CN111876496A - 一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码及其鉴别方法和应用 - Google Patents

一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码及其鉴别方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码及其鉴别方法和应用，属于分子生物学技术领域，本发明所述髭鲷未定种sp的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述横带髭鲷的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。扩增所述的DNA条形码的引物，包括F296和R515；所述方法包括以下步骤：提取待鉴别样本的基因组DNA；用所述的引物扩增所述的待鉴别DNA；将扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；确定待鉴别样本的种类。利用本发明提供的DNA条形码鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷结果稳定，可重复性强。

Description

一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码及其鉴别方 法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码及其鉴别方法和应用。
背景技术
髭鲷未定种sp发现于海南、浙江等近海水域，隶属于松鲷目(Lobotiformes)、髭鲷属(Hapalogenys)。其外部形态与横带髭鲷(Hapalogenys analis Richardson,1845)极为相似：背鳍I，XI-15～17；臀鳍III-9～10；胸鳍17；腹鳍I-5；尾鳍18～20，侧线鳞42-47。体呈椭圆形，高而侧扁；体长为体高1.6～2.1倍，为头长2.45～2.78倍；体背面较窄，腹面钝圆；尾柄短而侧扁，其长与高约相等。头中等大，由吻端至第一背鳍起点前坡度甚陡；头腹面较宽而平直，头长为吻长3.61～3.82倍，为眼径2.83～3.14倍。吻钝尖，其长约与眼径相等。眼中等大，侧上位，距吻端与距鳃孔距离上角相等。眼间隔微凸。鼻孔每侧2个，椭圆形，前鼻孔大于后鼻孔，周围有瓣膜，后缘瓣膜高呈三角形。口前位而低，稍斜，两颌等长，两颌牙细小呈带状，外行牙较大。颊部密生小髭，颏孔3对，最后一对长裂缝状。鳃孔大，前鳃盖骨后缘具细锯齿，鳃盖骨后缘有一小的扁平棘。假鳃明显。鳃耙6～8+12～14，钝短。体被细栉鳞。头部除吻端、两颌及额部外皆被鳞。上颌骨有鳞。背鳍、臀鳍基部有鳞鞘。侧线完全，位高，与背缘平行。背鳍棘部与鳍条部仅在基部相连，中间形成一深凹陷；背鳍鳍棘强大，在起点处有一向前倒棘，第二鳍棘最长且明显粗壮。臀鳍小，其起点与背鳍鳍条部相对。胸鳍小，末端圆形。腹鳍稍长于胸鳍，起点在胸鳍基底下方，其末端接近肛门。尾鳍圆形。体背部灰褐色，腹部较淡。体侧有4条黑色横带。髭鲷未定种sp为海南、浙江等近海水域少见鱼种。目前用于鉴定髭鲷未定种sp的方法还没有见正式报道。由于髭鲷未定种sp与横带髭鲷形态非常相似，二者仅在第二背鳍棘粗细及长短程度上存在较为明显的差别，仅凭借形态特征容易造成误鉴定。因此寻找区分髭鲷未定种sp和横带髭鲷的可靠标准，从混杂的个体中鉴别、分离样品成为一个重要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码及其鉴别方法和应用；本发明采用微型DNA条形码将两种髭鲷进行鉴别，操作简单，易于掌握，准确性高；有助于解决种质混杂等问题，为种质保护及合理利用、鱼类分类学研究提供技术支撑。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码，所述髭鲷未定种sp的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述横带髭鲷的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了扩增所述的DNA条形码的引物，包括F296和R515；所述F296的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述R515的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明提供了一种利用所述的DNA条形码鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的方法，包括以下步骤：
1)提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA；
2)以步骤1)中获得的待鉴别DNA为模板，以所述的引物进行PCR扩增获得扩增产物；
3)将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物的序列和髭鲷未定种sp的DNA条形码一致，则待鉴别样本为髭鲷未定种sp；如果所述扩增产物的序列和横带髭鲷的DNA条形码一致，则待鉴别样本为横带髭鲷。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增的扩增体系以25.15μL计，包括以下组分：超纯水17.5μL，10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，rTaq 0.15μL，待鉴别DNA 1μL，引物F296 1μL，引物R515 1μL。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增的扩增程序如下：
94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
优选的，所述扩增产物的序列通过测序获得。
本发明提供了所述的鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码、扩增所述DNA条形码的引物在鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码，位于线粒体DNA(mtDNA)12S rRNA上；利用所述DNA条形码鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷结果稳定，可重复性强；鉴别方法简单。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码，所述髭鲷未定种sp的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述横带髭鲷的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码位于mtDNA 12SrRNA上，所述髭鲷未定种sp的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
CACCGTGGTTATACGAGAAGCCTAAATTGTTAGATACCGGAGTAAAGTGTGGTTAAGACTTAAACCCTAAGACTAAAGCTGAATGCCTTCTAGGCCGTTATAATTACCTGAAAGTGAGAAAACCAATTACGAAAGTAGCTTTACTGCTTCTGACTCCACGAAAGCCAGGAAA；
所述横带髭鲷的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
CACCGCGGTTATACGAGAAGCCCAAGTTGTTAGATACCGGCGTAAAGTGTGGTTAAGACTTAAACCCTAAGACTAAAGCTGAATGCCTTCTAGGCCGTTATACGTACCTGAAAGTAAGAAAACCAATTACGAAAGTAGCTTTACTACTTCTGACTCCACGAAAGCCAGGAAA。
在本发明中，所述髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码序列存在8个碱基的差异，表现为5个转换，3个颠换。
本发明提供了扩增所述的DNA条形码的引物，包括F296和R515；所述F296的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：5’-GTTGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；所述R515的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’。
本发明还提供了一种利用DNA条形码鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的方法，包括以下步骤：1)提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA；2)以步骤1)中获得的待鉴别DNA为模板，以所述的引物进行PCR扩增获得扩增产物；3)将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物的序列和髭鲷未定种sp的DNA条形码一致，则待鉴别样本为髭鲷未定种sp；如果所述扩增产物的序列和横带髭鲷的DNA条形码一致，则待鉴别样本为横带髭鲷。
