CN101760546A - 抗病基因的分子标记及其染色体定位 - Google Patents

Abstract

迅速发展的DNA分子标记技术促进了小麦抗病基因的标记和作图及其染色体定位。小麦抗白粉病基因分子标记筛选始于90年代初，在已报道的67个主效小麦抗白粉病基因中，已对49个基因进行了标记和作图。Biffen(1905)最先报道小麦条锈病抗性符合孟德尔遗传规律，随后有许多抗条锈病基因被鉴定和定位。迄今为止，国际上已命名的抗小麦条锈病主效基因已有37个位点(Yr1-Yr37)的40个主效基因(包括5个复等位基因)，已对17个基因进行了标记和作图。

Description

抗病基因的分子标记及其染色体定位

技术领域

抗病基因的分子标记及其染色体定位属于作物遗传育种学领域。

背景技术

迅速发展的DNA分子标记技术促进了小麦抗病基因的标记和作图及其染色体定位。小麦抗白粉病基因分子标记筛选始于90年代初，在已报道的67个主效小麦抗白粉病基因中，已对49个基因进行了标记和作图。Biffen(1905)最先报道小麦条锈病抗性符合孟德尔遗传规律。随后有许多抗条锈病基因被鉴定和定位。迄今为止，国际上已命名的抗小麦条锈病主效基因已有37个位点(Yr1-Yr37)的40个主效基因(包括5个复等位基因)，已对17个基因进行了标记和作图。

发明内容

1、RFLP(Restriction fragment length polymorphism)标记

RFLP是较早被广泛应用的一类分子标记，是基于Southern杂交的分子标记方法。该技术首先在人类基因组作图中发展起来(Botstein et al，1980)，以后被广泛用于植物基因组作图(Hellentiaris et al，1986)。

但是，由于RFLP标记对DNA质量要求高、用量大(5～10ug)、操作复杂，通常要接触放射性物质，因而难以直接在育种中应用。为此，Talbert等(1995)提出将RFLP标记转化成基于PCR的STS标记，以方便其在遗传标记和育种中的应用。Pm1a和Pm4的RFLP标记已相继转化成了STS标记(Hu等，1997；刘金元等，1999；陈松柏等，2002)，为这些标记在育种实践中的应用奠定了基础。

2、RAPD(Random amplified polymorphic DNA)标记

RAPD是由Williams等(1990)和Welsh等(1990)分别发展起来的分子标记技术。与RFLP相比，其具有简单易行、DNA用量少、无需放射性同位素、周期短等优点。

RAPD技术没有物种特异性限制，对DNA质量要求不高，操作简便，但其重复性、可靠性较差，通常需要将RAPD标记转化为特异性强、稳定性高的SCAR、STS标记。Liu等(1999)将Pm21的RAPD标记克隆、测序，设计特异引物，转化成了特异性的SCAR标记。Wang等(2001)将黑麦的专化SCAR标记用于Pm8的检测。Zhang等(2000)也参照Cenci等(1999)的研究结果设计应用了可以用以检测Pm13的SCAR标记。Oliver(1999)筛选到与Yr17连锁的RAPD标记，并将其转化为稳定的SCAR标记。随后，Yr5、Yr8、Yr18等抗条锈病基因的RAPD标记经克隆、测序和引物设计转化为SCAR标记(钟鸣等，2000；刘红彦等，1999)。

3、AFLP(Amplified fragment length polymorphism)标记

AFLP是由荷兰KeyGene公司Zabeau(1993)发明，并由Vos等(1995)发展起来的分子标记技术。该技术既有RFLP技术的可靠性，又有PCR技术高效灵敏等优点，其最大优点是多态性丰富，重复性好，通过变性PAGE可检测到的谱带多达50-100条，是一种十分理想和有效的遗传标记。

但是，AFLP标记技术存在的技术性强、对DNA质量要求高、试验花费大等不利因素大大限制了其在实际中的应用。为此，人们试图将得到的与目的基因连锁的AFLP标记转化为位点特异性的SCAR标记或STS标记，以增强标记的易用性。王丽娟(2005)通过对225对AFLP引物组合的筛选，找到6个与抗条锈基因连锁的AFLP标记，并将其中的AFLP标记P34M54₄₂₁、P32M59₂₀₈、P36M53₁₆₄成功转化为SCAR标记SC-P34M54₃₇₈、SC-P32M59₁₄₇和SC-P36M5₃₉₉。邵映田等(2001)筛选到1个与Yr10基因连锁的AFLP标记PT0502，并将其转化为稳定的SCAR标记SC₂₀₀，遗传距离仅为0.5cM。Smith等(2002)应用AFLP技术将1个与小麦YrMoro抗条锈基因共分离的AFLP标记转化为STS标记，为遗传育种提供了方便。

