CN106521021A - 一种用于鉴定水稻粒宽和粒重gs5基因的单倍体型的基因标记及应用 - Google Patents
一种用于鉴定水稻粒宽和粒重gs5基因的单倍体型的基因标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因的单倍体型的基因标记：包括正向引物与反向引物，以鉴定三种GS5单倍体型：明恢63型、珍汕97型或中花11型。本发明还提供了上述鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的方法，包括将用上述引物组对水稻基因组DNA进行PCR扩增；对获得的PCR产物，以限制性内切酶Stu I和/或限制性内切酶Nco I进行酶切电泳，以鉴定GS5基因的单倍体型。本发明所获得的基因标记为基因自身标记，不需要作表型鉴定；实验重复性好，结果可靠，能够准确、高效地选择GS5基因座位相应的单倍体型，为水稻分子标记辅助育种提供了重要的工具。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因的单倍体型的基因标记及应用。
背景技术
粒重是决定水稻产量的要素之一，它由水稻谷粒大小决定，该性状又可以分解为粒长、粒宽和粒厚，与粒长相关的基因/QTL如GS3、GL3、GL7(Fan等，2006；Zhang等，2012；Qi等，2012；Wang等，2015)，与粒宽相关的GW2、qSW5/GW5、GW8/OsSPL16)(Song等，2007；Shomura，等2008；Weng等，2008；Li等，2011；Wang等，2012)，与灌浆相关的GIF1和TGW6(Wang等，2008；Ishimaru等，2013)，以及调控谷粒大小/粒重的GS2(Hu等，2015；Duan等，2015；Chen等，2015)等相继被克隆。这些粒型形成相关基因的克隆和功能分析，为粒型分子设计育种提供了基因资源。
Li等(2011)报道的GS5控制粒宽和粒重，该基因编码一个丝氨酸羧肽酶，正调控籽粒大小，其较高的表达水平可能参与促进细胞周期循环，加快细胞循环进程，从而促进水稻颖壳细胞的横向分裂，增大颖壳的宽度，继而加快谷粒的充实和胚乳的生长速度，最终种子变大、粒重及单株产量提高。重组单株测序、qRT-PCR以及遗传转化实验都表明，GS5影响粒宽是由启动子的序列变异造成的。对GS5启动子区域测序发现，栽培品种序列分为三种单倍体型：H94或明恢63型(窄粒)、珍汕97型(中间型)和中花11型(宽粒)，每种单倍体型内的品种序列完全相同。然而目前还没有关于GS5基因辅助选择育种的功能分子标记，目前缺少通过对GS5基因的功能研究和序列变异进行分析从而确定GS5基因标记、以及GS5基因单倍体型的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明首先提供了用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因的单倍体型的基因标记及应用，以在分子标记辅助选择育种中提高选育效率，即本发明的第一目的在于提供一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的基因标记(下称CAPS标记或“GS5-M1”)，所述基因标记为以下引物组：
正向引物(5′-3′)CTCTTGCTAACTTTCCTCCA
反向引物(5′-3′)AGTTTCCTTTTCCACACACT。
优选地，本发明所述水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型为明恢63型、珍汕97型或中花11型。
优选地，本发明所述的明恢63型、珍汕97型或中花11型被标记的DNA序列分别为SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的DNA序列；更优选地，本发明所述的明恢63型、珍汕97型或中花11型被扩增的DNA序列分别为SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的DNA序列。其中，SEQ ID NO3～SEQ ID NO8分别为：
SEQ ID NO 3：单倍体型明恢63型被标记的DNA序列；
SEQ ID NO 4：单倍体型珍汕97型被标记的DNA序列；
SEQ ID NO 5：单倍体型中花11型被标记的DNA序列；
SEQ ID NO 6：单倍体型明恢63型被扩增的DNA序列；
SEQ ID NO 7：单倍体型珍汕97型被扩增的DNA序列；
SEQ ID NO 8：单倍体型中花11型被扩增的DNA序列。
本发明还提供了一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的PCR试剂组，优选地，所述PCR试剂组包括上述引物组、dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液。
本发明还提供了上述用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的试剂盒，优选地。本发明所述试剂盒包括上述GS5-M1基因标记或包括上述PCR试剂组。
本发明的另一目的在于提供一种鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的方法，包括如下步骤：
1)、以上述引物组(GS5-M1基因标记)，对水稻基因组DNA进行PCR扩增；
2)、将步骤1)获得的PCR产物，限制性内切酶Stu I和/或限制性内切酶Nco I进行酶切电泳，以鉴定GS5基因的单倍体型。
