KR20240055233A - 모래주사 종 식별용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법 - Google Patents

모래주사 종 식별용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCR 프라이머인 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 모래주사에 특이적인 표적 서열을 증폭함으로써 다른 담수어류와 모래주사를 식별하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 포함하는 조성물을 사용하여, 실시간 PCR을 통해 어류 또는 환경수로부터 모래주사를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 식별할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

모래주사 종 식별용 PCR 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법{PCR primer set and probe for species identification of Microphysogobio koreensis and real-time PCR method using the same}
본 발명은 PCR 프라이머인 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 모래주사에 특이적인 표적 서열을 증폭함으로써 다른 담수어류와 모래주사를 식별하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 포함하는 조성물을 사용하여, 실시간 PCR을 통해 어류 또는 환경수로부터 모래주사를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 식별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
모래주사(Microphysogobio koreensis)는 한국 고유종으로 낙동강과 섬진강 수계에 분포한다. 1998년 멸종위기 야생동·식물 및 보호야생동·식물로 지정되어 처음 보호받기 시작했으며, 이후 멸종위기 야생생물 Ⅱ급을 거쳐 2017년 멸종위기 야생생물 Ⅰ급으로 격상되어 환경부로부터 보호를 받고 있다.
최근 물속의 환경 DNA (environmental DNA ; eDNA)를 분석해 어떤 종이 서식하고 있는지를 예측할 수 있는 기술이 개발되어 많은 연구자들이 이용하고 있다.
환경 DNA는 살아있는 생물에서 추출하는 DNA가 아닌 서식하는 주변환경에서 수집된 유기물로서, 어류의 경우 대표적으로 점액, 분비물, 비늘 등으로부터 유전체를 확보하여 염기서열 분석을 통해 식별하는 방법을 의미한다. 예를 들어 환경수 만을 샘플링하여 발견한 DNA 조각으로부터 특정유전자를 증폭하여 분석함으로써 하천 내 어떤 생물이 살고 있는지 알아낼 수 있는 방법이다. 따라서 직접 채집하지 않고도 목적하는 생물의 서식여부를 알아 낼 수 있어 채집자의 기술에 의존하지 않으며, 노동집약적인 방식에 비해 비용이나 신뢰성면에서 희귀종의 번식지나 서식지를 확인하는데 매우 효과적인 방식이다.
본 발명은 어류 또는 환경수에서 모래주사 식별의 특이도와 민감도를 향상시키고자 모래주사 식별용 특이 프라이머 세트와 프로브를 개발하고, 이를 이용해 실시간 PCR 방법(real-time PCR, qPCR 등)을 확립하였다.
한국등록특허 제10-2018798호 한국등록특허 제10-1955124호
본 발명은 상기 기술의 문제점을 해결하기 위해 도출한 것으로, 어류 또는 환경수로부터 모래주사를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 식별할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 포함하는 조성물을 사용함으로써, 실시간 PCR을 통해 어류 또는 환경수로부터 모래주사를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 식별할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 모래주사 식별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 모래주사 식별용 프로브를 제공한다.
아울러 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 상기 프로브를 포함하는 모래주사 식별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 DNA; 및 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물의 CT(threshold cycle) 값을 확인하는 단계를 포함하는 모래주사를 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭된 산물의 CT 값을 확인하는 단계는 최대 사이클 수 이하에서 CT가 나타날 때 모래주사로 판정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 어류 또는 환경수로부터 모래주사를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 식별할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 포함하는 조성물을 사용함으로써, 실시간 PCR(real-time PCR, qPCR 등)을 통해 어류 또는 환경수로부터 모래주사를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 식별할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
아울러 본 발명은 특이 프라이머 세트와 프로브를 이용함으로써, 염기서열 결정이나 전기영동을 해야 하는 번거로움과 과정을 줄일 수 있고, 오염가능성이 줄어들며, 정량분석이 가능한 모래주사의 식별방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 남강, 영강, 섬진강의 3가지 모래주사 게놈 DNA시료를 대상으로 qPCR 프라이머 조합들을 이용해 qPCR 증폭반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 담수어류 및 모래무지아과 어류 44개 표본을 대상으로 모래주사 종특이적 실시간 PCR 증폭반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 남강, 섬진강의 2가지 모래주사 게놈 DNA시료를 대상으로 총 3가지 온도 단계로 Taqman 탐침자를 이용해 실시간 PCR 증폭반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 모래주사 종특이적 실시간 PCR 마커의 모래주사 COB 영역 플라스미드의 농도(1×102~1×109 copies/rxn)에 따른 qPCR 증폭반응의 Ct값을 나타내는 증폭반응의 검량선(r 2=1)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 모래주사 종특이적 실시간 PCR 마커의 모래주사 COB 영역 플라스미드의 농도(1×100~1×109 copies/rxn)에 따른 qPCR 증폭반응의 Ct값을 나타내는 증폭곡선을 나타낸다.
