CN110878364A - 一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的dna条形码及其鉴别方法和应用 - Google Patents
一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的dna条形码及其鉴别方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码及其鉴别方法和应用，属于分子生物学技术领域，本发明所述中颌棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述赤鼻棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。扩增所述的DNA条形码的引物，包括F295和R517；所述方法包括以下步骤：提取待鉴别样本的基因组DNA；用所述的引物扩增所述的待鉴别DNA；将扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；确定待鉴别样本的种类。利用本发明提供的DNA条形码鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀结果稳定，可重复性强。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码及其鉴别方法和应用。
背景技术
中颌棱鳀体侧扁，在腹鳍前后处的腹部位置有一排锐利的棱鳞：腹鳍前15～16个，腹鳍后10个，共约25～26个。头略小，侧扁。吻钝，吻长短于眼径。口大倾斜；上颌骨末端尖但短，仅达前鳃盖骨后缘；第一鳃弓下枝鳃耙数28～31。体被圆鳞，鳞中大，易脱落，无侧线；背鳍前方具1小棘，胸、腹鳍具腋鳞。背鳍起始于体中部，具12软条；臀鳍长，具28～34分枝之软条；尾鳍叉形。体背部青灰色，具暗灰色带，侧面银白色。背鳍、胸鳍及尾鳍黄色或淡黄色；腹鳍及臀鳍淡色。中颌棱鳀同赤鼻棱鳀一样，皆为海南省近海较常见鱼种。其肉质细腻鲜美，具有较高的食用价值。由于二者形态比较相似，且分布区存在一定重叠，仅凭借形态特征较难将两者区分，因此寻找区分中颌棱鳀和赤鼻棱鳀的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。目前用于鉴定中颌棱鳀的微型DNA条形码技术还没有见正式报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码及其鉴别方法和应用；采用微型DNA条形码将两种棱鳀进行鉴别，操作简单，易于掌握，准确性高；有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码，所述中颌棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述赤鼻棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了扩增所述的DNA条形码的引物，包括F295和R517；所述F295的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述R517的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明提供了一种利用DNA条形码鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的方法，包括以下步骤：
1)提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA；
2)用所述的引物扩增步骤1)中所述的待鉴别DNA获得扩增产物；
3)将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物序列和中颌棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为中颌棱鳀；如果所述扩增产物序列和赤鼻棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为赤鼻棱鳀。
优选的，步骤2)中所述扩增的扩增体系以25.15μL计，包括以下组分：超纯水17.5μL，10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，rTaq 0.15μL，待鉴别DNA 1μL，引物F295 1μL，引物R5171μL。
优选的，步骤2)中所述扩增的扩增程序如下：
94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
优选的，所述扩增产物的序列通过将扩增产物测序获得。
本发明提供了所述的鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码、扩增所述DNA条形码的引物在鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码，位于mtDNA 12S rRNA上；利用所述DNA条形码鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀结果稳定，可重复性强；鉴别方法简单。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码，所述中颌棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述赤鼻棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码位于mtDNA 12S rRNA上，所述中颌棱鳀的DNA条形码序列具体如下：
CACCGCGGTTATACGAGAGGCCCTAGTTGATAAATACGGCGTAAAGAGTGGTTATGGAATTATTTTTATTAAAGCCGAAAGCCCCTTAGACTGTCATACGCACCCAGAGGCTAGAACCCCACTAAACGAAAGTAGCTTTATTAATGCCCACCAGAACCCACGACAGCTGGGACA；
所述赤鼻棱鳀的DNA条形码序列具体如下：
CACCGCGGTTATACGAGAGGCCCAAGTTGACTAATACGGCGTAAAGAGTGGTTATGGAGTCCTTACACTAAAGCCGAAAGCCCCTTAAACTGTCATACGCACCCAGGGGCCAGAATCCCACCGCACGAAAGTAGCTTTATTAACGCCCACCAGAACCCACGACAGCTAGGACA。
在本发明中，所述中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码序列存在19个碱基的差异，表现为5个颠换，13个转换、1个插入/缺失。
在本发明中，中颌棱鳀种内(包括三亚群体，陵水群体和海口群体)的扩增结果表现出高度的一致性；与赤鼻棱鳀的扩增结果差异显著。本发明提供的基于12S rRNA基因的碱基差异的DNA条形码能够区分中颌棱鳀和赤鼻棱鳀的种质。
本发明提供了扩增所述的DNA条形码的引物，包括F295和R517；所述F295的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；所述R517的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
