余的个体为第四个群体。该实验结果和采样顺序一致，充分证明了本方法的准确性。

Claims (2)

1.用于青鱼亲缘关系鉴定的双重PCR引物组合，其特征在于，由5组微卫星引物组成，引物序列如下：
Figure FDA0003019310810000011
2.权利要求1所述的双重PCR引物组合用于青鱼亲缘关系鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)提取青鱼样本的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的引物组合进行双重PCR，PCR反应体系15μL：10×PCR Buffer1μL，2.5mmol/L dNTP 1μL，MgCl2 1μL，每组反应体系两对引物的上下游引物各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，超纯水6.5μL，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度60℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
(3)PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；
(4)统计PCR扩增产物的基因型，分析个体之间的亲缘关系。
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