CN107400718A - 基于Real‑timeARMS‑qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 - Google Patents
基于Real‑timeARMS‑qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107400718A CN107400718A CN201710755444.XA CN201710755444A CN107400718A CN 107400718 A CN107400718 A CN 107400718A CN 201710755444 A CN201710755444 A CN 201710755444A CN 107400718 A CN107400718 A CN 107400718A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- arms
- dendrobidium huoshanness
- dna
- qpcr
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 241000208140 Acer Species 0.000 title claims abstract description 31
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 44
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 9
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 9
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 9
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 240000004638 Dendrobium nobile Species 0.000 description 16
- 241001523681 Dendrobium Species 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 7
- 241000026010 Dendrobium candidum Species 0.000 description 6
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical class [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 241001264165 Dendrobium devonianum Species 0.000 description 2
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 241001143500 Aceraceae Species 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 241000229499 Dendrobium loddigesii Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000595467 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010052641 Mitochondrial DNA mutation Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001529246 Platymiscium Species 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001437 anti-cataract Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于Real‑time ARMS‑qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法,该引物组包括两对预扩增引物和两对ARMS特异性引物;该鉴定方法包括:待检样品DNA的提取;预扩增;Real‑time ARMS‑qPCR扩增。本发明基于Real‑time ARMS‑qPCR鉴定霍山石斛的引物组可有效地进行扩增,通过该引物组采用基于ARMS技术结合实时荧光定量PCR方法,可以快速且精准地对霍山石斛及其枫斗制品进行鉴定,建立了一种准确、灵敏、快速、稳定、可重复的霍山石斛及其枫斗制品的鉴定方法。
Description
技术领域
本发明涉及霍山石斛及其枫斗制品鉴定,具体涉及一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组及其鉴定方法。
背景技术
霍山石斛又称米斛、霍石斛等,属兰科石斛属多年生草本植物,为我国特有濒危珍稀石斛品种,因其质量上乘而驰名中外。现代药理学研究表明:霍山石斛具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗白内障等极高药用价值。由于霍山石斛自然状态下萌芽率低、生长缓慢,加上长期过度采挖,其野生资源已濒临灭绝,导致市场上霍山石斛伪品很多。石斛原植株及枫斗产品形态相似。近年来霍山石斛及其枫斗制品的伪品很多,且多为其他枫斗类石斛,因此对霍山石斛及其枫斗制品的准确鉴定显得尤为重要。传统形态、理化鉴定方法准确性低,而传统的分子鉴定技术如RAPD、Ap-PCR等又具有可重复性差、稳定性差、用时较久、实验条件苛刻等缺点然而。亟需建立一种准确、灵敏、快速、稳定的鉴定方法。
实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,rt-qPCR)是在PCR基础上发展起来的具有高灵敏性的核酸定量技术。其原理是利用荧光信号实时监测整个PCR进程并对特异性产物的量进行分析。目前研究表明可以通过荧光阈值(threshold)和Ct值(样本域值循环数)对物种进行有效鉴定。突变扩增阻滞体系(Amplification RefractoryMutation System,ARMS)指在特异性引物的3’近末端引入一个或两个人为的错配碱基以增强鉴定反应的特异性。其原理是3’末端错配的引物以低于配对引物的速度延伸,待鉴别物种的片段被扩增出来而非目的物种的DNA不能扩增,从而达到鉴定的目的。Real-timeARMS-qPCR技术将ARMS与rt-qPCR技术相结合,可以对突变体或待测种进行定量、定性检测,具有准确性高、重复性好等优点。目前已广泛用于病毒突变体、线粒体DNA突变位点等方面的鉴别。作为一种珍稀中草药,霍山石斛及其枫斗制品的快速有效鉴定亟需展开。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的问题,本发明提供一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组及其鉴定方法。通过该引物组采用ARMS技术结合rt-qPCR可以快速且精准地对霍山石斛及其枫斗制品进行鉴定。