이하 실시예 및 도면을 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용된 용어, 실시예, 도면 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 통상의 기술자의 이해를 돕기 위하여 예시된 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 권리범위 등이 이에 한정되어 해석되어서는 안 된다.
본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 모래주사 식별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 모래주사 식별용 프로브에 관한 것이다.
아울러 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 상기 프로브를 포함하는 모래주사 식별용 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 DNA; 및 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물의 CT(threshold cycle) 값을 확인하는 단계를 포함하는 모래주사를 식별하는 방법에 관한 것이다.
또한 상기 증폭된 산물의 CT 값을 확인하는 단계는 최대 사이클 수 이하에서 CT가 나타날 때 모래주사로 판정하는 것을 특징으로 한다.
(실시예 1) 담수어류 유전시료 확보
담수어류 20개의 표본시료 및 모래주사를 포함한 모래무지아과류 24개의 시료를 확보하였다.
DNA 추출용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0; 125 mM NaCl; 10 mM EDTA pH 8.0; 1% SDS; 8 M Urea) (Asahida et al. 1996) 600 μl와 Proteinase K 용액(20 mg/ml) 6 μl를 넣고 문헌과 동일한 과정으로 유전시료를 확보하였다(표 1 및 표 2).
No. Specimen no. Species name Common name Remark
1 AGTC-FF-0144 농어목 검정우럭과 블루길
2 AGTC-FF-0096 농어목 꺽지과 꺽지
3 AGTC-FF-0172 농어목 동사리과 동사리
4 AGTC-FF-0078 농어목 돛양태과 강주걱양태
5 AGTC-FF-0017 동갈치목 송사리과 송사리
6 AGTC-FF-0060 드렁허리목 드렁허리과 드렁허리
7 AGTC-FF-0103 메기목 동자개과 동자개
8 AGTC-FF-0011 메기목 메기과 메기
9 AGTC-FF-0237 메기목 퉁가리과 퉁가리
10 AGTC-FF-0061 바다빙어목 바다빙어과 은어
11 AGTC-FF-0089 연어목 연어과 무지개송어
12 AGTC-FF-0119 잉어목 모래무지아과 미꾸리
13 AGTC-FF-0246 잉어목 잉어과 백조어
14 AGTC-FF-0133 잉어목 잉어과 강준치아과 강준치
15 AGTC-FF-0126 잉어목 잉어과 납자루아과 납자루
16 AGTC-FF-0002 잉어목 잉어과 잉어아과 잉어
17 AGTC-FF-0005 잉어목 잉어과 피라미아과 피라미
18 AGTC-FF-0006 잉어목 잉어과 황어아과 버들치
19 AGTC-FF-0112 잉어목 종개과 대륙종개
20 AGTC-FF-0066 큰가시고기목 큰가시고기과 큰가시고기
No. Specimen no. Species name Common name Remark
1 AGTC-FF-0130 Pseudorasbora parva 참붕어
2 AGTC-FF-0109 Pungtungia herzi 돌고기
3 AGTC-FF-0107 Pseudopungtungia nigra 감돌고기
4 AGTC-FF-0110 Coreoleuciscus splendidus 쉬리
5 AGTC-FF-0139 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리
6 AGTC-FF-0116 Ladislabia taczanowskii 새미
7 AGTC-FF-0111 Sarcocheilichthys variegatus wakiyae 참중고기
8 AGTC-FF-0138 Sarcocheilichthys nigripinnis morii 중고기