4、SSR(Simple sequence repeats)标记

SSR是基因组重复序列中的一种类型，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，其特点是多态性强、共显性、在整个基因组中随机分布、稳定性好、操作简单。

SSR已被证实是小麦研究中的一种非常有效的分子标记，比RFLP标记技术检测到的多态性更高(

等，1995；Devos等，1995)。Fahima等(1997)用23个SSR标记共检测出230个等位基因，平均每个引物能检测到10个等位基因。Plaschke等(1995)用23个SSR标记对40份欧洲小麦品种进行检测，共发现142个多态性位点，平均每个SSR标记能检测到6.2个多态性位点。Bryan等(1997)报道John Innes Centre研究组对200余个SSR克隆进行测序，并对其中153个SSR设计了引物，选用49个引物对10个小麦品种进行PCR扩增，平均每个位点能检测到3.5个等位变异。可见SSR标记在小麦的遗传研究中具有很大的应用潜力。

5、RGAP(Resistance gene analogs polymorphism)标记

抗性基因同源序列多态性(RGAP)是利用抗病基因产物保守序列设计特异引物，在不同物种中通过PCR扩增产生抗病基因同源序列多态性。比较克隆的植物抗病基因序列发现，大多数抗病基因在结构上均含有富含亮氨酸重复序列(Leucine Rich Repeats，LRR)、核苷酸结合位点(Nucleotide Binding Site，NBS)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/ThreonineKinases，STK)、跨膜结构域(Transmembrane Domain，TM)、亮氨酸拉链(Leucine Zipper，LZ)、果蝇Toll和人类白细胞介素受体结构域(Toll/1L-1 Receptor homologous region，T1R)等保守序列，并认为这些特定的结构域参与蛋白质间的相互作用。抗病基因中的这些保守序列为小麦RGAP的分离提供了极大的便利。目前，该技术已被广泛应用于植物抗病基因的分子标记、基因分离及遗传图谱构建等研究领域。有些抗病基因的分子标记已经被成功转化为可直接用于辅助育种的SCAR，STS等标记(Chen et al，2003)。Shi等(2001)利用Yr近等基因系，根据抗病基因不受序列设计引物筛选到4个与Yr9共分离的RGAP标记，证实Yr9基因定位在1B染色体，该标记的获得可用于Yr9基因的克隆和标记辅助选择。Chen等(2000)在研究HTAP时，用LRR和NBS序列得到由10个RGAP标记的一个连锁群的3个QTL。Yan等(2003)利用RGAP标记技术获得2个与Yr5共分离的共显性标记Xwgp-17和Xwgp-18。

除了以上介绍的几种分子标记外，还有许多分子标记技术，如STS，ISSR，CAPS标记等，已经趋向成熟或正在发展，这些标记技术的发展和成熟将为今后小麦抗病基因研究及育种工作提供很大的便利。

具体实施方式

1、RFLP(Restriction fragment length polymorphism)标记

RFLP是较早被广泛应用的一类分子标记，是基于Southern杂交的分子标记方法。该技术首先在人类基因组作图中发展起来(Botstein et al，1980)，以后被广泛用于植物基因组作图(Hellentiaris et al，1986)。

Hartl等最早于1993年以NILs为材料，用该技术找到了与小麦抗白粉病基因Pm3紧密连锁的RFLP标记，此后，又有学者相继找到了与Pm1a(Ma等，1994；Hartl等，1995)、Pm2(Ma等，1994；Hartl等，1995)、Pm3a(Hartl等，1993)、Pm3b(Ma等，1994)、Pm4a(Ma等，1994)、Pm5(Chao等，1989)Pm6(Tao等，2000)、Pm12(Jia等，1996)、Pm13(Caici等，1999)、Pm17(Hsam等，2000)、Pm18(Hsam等，1998)、Pm26(Rong等，2000)、Pm27(Jarve等，2000)、Pm29(Zeller等，2002)连锁的RFLP标记。Autrique等(1995)将抗条锈病基因Yr18定位在7D染色体的短臂上。Peng等(2000)建立了Yr15、YrH52的RFLP标记。Spielmepy等(2000)利用该技术分析1D染色体，绘制了RFLP图谱。截至目前，已经构建了小麦7个部分同源群较详尽的RFLP遗传图谱，并筛选到与抗叶锈基因Lr1、Lr3、Lr9、Lr10、Lr19、Lr24、Lr32、Lr34，抗条锈病基因Yr15、Yr18和抗秆锈病基因Sr22等连锁的RFLP标记。

