CN110527743A - 用于鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记及其应用，属于分子检测技术领域，该发明利用筛选的17对多态性鉴别引物，实现了新疆彩色棉27种品种的指纹图谱构建和分子鉴定，该17对引物不仅具有多态性高、稳定性好、时效性强、操作简单、灵敏性强等优点，而且可以准确检测、锁定目标基因，遗传效应值更加可靠，所反应出的不同等位变异与表型直接相关联，将田间表型性状与室内分子标记紧密相连；本发明最少仅需10对核心引物即可鉴定出27种品种，更具有实用性。

Description

用于鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，尤其涉及一种用于鉴别新疆彩色棉品种的多态性分 子标记及应用。
背景技术
随着棉花产业的迅速发展，棉花种子市场多、乱、混、杂等问题日益严重，种子质量不断下降，严重阻碍了棉花产业的健康发展。因此，优质棉花品种的培育和保护成为 国内外育种研究者共同讨论的问题。传统形态学鉴定方法具有周期较长、成本差、有效 期短、易受环境影响、可靠性差等缺点，难以适应新形势发展的需要。分子标记技术可 以完全适应新形势发展的需要，为品种鉴定和种子纯度真实性检测提供了新思路，并逐 步应用于农作物品种鉴定和遗传多样性分析。
目前，小麦、水稻、玉米、大豆、烟草等主要农作物的DNA指纹图谱逐步形成标准 和规范。基于分子标记构建棉花DNA指纹图谱的研究也有了很大发展，但关于新疆彩色 棉品种DNA指纹图谱的构建报道较少。国际植物品种权保护组织(UPOV)已将构建DNA指 纹数据库的标记确定为SSR和SNP。与SNP标记相比，棉花SSR引物开发速度非常快且 数量多。随着第2代测序技术的迅猛发展，SSR标记技术已十分纯熟，研究基础好，易 推广应用。
SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列)标记是指：均匀分布于真核生物基 因组中的简单重复序列，由2-6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富。功能标记是指：来源于控制表型的基因序列内部，在鉴别基因序列的表型功能后，挖掘该序列中的多态性信息及对应序列的表型效应，从而开发出能够区分和预测等位基因及相对性状的DNA标记。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题，提供一种用于鉴别新疆彩色棉品种的多态 性分子标记及应用，以构建获得新疆彩色棉品种DNA指纹图谱，为新疆彩色棉品种的分子检测和育种提供新的实用标记和方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记，所述多态性分子标记为 由17对多态性鉴别引物中的一种、或多种的组合引物组成，所述17对多态性鉴别引物的序列如下所示：
作为本发明进一步的优化方案，所述新疆彩色棉品种为新彩棉1-8、10-28号品种，对应的多态性分子标记为多态性特征引物或多态性组合引物，具体为：
鉴别新彩棉1号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物NAU0990；
鉴别新彩棉2号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、JESPR0251、MUCS0101；
鉴别新彩棉3号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物JESPR0251、SSR225；DPL0757、JESPR0251；
鉴别新彩棉4号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物DPL0111；或SSR241；
鉴别新彩棉5号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物TT2-3AIde1；
鉴别新彩棉6号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物NAU1167、JESPR0251、HAU2022；
鉴别新彩棉7号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物HAU2786；
鉴别新彩棉8号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物W01；或SSR225；
鉴别新彩棉10号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物Gh_A07G20491；