9 AGTC-FF-0079 Squalidus japonicus coreanus 몰개
10 AGTC-FF-0140 Squalidus chanakaensis tsuchigae 참몰개
11 AGTC-FF-0146 Squalidus multimaculatus 점몰개
12 AGTC-FF-0095 Hemibarbus labeo 누치
13 AGTC-FF-0129 Hemibarbus longirostris 참마자
14 AGTC-FF-0084 Hemibarbus mylodon 어름치
15 AGTC-FF-0106 Pseudogobio esocinus 모래무지
16 AGTC-FF-0082 Gobiobotia macrocephala 꾸구리
17 AGTC-FF-0036 Gobiobotia brevibarba 돌상어
18 AGTC-FF-0022 Gobiobotia nakdongensis 흰수마자
19 AGTC-FF-0080 Microphysogobio yaluensis 돌마자
20 AGTC-FF-0040 Microphysogobio rapidus 여울마자
21 AGTC-FF-0120 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早?
22 AGTC-FF-0122 Microphysogobio longidorsalis 배가사리
23 AGTC-FF-0086 Saurogobio dabryi 두우쟁이
24 Mko positive Microphysogobio koreensis 모래주사
(실시예 2) PCR 증폭과 프라이머 설계
설계된 PCR 프라이머 조합들을 이용하여 어류 44개체의 미토콘드리아 COB 유전자 영역을 PCR 증폭하였다.
PCR 증폭산물의 DNA 서열정보를 해독하여 미토콘드리아 COB 영역 DNA 염기서열정보 매트릭스를 작성하였다.
COB 염기서열 매트릭스를 비교 분석하여 모래주사에서만 증폭이 가능한 모래주사 식별용 프라이머(서열번호 1 내지 8) 및 프로브(서열번호 9)를 아래와 같이 제작하였다(표 3).
이때 Sequence Manipulation Suite: PCR Primer Stats (http://www.bioinfor-matics.org/sms2)를 이용하여 PCR 프라이머 조합들과 형광탐침자들의 길이, GC 함량, T m 값, 2차구조 등을 계산하고 예측하여 최적의 조합을 설계하였다.
구체적으로는 PCR 프라이머는 20~27 mer, GC 함량 30~55% 로, T m 값은 60~63℃ 이 되도록 설계하였다.
또한 형광탐침자는 22~27 mer, GC 함량 37~55% 가 되도록 설계하였고, T m 값은 프라이머 조합들의 T m 값보다 2~5℃ 정도 높도록 설계하였다.
서열
번호		 이름 염기서열(5'→3') 비고
1 Mko-COB-0429f CACAGTAATTACAAATCTCCTTTCC 25 mer, GC=36.0%, Tm=60.9℃ (both)
2 Mko-COB-0633r ATTTTATCCGCATCGGAATTC 21 mer, GC=38.1%, Tm=59.6℃, self-annealing
(SJ)
3 Mko-COB-0723r GGAGAATAGCGCCAGC 16 mer, GC=62.5%, Tm=59.1℃ (ND)
4 Mko-COB-0726r2 TTRGGGGAGAATAGCGCC 18 mer, GC=55-61%, Tm=63-64℃, self-annealing
(both)
5 Mko-COB-0741r GGTCTCCCAGCAGGTTA 17 mer, GC=58.8%, Tm=60.3℃ (ND)
6 Mko-COB-0873r TTAGAATAGAGAATAATAAGGCAAGG 26 mer, GC=30.8%, Tm=59.2℃ (SJ)
7 Mko-COB-0810r TAGGCAAATAGGAAATATCATTCC 24 mer, GC=33.3%, Tm=59.2℃, self & hairpin (ND)
8 Mko-COB-0945r GGTGATTGGGCGAAATGTA 19 mer, GC=47.4%, Tm=60.7℃
(both, 1 MM)
9 Mko-COB-0496p CATTGTCTACGGAAAAGCCTCC 택맨(TaqMan) 프로브
22 mer, GC=50.0%, Tm=64.1℃ (both)
상기 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다.