优选地，本发明所述步骤1)中的PCR扩增的条件为：
1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，16℃保温。
优选地，本发明所述步骤2)使用限制性内切酶Stu I酶切电泳后，获得电泳条带大小为456bp的水稻单倍体型为中花11型；获得93bp和363bp两个条带，分别为明恢63型和珍汕97型；优选地，所述步骤2)使用限制性内切酶Nco I酶切电泳后，获得电泳条带大小为456bp的水稻单倍体型为明恢63和中花11型；获得184bp和272bp两条片段为珍汕97型。
因此，本发明提供了上述基因标记在鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型以及水稻分子标记辅助育种中的应用。
通过本发明的技术方案以及后续实施例所示，本发明的用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因的单倍体型的基因标记至少具有以下优点：
1)本发明所获得的基因标记是根据GS5基因造成表型变异的启动子的碱基差异设计的，为基因自身标记，在标记辅助选择育种中不需要作表型鉴定。
2)本发明的标记为共显性标记，可鉴别GS5基因座位不同单倍体型的杂合体和纯合体，实验重复性好，结果可靠。
3)利用本发明的标记进行辅助选择育种，不仅节约成本，而且能够准确、高效地选择GS5基因座位相应的单倍体型。
附图说明
图1为GS5基因的三种单倍体型明恢63型(MH63)、珍汕97型(ZS97)和中花11型(ZH11)被标记的部分启动子序列比较图；
图2为标记基因GS5-M1对24个水稻品种基因组DNA扩增的PCR产物利用Stu I酶切的电泳检测结果图；
图3为标记基因GS5-M1对24个水稻品种基因组DNA扩增的PCR产物利用Nco I酶切的电泳检测结果图。
具体实施方式
在本发明的实施例中，提供了一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的基因标记，包括以下引物组：
正向引物(5′-3′)CTCTTGCTAACTTTCCTCCA——序列表中SEQ ID NO1；以及
反向引物(5′-3′)AGTTTCCTTTTCCACACACT——序列表中SEQ ID NO2。
在本发明的实施例中，所述水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型为明恢63型、珍汕97型或中花11型。
在本发明的一个实施例中，所述的明恢63型、珍汕97型或中花11型被标记的DNA序列分别为SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的DNA序列；在本发明另一个优选的实施例中，所述的明恢63型、珍汕97型或中花11型被扩增的DNA序列分别为SEQ ID NO6、SEQ IDNO7或SEQ ID NO8的DNA序列。
其中，SEQ ID NO3～SEQ ID NO8分别为序列表中以下序列：
SEQ ID NO3：单倍体型明恢63型被标记的DNA序列；
SEQ ID NO4：单倍体型珍汕97型被标记的DNA序列；
SEQ ID NO5：单倍体型中花11型被标记的DNA序列；
SEQ ID NO6：单倍体型明恢63型被扩增的DNA序列；
SEQ ID NO7：单倍体型珍汕97型被扩增的DNA序列；
SEQ ID NO8：单倍体型中花11型被扩增的DNA序列。
在本发明的一个实施例中，本发明还提供了一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的PCR试剂组；在本发明的另一个实施例中，所述PCR试剂组包括上述正反向引物组、dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液。
在本发明的一个实施例中，所述PCR缓冲液采用10μL反应体系：模板DNA 1.0μL，10×PCR Buffer 1.0μL，25mM的MgCl2 1.0μL，2mM的dNTP 1.0μL，0.3μM的引物1.0μL，Taq酶0.2U，加ddH2O补至10μL。
在本发明的另一个实施例中，PCR反应后的酶切反应分别体系为：Stu I0.5μL，10×M Buffer 2μL，加ddH2O补至20μL；Nco I 0.5μL，10×K Buffer 2μL，BSA 2μL，加ddH2O补至20μL。反应条件为：37℃温浴(水浴或空气浴)1个小时。
在本发明的一个实施例中，还提供了上述用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的试剂盒；在本发明的又一个实施例中，本发明所述试剂盒包括上述引物组或包括上述PCR试剂组。
在本发明的一个实施例中，提供了一种鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的方法，包括如下步骤：
1)、以上述引物组(GS5-M1基因标记)，对水稻基因组DNA进行PCR扩增；
2)、将步骤1)获得的PCR产物，限制性内切酶Stu I和/或限制性内切酶Nco I进行酶切电泳，以鉴定GS5基因的单倍体型。
在本发明的一个实施例中，本发明所述步骤1)中的PCR扩增的条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，16℃保温。