鉴别新彩棉11号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物DPL0757、SSR225；SSR225、JESPR0251；
鉴别新彩棉12号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物DPL0757、SSR225；DPL0757、okra-195；
鉴别新彩棉13号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物JESPR0197；
鉴别新彩棉14号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167、JESPR0251；
鉴别新彩棉15号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167；
鉴别新彩棉16号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物DPL0111；或HAU2786；
鉴别新彩棉17号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167；
鉴别新彩棉18号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物JESPR0251、SSR225；
鉴别新彩棉19号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1233；
鉴别新彩棉20号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物NAU1167、SSR225；或okra-195、SSR225；或okra-195、NAU2277；或SSR225、JESPR0251；
鉴别新彩棉21号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167；
鉴别新彩棉22号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物SSR225；或W01；或SSR241；
鉴别新彩棉23号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物okra-195、JESPR0251；
鉴别新彩棉24号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物DPL0757、NAU2277；
鉴别新彩棉25号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物okra-195、JESPR0251；
鉴别新彩棉26号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物NAU2277、SSR225；或okra-195、JESPR0251；或DPL0757、okra-195；或DPL0757、JESPR0251；
鉴别新彩棉27号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物okra-195；或W01；
鉴别新彩棉28号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物NAU2277。
本发明还提供了一种利用上述多态性分子标记鉴别27种新疆彩色棉品种的方法，步 骤包括：
(1)提取棉花DNA；
(2)利用所述多态性分子标记对棉花DNA进行PCR扩增，若为多态性组合引物，则按照组合引物中的先后顺序进行扩增，获得PCR产物；
(3)电泳检测PCR产物；
(4)结果鉴别：将具有特征引物带型或组合引物特征信息的品种与其他品种区分开， 最终鉴别出相对应的品种。
上述结果鉴别的方式包括两种情况，分别为应用组合引物和应用特征引物进行PCR 扩增、电泳后对结果进行鉴别，其中：
应用所述特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：应用特征引物对新疆彩色棉27个品种DNA进行扩增、电泳，对特征引物电泳结果进行分析比较， 将具有特征引物带型的新彩棉品种与其他彩棉品种区分开，最终鉴别出相对应的新疆彩 色棉品种；
应用所述组合引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：按照组合引物中的先后顺序对新疆彩色棉27个品种DNA进行扩增、电泳，对组合引物电泳结果 进行分析比较，将具有组合引物特征信息的新彩棉品种与其他品种区分开，最终鉴别出 相对应的新疆彩色棉品种。
本发明还提供了一种利用上述多态性分子标记构建27种新疆彩色棉品种指纹图谱 的方法，包括以下步骤：