本发明还提供了一种利用DNA条形码鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的方法，包括以下步骤：1)提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA；2)用所述的引物扩增步骤1)中所述的待鉴别DNA获得扩增产物；3)将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物序列和中颌棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为中颌棱鳀；如果所述扩增产物序列和赤鼻棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为赤鼻棱鳀。
在本发明中，提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA。本发明对所述待鉴别样本的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物基因组DNA提取方法即可，可采用商品化的试剂盒进行提取。
本发明在获得所述待鉴别DNA后，用所述的引物扩增所述的待鉴别DNA获得扩增产物。在本发明中，所述扩增的扩增体系以25.15μL计，优选的包括以下组分：超纯水17.5μL，10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，rTaq 0.15μL，待鉴别DNA 1μL，引物F295 1μL，引物R517 1μL。在本发明中，所述扩增的扩增程序优选的如下：94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。本发明在所述扩增结束后优选的还包括扩增产物的纯化步骤；本发明对所述纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的PCR产物纯化试剂盒即可。本发明在获得所述纯化产物后，优选的将所述扩增产物测序获得扩增产物的序列。本发明对所述测序的方法没有特殊限定，优选的委托生物测序公司进行。
本发明在获得所述扩增产物序列后，将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物序列和中颌棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为中颌棱鳀；如果所述扩增产物序列和赤鼻棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为赤鼻棱鳀。
本发明还提供了所述的鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码、扩增所述DNA条形码的引物在鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀中的应用。利用本发明提供的鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码、扩增所述DNA条形码的引物能够实现中颌棱鳀与赤鼻棱鳀简单、快速、准确的鉴别。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选用海南三亚、陵水和海口近海的中颌棱鳀与三亚近海的赤鼻棱鳀，组成3个不同地理群体的中颌棱鳀样本群和赤鼻棱鳀样本群，提取4个样本群中个体的DNA，然后以所提取的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；
所述的引物序列为F295(SEQ ID No.3)：5’-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；R517(SEQ ID No.4)：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’；
所述的PCR扩增的反应体系组成为：
0.2mL离心管中依次加入：
PCR扩增程序为94℃预变性3min，(94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s)×38个循环，72℃延伸5min，4℃保存∞。
使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，具体纯化步骤如下：(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。提前记录1.5mL离心管重量，并计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)；(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)；(3)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；并加入1个凝胶体积的异丙醇；(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12000×g离心1min，弃滤液；(5)将制备管置回2ml离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液；(6)将制备管置回2ml离心管，加650μL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用650μL Buffer W2洗涤一次，12000×g离心1min；(7)将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min；(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25-30μLEluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。收集洗脱液后送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序平台为美国ABI公司3730XL型测序仪。测序结束后对4个群体的测序结果进行比对。
由中颌棱鳀和赤鼻棱鳀mtDNA 12S rRNA基因174bp序列排序结果可以看出中颌棱鳀与赤鼻棱鳀存在19个碱基的差异，表现为5个颠换，13个转换、1个插入/缺失。
3个中颌棱鳀群体和赤鼻棱鳀的mtDNA 12S rRNA基因174bp序列比对结果为：
SYC CACCGCGGTT ATACGAGAGG CCCAAGTTGA CTAATACGGC GTAAAGAGTG
SYZ ********** ********** ***T****** TA******** **********
LSZ ********** ********** ***T****** TA******** **********
HKZ ********** ********** ***T****** TA******** **********
Ruler.........10 .........20 .........30 .........40 .........50