在本发明的再一个实施例中，本发明所述步骤2)使用限制性内切酶Stu I酶切电泳后，获得电泳条带大小为456bp的水稻单倍体型为中花11型；获得93bp和363bp两个条带，分别为明恢63型和珍汕97型；优选地，所述步骤2)使用限制性内切酶Nco I酶切电泳后，获得电泳条带大小为456bp的水稻单倍体型为明恢63和中花11型；获得184bp和272bp两条片段为珍汕97型。因此，利用Stu I对GS5-M1标记的PCR扩增产物进行酶切电泳，可以准确鉴定出宽粒中花11型品种；利用Nco I对PCR产物进行酶切电泳，可以鉴定出中宽珍汕97型品种，结合二者检测结果可以鉴定出窄粒明恢63型品种。
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1 24种水稻的GS5基因型分析
1、供试材料
三种水稻单倍体型GS5基因单倍体型(窄粒明恢63型、中宽珍汕97型和宽粒中花11型)分别选择如下表1所示的水稻品种，并按如下方法测定粒宽。
表1 24种水稻品种的单倍体型及粒宽
2、粒宽测定
每份材料随机取10粒饱满的谷粒，将它们肩并肩排列，不重叠、不留隙紧靠摆成一行，用游标卡尺读数，求其平均值即为粒宽(mm)。参见上表1。
3、DNA提取
在苗期取上述水稻叶片，基因组DNA的提取参照Scott等(1988)的CTAB法，改进如下：
1)取约0.1g叶片，置于2.0mL离心管中，加入1粒钢珠及500μL 2×CTAB DNA提取液(20g CTAB，12.1g Tris-Base，7.44g EDTA-Na，81.9g NaCl，溶解于1L蒸馏水中)，使用组织研磨仪打碎叶片，65℃温浴30min，期间振动混匀数次；
2)从水浴中取出离心管，加入约500μL氯仿(CHCl3)，充分震荡混匀，在10000rpm下离心5min；
3)转移上清液至新的1.5mL的离心管中，加入上清体积0.7～1倍的异丙醇，将离心管轻微混匀后于-20℃冰箱中放置半小时后，10000rpm离心5min；
4)弃上清液，管底的乳白色沉淀用70％的酒精洗涤两次。将离心管中的酒精倒出后，倒置于干净的吸水纸上自然晾干；
5)晾干后的DNA加双蒸水溶解，调节最终浓度为100～1000ng/μL，置于－20℃冰箱内保存备用。
4、基因标记的设计
如图1所示，发明人有选择地设计了三种水稻GS5基因单倍体型(窄粒明恢63型、中宽珍汕97型和宽粒中花11型)的CAPS基因标记GS5-M1(图1)，其中，设计的正反引物序列如下：
正向引物(5′-3′)CTCTTGCTAACTTTCCTCCA
反向引物(5′-3′)AGTTTCCTTTTCCACACACT。
其中，灰色突出表示水稻窄粒明恢63型、中宽珍汕97型和宽粒中花11型之间的序列变异位置，基因标记GS5-M1的前后引物(即正向、反向引物)位置在图1中标明，Stu I和Nco I两处酶切识别位点也标注在相应的SNP位置上。
其中，如图1所示，SEQ ID NO 3～NO8所对应的DNA序列分别为：
SEQ ID NO3：单倍体型明恢63型(MH63)部分启动子DNA序列；
SEQ ID NO4：单倍体型珍汕97型(ZS97)部分启动子DNA序列；
SEQ ID NO5：单倍体型中花11型(ZH11)部分启动子DNA序列；
SEQ ID NO6：单倍体型明恢63型被扩增的DNA序列；
SEQ ID NO7：单倍体型珍汕97型被扩增的DNA序列；
SEQ ID NO8：单倍体型中花11型被扩增的DNA序列。
5、基因型分析
利用设计的基因标记GS5-M1(上述正反向引物组)对24份供试水稻品种进行基因型检测，首先通过设计的上述引物组进行PCR扩增，扩增产物进行酶切反应，酶切后的PCR产物进行凝胶电泳即可鉴定出三种基因型水稻。
PCR采用10μL反应体系：模板DNA 1.0μL，10×PCR Buffer 1.0μL，25mM的MgCl21.0μL，2mM的dNTP 1.0μL，0.3μM的引物1.0μL，Taq酶0.2U，加ddH2O补至10μL。
PCR扩增条件为：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，16℃保温。
PCR结束后，取1μL产物进行酶切反应。酶切反应分别体系为：Stu I 0.5μL，10×MBuffer 2μL，加ddH2O补至20μL；Nco I 0.5μL，10×K Buffer 2μL，BSA2μL，加ddH2O补至20μL。反应条件为：37℃温浴(水浴或空气浴)1个小时。
酶切后的PCR产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上拍照。
PCR产物利用限制性内切酶Stu I进行酶切，所有14个籼稻品种能够被切开，扩增出93bp和363bp两个条带，所有10个粳稻品种都不能被切，电泳条带大小为456bp(图2)。如图2所示，M为DNA marker，1～24品种分别为明恢63、R402、R998、黄华占、Dular、Kasalath、珍汕97、龙特甫、广陆矮4号、桂朝2号、南京11号、特青、马尾占、IR8、中花11、日本晴、空育131、桂花黄、秀水09、郑稻5号、农垦57、苏御糯、辽粳287、武育粳3号。
PCR产物利用限制性内切酶Nco I进行酶切，籼稻珍汕97等8个品种能够被切开，扩增出184bp和272bp两条片段，籼稻明恢63等6个和中花11等10个粳稻品种不能被切，电泳条带大小为456bp(图3)。如图3所示，M为DNA marker，1～24品种分别为明恢63、R402、R998、黄华占、Dular、Kasalath、珍汕97、龙特甫、广陆矮4号、桂朝2号、南京11号、特青、马尾占、IR8、中花11、日本晴、空育131、桂花黄、秀水09、郑稻5号、农垦57、苏御糯、辽粳287、武育粳3号。