상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NED, JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), MGB Eclipse, BHQ1, BHQ2, BHQ3, NFQ 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어 상기 프로브(Mko-COB-0496p)는 HEX-CATTGTCTACGGAAAAGCCTCC-MGBEclipse, FAM-CATTGTCTACGGAAAAGCCTCC-BHQ1 등으로 정의될 수 있다.
상기 프로브는 택맨(TaqMan) 프로브로서, 5' 말단은 리포터인 형광표지 인자(FAM, HEX 등)로, 3' 말단은 억제자(quencher) 물질(MGB Eclipse, BHQ1 등)로 이루어져, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드와 함께 이용하는 것이 바람직하다.
상기 프로브는 PCR 과정 중 어닐링(annealing) 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하며, 연장(extension) 단계에서 중합효소의 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 프로브만 분해되어 형광표지 인자가 프로브에서 유리되어 억제자에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
(실시예 3) 실시간 PCR 검증
실시간 PCR 증폭반응을 수행하기 위해 GoTaq ® Probe qPCR MasterMix (Promega, 미국)를 이용하여 아래와 같이 PCR 반응액을 조제하였다(표 4). 이때 주형DNA (Template DNA)는 게놈DNA (20 ng/㎕)를 사용하였다.
Reagent Cocktail (×20)
GoTaq® Probe qPCR MasterMix 10 ㎕ 200 ㎕
CXR (20x) 1 ㎕ 20 ㎕
Genomic DNA (20 ng/㎕) 1 ㎕ 20 ㎕
Forward primer (5 pmol) 1 ㎕ 20 ㎕
Reverse primer (5 pmol) 1 ㎕ 20 ㎕
Probe 1 (5 pmol) 0.5 ㎕ 10 ㎕
Nuclease-free water 4.5 ㎕ 90 ㎕
Total 20 ㎕ 400 ㎕
실시간 PCR 증폭반응은 QuantStudio5 (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 아래와 같은 조건으로 PCR 증폭반응을 수행하였다(표 5).
Temperature Time No. cycles
Initial denaturation 95℃ 2 min 1
Denaturation 95℃ 15 sec 50
Annealing/elongation 60℃ 1 min
상기 표 3에서 설계된 프라이머들을 이용하여 총 7개의 프라이머 조합을 만들었으며(표 6), 이들을 남강, 영강, 섬진강의 3가지 모래주사 게놈 DNA를 대상으로 실시간 PCR(이하 ‘qPCR’) 증폭반응을 수행하였다.
No. Primer set qPCR
(증폭
반응) 		Probe qPCR (Ct 값)
남강 영강 섬진강
1 Mko-COB-0429f/Mko-COB-0633r O Mko-COB-0496p 35 37 17
2 Mko-COB-0429f/Mko-COB-0723r O Mko-COB-0496p 17 19 26
3 Mko-COB-0429f/Mko-COB-0726r2 O Mko-COB-0496p 17 19 17
4 Mko-COB-0429f/Mko-COB-0741r O Mko-COB-0496p 17 19 33
5 Mko-COB-0429f/Mko-COB-0873r O Mko-COB-0496p 17 19 20
6 Mko-COB-0429f/Mko-COB-0810r O Mko-COB-0496p 33 36 18
7 Mko-COB-0429f/Mko-COB-0945r O Mko-COB-0496p 17 20 18
형광탐침자를 이용해 qPCR 증폭반응을 수행한 결과, 7개의 프라이머 조합 모두 실시간 PCR 증폭반응을 보였으나, 3가지 모래주사 게놈 DNA에 대해 각각 다른 Ct 값을 나타내었다(도 1).
이들 프라이머 조합 중 3가지 모래주사 게놈 DNA 모두에서 Ct 값이 비슷하게 나타나는 프라이머 조합은 총 3개이며(No 3, No 5, No 7), 이들 3개의 조합은 모래주사 종특이적 PCR용 프라이머 조합으로 적합한 것으로 판단되었으나, 담수어류 미토콘드리아 COB 영역 DNA 염기서열정보 매트릭스를 통해 모래주사에 가장 적합할 것으로 예상되는 프라이머 조합은 Mko-COB-0429f(서열번호 1), Mko-COB-0945r(서열번호 8) 및 형광탐침자 Mko-COB-0496p(서열번호 9)로 판단되었다.