技术方案:为了实现上述目的,如本发明所述一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组,包括两对预扩增引物和两对ARMS特异性引物,所述两对预扩增引物:第一对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.1和2所示,第二对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.3和4所示;所述两对ARMS特异性引物:第一对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.5和6所示,第二对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.7和8所示。
石斛属植物经过烘干等过程加工为枫斗类制品后,其多糖含量显著增加,使得DNA提取的得率十分低,同时加工过程也增加了DNA损伤,导致获得的DNA片段完整度较低,难以满足常规PCR反应。本发明通过对石斛属植物大量核基因组及绿体基因组序列片段的比对及序列变异度的计算分析,获得了一些具有高序列变异度的片段,并从中筛选出含有霍山石斛特有变异位点的片段。基于含有霍山石斛特有变异位点的片段两侧的保守序列进行引物设计,并进行PCR扩增验证,最终获得扩增效率最高的DNA片段,其扩增引物序列为Seq IDNO.1-4。该引物可以准确、有效的对损伤后的DNA进行扩增,提高目标片段DNA浓度,便于后续鉴定分析。
而基于霍山石斛特有变异位点设计的特异性引物,可以有效的在预扩增后的石斛属植物及枫斗类制品DNA中特异性扩增出霍山石斛。同时,本发明利用ARMS技术对引物对进行改进,在引物序列末端第2-4个碱基位置处随机引入错配碱基,经反复实验对比,获得效果最佳的ARMS特异性引物Seq ID NO.5-8。该引物可以更加快速、准确、稳定的鉴定霍山石斛及其枫斗制品。
Seq ID NO.1:
5’-GGGCAATCCTGAGCCAAATC-3’
Seq ID NO.2:
5’-AGAGGGACTTGAACCCTCACGA-3’
Seq ID NO.3:
5’-CCACAGGATCAGAAGTAGTGG-3’
Seq ID NO.4:
5’-TCCTAGATGTGAAAAGAGGC-3’
Seq ID NO.5:
5’-TGTTCTAACGAATGAAATTGCCTG-3’
Seq ID NO.6:
5’-AGATAGATTCTTAATCTAATGCTG-3’
Seq ID NO.7:
5’-CATAATAAATATGTCGAAATTCTTTGGTT-3’
Seq ID NO.8:
5’-ACTCATTCACTGAGTAAAGGATTGAAGTA-3’。
如本发明所述的一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的鉴定方法,包括如下步骤:
(1)待检样品DNA的提取:液氮充分研磨待检样品,提取总DNA;
(2)预扩增:以上述DNA为模板,利用预扩增引物进行PCR扩增,获得预扩增DNA;
(3)Real-time ARMS-qPCR扩增:以预扩增DNA为模板,利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增,得到荧光扩增曲线及相应Ct值,并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
其中,步骤(2)所述的PCR扩增反应体系为:总体积20μL,包括:10×PCR Buffer 2μL、dNTP 1.4μL,Mg2+1.4μL,预扩增上游引物和下游引物各2μL,模板DNA 3μL DNA,Taq DNA聚合酶0.2μL,余量为ddH2O。
所述的PCR扩增反应条件为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃或47℃退火30s,72℃延伸5min,共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
其中,步骤(3)所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为:总体积20μL,包括:预扩增DNA 3μL,ARMS特异性上游引物和下游引物各2μL,SYBR Green Mix TaqⅡ10μL,余量为ddH2O。
所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为:94℃预变性4min;94℃变性30s,53℃或55℃退火30s,72℃延伸5min,共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
进一步地,所述霍山石斛还包括霍山石斛的枫斗制品。
有益效果:与现有技术相比,本发明基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛的引物组可有效地进行扩增,通过该引物组采用基于ARMS技术结合实时荧光定量PCR方法,可以快速且精准地对霍山石斛及其枫斗制品进行鉴定,建立了一种准确、灵敏、快速、稳定、可重复的霍山石斛及其枫斗制品的鉴定方法。本发明通过扩增曲线及Ct值差异对霍山石斛进行鉴定,基于霍山石斛的特异性扩增:扩增曲线最早出现且Ct值较低,可达到快速、准确、稳定、鉴定霍山石斛及其枫斗制品的目的。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的预扩增胶图;
图2为本发明实施例1霍山石斛及其混伪品(包含枫斗制品)的荧光定量扩增曲线图;
图3为本发明实施例2得到的预扩增胶图;
图4为本发明实施例2霍山石斛及其混伪品(包含枫斗制品)的荧光定量扩增曲线图;
图5为基于ITS序列对霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛、粉花石斛及齿瓣石斛的聚类鉴别分析结果图;
图6为基于实施例1的方法对霍山石斛及细茎石斛、铁皮石斛、粉花石斛及齿瓣石斛的荧光定量扩增曲线图;
图7为基于实施例2的方法对霍山石斛及细茎石斛、铁皮石斛、粉花石斛及齿瓣石斛的荧光定量扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)选取霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛以及其它17种枫斗类石斛样品(如表1所示),通过液氮充分研磨待检样品,分别提取总DNA。提取方法为开发的改良CTAB法提取法,改良CTAB法相比于传统CTAB法,增加了3倍的CTAB及PVP40用量;
(2)以上述各石斛样品DNA为模板,利用Seq ID NO.1和2进行预扩增,获得预扩增DNA,预扩增可提高待鉴定的模板DNA浓度;
预扩增反应在PCR仪:Veriti 96Well Thermal Cycler(Applied Biosystems)上进行;
PCR反应体系特征为:总体积20μL,其中包含了:10×PCR Buffer 2μL、dNTP(10mmol·L-1)1.4μL,Mg2+(25mmol·L-1)1.4μL,预扩增上游引物和下游引物(2μmol·L-1)各2μL,模板DNA 3μL10ng/μL DNA,Taq DNA聚合酶(5U·μL-1,TaKaRa)0.2μL,余量为ddH2O;
扩增程序条件为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃(Seq ID NO.1和2)退火30s,72℃延伸5min,共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
