KR102471928B1 - 좀수수치 환경유전자 검출용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법 - Google Patents

좀수수치 환경유전자 검출용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCR 프라이머인 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 좀수수치에 특이적인 표적 서열을 증폭시킴으로써 다른 담수어류와 좀수수치를 식별하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5의 좀수수치에서 유래한 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 포함하는 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 통해 어류 또는 환경수로부터 좀수수치를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

좀수수치 환경유전자 검출용 PCR 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법{PCR primer set and probe for environmental DNA detection of Kichulchoia brevifasciata and real-time PCR method using the same}
본 발명은 PCR 프라이머인 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 좀수수치에 특이적인 표적 서열을 증폭함으로써 다른 담수어류와 좀수수치를 식별하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 좀수수치에서 유래한 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여, 실시간 PCR을 통해 어류 또는 환경수로부터 좀수수치를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
좀수수치(Kichulchoia brevifasciata)는 잉어목(Cypriniformes) 미꾸리과(Cobitidae) 좀수수치속에 속하는 어류로 우리나라에서는 전남 여수시 남면(금오도) 및 고흥군 금산면, 풍양면 등 일부지역에 극히 제한적으로 분포하고 있다.
일반적으로 좀수수치는 수수미꾸리(Kichulchoia multifasciata)와 형태적으로 매우 유사하지만, 분포지역이 다르고, 척추골수, 새파수 및 가로무늬의 차이 등으로 구분할 수 있다. 수심이 얕고 흐름이 빠른 자갈 바닥의 비교적 작은 하천에 서식하며, 주 먹이원은 수서곤충, 부착조류 등으로 알려져 있다.
최근 하천 정비공사, 골재채취 등으로 인하여 서식지가 감소하고 있으며, 그 결과 개체수가 급감하고 있다. 환경부에서는 2012년 멸종위기 야생생물 Ⅱ급으로 지정하였고, 2017년에는 멸종위기 야생생물 Ⅰ급으로 상향하여 법적 보호를 하고 있으며, 국가생물적색자료집(2020)에서는 위급(Critically Endangered, CR)종으로 분류되어 보호가 시급한 종이다. 좀수수치는 과거 고흥반도 및 여수시 일대 소하천에 두루 분포하였으나, 현재는 일부 구간에만 서식하는 것으로 조사되어 서식범위가 매우 협소해진 상황이다. 특히 최근에는 남아 있는 개체군의 크기도 축소되어 서식지를 알아내기에도 큰 어려움이 있다.
최근 물 속의 환경 DNA (environmental DNA ; eDNA)를 분석해 어떤 종이 서식하고 있는지를 예측할 수 있는 기술이 개발되어 많은 연구자들이 이용하고 있다. 환경 DNA는 살아있는 생물에서 추출하는 DNA가 아닌 서식하는 주변환경에서 수집된 유기물로서, 어류의 경우 대표적으로 점액, 분비물, 비늘 등으로부터 유전체를 확보하여 염기서열 분석을 통해 식별하는 방법을 의미한다. 예를 들어 환경수 만을 샘플링하여 발견한 DNA 조각으로부터 특정유전자를 증폭하여 분석함으로써 하천 내 어떤 생물이 살고 있는지 알아낼 수 있는 방법이다. 따라서 직접 채집하지 않고도 목적하는 생물의 서식여부를 알아 낼 수 있어 채집자의 기술에 의존하지 않으며, 노동집약적인 방식에 비해 비용이나 신뢰성면에서 희귀종의 번식지나 서식지를 확인하는데 매우 효과적인 방식이다. 다만, 개체군의 크기가 매우 적거나 생체량이 작은 희귀종의 경우에는 민감도가 높은 분석법을 이용해야 한다.
환경유전자를 분석하는 방법은 메타바코딩(metabarcoding), 메타지놈(metagenome), 종 특이 마커(species-specific PCR) 등이 있다. 대부분 매우 소량이 발생하는 환경유전자의 특성상 메타바코딩과 종 특이 마커 PCR이 주로 이용되고 있다. 메타바코딩은 환경수 내에 살고 있는 다양한 종을 알아내는데 주로 이용하고 있으나, 분석비용이 비싸고 시간이 오래 걸리는 단점을 가지고 있다. 반면 종 특이 마커 PCR은 개발하는데 시간과 비용이 들지만 한번 개발해 놓으면 민감도가 높고 불과 수 시간 안에 분석이 가능한 장점을 가지고 있다. 따라서 멸종위기종 개체군의 서식여부를 확인하고 검증하는데 있어서는 종 특이 마커 PCR이 유리한 측면이 많다. 이와 같은 방법을 이용할 시 좀수수치의 서식가능성이 있는 하천수를 대상으로 적용하면 좀수수치의 잠재적 서식지를 확인할 수 있으며, 높은 농도로 검출된다면 상대적 출현량을 도출할 수도 있다.