또한 상기 설계된 프라이머 세트를 사용하여 담수어류 20종의 표본시료, 모래주사를 포함한 모래무지아과 24종의 표본시료를 포함한 총 44종의 게놈 DNA(20ng/rxn)들의 실시간 PCR 증폭반응 여부를 확인하여, 실시간 PCR 마커의 특이성(specificity)을 검증한 결과는 아래와 같다(표 7 및 도 2)
No. Specimen no. Species name Common name Amp.* 분류군
1 AGTC-FF-0144 Lepomis macrochirus 블루길 UD** 농어목 검정우럭과
2 AGTC-FF-0096 Coreoperca herzi 꺽지 UD 농어목 꺽지과
3 AGTC-FF-0172 Odontobutis platycephala 동사리 UD 농어목 동사리과
4 AGTC-FF-0078 Repomucenus olidus 강주걱
양태		 UD 농어목 돛양태과
5 AGTC-FF-0017 Oryzias latipes 송사리 UD 동갈치목 송사리과
6 AGTC-FF-0060 Monopterus albus 드렁허리 UD 드렁허리목
드렁허리과
7 AGTC-FF-0103 Tachysurus fulvidraco 동자개 UD 메기목 동자개과
8 AGTC-FF-0011 Silurus asotus 메기 UD 메기목 메기과
9 AGTC-FF-0237 Liobagrus obesus 퉁가리 UD 메기목 퉁가리과
10 AGTC-FF-0061 Plecoglossus altivelis 은어 UD 바다빙어목
바다빙어과
11 AGTC-FF-0089 Onchorhynchus mykiss 무지개
송어		 UD 연어목 연어과
12 AGTC-FF-0119 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 UD 잉어목 미꾸리과
13 AGTC-FF-0246 Culter brevicauda 백조어 UD 잉어목 잉어과
14 AGTC-FF-0133 Erythroculter erythropterus 강준치 UD 잉어목 잉어과
강준치아과
15 AGTC-FF-0126 Pseudogobio esocinus 납자루 UD 잉어목 잉어과
납자루아과
16 AGTC-FF-0002 Cyprinus carpio 잉어 UD 잉어목 잉어과
잉어아과
17 AGTC-FF-0005 Zacco platypus 피라미 UD 잉어목 잉어과
피라미아과
18 AGTC-FF-0006 Rhynchocypris oxycephalus 버들치 UD 잉어목 잉어과
황어아과
19 AGTC-FF-0112 Orthrias nudus 대륙종개 UD 잉어목 종개과
20 AGTC-FF-0066 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시
고기		 UD 큰가시고기목
큰가시고기과
21 AGTC-FF-0130 Pseudorasbora parva 참붕어 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
22 AGTC-FF-0109 Pungtungia herzi 돌고기 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
23 AGTC-FF-0107 Pseudopungtungia nigra 감돌고기 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
24 AGTC-FF-0110 Coreoleuciscus splendidus 쉬리 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
25 AGTC-FF-0139 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
26 AGTC-FF-0116 Ladislabia taczanowskii 새미 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
27 AGTC-FF-0111 Sarcocheilichthys variegatus wakiyae 참중고기 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
28 AGTC-FF-0138 Sarcocheilichthys nigripinnis morii 중고기 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
29 AGTC-FF-0079 Squalidus japonicus coreanus 몰개 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
30 AGTC-FF-0140 Squalidus chanakaensis tsuchigae 참몰개 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
31 AGTC-FF-0146 Squalidus multimaculatus 점몰개 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
32 AGTC-FF-0095 Hemibarbus labeo 누치 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
33 AGTC-FF-0129 Hemibarbus longirostris 참마자 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
34 AGTC-FF-0084 Hemibarbus mylodon 어름치 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
35 AGTC-FF-0106 Pseudogobio esocinus 모래무지 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
36 AGTC-FF-0082 Gobiobotia macrocephala 꾸구리 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
37 AGTC-FF-0036 Gobiobotia brevibarba 돌상어 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
38 AGTC-FF-0022 Gobiobotia nakdongensis 흰수마자 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
39 AGTC-FF-0080 Microphysogobio yaluensis 돌마자 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
40 AGTC-FF-0040 Microphysogobio rapidus 여울마자 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
41 AGTC-FF-0120 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
42 AGTC-FF-0122 Microphysogobio longidorsalis 배가사리 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
43 AGTC-FF-0086 Saurogobio dabryi 두우쟁이 UD 잉어목 잉어과
모래무지아과
44 Mko positive Microphysogobio koreensis 모래주사 Amp* 잉어목 잉어과
모래무지아과
모래주사를 제외한 담수어류 및 모래무지아과 43개 표본의 게놈 DNA의 실시간 PCR 증폭반응이 나타나지 않으므로, 본 발명의 프라이머 세트는 모래주사 종특이적 실시간 PCR 마커로 사용 가능한 것으로 확인되었다.