预扩增产物DNA经1%琼脂糖凝胶,1×TBE缓冲液,180V稳压电源,电泳20min,通过凝胶成像系统Gel Image System(Tanon 3500)扫描成像,预扩增胶图如图1所示,图中1-20分别代表预扩增后的各材料的DNA条带图,其物种顺序与表1一致。
(3)Real-time ARMS-qPCR扩增:以预扩增DNA为模板,利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增,
反应在96(Roche)荧光定量PCR仪的96孔反应板上进行;
Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系特征为:总体积20μL,其中包含了:3μL 10ng/μL DNA(预扩增DNA),4μLARMS特异性引物(上下游引物各2μL,浓度为2μM),10μL SYBRGreen Mix TaqⅡ(Takara),余量为ddH2O。
反应程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,53℃(Seq ID NO.5和6)退火30s,72℃延伸5min;共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。观察每对引物扩增得到的霍山石斛与其混伪品的荧光扩增曲线及相应Ct值,并比较Ct值;并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
扩增片段大小大约为270bp,扩增曲线如图2所示,霍山石斛最先得到扩增,其他石斛扩增效率极低或未得到扩增。Ct值如表2,霍山石斛的平均Ct值为17.58±0.03,比其混伪品的Ct值低。且霍山石斛的Ct值与其他混淆种的Ct值经SPSS统计分析比较得出P值小于0.001,即说明霍山石斛可用该方法与其他枫斗类石斛显著区分(P<0.001)。
表1本实验采用的20种石斛名称及采样情况
Note:—represents no specific“Fengdou”name
表2荧光定量PCR扩增Ct值结果(以Seq ID NO.5和6为引物)
霍山石斛的枫斗制品检测方法与实施例1相同,结果类似。
实施例2
(1)选取霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛以及其它17种石斛样品(同实施例1),通过液氮充分研磨待检样品,使用改良的CTAB法提取法分别提取总DNA;
(2)以上述各石斛样品DNA为模板,利用Seq ID NO.3和4进行预扩增,获得预扩增DNA,预扩增可提高待鉴定的模板DNA浓度;
预扩增反应在PCR仪:Veriti 96 Well Thermal Cycler(Applied Biosystems)上进行;
PCR反应体系特征为:总体积20μL,其中包含了:10×PCR Buffer 2μL、dNTP(10mmol·L-1)1.4μL,Mg2+(25mmol·L-1)1.4μL,预扩增上游引物和下游引物(2μmol·L-1)各2μL,模板DNA 3μL10ng/μL DNA,Taq DNA聚合酶(5U·μL-1,TaKaRa)0.2μL,余量为ddH2O;
扩增程序条件为:94℃预变性4min;94℃变性30s,47℃(Seq ID NO.3和4)退火30s,72℃延伸5min,共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
预扩增产物DNA经1%琼脂糖凝胶,1×TBE缓冲液,180V稳压电源,电泳20min,通过凝胶成像系统Gel Image System(Tanon 3500)扫描成像,预扩增胶图如图3所示,图中1-20分别代表预扩增后的各材料的DNA条带图,其物种顺序与表1一致。
(3)Real-time ARMS-qPCR扩增:以预扩增DNA为模板,利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增,
反应在96(Roche)荧光定量PCR仪的96孔反应板上进行;
Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系特征为:总体积20μL,其中包含了:3μL 10ng/μL DNA(预扩增DNA),4μLARMS特异性引物(上下游引物各2μL,浓度为2μM),10μL SYBRGreen Mix TaqⅡ(Takara),余量为ddH2O。
反应程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃(Seq ID NO.7和8)退火30s,72℃延伸5min;共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。观察每对引物扩增得到的霍山石斛与其混伪品的荧光扩增曲线及相应Ct值,并比较Ct值;并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
扩增片段大小大约为160bp,扩增曲线如图4所示,霍山石斛最先得到扩增,其他石斛扩增效率极低或未得到扩增。Ct值如表3,霍山石斛的平均Ct值23.42±0.46,比其混伪品的平均Ct值低。且霍山石斛的Ct值与其他混淆种的Ct值经SPSS统计分析比较得出P值小于0.001,即说明霍山石斛可用该方法与其他石斛显著区分(P<0.001)。
表3荧光定量PCR扩增Ct值结果(以Seq ID NO.7和8为引物)
霍山石斛的枫斗制品检测方法与实施例1相同,结果类似。
对比例1
(1)随机选取霍山石斛、细茎石斛、齿瓣石斛、铁皮石斛以及美花石斛这5种枫斗类石斛各6份材料。通过液氮充分研磨待检样品,使用改良的CTAB法提取法分别提取总DNA;
(2)以上述各石斛样品DNA为模板,利用ITS序列通用引物进行扩增及测序;
扩增反应在PCR仪:Veriti 96Well Thermal Cycler(Applied Biosystems)上进行;
PCR反应体系特征为:总体积10μL,其中包含了:10×PCR Buffer 1μL、dNTP(10mmol·L-1)0.7μL,Mg2+(25mmol·L-1)0.7μL,ITS通用引物上游引物和下游引物(2μmol·L-1)各1μL,模板DNA 5.5μL 10ng/μL DNA,Taq DNA聚合酶(5U·μL-1,TaKaRa)0.1μL;
扩增程序条件为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃(ITS通用引物)退火30s,72℃延伸3min,共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
扩增产物送交华大基因公司测序进行测序;
(3)对测序后获得的DNA序列进行Maximum likelihood系统进化树的构建分析;
序列比对使用软件Mega 5.2,Maximum likelihood系统进化树的构建分析使用软件RAxML 8.0.2进行。
通过ITS序列构建的系统进化树结果如图5所示,由图5可见,霍山石斛和细茎石斛并不能很好的区分开,因此表明利用传统的鉴别方法,并不能将霍山石斛与细茎石斛完全区分。而利用本发明实施例1,2提供的方法可以更加准确、稳定的对霍山石斛进行鉴别(如图6,图7中霍山石斛均能与细茎石斛及其它石斛明显区分),同时相较于对比例ITS序列的测序所花费的时间,本发明实施例1和2的重复性较好,可以更加快速、灵敏的对霍山石斛进行鉴别。因此,综上,本发明是一种准确、灵敏、快速、稳定、可重复的霍山石斛及其鉴定方法的试验。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛的引物组及其鉴定方法