步骤一、提取27种新疆彩色棉品种DNA；
步骤二、利用所述多态性鉴别引物对27种棉花DNA进行PCR扩增，获得PCR产物；
步骤三、电泳检测PCR产物；
步骤四、根据电泳结果分析获得各品种的指纹代码，即构建获得所述指纹图谱。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤二中，多态性鉴别引物为从17对引物中筛选获得的扩增条带清晰、带型简单、多态性好的引物，作为构建新疆彩色棉品种指纹 图谱的核心引物。
作为本发明进一步的优化方案，所述核心引物为10对，分别为： SSR225-JESPR0251-NAU1167-NAU2277-W01-okra-195-DPL0757-NAU1233-MUCS0101-HAU2 022。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤四中，构建指纹图谱的方法包括：根据各多态性鉴别引物在各新疆彩色棉品种中的带型，将相同带型进行归类，并用数字编码， 获得各品种的数字指纹代码，即构建获得所述指纹图谱。
作为本发明进一步的优化方案，所述新疆彩色棉品种为新彩棉1-8、10-28号品种，所述多态性鉴别引物为10对核心引物，SSR225-JESPR0251-NAU1167-NAU2277-W01-okra-195-DPL0757-NAU1233-MUCS0101-HAU2 022，利用数字1-7编码各引物的带型，获得该27个品种在10对核心引物下的数字指纹代 码。
按照上述核心引物顺序，所述新疆彩色棉27个品种的数字指纹代码为如下所示：
本发明还提供了一种上述多态性分子标记在鉴别新疆彩色棉27个品种中的应用。
本发明还提供了一种上述数字指纹代码在鉴别新疆彩色棉27个品种中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记 及其应用，具体利用SSR分子标记技术结合其他与重要性状紧密连锁分子标记或功能标记来鉴别不同棉花品种，该技术不仅具备时效性强、操作简单、灵敏性强、DNA能够长 久保存等优点，而且功能标记可以准确检测、锁定目标基因，遗传效应值更加可靠，所 反应出的不同等位变异与表型直接相关联，本发明最少用10对核心引物即可鉴别出27个 新疆彩色棉品种。
附图说明
图1为引物SSR225在27份新疆彩色棉品种中的扩增结果，1-27分别代表新彩棉1-8、 10-28号，箭头所指为引物SSR225在27份新疆彩色棉品种中扩增出的不同等位基因位点； 同时，SSR225为新彩棉8号和22号的特征引物；
图2为引物W01在27份新疆彩色棉品种中的扩增结果，1-27分别代表新彩棉1-8、10-28号，箭头所指为引物W01在27份新疆彩色棉品种中扩增出的不同等位基因位点；同时，W01为新彩棉8号和27号的特征引物；
图3为引物okra-195在27份新疆彩色棉品种中的扩增结果，1-27分别代表新彩棉1-8、10-28号，箭头所指为引物SSR273在27份新疆彩色棉品种中扩增出的不同等位基因 位点；同时，okra-195为新彩棉27号的特征引物。
具体实施方式
下面对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于 对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的 试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
本发明根据多态性、稳定性、鉴别能力等综合特征进行筛选，获得了17对综合特性优良的引物，并以新疆彩色棉27个品种为材料，构建新彩棉的DNA指纹图谱，得到 可用于鉴别新疆彩色棉27个品种的分子标记。所述分子标记包括11个新疆彩色棉品种 的特征引物、16个新疆彩色棉品种的组合引物。并采用最少10对核心引物将27个新彩 棉品种完全区分，并构建出27个新彩棉品种在10对核心引物下的十位数字指纹代码。
其中：
新疆彩色棉的27个品种名称、系谱来源及选育时间如下表1所示，该27个品种均为市售常规品种。
表1.新疆27个彩色棉品种的名称、系谱来源、颜色及选育时间
11个新疆彩色棉品种的特征引物如下表2所示：
表2. 11个新疆彩色棉品种的特征引物
16个新疆彩色棉品种的组合引物如下表3所示：
表3. 16个新疆彩色棉品种的组合引物
2.1、应用上述多态性分子标记鉴别新疆彩色棉27个品种的具体方法如下：
2.1.1、棉花DNA提取
一、采用改良的SDS法进行棉花种子DNA的提取并进行浓度检测和质量检测
(1)剥壳：剥去棉种种皮外壳放入2mL离心管中并加入500μLdH2O浸泡若干小时 后将水倒去。