在本发明中，提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA。本发明对所述待鉴别样本的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物基因组DNA提取方法即可，优选的采用商品化的试剂盒进行提取。
本发明在获得所述待鉴别DNA后，以所述待鉴别DNA为模板，用所述的引物进行PCR扩增获得扩增产物。在本发明中，所述扩增的扩增体系以25.15μL计，优选的包括以下组分：超纯水17.5μL，10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，rTaq 0.15μL，待鉴别DNA 1μL，引物F296 1μL，引物R515 1μL。在本发明中，所述扩增的扩增程序优选的如下：94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。本发明在所述扩增结束后优选的还包括扩增产物的纯化步骤；本发明对所述纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的PCR产物纯化试剂盒即可。本发明在所述纯化步骤后，优选的将纯化后的扩增产物测序获得扩增产物的序列。本发明对所述测序的方法没有特殊限定，优选的委托生物测序公司进行。
本发明在获得所述扩增产物序列后，将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物的序列和髭鲷未定种sp的DNA条形码一致，则待鉴别样本为髭鲷未定种sp；如果所述扩增产物的序列和横带髭鲷的DNA条形码一致，则待鉴别样本为横带髭鲷。
本发明还提供了所述的鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码、扩增所述DNA条形码的引物在鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷中的应用。利用本发明提供的鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码、扩增所述DNA条形码的引物能够实现髭鲷未定种sp与横带髭鲷简单、快速、准确的鉴别。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选用海南三亚、海口和浙江舟山近海的髭鲷未定种sp与三亚近海的横带髭鲷，组成3个不同地理群体的髭鲷未定种sp样本群和横带髭鲷样本群，提取4个样本群中个体的DNA，然后以所提取的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；
引物序列为F296(SEQ ID No.3)：5’-GTTGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’；R515(SEQ IDNo.4)：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’；
所述的PCR扩增的反应体系组成为：
0.2mL离心管中依次加入：
Figure BDA0002654318500000051
PCR扩增程序为94℃预变性3min，(94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s)×38个循环，72℃延伸5min，4℃保存∞。
使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，具体纯化步骤如下：(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。提前记录1.5mL离心管重量，并计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)；(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2～3min)，直至凝胶块完全熔化(6～8min)；(3)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；并加入1个凝胶体积的异丙醇；(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2mL离心管)中，12000×g离心1min，弃滤液；(5)将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液；(6)将制备管置回2mL离心管，加650μL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用650μL Buffer W2洗涤一次，12000×g离心1min；(7)将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min；(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25～30μLEluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。收集洗脱液后送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序平台为美国ABI公司3730XL型测序仪。测序结束后对4个群体的测序结果进行比对。
由髭鲷未定种sp和横带髭鲷mtDNA 12S rRNA基因172bp碱基排序结果可以看出髭鲷未定种sp与横带髭鲷存在8个碱基的差异，表现为5个转换，3个颠换。
3个髭鲷未定种sp群体和横带髭鲷的mtDNA 12S rRNA基因172bp序列比对结果如表1所示。
表1 3个髭鲷未定种sp群体和横带髭鲷的mtDNA 12S rRNA基因序列比对结果
Figure BDA0002654318500000061
Figure BDA0002654318500000071
其中“*”表示相同的碱基序列位点，SYHA：三亚近海横带髭鲷样品；SYSP：三亚近海髭鲷未定种sp样品；HKSP：海口近海髭鲷未定种sp样品；ZSSP：舟山近海髭鲷未定种sp样品。
测序结果表明，髭鲷未定种sp的DNA条形码序列为：CACCGTGGTTATACGAGAAGCCTAAATTGTTAGATACCGGAGTAAAGTGTGGTTAAGACTTAAACCCTAAGACTAAAGCTGAATGCCTTCTAGGCCGTTATAATTACCTGAAAGTGAGAAAACCAATTACGAAAGTAGCTTTACTGCTTCTGACTCCACGAAAGCCAGGAAA；横带髭鲷的DNA条形码序列为：CACCGCGGTTATACGAGAAGCCCAAGTTGTTAGATACCGGCGTAAAGTGTGGTTAAGACTTAAACCCTAAGACTAAAGCTGAATGCCTTCTAGGCCGTTATACGTACCTGAAAGTAAGAAAACCAATTACGAAAGTAGCTTTACTACTTCTGACTCCACGAAAGCCAGGAAA。
髭鲷未定种sp的3个地点采集的23尾样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。
由此可见，髭鲷未定种sp种内(包括三亚群体，海口群体和舟山群体)的扩增结果表现出高度的一致性；与横带髭鲷的扩增结果差异显著。本发明提供的基于12SrRNA基因的碱基差异的DNA条形码能够区分髭鲷未定种sp和横带髭鲷的种质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 海南热带海洋学院
<120> 一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码及其鉴别方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 172
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caccgtggtt atacgagaag cctaaattgt tagataccgg agtaaagtgt ggttaagact 60
taaaccctaa gactaaagct gaatgccttc taggccgtta taattacctg aaagtgagaa 120
aaccaattac gaaagtagct ttactgcttc tgactccacg aaagccagga aa 172
<210> 2
<211> 172
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caccgcggtt atacgagaag cccaagttgt tagataccgg cgtaaagtgt ggttaagact 60
taaaccctaa gactaaagct gaatgccttc taggccgtta tacgtacctg aaagtaagaa 120
aaccaattac gaaagtagct ttactacttc tgactccacg aaagccagga aa 172
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gttggtaaaa ctcgtgccag c 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
catagtgggg tatctaatcc cagtttg 27