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gggcaatcct gagccaaatc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agagggactt gaaccctcac ga 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccacaggatc agaagtagtg g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcctagatgt gaaaagaggc 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgttctaacg aatgaaattg cctg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agatagattc ttaatctaat gctg 24
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cataataaat atgtcgaaat tctttggtt 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
actcattcac tgagtaaagg attgaagta 29
Claims (7)
1.一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组,其特征在于,包括两对预扩增引物和两对ARMS特异性引物,所述两对预扩增引物:第一对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.1和2所示,第二对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.3和4所示;所述两对ARMS特异性引物:第一对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.5和6所示,第二对引物,其上下游引物序列如Seq ID NO.7和8所示。
2.一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛的鉴定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)待检样品DNA的提取:液氮充分研磨待检样品,提取总DNA;
(2)预扩增:以上述DNA为模板,利用预扩增引物进行PCR扩增,获得预扩增DNA;
(3)Real-time ARMS-qPCR扩增:以预扩增DNA为模板,利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增,得到荧光扩增曲线及相应Ct值,并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
3.根据权利要2所述的鉴定方法,其特征在于,步骤(2)所述的PCR扩增反应体系为:总体积20μL,包括:10×PCR Buffer 2μL、dNTP 1.4μL,Mg2+1.4μL,预扩增上游引物和下游引物各2μL,模板DNA 3μL DNA,Taq DNA聚合酶0.2μL,余量为ddH2O。
4.根据权利要2所述的鉴定方法,其特征在于,步骤(2)所述的PCR扩增反应条件为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃或47℃退火30s,72℃延伸5min,共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
5.根据权利要求2所述的鉴定方法,其特征在于,步骤(3)所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为:总体积20μL,包括:预扩增DNA 3μL,ARMS特异性上游引物和下游引物各2μL,SYBR Green Mix TaqⅡ10μL,余量为ddH2O。
6.根据权利要2所述的鉴定方法,其特征在于,步骤(3)所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为:94℃预变性4min;94℃变性30s,53℃或55℃退火30s,72℃延伸5min,共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
7.根据权利要2所述的鉴定方法,其特征在于,所述霍山石斛还包括霍山石斛的枫斗制品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710755444.XA CN107400718B (zh) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | 基于Real-timeARMS-qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710755444.XA CN107400718B (zh) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | 基于Real-timeARMS-qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107400718A true CN107400718A (zh) | 2017-11-28 |
CN107400718B CN107400718B (zh) | 2020-04-03 |
Family
ID=60396753
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710755444.XA Active CN107400718B (zh) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | 基于Real-timeARMS-qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107400718B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108728573A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-02 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种鉴别铁皮石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 |
CN108998554A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-14 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106119408A (zh) * | 2016-09-23 | 2016-11-16 | 皖西学院 | 一种霍山石斛的鉴定方法 |
CN106148560A (zh) * | 2016-09-23 | 2016-11-23 | 皖西学院 | 一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法 |
