CN103571833A

CN103571833A - 一种ssr标记引物设计方法、小麦ssr标记引物

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Publication number: CN103571833A
Application number: CN201310579379.1A
Authority: CN
Inventors: 罗培高; 李鑫; 陈万权; 张敏; 任正隆; 张怀渝
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2033-11-18
Also published as: CN103571833B

Abstract

本发明公开了SSR标记引物设计方法。针对现有SSR标记引物多态性不足的缺陷，本发明提供了一种基于基因组草图序列设计新SSR标记引物的方法。本方法首先选择一位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物，其次将起始SSR标记引物与其所在染色体草图序列进行序列比对查找比对结果中的片段重叠群，然后搜寻片段重叠群中的SSR序列作为结果SSR序列，最后根据结果SSR序列设计SSR标记引物。本发明还提供了14对新的与小麦条锈病抗性有关的SSR标记引物，其中5对在供试遗传群体中产生多态性；以及以L693×L661和L661×L693F₂单株作为作图群体的小麦遗传图谱构建方法。本发明方法可快速增加已知位点SSR标记引物的数量，增加SSR标记多态性，与基因初定位相结合可以快速加密遗传图谱。

Description

一种SSR标记引物设计方法、小麦SSR标记引物

技术领域

本发明涉及一种分子标记引物设计方法及小麦分子标记引物，特别是涉及一种SSR分子标记引物设计方法及小麦SSR标记引物，属于基因工程、作物遗传育种领域。

背景技术

SSR标记以PCR技术为核心的DNA标记技术，其技术原理是利用SSR序列在基因组中分布广泛、多态性高，且SSR序列两端的序列多是相对保守的单拷贝序列的特征，根据检测基因组区域SSR序列两端的单拷贝序列设计一对特异引物，再利用PCR技术，扩增每个位点的SSR序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。SSR标记具有多态性高、可靠性高等技术优势，是目前最为常用的SSR分子标记技术。但由于创建新的标记时需确定重复序列两端的序列信息，因此其引物开发存在困难且费用较高。

辅助育种是目前植物分子标记技术的重要应用技术领域之一。利用分子标记辅助育种，前提是用分子标记对育种所需要的基因进行精确的遗传学定位，定位越精细，利用分子标记作为诊断标记就越准确，就越能加快育种进程。目前利用SSR标记技术实现基因精细定位依然存在如下三方面技术缺陷：一、SSR标记引物开发成本高、开发周期长；二、尽管SSR标记多态性出现的几率相对较高，但是仍然还是有很多位点不会出现多态性。尤其是针对遗传背景相近的姐妹系衍生的遗传作图群体，已标记的位点间遗传距离依然较大，比如小麦染色体0.1cM，就需要更多的多态性分子标记；三、在利用近等基因系对小麦新基因进行作图时，由于近等基因系本身在遗传上非常相似，因而也会面临由于多态性分子标记太少，而不能将基因的位置定位到很精确的问题。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种SSR标记引物设计方法，该方法基于基因组草图序列实现。利用新设计引物完成的SSR标记方法能够增加已知位点SSR标记多态性。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种SSR标记引物设计方法，其特征在于：依照如下步骤实施：

步骤S1、选择一位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物；

步骤S2、将起始SSR标记引物与其所在染色体草图序列进行序列比对，比对精度不低于95%，查找比对结果中的片段重叠群；

步骤S3、搜寻步骤S2查找到的片段重叠群中的SSR序列作为结果SSR序列；

步骤S4、根据该结果SSR序列与其左右两侧序列设计扩增引物，得到结果SSR标记引物。

上述方法的基本技术原理在于：利用现有位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物，在该起始SSR标记引物所在染色体草图序列进行比对，查找包含该起始SSR标记引物序列的草图片段重叠群（Contig）；再搜索该片段重叠群中SSR序列得到结果SSR序列，最后根据该结果SSR序列与其左右两侧序列设计出能扩增出该结果SSR序列的引物，即得到新设计出的SSR标记引物。依照此方法发现的结果SSR位点与起始SSR标记位点间物理距离很近（<10kb），在减数分裂时，该物理距离内发生交换的概率很小（平均概率<0.01%），因此两标记位点在遗传上可以视为完全连锁。如果比对查找到的草图片段重叠群中含有多个SSR位点，那么就可以实现从一个已知的SSR标记位点快速找到多个与其连锁的SSR标记位点。尽管SSR标记出现多态性的概率保持不变，但是由于SSR标记绝对数量增多可以使得标记呈现多态性的数量也随之增多，由此使得精细定位得以进行。利用引物设计方法设计出各新的结果SSR标记位点对应的引物，与PCR扩增相结合可以应用遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定、指纹图谱构建和分子标记辅助育种等领域。