본 발명은 환경수에서 좀수수치 검출의 특이도와 민감도를 향상시키고자 좀수수치 검출용 특이 프라이머 세트와 프로브를 개발하고, 이를 이용해 실시간(real-time) PCR법을 확립하였다.
한국공개특허 제10-2012-0136201호
본 발명은 상기 기술의 문제점을 해결하기 위해 도출한 것으로, 어류 또는 환경수로부터 좀수수치의 유전자를 검출할 수 있는 특이성과 민감도가 우수한 특이 프라이머 세트와 프로브를 제공하는 것에 그 목적이 있다.
또한 염기서열 결정이나 전기영동을 해야 하는 번거로움과 과정을 줄일 수 있으며, 특이성이 높고, 정량분석이 가능한 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 좀수수치 특이 실시간 PCR 방법을 제공하는 것이다.
아울러 본 발명은 실시간 PCR을 통해 단 시간 내에 정확하게 좀수수치 시료를 검출하는 검출용 키트를 제공함으로써 식별 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 좀수수치 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 좀수수치 검출용 프로브를 제공한다.
아울러 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 및 상기 프로브를 포함하는 좀수수치 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 DNA; 및 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 좀수수치를 검출하는 방법을 제공한다.
아울러 본 발명은 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 DNA; 및 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물의 CT(threshold cycle) 값을 확인하는 단계를 포함하는 좀수수치를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 전기영동으로 확인하는 단계는 353~355 bp가 검출되면 좀수수치로 판정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭된 산물의 CT 값을 확인하는 단계는 최대 사이클 수 이하에서 CT가 나타날 때 좀수수치로 판정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하여 좀수수치를 검출할 수 있는 특이성과 민감도가 우수한 특이 프라이머 세트와 프로브를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 특이 프라이머 세트와 프로브를 이용함으로써, 염기서열 결정이나 전기영동을 해야 하는 번거로움과 과정을 줄일 수 있고, 오염가능성이 줄어들며, 정량분석이 가능한 좀수수치 특이 실시간 PCR 방법을 제공할 수 있다.
아울러 좀수수치의 서식가능성이 있는 하천수를 대상으로 적용하면 좀수수치의 잠재적 서식지를 확인할 수 있으며, 높은 농도로 검출된다면 상대적 출현량을 도출할 수도 있다.
도 1은 본 발명의 어류 조직시료 100개를 대상으로 미토콘드리아 cytochrome b (COB) 유전자의 PCR 증폭반응을 수행한 대표적 결과를 보여주는 전기영동사진을 나타낸다.
도 2는 담수어류 미토콘드리아 COB 유전자의 DNA 염기서열정보를 해독하고 그 정보를 비교하기 위해 적성된 매트릭스의 이미지를 나타낸다.
도 3은 좀수수치 게놈 DNA 농도별 실시간 PCR 증폭반응의 검량선(r 2=0.999)을 나타낸다.
도 4는 담수어류 44종을 대상으로 좀수수치 특이적 실시간 PCR 증폭반응용 분자마커의 특이성 검증 결과를 나타낸다(좀수수치 positive control은 좀수수치 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 플라스미드 1×105 copies/μl의 농도을 의미함).
이하 실시예 및 도면을 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용된 용어, 실시예, 도면 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 통상의 기술자의 이해를 돕기 위하여 예시된 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 권리범위 등이 이에 한정되어 해석되어서는 안 된다.
본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 좀수수치 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 좀수수치 검출용 프로브에 관한 것이다.
아울러 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 및 상기 프로브를 포함하는 좀수수치 검출용 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 DNA; 및 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 좀수수치를 검출하는 방법에 관한 것이다.
아울러 본 발명은 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 DNA; 및 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물의 CT(threshold cycle) 값을 확인하는 단계를 포함하는 좀수수치를 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 전기영동으로 확인하는 단계는 353~355 bp가 검출되면 좀수수치로 판정하는 것을 특징으로 한다.
상기 증폭된 산물의 CT 값을 확인하는 단계는 최대 사이클 수 이하에서 CT가 나타날 때 좀수수치로 판정하는 것을 특징으로 한다.
(실시예 1) 잉어과 어류 유전시료 확보
어류 4종 총 100개의 지느러미 시료를 확보하였다.