Claims (7)

1.一种鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码，其特征在于，所述髭鲷未定种sp的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示；所述横带髭鲷的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。
2.扩增权利要求1所述的DNA条形码的引物，其特征在于，包括F296和R515；所述F296的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述R515的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.一种利用权利要求1所述的DNA条形码鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的方法，包括以下步骤：
1)提取待鉴别样本的基因组DNA获得待鉴别DNA；
2)以步骤1)中获得的待鉴别DNA为模板，以权利要求2所述的引物进行PCR扩增获得扩增产物；
3)将所述扩增产物的序列与DNA条形码进行比对；如果所述扩增产物的序列和髭鲷未定种sp的DNA条形码一致，则待鉴别样本为髭鲷未定种sp；如果所述扩增产物的序列和横带髭鲷的DNA条形码一致，则待鉴别样本为横带髭鲷。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的扩增体系以25.15μL计，包括以下组分：超纯水17.5μL，10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，rTaq 0.15μL，待鉴别DNA 1μL，引物F296 1μL，引物R515 1μL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的扩增程序如下：
94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸20s，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的序列通过测序获得。
7.权利要求1所述的鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷的DNA条形码、权利要求2所述的扩增所述DNA条形码的引物在鉴别髭鲷未定种sp与横带髭鲷中的应用。
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