(2)研磨：加入150μL，65℃水浴后的SDS提取液(成分:1％SDS，0.01mol·L-1EDTA，0.705mol·L-1NaCl，0.05mol·L-1Tris，0.5％山梨醇，1％PVP，1％β-巯基乙醇)， 每个离心管加入两个无锈钢珠并用漩涡振荡仪(转速：30r/s时间：40s)研磨打碎， 粉碎后加入650μL水浴SDS。
(3)核裂解：将离心管放入水浴锅中水浴，每隔10分钟振荡一次，共三次。用吸 铁石吸出钢珠，将样品放入4℃冰箱冰浴10min。取出、摇匀放入4℃离心机中12000 rpm/min离心10min。
(4)除蛋白：取650μL的上清吸于2mL离心管中，并加入等体积酚:氯仿:异戊 醇(25:24:1)(体积比)，混匀至不分层，4℃12000rpm/min离心10min，再取上清液 与2mL离心管中，加入等体积的氯仿混匀至不分层，12000rpm/min离心10min。
(5)沉淀DNA：转移上清液至新的1.5mL离心管，加等体积的预冷异丙醇，缓慢颠 倒数次，可见清晰DNA絮状沉淀，静置5min于4℃冰箱中，12000rpm/min离心6min， 弃上清液。
(6)洗涤：用100μL75％乙醇洗涤沉淀2次，每次离心5min，最后用100μL 无水乙醇洗涤。
(7)溶解：倒去乙醇后，将DNA自然晾干，加200μL ddH2O溶解备用。
二、PCR扩增
应用上述分子标记对新疆彩色棉27个品种进行PCR扩增，PCR扩增体系为：
选用20μL的PCR反应体系，包括10×Taq buffer(含有Mg2+)2.0μL，2.5mM dNTPs1.6μL，10μmol·L-1上下游引物各1μL Taq DNA聚合酶0.2mL(5U/μL)，模板 DNA 2.0μL，最后用ddH2O补足。
PCR扩增过程在梯度PCR仪中进行，程序为：
94℃预变性3min；94℃变性处理30s、55℃退火处理30s和72℃延伸处理45s， 共33个循环；72℃延伸10min；PCR扩增产物保存于4℃冰箱内备用。
应用组合引物与特征性引物鉴别新疆彩色棉品种的方法不同：应用组合引物鉴别， 需要按照文中所述的组合引物的先后顺序进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析电泳结果，逐步进行鉴别，最终鉴别出相应的新疆新彩棉品种；而应用特征引物鉴别，只 需单独用特征引物对新彩棉27个品种进行扩增、电泳，分析结果，就可以鉴别出相应 的新疆新彩棉品种。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染检测
(1)相关试剂的配置：
10×TBE：
Tris：108g，
硼酸：55g，
EDTA：7.44g，
加1000mL ddH2O充分溶解。
8％原胶溶液：
丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺40％溶液(37.5:1)：200mL，
10×TBE：100mL，
ddH2O：700mL。
10％APS：
10g的过硫酸铵溶于100mL ddH2O中，4℃保存备用。
电泳缓冲液(1×TBE)：
将100mL10×TBE加ddH2O稀释至1000mL。
PAGE胶凝固液：
将400μL10％APS(Ammonium persulfate)和40μL TEMED与40mL的8％原胶溶液 混匀。
(2)8％非变性PAGE凝胶电泳：
1)制板：将水洗干净的方板和玻璃板平放好，用浸湿75％乙醇的脱脂棉花团擦拭玻 璃板，待晾干后，将两块玻璃板扣在一起，并用胶带在玻璃板底部固定，用夹子夹紧。 最后插进梳子并利用夹子来调节两块玻璃板合扣的松紧度，调整好后将梳子拔出放置于 一旁；
2)灌胶：以单板胶为例：将比例为400μL10％APS(Ammonium persulfate)、40μ LTEMED、40mL 8％Acr-Bis胶溶液的PAGE胶凝固液混匀后，缓慢倒入玻璃板，倒胶时 要严防出现气泡，平直插入梳子，等待胶液凝固；
3)点样：在20μLPCR扩增产物中加入4μL5×Loading buffer轻轻震荡混匀；
4)电泳：电泳槽(JY-SPDT)上部缓冲液(1×TBE缓冲液)要覆盖凝胶但不宜过多，电泳槽底部缓冲液一般不超过红线。150V恒压电泳70min。
(3)银染
电泳结束后，等待玻璃板降至室温后，进行染色。银染流程如下：
1)固定:胶板在摇床(TS-20000)上用固定液(10％C2H5OH、0.5％CH3COOH)固定5-6min；
2)染色:胶板在摇床上用银染(液0.2％AgNO3)染色6-8min；
3)水洗:ddH2O水洗，不超过30s；
4)显影:将胶板置于显影液(1.5％NaOH、0.4％HCHO)中，并在摇床缓慢摇动直至条带显现；
5)水洗:ddH2O水洗；
6)观察:胶片观察灯(ZHGP-70)统计带型并照相。
四、鉴别
利用所述分子标记构建27个新疆彩色棉品种指纹图谱，用于鉴别。