CN106282373A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-01-04 | 皖西学院 | 一种霍山石斛与河南石斛的对比鉴定方法 |
CN106282372A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-01-04 | 皖西学院 | 霍山石斛与美花石斛的比对鉴定方法 |
CN106521003A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-03-22 | 三明市农业科学研究院 | 一种鉴别铁皮石斛的方法及其使用的pcr引物 |
-
2017
- 2017-08-29 CN CN201710755444.XA patent/CN107400718B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106119408A (zh) * | 2016-09-23 | 2016-11-16 | 皖西学院 | 一种霍山石斛的鉴定方法 |
CN106148560A (zh) * | 2016-09-23 | 2016-11-23 | 皖西学院 | 一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法 |
CN106282373A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-01-04 | 皖西学院 | 一种霍山石斛与河南石斛的对比鉴定方法 |
CN106282372A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-01-04 | 皖西学院 | 霍山石斛与美花石斛的比对鉴定方法 |
CN106521003A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-03-22 | 三明市农业科学研究院 | 一种鉴别铁皮石斛的方法及其使用的pcr引物 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
徐慧君: "基于Real-time PCR及ARMS技术鉴定铁皮石斛药材的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108728573A (zh) * | 2018-06-13 | 2018-11-02 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种鉴别铁皮石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 |
CN108728573B (zh) * | 2018-06-13 | 2022-02-01 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种鉴别铁皮石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 |
CN108998554A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-14 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 |
CN108998554B (zh) * | 2018-08-14 | 2022-02-25 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107400718B (zh) | 2020-04-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7131086B2 (ja) | 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法 | |
CN108728573B (zh) | 一种鉴别铁皮石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 | |
CN107586867A (zh) | 薄壳山核桃品种Pawnee的特征序列、标记引物及鉴定方法 | |
CN107557434A (zh) | 薄壳山核桃品种Van Deman的特征序列、标记引物及鉴定方法 | |
CN107400718A (zh) | 基于Real‑timeARMS‑qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 | |
CN110734921A (zh) | 一种茶树炭疽病菌Colletotrichum siamense的检测方法 | |
CN107586866A (zh) | 薄壳山核桃品种Moore的特征序列、标记引物及鉴定方法 | |
CN109666758B (zh) | 基于InDel标记的道地川芎鉴定用引物及鉴定方法 | |
US20070015192A1 (en) | Method of herbal authentication based on 5S rRNA spacer sequences | |
CN104120170B (zh) | 马铃薯早疫病菌检测试剂盒及检测方法 | |
CN104017892A (zh) | 一种鉴别半夏品种资源的方法 | |
CN107619879A (zh) | 一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对及其应用 | |
CN104498593A (zh) | 鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒 | |
KR101346261B1 (ko) | 실시간 pcr 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 | |
CN108998554B (zh) | 鉴别药典中3种药用石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 | |
KR100673070B1 (ko) | 실시간 pcr법을 이용한 인삼의 종간 유전자 감별 방법 | |
CN108330164B (zh) | 薄壳山核桃品种Moore的特征序列、引物及鉴定方法 | |
Guo et al. | DNA isolation, optimization of ISSR-PCR system and primers screening of Scutellaria baicalensis | |
CN100547082C (zh) | 鉴别黄独性别的引物、片段与方法 | |
CN111206112A (zh) | 快速检测杭白菊中三种真菌的引物组、试剂盒及方法 | |
CN111041117A (zh) | 五加科中药制品鉴别试剂盒和方法 | |
CN104120168B (zh) | 接骨木镰刀菌检测试剂盒及检测方法 | |
CN115109865B (zh) | 一种丹参花药的内参基因及其用途 | |
CN116516050A (zh) | 实时荧光pcr鉴定印度紫檀的方法、引物及试剂盒 | |
CN108998559A (zh) | 鉴定齿瓣延胡索的snp标记、等位基因特异性pcr法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |