CN110484653A - Ssr分子标记引物、仙草品种的鉴定方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种SSR分子标记引物、仙草品种的鉴定方法及试剂盒。该SSR分子标记引物用于扩增分子标记，仙草的分子标记选自SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点中的至少一种。通过上述SSR分子标记引物能够快速、准确地确定仙草的品种。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种SSR分子标记引物、仙草品种的鉴定方法及试剂盒。
背景技术
仙草(Mesona chinensis Benth)又名仙人草、凉粉草，为唇形科凉粉草属一年生草本宿根植物，是我国南方和东南亚国家的重要保健食品，国内主要产地包括台湾、浙江、江西、广东、福建和广西西部。仙草味甘微涩，性寒凉，自古以来被用作消暑解渴、凉血之良药。现代药理学研究表明，仙草具有抗氧化、降血压、降血糖、降血脂、抗菌等多种功效。仙草主要用于凉茶和仙人冻的加工生产，但两种用途对仙草的原料要求不同。
不同仙草品种中多糖的含量相差很大，这些差异直接影响仙草的食用品质和生产用途，因此仙草品种鉴定和纯度鉴定工作非常重要。人们早期采用形态学特征作为仙草品种鉴定依据。然而这种鉴定方法依赖于鉴定人员的长期经验积累，容易受环境和主观因素的影响，费时费力且准确度无法保证。因此建立一套快速、精准、经济的仙草品种鉴定技术，对于仙草产业的发展非常重要。
发明内容
基于此，针对目前仙草品种鉴定时的费时费力且准确度无法保证的问题，有必要提供一种能够快速、精准鉴定仙草品种的SSR分子标记引物、仙草品种的鉴定方法及试剂盒。
一种SSR分子标记引物，用于扩增仙草中含有SSR分子标记的核苷酸片段所述SSR分子标记包括SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点中的至少一种，所述SSR80位点的核苷酸序列包含以ACACG为重复单元的串联重复序列，所述SSR82位点的核苷酸序列包含以AGATA为重复单元的串联重复序列，所述SSR83位点的核苷酸序列包含以ATAAA为重复单元的串联重复序列，所述SSR100位点的核苷酸序列包含以AATCT为重复单元的串联重复序列，所述SSR102位点的核苷酸序列包含以TTTAT为重复单元的串联重复序列，所述SSR106位点的核苷酸序列包含以TCCACA为重复单元的串联重复序列。
上述SSR分子标记引物能够快速、准确地确定仙草的品种。
在其中一个实施例中，所述SSR80位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SSR82位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SSR83位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SSR100位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SSR102位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SSR106位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在其中一个实施例中，包括用于扩增含有SSR80位点的核苷酸片段、含有SSR82位点的核苷酸片段、含有SSR100位点的核苷酸片段及含有SSR106位点的核苷酸片段的引物中的至少一种。
在其中一个实施例中，用于扩增含有所述SSR80位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；用于扩增含有所述SSR82位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示；用于扩增含有所述SSR83位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示；用于扩增含有所述SSR100位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14所示；用于扩增含有所述SSR102位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示；用于扩增含有所述SSR106位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.17～SEQ IDNO.18所示。
一种仙草品种的鉴定方法，包括以下步骤：
以待测仙草的基因组DNA为模板、上述SSR分子标记引物为引物进行PCR扩增反应，得到扩增产物；及
根据所述扩增产物鉴定仙草的品种。
在其中一个实施例中，所述根据所述扩增产物鉴定仙草的品种的步骤包括：
将所述扩增产物进行电泳，根据所述扩增产物的电泳结果鉴定仙草的品种。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应的反应体系的总体积为10μL～25μL，所述PCR扩增反应的反应体系包括0.2μM的正向引物、0.2μM的反向引物、1×DNA聚合酶预混液及100ng～200ng的所述待测仙草的基因组DNA。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性3min～5min；94℃变性30s，55℃～58℃退火30s，72℃延伸30s～45s，35个循环；72℃后延伸5min～10min。
一种试剂盒，包括上述SSR分子标记引物。
在其中一个实施例中，还包括DNA提取试剂、DNA聚合酶预混液及电泳试剂中的至少一种。
附图说明