以标记引物SSR225为例，按照上述步骤二、三中的方法进行操作，得到电泳扩增图见图1，利用NTSYS-pcV2.10软件进行数据分析，选择清晰可变的电泳带，样品有带则记 为1，无带则记为0，获得该引物对应的各品种的指纹信息；利用Jaccard系数计算出不 同试验材料的遗传相似系数，并进行遗传多样性分析。
如图1，箭头所指的为标记引物SSR225在新疆彩色棉27个品种中扩增出的不同等位 基因位点，其中：新彩棉1、2、5、6、18、19、23、25、26、28号的指纹信息为0100000； 新彩棉3、7、12、16、27号的指纹信息为1110000；新彩棉4、13、20、24号的指纹信息 为0001000；新彩棉8号的指纹信息为0101010；新彩棉10、21号的指纹信息为0100100； 新彩棉11、14、15、17号的指纹信息为0100001；新彩棉22号的指纹信息为1111010。
可以看出，SSR225标记引物电泳扩增结果图说明它可在新彩棉27个棉花品种中扩增 出7种不同等位基因型，且SSR225对应的新彩棉8号和新彩棉22号的指纹信息是唯一的，SSR225为新彩棉8号和新彩棉22号的特征引物。
其它引物的等位基因型的确定及指纹信息的读取方法同标记SSR225的方法。例如图 2所示，为另一引物W01在27种新彩棉品种中的扩增结果，W01对应的新彩棉8号和新彩棉27号的指纹信息是唯一的，WO1为新彩棉8号和27号的特征引物；如图3所示，为另一引 物JESPR0251在27种新彩棉品种中的扩增结果。各引物对应的品种的指纹信息组成该27 种新彩棉的指纹图谱。
鉴别新疆新彩棉27个品种的方法按引物的不同，分为应用组合引物与特征引物进行扩增、电泳进行鉴别。
组合引物的鉴别方法如下：
以鉴别新疆彩色棉2号品种为例，其多态性组合引物为：SSR225、JESPR251、MUCS101。
第一步：提取待测的新彩棉品种DNA样品，下面以27种新彩棉品种为例进行鉴别，将27种新彩棉品种DNA样品分别加入编号为1-27的PCR扩增管，按如下PCR扩增体系 进行PCR扩增。
PCR扩增体系
选用20μL的PCR反应体系：
10×Taq buffer(含有Mg2+)2.0μL，
2.5mM dNTPs 1.6μL，
10μmol·L-1上下游引物各1μL，
Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，
模板DNA 2.0μL，
最后用ddH2O补足。
PCR扩增程序：
在梯度PCR仪中进行
94℃预变性3min；94℃变性处理30S、53℃退火处理30s和72℃延伸处理45s， 共33个循环；72℃延伸10min；降至16℃后，PCR扩增产物保存于4℃冰箱内备用
电泳步骤：
PCR扩增结束后对扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离，电泳后分离 开的扩增产物经银染显色后读取相应引物的PCR扩增条带并记录各DNA样品在相同引物下扩增产物的条带。
用SSR225对待测新彩棉品种(27种)进行PCR扩增，如上文所述，SSR225可将可 将27个品种分为8类，第一类包括新彩棉1、2、5、6、18、19、23、25、26、28号， 其扩增条带为0100000；第二类包括新彩棉3、7、12、16、27号，其扩增条带为1110000； 第三类包括新彩棉4、13、20、24号，其扩增条带为0001000；第四类只有新彩棉8号， 其扩增条带为0101010；第五类包括新彩棉10、21号，其扩增条带为0100100；第六类 包括新彩棉11、14、15、17号，其扩增条带为0100001；第七类只有新彩棉22号，其 扩增条带为1111010。这样就可将新彩棉1、2、6、18、19、23、26、28号先从27个新 疆彩色棉品种中区分开。
第二步：将鉴别为第一类的新彩棉1、2、5、6、18、19、23、25、26、28号的DNA 样品分别加入编号为1-10的扩增管，采用第一步相同的方法进行扩增和电泳，只需将 引物换为JESPR0251，扩增程序的温度调为49℃，其他方法及步骤与第一步相同。根据 JESPR0251引物的等位基因型及指纹信息，可将上述8个品种分为3类，第一类包括新 彩棉1、2、6、26号，其扩增条带为010；第二类只有新彩棉18号，其扩增条带为110； 第三类包括新彩棉5、28号，其扩增条带为100；第四类包括新彩棉19、23、25号，其 扩增条带为011。这样就把新彩棉1、2、6、26号从这10个品种中区别开。
第三步：将提取的新彩棉1、2、6、26号的DNA样品分别加入编号为1-4号的扩增 管，采用与第一步中相同的方法进行扩增和电泳，只需将引物换MUCS101，扩增程序的 温度调为54℃，其他方法及步骤与第一步相同。根据MUCS101引物的等位基因型及指纹 信息，可将新彩棉1、2、6、26号分为2类，第一类包括新彩棉1、6、26号，其扩增 条带为10，第二类只有新彩棉2号，其扩增条带为01。这样就可最终确定出新彩棉2 号。