但是，由于RFLP标记对DNA质量要求高、用量大(5～10ug)、操作复杂，通常要接触放射性物质，因而难以直接在育种中应用。为此，Talbert等(1995)提出将RFLP标记转化成基于PCR的STS标记，以方便其在遗传标记和育种中的应用。Pm1a和Pm4的RFLP标记已相继转化成了STS标记(Hu等，1997；刘金元等，1999；陈松柏等，2002)，为这些标记在育种实践中的应用奠定了基础。

2、RAPD(Random amplified polymorphic DNA)标记

RAPD是由Williams等(1990)和Welsh等(1990)分别发展起来的分子标记技术。与RFLP相比，其具有简单易行、DNA用量少、无需放射性同位素、周期短等优点。

Hartl等(1995)利用F₂分离群体构建的DNA池进行RAPD分析，鉴定到一个与抗白粉病基因连锁的RAPD标记。随后相继鉴定出与Pm1a(Hu等，1997)、Pm2(刘金元等，2000)、Pm4a(Li等，1995)、Pm6(王心宇等，2000)、Pm12(Shi等，1998)、Pm17(张旭等，1998)、Pm21(Qi等，1995)、Pm25(Shi等，1998)连锁的RAPD标记。Sun等(1997)采用近等基因系将Yr15基因定位在染色体1B上。Chagué等(1999)通过BSA法和NIL法相结合，找到了与Yr15紧密连锁的RAPD标记。牛永春等(1998)利用BSA法筛选到与小麦品种Lee中抗条锈基因紧密连锁的RAPD标记。对抗条锈病基因Yr5、Yr8和Yr10的近等基因系的RAPD分析分别找到3个与Yr8连锁的标记和3个与Yr5基因连锁标记(钟鸣等，2000，2002)。陈晓红等(2004)利用变性PAGE银染法鉴定筛选到2个与Yr5基因完全连锁和紧密连锁的分子标记S1320₂₀₇和S1348₃₆₃，在该研究中用变性PAGE分离PCR产物结合银染显色，改善了小麦RAPD实验的重复性和多态性水平。

RAPD技术没有物种特异性限制，对DNA质量要求不高，操作简便，但其重复性、可靠性较差，通常需要将RAPD标记转化为特异性强、稳定性高的SCAR、STS标记。Liu等(1999)将Pm21的RAPD标记克隆、测序，设计特异引物，转化成了特异性的SCAR标记。Wang等(2001)将黑麦的专化SCAR标记用于Pm8的检测。Zhang等(2000)也参照Cenci等(1999)的研究结果设计应用了可以用以检测Pm13的SCAR标记。Oliver(1999)筛选到与Yr17连锁的RAPD标记，并将其转化为稳定的SCAR标记。随后，Yr5、Yr8、Yr18等抗条锈病基因的RAPD标记经克隆、测序和引物设计转化为SCAR标记(钟鸣等，2000；刘红彦等，1999)。

3、AFLP(Amplified fragment length polymorphism)标记

AFLP是由荷兰KeyGene公司Zabeau(1993)发明，并由Vos等(1995)发展起来的分子标记技术。该技术既有RFLP技术的可靠性，又有PCR技术高效灵敏等优点，其最大优点是多态性丰富，重复性好，通过变性PAGE可检测到的谱带多达50-100条，是一种十分理想和有效的遗传标记。