图1～图6分别依次为实施例1的SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点所对应的SSR分子标记引物的扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图7～图12分别依次为实施例2的SSR10位点、SSR36位点、SSR78位点、SSR81位点、SSR96位点及SSR97位点所对应的SSR分子标记引物的扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种SSR分子标记引物，该SSR分子标记引物用于扩增仙草中含有SSR分子标记的核苷酸片段，利用该SSR分子标记引物，能够快速、准备地确定仙草的品种。该SSR分子标记包括SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点中的至少一种。SSR80位点的核苷酸序列包含以ACACG为重复单元的串联重复序列，SSR82位点的核苷酸序列包含以AGATA为重复单元的串联重复序列，SSR83位点的核苷酸序列包含以ATAAA为重复单元的串联重复序列，SSR100位点的核苷酸序列包含以AATCT为重复单元的串联重复序列，SSR102位点的核苷酸序列包含以TTTAT为重复单元的串联重复序列，SSR106位点的核苷酸序列包含以TCCACA为重复单元的串联重复序列。
简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)，也称微卫星DNA，是以1个～6个脱氧核糖核苷酸为重复单元的串联重复序列，长度一般在200bp以下。SSR在真核生物基因组中含量丰富，且均匀分布于整个植物基因组中。根据SSR位点两端的侧翼序列设计引物，对SSR位点进行扩增，由于SSR位点中重复单元的数量易发生变异，扩增所得包含SSR位点的片段长度具有多态性。基于SSR长度的差异，设计引物扩增包含SSR位点的核酸片段并通过高分辨率电泳检测扩增产物长度的多态性，可以快速、准确地区分不同品种的仙草样品。还可以通过与已知品种仙草样品的扩增产物比对，完成待测样品的品种鉴定。
在其中一个实施例中，SSR80位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SSR82位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SSR83位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，SSR100位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，SSR102位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，SSR106位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
具体地，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为：5’-ACACGACACGACACGACACGACACG-3’。如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为：5’-AGATAAGATAAGATAAGATAAGATA-3’。如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列为：5’-ATAAAATAAA ATAAAATAAAATAAA-3’。如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为：5’-AATCTAATCTAATCTAATCTAATCTAATCT-3’。如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为：5’-TTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTAT-3’。如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为：5’-TCCACATCCACATCCACATCCACATCCACA-3’。
在其中一个实施例中，SSR分子标记包括SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点。通过SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点的配合，对待测仙草的基因组DNA上多个SSR位点的扩增、鉴定，能够进一步提高鉴定结果的准确性。
具体地，用于扩增含有SSR80位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；用于扩增含有SSR82位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ IDNO.9～SEQ ID NO.10所示；用于扩增含有SSR83位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQID NO.11～SEQ ID NO.12所示；用于扩增含有SSR100位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14所示；用于扩增含有SSR102位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示；用于扩增含有SSR106位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示。
具体地，如SEQ ID NO.7的核苷酸序列为5’-ATTTGGTTCGGTTCGGTTTT-3’；如SEQ IDNO.8的核苷酸序列为5’-GGTCCATATCACCAACACCC-3’；如SEQ ID NO.9的核苷酸序列为5’-CAATGACAACCAAACATGCC-3’；如SEQ ID NO.10的核苷酸序列为5’-GCAGCCCGAGAATTGTCTAC-3’；如SEQ ID NO.11的核苷酸序列为5’-TTGCATCTTCATGTGCAATTC-3’；如SEQ ID NO.12的核苷酸序列为5’-CACAACAATTCACCTCGCAA-3’；如SEQ ID NO.13的核苷酸序列为5’-TTTGTCATGACTTCGGCTTG-3’；如SEQ ID NO.14的核苷酸序列为5’-AACTCCCACCGACAGTTTCA-3’；如SEQ ID NO.15的核苷酸序列为5’-TGCAACAATTTTTGGTATATATCTTTC-3’；如SEQ IDNO.16的核苷酸序列为5’-CCCTCCAGCATACCTGCTTA-3’；如SEQ ID NO.17的核苷酸序列为5’-AAACATACCAACTCACCACTCC-3’；如SEQ ID NO.18的核苷酸序列为5’-AAAGATGGGTGGAGTGAGAAAA-3’。
在其中一个实施例中，SSR分子标记包括SSR80位点、SSR82位点、SSR100位点及SSR106位点中的至少一种。对应地，SSR分子标记引物包括用于扩增含有SSR80位点的核苷酸片段、含有SSR82位点的核苷酸片段、含有SSR100位点的核苷酸片段及含有SSR106位点的核苷酸片段的引物中的至少一种。
上述SSR分子标记引物的GC含量为45％～60％，引物长度在18bp～27bp之间，退火温度为57℃～60℃，扩增产物长度在170bp～280bp之间。
本发明一实施方式还提供一种仙草品种的鉴定方法，该方法包括以下步骤S110～步骤S120。
步骤S110：以待测仙草的基因组DNA为模板、上述任一实施例的SSR分子标记引物为引物进行PCR扩增反应，得到扩增产物。
具体地，将待测仙草的基因组DNA、上述SSR分子标记引物、DNA聚合酶预混液及ddH2O混合，制得PCR扩增反应的反应体系(简称PCR扩增体系)。然后将PCR扩增体系置于PCR仪中进行扩增反应，得到扩增产物。
在其中一个实施例中，PCR扩增体系的总体积为10μL～25μL；PCR扩增体系包括0.2μM的正向引物、0.2μM的反向引物、1×DNA聚合酶预混液及100ng～200ng待测仙草的基因组DNA。当然，可以理解的是，此实施例中的DNA聚合酶预混液中包括了PCR扩增反应所必需的DNA聚合酶、dNTPs以及反应所需的缓冲液条件。在其他实施例中，当DNA聚合酶预混液中不包括dNTPs和反应所需缓冲液时，也可以单独按照扩增的需求将DNA聚合酶和dNTPs加入PCR扩增体系中。例如，正向引物0.2μM、反向引物0.2μM、1×EasyTaq Buffer、dNTPs 0.2mM、EasyTaq DNAPolymerase 2.5units-5units、待测仙草的基因组DNA100ng～200ng。
在其中一个实施例中，PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性3min～5min；94℃变性30s，55℃～58℃退火30s，72℃延伸30s～45s，35个循环；72℃后延伸5min～10min。进一步地，PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃后延伸10min
在其中一个实施例中，SSR分子标记引物包括SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点中的至少两种所对应的SSR分子标记引物。此时，将不同的SSR分子标记位点所对应的SSR分子标记引物分别与待测仙草的基因组DNA混合，制备成不同SSR分子标记引物的PCR扩增体系，然后对不同SSR分子标记序列分别进行扩增、电泳检测，得到各SSR分子标记引物扩增产物的电泳结果，根据各电泳结果鉴定待测仙草的品种。通过对待测仙草的基因组DNA上多个SSR位点的扩增、鉴定，能够进一步提高鉴定结果的准确性。
当然，在一些实施方式中，还包括待测仙草的基因组DNA提取步骤。具体地，采用CTAB法提取待测仙草的基因组DNA。当然，其他一些实施方式中，也可以采用商业的试剂盒提取待测仙草的基因组DNA，或者本领域常用的提取基因组DNA方法提取仙草的基因组DNA。
在其中一个实施例中，还包括构建已知品种的仙草的身份信息的步骤。也即是，以已知品种的仙草的基因组DNA为模板、上述SSR分子标记引物为引物进行PCR扩增，并将扩增产物进行电泳，得到已知品种的仙草的电泳带型。将得到已知品种的仙草的电泳带型为参考，便于后续鉴定待测仙草的品种。
步骤S120：根据扩增产物鉴定仙草的品种。
在本实施方式中，将扩增产物进行电泳，根据扩增产物的电泳结果鉴定仙草的品种。具体地，电泳为聚丙烯凝胶电泳或毛细管电泳。进一步地，聚丙烯凝胶电泳为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在利用银染检测时，条带清晰、杂带少、带型分析准确性更高、结果更加可靠。
在其中一个实施例中，比较采用同一种SSR分子标记引物扩增得到的待测品种的仙草的扩增产物与已知仙草品种的扩增产物的电泳带型，从而鉴定待测仙草的品种。
上述仙草品种的鉴定方法能够快速、准确地确定仙草的品种。
本发明一实施方式还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述SSR分子标记引物。应用该试剂盒能够快速、准确地确定仙草的品种。
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括DNA提取试剂、DNA聚合酶预混液及电泳试剂中的至少一种。
具体地，DNA提取试剂用于提取基因组DNA。进一步地，DNA提取试剂包括细胞裂解液、DNA抽提试剂及DNA纯化试剂。
DNA聚合酶预混液用于PCR扩增反应。进一步地，DNA聚合酶预混液包括DNA聚合酶和dNTPs及基础缓冲液。
电泳试剂用于扩增产物的电泳检测。进一步地，电泳试剂包括电泳缓冲液、染色剂及显色剂中的至少一种。当电泳为变性聚丙烯凝胶电泳时，电泳试剂还包括制备变性聚丙烯凝胶的试剂，例如丙烯酰胺、尿素、过硫酸铵等。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
(1)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成表1所示的仙草的SSR分子标记所对应的引物。其中，SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点所对应的SSR分子标记引物均满足：GC含量为45％～60％，退火温度为57℃～60℃，预期产物长度在170bp～280bp之间，引物长度在18bp～27bp之间。
表1
(2)分别取4个已知品种的仙草(闽选一号、台湾品种、增城一号和增城二号)、2个未知品种的仙草(分别编号为仙草1和仙草2)、薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)、留兰香(Mentha spicata L.)、夏枯草(Prunella vulgaris L.)、丹参(Salvia miltiorrhizaBunge.)、韩信草(Scutellaria indica L.)和半枝莲(Scutellaria barbata D.)的新鲜幼嫩茎组织，均利用CTAB法分别提取上述12个样本的基因组DNA，得到12个样本的基因组DNA。
(3)制备各样本的PCR扩增体系：以表1所示的SSR分子标记引物分别为引物、上述12个样本的基因组DNA为模板，配制表1所示的SSR分子标记引物对应于12个样本的PCR扩增体系，其中各样本的PCR扩增体系的组成均为：10μL的2×EasyTaq PCR SuperMix、0.2μL的10μM正向引物、0.2μL的10μM反向引物、0.5μL 200ng/μL的模板DNA及ddH2O补齐至20μL。
(4)将步骤(3)配置好的各PCR扩增体系置于PCR仪中进行PCR扩增反应，得到各样本分别对应不同SSR分子标记引物的扩增产物。其中各PCR扩增反应程序均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃后延伸10min；12℃保存。
(5)将步骤(4)得到的扩增产物利用7％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。具体步骤为：将7％的变性聚丙烯酰胺凝胶在250V恒压下预电泳30min后，用移液枪将胶孔中沉积的尿素吹干净。然后将各扩增产物分别与2.5μL 10×loading buffer混匀后，取3μL混合液上样至完成预电泳的凝胶梳孔中，于0.5×TBE缓冲液中，室温(26℃)条件下，250V恒压电泳6h。
(6)取出步骤(5)电泳后的凝胶，用纯水漂洗3次后进行银染和显色。具体步骤如下：将凝胶浸入0.1％的硝酸银溶液中，置于100rpm的水平摇床上室温(26℃)避光染色10min；然后用纯水漂洗染色后的凝胶4次，洗去凝胶表面多余的硝酸银；然后将漂洗后的凝胶浸没于含有1％NaOH、0.38％硼酸和0.5％甲醛的显色液中，室温条件下于100rpm的水平摇床上显色10min～20min，至有清晰的条带出现。然后将显色结束的凝胶用纯水漂洗后拍照记录。结果如图1～图6所示。
图1为采用针对SSR80位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图2为采用针对SSR82位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图3为采用针对SSR83位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图4为采用针对SSR100位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图5为采用针对SSR102位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图6为采用针对SSR106位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
由图1～图6可知，4种不同品种的已知仙草的电泳条型差异明显，并且与仙草属于近亲的薄荷、留兰香、夏枯草、丹参、韩信草和半枝莲的电泳条带与仙草的条带完全不同。所以，针对SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点设计的特异性引物均能够将4种不同品种的已知仙草进行有效的区分。
实施例2
(1)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成表2所示的仙草的分子标记所对应的SSR分子标记引物。其中，SSR10位点、SSR36位点、SSR78位点、SSR81位点、SSR96位点及SSR97位点所对应的SSR分子标记引物均满足：GC含量为45％-60％，退火温度为57℃～63℃，预期产物长度在170bp～280bp之间，引物长度在18bp～27bp之间。
表2
(2)分别取4个已知品种的仙草(闽选一号、台湾品种、增城一号和增城二号)、2个未知品种的仙草(分别编号为仙草1和仙草2)薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)、留兰香(Mentha spicata L.)、夏枯草(Prunella vulgaris L.)、丹参(Salvia miltiorrhizaBunge.)、韩信草(Scutellaria indica L.)和半枝莲(Scutellaria barbata D.)的新鲜幼嫩茎组织，均利用CTAB法分别提取上述12个样本的基因组DNA，得到12个样本的基因组DNA。
(3)制备各样本的PCR扩增体系：以表2所示的SSR分子标记引物分别为引物、上述12个样本的基因组DNA为模板，配制表2所示的SSR分子标记引物对应于12个样本的PCR扩增体系，其中各PCR扩增体系的组成均为：10μL的2×EasyTaq PCR SuperMix、0.2μL的10μM正向引物、0.2μL的10μM反向引物、0.5μL 200ng/μL的模板DNA及ddH2O补齐至20μL。
(4)将步骤(3)的各PCR扩增体系置于PCR仪中进行扩增反应，得到12个样本分别对应不同SSR分子标记引物的扩增产物。其中各PCR扩增体系的反应程序均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃后延伸10min；12℃保存。
(5)将步骤(4)得到的扩增产物用7％的变性丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。具体步骤参照实施例1。
(6)取出步骤(5)电泳后的凝胶，用纯水漂洗3次后进行银染和显色。具体步骤参照实施例1。结果如图7～图12所示。
图7为采用针对SSR10位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图8为采用针对SSR36位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图9为采用针对SSR78位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图10为采用针对SSR81位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图11为采用针对SSR96位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
图12为采用针对SSR97位点设计的特异性引物(SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36)分别扩增12个样本的基因组DNA所得扩增产物的电泳图。
由图7～图12可知，4种不同品种的已知仙草的电泳条型差异不明显。虽然针对SSR10位点、SSR36位点、SSR78位点、SSR81位点、SSR96位点及SSR97位点的特异性引物满足：GC含量为45％～60％，退火温度为57℃～63℃，预期产物长度在170bp～280bp之间，引物长度在18bp～27bp之间，但从以已知品种的仙草的基因组DNA为模板、上述SSR位点所对应的SSR分子标记引物为引物进行PCR扩增反应得到的扩增产物的带型中不能将已知的4种仙草品种区分。因此，上述仙草的分子标记(SSR10位点、SSR36位点、SSR78位点、SSR81位点、SSR96位点及SSR97位点)、上述仙草的分子标记对应的特异性引物不适用于仙草的品种鉴定。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）
<120> SSR分子标记引物、仙草品种的鉴定方法及试剂盒
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acacgacacg acacgacacg acacg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agataagata agataagata agata 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataaaataaa ataaaataaa ataaa 25
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatctaatct aatctaatct aatctaatct 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttattttat tttattttat tttattttat 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccacatcca catccacatc cacatccaca 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atttggttcg gttcggtttt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtccatatc accaacaccc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caatgacaac caaacatgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcagcccgag aattgtctac 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgcatcttc atgtgcaatt c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacaacaatt cacctcgcaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttgtcatga cttcggcttg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aactcccacc gacagtttca 20
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgcaacaatt tttggtatat atctttc 27
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccctccagca tacctgctta 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaacatacca actcaccact cc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaagatgggt ggagtgagaa aa 22
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ataataataa taata 15
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcaatcaatc aatcaatcaa 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatacaatac aatacaatac aatac 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acctaaccta acctaaccta accta 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttttgttttg ttttgttttg ttttg 25
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaataaataa ataaataaat aaataaat 28