特征引物的鉴别方法如下：
以新疆彩色棉1号品种为例，其多态性特征性引物为NAU0990。将待测的新彩棉DNA样品(27个新彩棉品种DNA样品)分别加入编号为1-27的扩增管，采用与上述步骤中 相同的方法进行PCR扩增和电泳，只需将引物换为NAU0990，扩增程序的温度调为53℃， 其他方法及步骤与上述步骤相同。分析电泳结果：在用引物NAU0990扩增后，电泳结果 可将新彩棉27个品种区分为3类，第一类只有新彩棉1号其扩增条带101，第二类包含 新彩棉2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 23、25、26、28号扩增条带为001，第三类包含新彩棉4、8、27号其扩增条带为110， 这样就可最终确定出新彩棉1号。
其他新疆新彩棉品种的鉴定方法同上，只需将鉴别引物及其对应的扩增温度进行调 换，其他步骤及方法同上。
应用组合引物鉴别新疆新彩棉品种时，每一步筛选的条件具体下表4所示。利用组合引物扩增、电泳后，记录二进制码(0代表相应位置未扩增出条带，1代表相应位置 扩增出条带)。
表4.部分彩棉品种鉴定所需的组合引物及其二进制码信息表
五、编码
根据每对引物对应的新彩棉的带型，将相同带型进行归类，并用数字编码。例如标记引物SSR225可在新彩棉27个棉花品种中扩增出7种不同等位基因型，其中：新彩棉1、 2、5、6、18、19、23、25、26、28号的指纹信息为0100000，为SSR225的第一种带型， 利用数字1编码该带型；新彩棉3、7、12、16、27号的指纹信息为1110000，为SSR225的 第二种带型，利用数字2编码该带型；新彩棉4、13、20、24号的指纹信息为0001000， 为SSR225的第三种带型，利用数字3编码该带型；新彩棉8号的指纹信息为0101010，为 SSR225的第四种带型，利用数字4编码该带型；新彩棉10、21号的指纹信息为0100100， 为SSR225的第五种带型，利用数字5编码该带型；新彩棉11、14、15、17号的指纹信息 为0100001，为SSR225的第六种带型，利用数字6编码该带型；新彩棉22号的指纹信息为 1111010，为SSR225的第七种带型，利用数字7编码该带型。
其它引物的带型确定及其编码方式同编码SSR225的方法，且不同引物之间用“-”隔开，建立获得新彩棉27个品种的的指纹代码，即为新彩棉27个品种的指纹图谱。
2.2、应用核心引物构建新建彩色棉核心引物指纹图谱，用于鉴别新疆彩色棉27个品种的方法为：
2.2.1、核心引物的筛选
从上述17对多态性鉴别引物中选取若干扩增条带清晰、带型简单、多态性好的引物， 作为构建新疆彩色棉品种指纹图谱的核心引物。
共筛选获得10对核心引物，包括：
SSR225-JESPR0251-NAU1167-NAU2277-W01-okra-195-DPL0757-NAU1233-MUCS0101- HAU2022；
2.2.2、核心引物PCR及电泳检测
依次用上述10对核心引物对新疆彩色棉27个品种进行PCR扩增和电泳检测。
2.2.3、新疆彩色棉27个品种核心引物特征指纹图谱的构建
对电泳图进行分析，利用NTSYS-pcV2.10软件进行数据分析，选择清晰可变的电泳带，样品有带则记为1，无带则记为0，获得该引物对应的各品种的指纹信息；利用Jaccard系数计算出不同试验材料的遗传相似系数，并进行遗传多样性分析。
得到每对引物对应的27种新彩棉的带型，将相似带型进行归类，并用数字编码，且不同引物之间用“-”隔开，建立获得新彩棉27个品种的核心基因的指纹代码。
如本实施例中，按照引物顺序：
SSR225-JESPR0251-NAU1167-NAU2277-W01-okra-195-DPL0757-NAU1233-MUCS0101-HAU2 022进行编码获得的各品种核心引物的指纹代码如下表所示，得到的指纹代码即为该品 种的核心指纹图谱，如下表5所示。
表5.27个新疆彩色棉品种的10对核心引物的数字指纹代码
由上表可以看出，任意两个品种的DNA指纹图谱都不相同，差异引物数均在1个以上， 可用于鉴别出27个新彩棉品种，且所对应的指纹代码是该品种所特有的指纹。
本发明通过SSR标记和功能标记的结合，构建新彩棉DNA指纹图谱，以寻求适用于新 彩棉的一套条带清晰、多态性好、重复性高、辨别能力强的核心引物，为棉花分子检测和分子育种提供实用标记和理论依据，规范棉花种子市场，进而推动棉花产业健康发展。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不 能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明 的保护范围。