Schweizer等(1998)利用6个与Pm4b紧密连锁的AFLP标记对该基因进行了分子作图，并用这些标记对收集的33个小麦材料进行了抗病性分析。与Pm1c(Hartl等，1999)、Pm4a(Hartl等，1999)、Pm17(Hsam等，2000)、Pm24(Huang等，2000)、Pm29(Zeller等，2002)等白粉病抗性基因连锁的AFLP标记相继被找到。Peng等(2000)建立了20个与抗条锈基因YrH52连锁的AFLP标记，显著增加了该基因周围的标记密度。周兖晨等(2001)通过用抗、感病材料及其F₂群体对24对AFLP引物组合进行筛选，获得1个与抗条锈基因YrLm紧密连锁的AFLP标记P1T3₂₀₅。

但是，AFLP标记技术存在的技术性强、对DNA质量要求高、试验花费大等不利因素大大限制了其在实际中的应用。为此，人们试图将得到的与目的基因连锁的AFLP标记转化为位点特异性的SCAR标记或STS标记，以增强标记的易用性。王丽娟(2005)通过对225对AFLP引物组合的筛选，找到6个与抗条锈基因连锁的AFLP标记，并将其中的AFLP标记P34M54₄₂₁、P32M59₂₀₈、P36M53₁₆₄成功转化为SCAR标记SC-P34M54₃₇₈、SC-P32M59₁₄₇和SC-P36M53₉₉。邵映田等(2001)筛选到1个与Yr10基因连锁的AFLP标记PT0502，并将其转化为稳定的SCAR标记SC₂₀₀，遗传距离仅为0.5cM。Smith等(2002)应用AFLP技术将1个与小麦YrMoro抗条锈基因共分离的AFLP标记转化为STS标记，为遗传育种提供了方便。

4、SSR(Simple sequence repeats)标记

SSR是基因组重复序列中的一种类型，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，其特点是多态性强、共显性、在整个基因组中随机分布、稳定性好、操作简单。

SSR已被证实是小麦研究中的一种非常有效的分子标记，比RFLP标记技术检测到的多态性更高(

等，1995；Devos等，1995)。Fahima等(1997)用23个SSR标记共检测出230个等位基因，平均每个引物能检测到10个等位基因。Plaschke等(1995)用23个SSR标记对40份欧洲小麦品种进行检测，共发现142个多态性位点，平均每个SSR标记能检测到6.2个多态性位点。Bryan等(1997)报道John Innes Centre研究组对200余个SSR克隆进行测序，并对其中153个SSR设计了引物，选用49个引物对10个小麦品种进行PCR扩增，平均每个位点能检测到3.5个等位变异。可见SSR标记在小麦的遗传研究中具有很大的应用潜力。

Huang等(2000)找到了与Pm24紧密连锁的SSR标记，等(2000)在定位Pm27、解超杰等(2003)在鉴定新的抗白粉病基因Pm31时均应用了SSR标记。Peng等(1999)利用SSR标记技术定位了3个与YrH52连锁的SSR标记，其中标记Xgwm413、Xgwm273与YrH52的遗传距离分别为1.3cM和2.7cM。Borner等(2000)获得1个距离Yrns-B1基因21cM左右的标记位点Xgwm493。Sun等(2002)以BC₃F₂和BC₃F₃为材料，筛选到1个距Yr5基因10.5-13.3cM的SSR标记。Ma等(2001)筛选到2个与Yr26连锁的SSR标记Xgwm11/18和Xgwm413，遗传距离分别为1.9cM和3.2cM，并将该基因定位在1BS上。Wang等(2002)建立了与Yr10相距1.2cM的SSR标记，这是目前为止找到的与Yr10连锁最紧密的SSR分子标记。

5、RGAP(Resistance gene analogs polymorphism)标记

抗性基因同源序列多态性(RGAP)是利用抗病基因产物保守序列设计特异引物，在不同物种中通过PCR扩增产生抗病基因同源序列多态性。比较克隆的植物抗病基因序列发现，大多数抗病基因在结构上均含有富含亮氨酸重复序列(Leucine Rich Repeats，LRR)、核苷酸结合位点(Nucleotide Binding Site，NBS)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/ThreonineKinases，STK)、跨膜结构域(Transmembrane Domain，TM)、亮氨酸拉链(Leucine Zipper，LZ)、果蝇Toll和人类白细胞介素受体结构域(Toll/1L-1Receptorhomologous region，T1R)等保守序列，并认为这些特定的结构域参与蛋白质间的相互作用。抗病基因中的这些保守序列为小麦RGAP的分离提供了极大的便利。目前，该技术已被广泛应用于植物抗病基因的分子标记、基因分离(Qin et al，2003)及遗传图谱构建(Maleki et al，2003)等研究领域。有些抗病基因的分子标记已经被成功转化为可直接用于辅助育种的SCAR，STS等标记。Shi等(2001)利用Yr近等基因系，根据抗病基因不受序列设计引物筛选到4个与Yr9共分离的RGAP标记，证实Yr9基因定位在1B染色体，该标记的获得可用于Yr9基因的克隆和标记辅助选择。Chen等在研究HTAP时，用LRR和NBS序列得到由10个RGAP标记的一个连锁群的3个QTL。Yan等利用RGAP标记技术获得2个与Yr5共分离的共显性标记Xwgp-17和Xwgp-18。