또한 Mko-COB-0429f/Mko-COB -0945r와 탐침자 Mko-COB-0496p를 사용하여, 남강, 섬진강의 2가지 모래주사 게놈 DNA시료로 결합 온도별 실시간 PCR 증폭반응을 수행한 결과, 실시간 PCR 증폭반응을 위한 최적의 결합 온도는 60~64℃로 확인되었다(도 3).
모래주사 종특이적 실시간 PCR 검량선을 작성하기 위해 1×109 copies/㎕ 농도의 모래주사 COB 영역 플라스미드를 10배씩 10번 희석하여 1×100~1×109 copies/㎕ 농도의 플라스미드를 이용해 검량선을 작성하였다(도 4).
검량선의 신뢰도를 판단하는 R2값은 0.999로 나타나 모래주사 특이적 qPCR 분자마커로 충분히 사용 가능한 것으로 판단되었고, 1×102 copies/㎕ 농도 아래에서 증폭반응이 불규칙하게 나타나서 최대 정량한계는 1×102 copies/㎕로 나타났으며, 1×102~1×109 copies/rxn의 시료를 이용해 검량선을 작성하였다.
또한 모래주사 종특이적 실시간 PCR 증폭반응의 검출한계를 확인하기 위해 1×109 copies/㎕ 농도의 모래주사 COB 영역 플라스미드를 10배씩 10번 희석하여 1×100~1×109 copies/㎕ 농도의 플라스미드를 이용해 검출한계를 확인하였다(도 5).
1×102 copies/㎕ 농도까지는 증폭반응이 규칙적으로 나타나서 정량 한계농도로 볼 수 있었으며, 1×101 copies/㎕ 농도에서 불규칙한 증폭반응이 나타났다. 또한, 1×100 copies/㎕ 농도에서 증폭반응이 나타나지 않은 것으로 보아 검출한계는 1×101 copies/㎕로 판단되었다.

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 모래주사 식별용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 모래주사 식별용 프로브.
  3. 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 제2항의 프로브를 포함하는 모래주사 식별용 조성물.
  4. 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 DNA; 및 제1항의 프라이머 세트 또는 제3항의 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
    상기 증폭된 산물의 CT(threshold cycle) 값을 확인하는 단계를 포함하는 모래주사를 식별하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 증폭된 산물의 CT 값을 확인하는 단계는 최대 사이클 수 이하에서 CT가 나타날 때 모래주사로 판정하는 것을 특징으로 하는 모래주사를 식별하는 방법.
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KR101955124B1 (ko) 2017-12-14 2019-03-12 아쿠아진텍주식회사 해산어류의 dna 바코딩 영역인 미토콘드리아 co1 유전자의 pcr 증폭반응과 dna 염기서열 해독을 위한 신규 프라이머 조합과 이를 이용한 핵산서열해독방법
KR102018798B1 (ko) 2018-09-21 2019-09-05 부경대학교 산학협력단 어류 분류용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법

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