上述方法，步骤S3中，一般选择5个核苷酸为重复元件的最大值。这是因为SSR是指重复元件为2～5个核苷酸的重复序列，其重复元件越长，发生变异导致多态性的概率就越低。

上述方法，可做如下优化：优化一，步骤S4的引物设计中，在保证能将目的SSR序列扩增的前提下，引物设计长度19bp～25bp；优化二，步骤S4的引物设计中，在保证能将目的SSR序列扩增的前提下，退火温度Tm值60℃，且上游和下游引物的Tm值相差不大于2℃；优化三，步骤S4的引物设计中，以结果SSR序列与其左右两侧各150bp序列进行扩增引物设计；优化四，在上述优化基础上，进一步地，步骤S4的引物设计中，(G+C)含量控制在40%～60%，PCR扩增产物长度150bp～250bp，尽量避免引物二级结构的出现。更进一步的是，(G+C)含量控制在55%。

上述SSR标记引物设计方法的一种优化方法是：步骤S1中首先进行目的基因的初定位，并在初定位确定的染色体区域内和/或附近寻找位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物。优化后的方案可应用于遗传图谱的加密，获得高密度的分子标记遗传图谱。

本发明提供14对小麦SSR标记引物（表1、表2），该小麦SSR标记引物是以8对已知的小麦SSR标记引物作为起始SSR标记引物利用本发明公开的标记引物设计方法设计得到的结果SSR标记引物。

表1 小麦SSR标记引物

※——具有多态性的SSR引物

表2 小麦SSR标记引物序列

以上述新设计的小麦SSR标记引物为基础，本发明进一步提供一种利用上述SSR标记引物设计方法得到的设计结果SSR标记引物实现的小麦遗传图谱构建方法，依照如下步骤实施：

步骤S1、以L693×L661与L661×L693的F₂单株作为作图群体；

步骤S2、提取作图群体植株的总DNA；

步骤S3、分别利用表2所示设计结果SSR标记引物以步骤S2所得总DNA为模版进行PCR扩增；

步骤S4、利用生物学软件分析步骤S3所得PCR扩增结果，构建小麦遗传图谱。

L693是小麦条锈病抗性株系，L661是小麦条锈病感病株系。依照上述方法获得的小麦遗传图谱与普通的方法构建的遗传图谱相比具有更大的标记密度，从而可能得到与目的基因更近的分子标记，能更好的应用于分子标记辅助育种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）提供了一种新的利用基因组草图序列实现的SSR标记引物设计方法，该方法可以快速增加已知位点的SSR标记引物的数量，可以通过增加SSR标记引物的总量增加具有多态性的SSR标记引物的数量，增加SSR标记多态性，能够使基因精确定位，并用定位该基因的空白标记作为育种中的辅助分子标记；（2）通过与基因初定位相结合，本发明方法可以快速加密遗传图谱；（3）提供了14对新的小麦SSR标记引物，其中5对在供试遗传群体中产生多态性；（4）提供的14对新的小麦SSR标记引物与小麦条锈病抗性有关，可以应用于小麦抗条锈病育种；（5）提供了以L693×L661与L661×L693的F₂单株作为作图群体的小麦遗传图谱构建方法，所得遗传图谱具有更大的标记密度。

附图说明

图1是实施例一技术路线示意图（示以Xgpw1239-1B为起始SSR标记引物）。

图2是实施例一扩增图。（R为抗病单株，H为杂合单株，S为感病单株，M为DNA Marker）

图3是实施例二扩增图。（亲本及F₂分离群体部分单株SSR引物扩增产物，泳道中，L661和L693为亲本，R为抗病单株，H为杂合单株，S为感病单株。）

图4是新设计SSR引物的中国春缺体-四体染色体定位图。

图5是采用本发明方法构建得到的小麦染色体1B的遗传图谱连锁群。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。

实施例一

本实施例记载以小麦材料实施的SSR标记引物设计方法，图1所示为技术路线图。

步骤S1、选择起始SSR标记引物

选择小麦1B染色体上已知的SSR标记引物Xgpw1239-1B作为起始SSR标记引物，其上、下游序列如SEQ ID NO.0511、SEQ ID NO.0512所示。

Xgpw1239-1B是L693的抗条锈病基因YrYU25初步定位后，确定的染色体区域附近的一个SSR标记。

步骤S2、查找片段重叠群

进入IWGSC（国际小麦基因测序委员会）官方网站http://www.wheatgenome.org/，选择BLAST工具，选择小麦1B染色体长、短臂（1BL、1BS）染色体草图序列为BLAST数据库；将Xgpw1239-1B序列与该BLAST数据库进行序列对比；选择Identities=100%的比对结果，发现一个长度为20647bp的片段重叠群符合要求，该片段重叠群序列中包含了Xgpw1239-1B引物的上下游序列，其IWGSC序列ID为3828766。

步骤S3、搜寻结果SSR序列

将该片段重叠群3828766下载后，用SSRHunter软件搜寻其中的SSR序列；选择5个核苷酸为重复原件的最大值，重复次数最少为5次进行搜寻，发现片段重叠群3828766中包含的4个SSR序列；以该4个SSR序列作为结果SSR序列。

步骤S4、结果SSR标记引物设计

分别利用步骤S3所得的4个SSR与其左右各150bp的序列数据，用Primer3软件设计扩增引物。

本实施方式的引物设计中，在保证能将目的SSR序列扩增的前提下，引物设计长度19～25bp；退火温度Tm值60℃,且上游和下游引物的Tm值相差不大于2℃；(G+C)含量55%；PCR扩增产物长度150～250bp；尽量避免引物二级结构的出现，最终得到了3对新的SSR标记引物（表1）。

步骤S5、PCR扩增及其遗传多态性检测

对新设计的引物进行扩增，PCR反应体系和扩增程序如下：

反应体系：Buffer2.5μL，MgCl₂2.5mM，dNTPs200μM，Primer2μM，DNA100ng，H₂O加至终体积25μL。

PCR反应程序：

预变性：94℃、3.00min

变性：94℃、1.00min→退火60℃、1.00min→延伸：72℃、1.00min；此过程35个循环

延伸：72℃、10.00min

扩增产物检测：扩增产物的检测通过普通变性胶或非变性胶检测。本实施方式中的具体检测方法是用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.3×TBE，2000V电压电泳40min，经过银染后成像（图2）。图2a、图2b、图2c分别显示结果SSR标记引物Xgpw1239-1B、Xgpw1239-2B、Xgpw1239-3B。

实施例二

本实施例记载以小麦材料实施的SSR标记引物设计方法。

分别选择7个在小麦遗传图谱上已公布的SSR标记引物（Xcfd2-1B、Xcfd65-1B、Xwmc626-1B、Xbarc137-1B、Xwmc597-1B、Xbarc187-1B、Xwmc611-1B）作为起始SSR标记引物，采用与实施例一相同的技术方案设计新的SSR标记引物。起始SSR标记引物与结果SSR标记引物如表1所示。银染后成像结果如图3所示。图3a、图3b、图3c、图3d、图3e、图3f、图3g、图3h、图3i、图3j、图3k分别显示结果SSR标记引物Xcfd2-1B-1、Xcfd65-1B-1、Xcfd65-1B-2、Xcfd65-1B-3、Xwmc626-1B-1、Xbarc137-1B-1、Xwmc597-1B-1、Xwmc597-1B-2、Xwmc597-1B-3、Xbarc187-1B-1、Xwmc611-1B-1。

实施例一、实施例二中共选择了8个在小麦遗传图谱上已公布的SSR标记引物为基础采用本发明方法设计新的SSR标记引物，共设计出了14对新的SSR引物（见表1、表2），显著增加了SSR标记位点的数量。

对新设计的SSR引物进行了中国春缺体-四体染色体定位，发现新设计的引物的确是位于小麦1B染色体上的。

14对新引物中，有Xcfd65-1B-1，Xcfd65-1B-2，Xwmc626-1B-1，Xbarc187-1B-1，Xwmc611-1B-1共计5对呈现多态性。图4a、图4b、图4c、图4d分别显示Xwmc626-1B-1、Xcfd65-1B-1、Xcfd65-1B-2、Xbarc187-1B-1。虽然并非所有位点的新引物都呈现多态性，但是如果出现例如Xcfd65-1B或Xwmc626-1B的情况，就能丰富多态性引物的数量，为遗传图谱的精细绘制提供标记。

实施例三

本实施例记载小麦材料SSR标记引物设计方法中基因初定位步骤的实施方法。

以小麦抗条锈病新材料L693的条锈病抗性新基因的精确定位为例。现有技术已经将抗条锈病新材料L693的抗条锈病基因YrYU25定位在了小麦的1B染色体上，且在1B染色体上只有3对多态性标记与抗性基因连锁（表3、表4），如果要对基因精确定位，3对多态性标记是远远不够的。根据YrYU25所在位点确定目的基因区域。

表3 1B染色体上与抗条锈病基因连锁的多态性引物统计

※——具有多态性的SSR引物

表4 1B染色体上与抗条锈病基因连锁的多态性引物序列

查寻小麦1B染色体的参考遗传图谱，针对性寻找目的基因区域内/附近已知的SSR标记位点，发现还有12对标记引物。以此12对标记引物作为起始SSR标记引物，并基于小麦基因组草图序列设计新的SSR引物，则能够用于遗传连锁图谱的精细绘制。

实施例四

本实施例记载以实施例二设计得到的小麦SSR标记引物实现的小麦遗传图谱构建方法。

步骤S1、以L693×L661与L661×L693的F₂单株作为作图群体

以L693与L661互为亲本分别得到两个F₂代遗传作图群体；

步骤S2、提取作图群体植株的总DNA

提取步骤S1得到的两个F₂群体的DNA作为作图群体植株的总DNA；

步骤S3、分别利用实施例一、二获得的设计结果SSR标记引物以步骤S2所得总DNA为模版进行PCR扩增

从实施例一、二中获得的5对呈现多态性的新的SSR引物中选取其中扩增效果好的3对：Xcfd65-1B-1，Xwmc626-1B-1，Xbarc187-1B-1，对群体DNA进行PCR扩增，扩增产物用聚丙烯凝胶电泳进行检测；

步骤S4、利用生物学软件分析步骤S3所得PCR扩增结果，构建小麦遗传图谱

对引物的扩增带型进行统计，与L693具有相同带型的记录为A，与L661具有相同带型的记录为B，与L693、L661混合带型相同的记为H。

使用遗传连锁分析软件Joinmap4.0对数据进行分析，得到标记和基因之间的连锁距离，使用mapdraw对结果数据进行作图。

图5是采用本发明方法构建得到的小麦1B遗传图谱连锁群。

Claims

1.一种SSR标记引物设计方法，其特征在于：依照如下步骤实施：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S4扩增引物设计中，退火温度Tm＝60℃，且上游与下游引物的Tm值相差不大于2℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S4引物设计长度19bp～25bp。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S4中，(G+C)含量控制在40%～60%，PCR扩增产物长度150bp～250bp。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S3结果SSR序列搜寻中，选择5个核苷酸作为重复元件的最大值。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S1中首先进行目的基因的初定位，然后在初定位确定的染色体区域内和/或附近寻找位点已知的SSR标记引物作为起始SSR标记引物。

7.利用权利要求1～6任一所述的SSR标记引物设计方法实现的SSR分子标记方法。

8.利用权利要求1～6任一所述的SSR标记引物设计方法设计得到的小麦SSR标记引物，其特征在于：所述起始SSR标记引物与所述结果SSR标记引物分别如表1所示：

表1 小麦SSR标记引物

※——具有多态性的SSR引物。

9.一种利用权利要求8所述的小麦SSR标记引物实现的小麦遗传图谱构建方法：其特征在于：依照如下步骤实施：

步骤S1、以L693×L661与L661×L693的F₂单株作为作图群体；

步骤S2、提取作图群体植株的总DNA；

步骤S3、分别利用所述设计结果SSR标记引物以步骤S2所得总DNA为模版进行PCR扩增；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中，PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.3×TBE，2000V电压电泳40min，经过银染后成像。