CN102978288B - 鉴定大豆开花期长短的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定大豆开花期长短的分子标记及其应用。所述分子标记为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的大小为270bp的分子标记A；和/或，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀NF58的基因组DNA得到的大小为311bp的分子标记B。本发明所提供的分子标记可用于大豆品种或株系开花期长短的鉴定或筛选，大大提高了育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。

Description

鉴定大豆开花期长短的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种鉴定大豆开花期长短的分子标记及其应用。

背景技术

大豆开花期是重要的生育期性状之一，是控制营养生长与生殖生长转化的重要因素。开花期长短对多个产量相关性状都有影响，准确预测开花期的长短对筛选适合的大豆品种进行育种具有重要意义。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定大豆开花期长短的分子标记。

所述分子标记为如下1）或2）的分子标记：

1）分子标记A和分子标记B；

2）分子标记A；

所述分子标记A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的大小为270bp的分子标记；

所述分子标记B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀NF58的基因组DNA得到的大小为311bp的分子标记；

所述开花期长是指所述待测大豆从播种到开花的天数大于或等于43天；

所述开花期短是指所述待测大豆从播种到开花的天数小于或等于36天。

所述从播种到开花的种植地在本实施例中具体为中国河北省石家庄市室外大田，播种时间具体为6月底。

所述分子标记A和所述分子标记B是将所述PCR扩增的产物在5-7%（如6%）的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离得到的；

所述6%聚丙烯酰胺凝胶是指每配制100mL所述聚丙烯酰胺凝胶使用丙烯酰胺57g和双苯酰亚胺3克。

本发明保护上述分子标记在大豆育种中的应用。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定大豆开花期长短的方法，包括用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增待测大豆的基因组DNA，若所述PCR扩增的产物为所述分子标记A，则所述待测大豆为开花期长的大豆或候选为开花期长的大豆；若所述PCR扩增的产物为所述分子标记B，则所述待测大豆为开花期短的大豆或候选为开花期短的大豆；

所述开花期长是指所述待测大豆从播种到开花的天数大于或等于43天；

所述开花期短是指所述待测大豆从播种到开花的天数小于或等于36天；

所述从播种到开花的种植地在本实施例中具体为中国河北省石家庄市室外大田，播种时间具体为6月底。

本发明保护所述方法在筛选所述开花期长的大豆中的应用。

本发明保护所述方法在筛选所述开花期短的大豆中的应用。

在上述方法或应用中，所述待测大豆为大豆品种冀豆12号、冀NF58或由所述冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系。

在上述方法或应用中，所述由冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系为将所述冀豆12号和冀NF58杂交并繁衍至F₂代以上的世代。

在本发明的实施例中，所述由冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系为以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体。

实验证明，与实测开花期天数结果相比，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对A，PCR扩增待测大豆（以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体的64个株系）的基因组DNA，通过得到的分子标记（分子标记A和分子标记B）预测上述待测大豆开花期长短，准确率可达93.8%。本发明可用于鉴定或筛选大豆品种或株系的开花期长短，大大提高育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为用引物对A PCR扩增待测大豆的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，从左至右的泳道依次为：以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体中的编号分别为5、6、10、13、15、22、28、32、35、38、39、45、46、54、58、66、68、71、72、75、76、77、79、98、99、102、110、111、112、114、116、131、132、150、158和167的家系、大豆品种冀豆12号（J）、冀NF58（N）。

图2为用引物对X PCR扩增待测大豆的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，从左至右的泳道依次为：大豆品种冀豆12号（J）、冀NF58（N）、以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体中的编号分别为5、6、10、13、15、22、28、32、35、38、39、45、46、54、58、66、68、71、72、75、76、77、79、98、99、102、110、111、112、114、116、131、132、150、158和167的家系。

图3为用引物对A PCR扩增待测大豆的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，从左至右的泳道依次为：大豆品种冀豆12号（J）、3个冀NF58（N）、以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体中的编号分别为1、7、9、16、19、20、41、42、48、49、50、63、73、81、84、86、87、88、96、127、138、151、156、161、162、163、168和170的家系。

图4为用引物对X PCR扩增待测大豆的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，从左至右的泳道依次为：大豆品种冀豆12号（J）、冀NF58（N）、以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体中的编号分别为1、7、9、16、19、20、41、42、48、49、50、63、73、81、84、86、87、88、96、127、138、151、156、161、162、163、168和170的家系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆品种冀豆12号：夏播开花期43天，河北冀丰农产品科技有限公司。

大豆品种冀NF58：夏播开花期36天，河北冀丰农产品科技有限公司。

实施例1、利用分子标记测定大豆品种冀豆12号和大豆品种冀NF58

利用SDS法提取大豆品种冀豆12号的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对A进行PCR扩增，取10μl PCR扩增产物，在95℃变性3min，立即放至冰上冷却，用6%聚丙烯酰胺凝胶（测序胶）在90W恒功率下电泳分离1.5小时，获得大小为270bp的分子标记A。

利用SDS法提取大豆品种冀NF58的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对A进行PCR扩增，取10μl PCR扩增产物，在95℃变性3min，立即放至冰上冷却，用6%聚丙烯酰胺凝胶（测序胶）在90W恒功率下电泳分离1.5小时，获得大小为311bp的分子标记B。

同时利用引物对X（由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成）对上述两个大豆品种冀豆12号的基因组DNA和冀NF58的基因组DNA分别进行PCR扩增，取10μl PCR扩增产物，在95℃变性3min，立即放至冰上冷却，用6%聚丙烯酰胺凝胶（测序胶）在90W恒功率下电泳分离1.5小时，分别获得大小为130bp的分子标记C和大小为142bp的分子标记D。

上述PCR扩增的反应体系及条件如下：

反应体系（20μl）：4μl模板DNA（30ng/μl），0.6μl引物（10μM），1.5μl dNTPs（2.5mM），2.0μl10×PCR Buffer（含15mM Mg²⁺），0.2μl Taq酶（5U/μl）和11.7μl ddH₂O。

反应条件：94℃预变性5min，循环阶段：94℃变性30s；47℃退火30s；72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR产物于4℃保存。

上述6%聚丙烯酰胺凝胶（测序胶）：57克丙烯酰胺（Acrylamide），3克双苯酰亚胺（Bis），420克尿素（Urea），100毫升10×TBE缓冲液（溶剂为水，溶质及其浓度为tris108g/L、硼酸55g/L、EDTA7.43g/L），加ddH₂O至1000毫升。

实施例2、利用分子标记预测冀豆12号和冀NF58衍生品系的开花期长短

利用实施例1的分子标记A和B以及分子标记C和D对待测大豆进行开花期预测，同时对待测大豆开花期进行实际调查，具体方法和结果如下：

1、待测大豆：以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体，共64个家系；

对照：开花期长的大豆品种冀豆12号和开花期短的大豆品种冀NF58。

2、分子标记检测及开花期长短的预测：分别取下述步骤3待测大豆叶片（每个家系取10个单株的叶片混合）用SDS法提取基因组DNA，分别用实施例1的引物对A和引物对X进行PCR扩增，各取10μl PCR扩增产物，在95℃变性3min，立即放至冰上冷却，在6%聚丙烯酰胺凝胶（测序胶）上90W恒功率下电泳分离1.5小时，银染、显影后拍照，结果图1、图2、图3和图4所示，记录数据，若为分子标记A或D，则判断该待测大豆的开花期长，记为“L”；若为分子标记B或C，则判断该待测大豆的开花期短，记为“S”；结果如表1的“分子标记预测”一栏所示。

3、开花期长短的实际调查：2011年夏（具体为6月27日），在石家庄室外大田种植步骤1的待测大豆，随机区组设计，每个家系种1行，行长2.0米，行距0.5米，设3次重复。正常水肥条件下管理，统计各家系及亲本的开花天数即从播种日到开花日（家系株行内开花达到50%）的天数，计算三次重复的平均值；将开花天数大于或等于43天的待测大豆定义为开花期长的大豆，记为“L”，将开花天数小于或等于36天的待测大豆定义为开花期短的大豆，记为“S”，结果如表1的“实测结果”一栏所示。

表1.待测大豆开花期长短的预测结果

注：表中编号为数字的待测大豆为以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F_9:11重组自交系群体中的不同家系。

结果表明，用引物对A扩增待测大豆，通过获得的分子标记A或B来预测64个大豆株系的开花期长短中有60个株系与实测结果相符，准确率为93.8%，用引物对X扩增待测大豆，通过获得的分子标记C或D来预测64个大豆株系的开花期长短中有50个株系与实测结果相符，准确率为75%。

Claims (4)

1.如下的分子标记在大豆育种中的应用；

所述分子标记为如下1）或2）的分子标记：

1）分子标记A和分子标记B；

2）分子标记A；

所述分子标记A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的大小为270bp的分子标记；

所述分子标记B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀NF58的基因组DNA得到的大小为311bp的分子标记；

所述育种为鉴定或辅助鉴定待测大豆开花期长短；

开花期长是指所述待测大豆从播种到开花的天数大于或等于43天；

开花期短是指所述待测大豆从播种到开花的天数小于或等于36天；

所述大豆为大豆品种冀豆12号、冀NF58或由所述冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系；

所述由冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系为将所述冀豆12号和冀NF58杂交并繁衍至F₂代以上的世代。

2.一种鉴定或辅助鉴定大豆开花期长短的方法，包括用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增待测大豆的基因组DNA，若所述PCR扩增的产物为分子标记A，则所述待测大豆为开花期长的大豆或候选为开花期长的大豆；若所述PCR扩增的产物为分子标记B，则所述待测大豆开花期短的大豆或候选为开花期短的大豆；

所述分子标记A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的大小为270bp的分子标记；

所述分子标记B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀NF58的基因组DNA得到的大小为311bp的分子标记；

开花期长是指所述待测大豆从播种到开花的天数大于或等于43天；

开花期短是指所述待测大豆从播种到开花的天数小于或等于36天；

所述待测大豆为大豆品种冀豆12号、冀NF58或由所述冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系；

所述由冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系为将所述冀豆12号和冀NF58杂交并繁衍至F₂代以上的世代。

3.权利要求2所述方法在筛选所述开花期长的大豆中的应用。

4.权利要求2所述方法在筛选所述开花期短的大豆中的应用。

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