Claims (10)

1.一种鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记，所述多态性分子标记为由若干对多态性鉴别引物中的一种、或多种的组合引物组成，其特征在于，所述多态性鉴别引物的序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种鉴别新疆彩色棉品种的多态性分子标记，其特征在于，所述新疆彩色棉品种为新彩棉1-8、10-28号品种，对应的多态性分子标记为多态性特征引物或多态性组合引物，具体为：
鉴别新彩棉1号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物NAU0990；
鉴别新彩棉2号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、JESPR0251、MUCS0101；
鉴别新彩棉3号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物JESPR0251、SSR225；DPL0757、JESPR0251；
鉴别新彩棉4号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物DPL0111；或SSR241；
鉴别新彩棉5号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物TT2-3AIde1；
鉴别新彩棉6号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物NAU1167、JESPR0251、HAU2022；
鉴别新彩棉7号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物HAU2786；
鉴别新彩棉8号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物W01；或SSR225；
鉴别新彩棉10号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物Gh_A07G20491；
鉴别新彩棉11号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物DPL0757、SSR225；SSR225、JESPR0251；
鉴别新彩棉12号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物DPL0757、SSR225；DPL0757、okra-195；
鉴别新彩棉13号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物JESPR0197；
鉴别新彩棉14号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167、JESPR0251；
鉴别新彩棉15号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167；
鉴别新彩棉16号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物DPL0111；或HAU2786；
鉴别新彩棉17号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167；
鉴别新彩棉18号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物JESPR0251、SSR225；
鉴别新彩棉19号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1233；
鉴别新彩棉20号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物NAU1167、SSR225；或okra-195、SSR225；或okra-195、NAU2277；或SSR225、JESPR0251；
鉴别新彩棉21号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物SSR225、NAU1167；
鉴别新彩棉22号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物SSR225；或W01；或SSR241；
鉴别新彩棉23号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物okra-195、JESPR0251；