除了以上介绍的几种分子标记外，还有许多分子标记技术，如STS，ISSR，CAPS标记等，已经趋向成熟或正在发展，这些标记技术的发展和成熟将为今后小麦抗病基因研究及育种工作提供很大的便利。

Claims (5)

1.RFLP(Restriction fragment length polymorphism)标记

RFLP是较早被广泛应用的一类分子标记，是基于Southern杂交的分子标记方法，该技术首先在人类基因组作图中发展起来，以后被广泛用于植物基因组作图；但是，由于RFLP标记对DNA质量要求高、用量大(5～10ug)、操作复杂，通常要接触放射性物质，因而难以直接在育种中应用，为此，Talbert等(1995)提出将RFLP标记转化成基于PCR的STS标记，以方便其在遗传标记和育种中的应用。

2.RAPD(Random amplified polymorphic DNA)标记

RAPD是由Williams等(1990)和Welsh等(1990)分别发展起来的分子标记技术。与RFLP相比，其具有简单易行、DNA用量少、无需放射性同位素、周期短等优点，RAPD技术没有物种特异性限制，对DNA质量要求不高，操作简便，但其重复性、可靠性较差，通常需要将RAPD标记转化为特异性强、稳定性高的SCAR、STS标记。

3.AFLP(Amplified fragment length polymorphism)标记

AFLP是由荷兰KeyGene公司Zabeau(1993)发明，并由Vos等(1995)发展起来的分子标记技术。该技术既有RFLP技术的可靠性，又有PCR技术高效灵敏等优点，其最大优点是多态性丰富，重复性好，通过变性PAGE可检测到的谱带多达50-100条，是一种十分理想和有效的遗传标记，但是，AFLP标记技术存在的技术性强、对DNA质量要求高、试验花费大等不利因素大大限制了其在实际中的应用，为此，人们试图将得到的与目的基因连锁的AFLP标记转化为位点特异性的SCAR标记或STS标记，以增强标记的易用性。

4.SSR(Simple sequence repeats)标记

SSR是基因组重复序列中的一种类型，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，其特点是多态性强、共显性、在整个基因组中随机分布、稳定性好、操作简单。

SSR已被证实是小麦研究中的一种非常有效的分子标记，比RFLP标记技术检测到的多态性更高，可见SSR标记在小麦的遗传研究中具有很大的应用潜力。

5.RGAP(Resistance gene analogs polymorphism)标记

抗性基因同源序列多态性(RGAP)是利用抗病基因产物保守序列设计特异引物，在不同物种中通过PCR扩增产生抗病基因同源序列多态性，比较克隆的植物抗病基因序列发现，大多数抗病基因在结构上均含有富含亮氨酸重复序列(Leucine Rich Repeats，LRR)、核苷酸结合位点(Nucleotide Binding Site，NBS)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/ThreonineKinases，STK)、跨膜结构域(Transmembrane Domain，TM)、亮氨酸拉链(Leucine Zipper，LZ)、果蝇Toll和人类白细胞介素受体结构域(Toll/lL-1Receptor homologous region，T1R)等保守序列，并认为这些特定的结构域参与蛋白质间的相互作用，抗病基因中的这些保守序列为小麦RGAP的分离提供了极大的便利。目前，该技术已被广泛应用于植物抗病基因的分子标记、基因分离及遗传图谱构建等研究领域，有些抗病基因的分子标记已经被成功转化为可直接用于辅助育种的SCAR，STS等标记，

除了以上介绍的几种分子标记外，还有许多分子标记技术，如STS，ISSR，CAPS标记等，已经趋向成熟或正在发展，这些标记技术的发展和成熟将为今后小麦抗病基因研究及育种工作提供很大的便利。