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atacgaaagc tggatgtggg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggattaatgg ccacgaagaa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtatgccacc cttacaagcc 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcacatacct gcaaccatga a 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgcgaattga ataaggcaaa 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttccaccctc tccttttctg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tggcatgcga gtgctattac 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gggagagtgg atgtgtaggc 20
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gcagaccata atgcttttgt ga 22
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccttagtgga tttcatgggc 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttgaacgaaa attgatggtc c 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctgttggatt tcaactcggg 20
Claims (10)
1.一种SSR分子标记引物，其特征在于，用于扩增仙草中含有SSR分子标记的核苷酸片段，所述SSR分子标记包括SSR80位点、SSR82位点、SSR83位点、SSR100位点、SSR102位点及SSR106位点中的至少一种，所述SSR80位点的核苷酸序列包含以ACACG为重复单元的串联重复序列，所述SSR82位点的核苷酸序列包含以AGATA为重复单元的串联重复序列，所述SSR83位点的核苷酸序列包含以ATAAA为重复单元的串联重复序列，所述SSR100位点的核苷酸序列包含以AATCT为重复单元的串联重复序列，所述SSR102位点的核苷酸序列包含以TTTAT为重复单元的串联重复序列，所述SSR106位点的核苷酸序列包含以TCCACA为重复单元的串联重复序列。
2.根据权利要求1所述的SSR分子标记引物，其特征在于，所述SSR80位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SSR82位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SSR83位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SSR100位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SSR102位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SSR106位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
3.根据权利要求1所述的SSR分子标记引物，其特征在于，包括用于扩增含有SSR80位点的核苷酸片段、含有SSR82位点的核苷酸片段、含有SSR100位点的核苷酸片段及含有SSR106位点的核苷酸片段的引物中的至少一种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的SSR分子标记引物，其特征在于，用于扩增含有所述SSR80位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；用于扩增含有所述SSR82位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示；用于扩增含有所述SSR83位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.12所示；用于扩增含有所述SSR100位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ IDNO.13～SEQ IDNO.14所示；用于扩增含有所述SSR102位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示；用于扩增含有所述SSR106位点的核苷酸片段的引物的序列分别如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示。
5.一种仙草品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测仙草的基因组DNA为模板、权利要求1～4任一所述的SSR分子标记引物为引物进行PCR扩增反应，得到扩增产物；及
根据所述扩增产物鉴定仙草的品种。
6.根据权利要求5所述的仙草品种的鉴定方法，其特征在于，所述根据所述扩增产物鉴定仙草的品种的步骤包括：
将所述扩增产物进行电泳，根据所述扩增产物的电泳结果鉴定仙草的品种。
7.根据权利要求5所述的仙草品种的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应体系的总体积为10μL～25μL，所述PCR扩增反应的反应体系包括0.2μM的正向引物、0.2μM的反向引物、1×DNA聚合酶预混液及100ng～200ng的所述待测仙草的基因组DNA。
8.根据权利要求5～7任一项所述的仙草品种的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性3min～5min；94℃变性30s，55℃～58℃退火30s，72℃延伸30s～45s，35个循环；72℃后延伸5min～10min。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的SSR分子标记引物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、DNA聚合酶预混液及电泳试剂中的至少一种。
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