鉴别新彩棉24号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物DPL0757、NAU2277；
鉴别新彩棉25号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物okra-195、JESPR0251；
鉴别新彩棉26号品种的多态性分子标记为：多态性组合引物NAU2277、SSR225；okra-195、JESPR0251；或DPL0757、okra-195；或DPL0757、JESPR0251；
鉴别新彩棉27号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物okra-195；或W01；
鉴别新彩棉28号品种的多态性分子标记为：多态性特征引物NAU2277。
3.一种利用如权利要求1-2任一所述的多态性分子标记鉴别27种新疆彩色棉品种的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)提取棉花DNA；
(2)利用所述多态性分子标记对棉花DNA进行PCR扩增，若为多态性组合引物，则按照组合引物中的先后顺序进行扩增，获得PCR产物；
(3)电泳检测PCR产物；
(4)结果鉴别：将具有特征引物带型或组合引物特征信息的品种与其他品种区分开，最终鉴别出相对应的品种。
上述结果鉴别的方式包括两种情况，分别为应用组合引物和应用特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别，其中：
应用所述特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：应用特征引物对新疆彩色棉27个品种DNA进行扩增、电泳，对特征引物电泳结果进行分析比较，将具有特征引物带型的新彩棉品种与其他彩棉品种区分开，最终鉴别出相对应的新疆彩色棉品种；
应用所述组合引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：按照组合引物中的先后顺序对新疆彩色棉27个品种DNA进行扩增、电泳，对组合引物电泳结果进行分析比较，将具有组合引物特征信息的新彩棉品种与其他品种区分开，最终鉴别出相对应的新疆彩色棉品种。
4.一种利用如权利要求1-2任一所述的多态性分子标记构建27种新疆彩色棉品种指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、提取27种新疆彩色棉品种DNA；
步骤二、利用多态性鉴别引物对27种棉花DNA进行PCR扩增，获得PCR产物；
步骤三、电泳检测PCR产物；
步骤四、根据电泳结果分析获得各品种的指纹代码，得到所述指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的一种利用多态性分子标记构建27种新疆彩色棉品种指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤二中，多态性鉴别引物为从17对引物中筛选获得的扩增条带清晰、带型简单、多态性好的引物，作为构建新疆彩色棉品种指纹图谱的核心引物。
6.根据权利要求5所述的一种利用多态性分子标记构建27种新疆彩色棉品种指纹图谱的方法，其特征在于，所述核心引物为10对，分别为：SSR225-JESPR0251-NAU1167-NAU2277-W01-okra-195-DPL0757-NAU1233-MUCS0101-HAU2022。
7.根据权利要求4所述的一种利用多态性分子标记构建27种新疆彩色棉品种指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤四中，构建指纹图谱的方法包括：根据各多态性鉴别引物在各新疆彩色棉品种中的带型，将相同带型进行归类，并用数字编码，获得各品种的数字指纹代码，即构建获得所述指纹图谱。
8.根据权利要求7所述的一种利用多态性分子标记构建27种新疆彩色棉品种指纹图谱的方法，其特征在于，所述新疆彩色棉品种为新彩棉1-8、10-28号品种，所述多态性鉴别引物为10对核心引物，SSR225-JESPR0251-NAU1167-NAU2277-W01-okra-195-DPL0757-NAU1233-MUCS0101-HAU2022，利用数字1-7编码各引物的带型，获得该27个品种在10对核心引物下的数字指纹代码。
按照上述核心引物顺序，所述新疆彩色棉27个品种的数字指纹代码为：
9.一种如权利要求1-2任一所述的多态性分子标记在鉴别新疆彩色棉27个品种中的应用。
10.一种如权利要求7所述的数字指纹代码在鉴别新疆彩色棉27个品种中的应用。
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