对这24个品种的粒宽进行烤种，结合基因型分析，发现利用Stu I对GS5-M1标记的PCR扩增产物进行酶切电泳，可以准确鉴定出宽粒中花11型品种；利用Nco I对PCR产物进行酶切电泳，可以鉴定出中宽珍汕97型品种，结合二者检测结果可以鉴定出窄粒明恢63型品种。
电泳谱带清晰、特异，表明利用该基因标记GS5-M1进行PCR扩增，随后对PCR产物用Stu I和Nco I两种限制性内切酶酶切后进行电泳检测，能够很好地区分GS5基因座上的三种等位基因型，可用于水稻GS5基因的标记辅助选择育种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 江西省农业科学院水稻研究所
<120> 一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因的单倍体型的基因标记及应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctcttgctaa ctttcctcca 20
<210> 2
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agtttccttt tccacacact 20
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cctcttgcta actttcctcc aaaatatgca taagattacc cattccatag aaattttaaa 300
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aattgaaatc ctccaaaatt cttacatttt ttctacaaat caaaggtgcc ataaatccac 420
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gcctaactac ctaagtagat actacaggaa tattggcacg catgttcaaa aaataataaa 780
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tctctaattt ctaactccca tggaattact agagaagcca aacaaactga ctctaatgtc 900
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Claims (10)
1.一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的基因标记，其特征在于，所述基因标记为以下引物组：
正向引物(5′-3′)CTCTTGCTAACTTTCCTCCA
反向引物(5′-3′)AGTTTCCTTTTCCACACACT。
2.根据权利要求1所述的基因标记，其特征在于，所述水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型为明恢63型、珍汕97型或中花11型。
3.根据权利要求2所述的基因标记，其特征在于，所述明恢63型、珍汕97型或中花11型中被标记的DNA序列分别为SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的DNA序列。
4.根据权利要求2所述的基因标记，其特征在于，所述明恢63型、珍汕97型或中花11型被扩增的DNA序列分别为SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的DNA序列。
5.一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的PCR试剂组，其特征在于，所述PCR试剂组包括权利要求1所述的引物组、dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液。
6.一种用于鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的基因标记或包括权利要求5所述的PCR试剂组。
7.一种鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型的方法，包括如下步骤：
1)、以权利要求1～4任一项所述的引物组，对水稻基因组DNA进行PCR扩增；
2)、将步骤1)获得的PCR产物，限制性内切酶Stu I和/或限制性内切酶Nco I进行酶切电泳，以鉴定GS5基因的单倍体型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的PCR扩增的条件为：
1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环；3)72℃延伸5min，16℃保温。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)使用限制性内切酶Stu I酶切电泳后，获得电泳条带大小为456bp的水稻单倍体型为中花11型；获得93bp和363bp两个条带，分别为明恢63型和珍汕97型；优选地，所述步骤2)使用限制性内切酶Nco I酶切电泳后，获得电泳条带大小为456bp的水稻单倍体型为明恢63和中花11型；获得184bp和272bp两条片段为珍汕97型。
10.根据权利要求1所述的基因标记在鉴定水稻粒宽和粒重GS5基因单倍体型以及水稻分子标记辅助育种中的应用。
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