SYC GTTATGGAGT CCTTAC-ACT AAAGCCGAAA GCCCCTTAAA CTGTCATACG
SYZ ********A* TA**TTT*T* ********** ********G* **********
LSZ ********A* TA**TTT*T* ********** ********G* **********
HKZ ********A* TA**TTT*T* ********** ********G* **********
Ruler .........60 .........70 .........80 .........90 .........100
SYC CACCCAGGGG CCAGAATCCC ACCGCACGAA AGTAGCTTTA TTAACGCCCA
SYZ *******A** *T****C*** **TAA***** ********** ****T*****
LSZ *******A** *T****C*** **TAA***** ********** ****T*****
HKZ *******A** *T****C*** **TAA***** ********** ****T*****
Ruler........110 ........120 ........130 ........140 ........150
SYC CCAGAACCCA CGACAGCTAG GACA
SYZ********** *********A****
LSZ********** *********A****
HKZ********** *********A****
Ruler........160........170...174
其中“*”表示相同的碱基序列位点，SYC：三亚近海赤鼻棱鳀样品；SYZ：三亚近海中颌棱鳀样品；LSZ：陵水近海中颌棱鳀样品；HKZ：海口近海中颌棱鳀样品。
测序结果表明，中颌棱鳀的DNA条形码序列为：CACCGCGGTTATACGAGAGGCCCTAGTTGATAAATACGGCGTAAAGAGTGGTTATGGAATTATTTTTATTAAAGCCGAAAGCCCCTTAGACTGTCATACGCACCCAGAGGCTAGAACCCCACTAAACGAAAGTAGCTTTATTAATGCCCACCAGAACCCACGACAGCTGGGACA；
赤鼻棱鳀的DNA条形码序列为：
CACCGCGGTTATACGAGAGGCCCAAGTTGACTAATACGGCGTAAAGAGTGGTTATGGAGTCCTTACACTAAAGCCGAAAGCCCCTTAAACTGTCATACGCACCCAGGGGCCAGAATCCCACCGCACGAAAGTAGCTTTATTAACGCCCACCAGAACCCACGACAGCTAGGACA。
中颌棱鳀的3个地点采集的16尾样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 海南热带海洋学院
<120> 一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码及其鉴别方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caccgcggtt atacgagagg ccctagttga taaatacggc gtaaagagtg gttatggaat 60
tatttttatt aaagccgaaa gccccttaga ctgtcatacg cacccagagg ctagaacccc 120
actaaacgaa agtagcttta ttaatgccca ccagaaccca cgacagctgg gaca 174
<210> 2
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caccgcggtt atacgagagg cccaagttga ctaatacggc gtaaagagtg gttatggagt 60
ccttacacta aagccgaaag ccccttaaac tgtcatacgc acccaggggc cagaatccca 120
ccgcacgaaa gtagctttat taacgcccac cagaacccac gacagctagg aca 173
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtcggtaaaa ctcgtgccag c 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
catagtgggg tatctaatcc cagtttg 27
Claims (7)
1.一种鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码，其特征在于，所述中颌棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述赤鼻棱鳀的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。
2.扩增权利要求1所述的DNA条形码的引物，其特征在于，包括F295和R517；所述F295的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述R517的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.一种利用DNA条形码鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的方法，包括以下步骤：
1)提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA；
2)用权利要求2所述的引物扩增步骤1)中所述的待鉴别DNA获得扩增产物；
3)将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物序列和中颌棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为中颌棱鳀；如果所述扩增产物序列和赤鼻棱鳀的DNA条形码一致，则待鉴别样本为赤鼻棱鳀。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述扩增的扩增体系以25.15μL计，包括以下组分：超纯水17.5μL，10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，rTaq 0.15μL，待鉴别DNA1μL，引物F295 1μL，引物R517 1μL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述扩增的扩增程序如下：
94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的序列通过将扩增产物测序获得。
7.权利要求1所述的鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀的DNA条形码、权利要求2所述的扩增所述DNA条形码的引物在鉴别中颌棱鳀与赤鼻棱鳀中的应用。
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