DNA 추출용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0; 125 mM NaCl; 10 mM EDTA pH 8.0; 1% SDS; 8 M Urea) (Asahida et al. 1996) 600 μl와 Proteinase K 용액(20 mg/ml) 6 μl를 넣고 문헌과 동일한 과정으로 유전시료를 확보하였다.
Spectrophotometer를 이용하여 추출된 게놈 DNA의 농도와 순도를 확인한 결과는 아래 표와 같다(표 1).
번호 학명 국명 분류군 게놈 DNA
농도
(ng/μl)		 A260/280
NIE-001 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과 434.7 1.82
NIE-002 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과 968.3 1.86
NIE-003 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과 313.9 1.86
NIE-004 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과 316.5 1.84
NIE-005 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과 275.1 1.77
NIE-006 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과 201.5 1.75
NIE-007 Pseudogobio esocinus 모래무지 잉어목 잉어과 모래무지아과 558.2 1.82
NIE-008 Pseudogobio esocinus 모래무지 잉어목 잉어과 모래무지아과 165.1 1.90
NIE-009 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 130.8 1.84
NIE-010 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 86.1 2.18
NIE-011 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 391.7 1.87
NIE-012 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과 648.0 1.84
NIE-013 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과 1191.4 1.86
NIE-014 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과 93.5 2.04
NIE-015 Phoxinus oxycephalus 버들치 잉어목 잉어과 황어아과 66.1 1.86
NIE-016 Phoxinus oxycephalus 버들치 잉어목 잉어과 황어아과 1204.0 1.87
NIE-017 Channa argus 가물치 농어목 가물치과 211.0 1.81
NIE-018 Channa argus 가물치 농어목 가물치과 3813.9 1.87
NIE-019 Coreoperca herzi 꺽지 농어목 꺽지과 433.9 1.87
NIE-020 Coreoperca herzi 꺽지 농어목 꺽지과 465.9 1.88
NIE-021 Odontobutis interrupta 얼룩동사리 농어목 망둑어과 2939.7 1.86
NIE-022 Odontobutis interrupta 얼룩동사리 농어목 망둑어과 443.9 1.81
NIE-023 Pseudobagrus fulvidraco 동자개 메기목 동자개과 81.3 2.13
NIE-024 Pseudobagrus fulvidraco 동자개 메기목 동자개과 95.3 2.11
NIE-025 Silurus asotus 메기 메기목 메기과 78.4 2.05
NIE-026 Silurus asotus 메기 메기목 메기과 709.7 1.86
NIE-027 Silurus asotus 메기 메기목 메기과 270.9 1.83
NIE-028 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과 286.6 1.86
NIE-029 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과 528.3 1.88
NIE-030 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과 123.2 1.88
NIE-031 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과 604.5 1.89
NIE-032 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과 540.0 1.89
NIE-033 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과 292.1 1.91
NIE-034 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과 100.6 1.76
NIE-035 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과 1338.9 1.90
NIE-036 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과 799.2 1.91
NIE-037 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과 1204.8 2.00
NIE-038 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과 469.5 1.97
NIE-039 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과 304.9 2.00
NIE-040 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과 264.4 1.99
NIE-041 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과 1987.2 2.04
NIE-042 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과 140.9 1.94
NIE-043 Monopterus albus 드렁허리 드렁허리목 드렁허리과 183.7 1.96
NIE-044 Monopterus albus 드렁허리 드렁허리목 드렁허리과 68.8 1.64
NIE-045 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과 240.2 1.97
NIE-046 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과 498.7 2.03
NIE-047 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과 66.4 1.96
NIE-048 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과 570.8 1.90
NIE-049 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과 67.0 1.94
NIE-050 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과 468.1 1.94
NIE-051 Gobiobotia naktongensis 흰수마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 1958.8 2.00
NIE-052 Gobiobotia naktongensis 흰수마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 1851.6 2.07
NIE-053 Gobiobotia macrocephala 꾸구리 잉어목 잉어과 모래무지아과 799.0 1.95
NIE-054 Gobiobotia macrocephala 꾸구리 잉어목 잉어과 모래무지아과 338.0 1.99
NIE-055 Pseudopungtungia nigra 감돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 1319.5 1.88
NIE-056 Pseudopungtungia nigra 감돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 317.4 1.96
NIE-057 Gobiobotia brevibarba 돌상어 잉어목 잉어과 모래무지아과 88.5 1.72
NIE-058 Gobiobotia brevibarba 돌상어 잉어목 잉어과 모래무지아과 774.6 1.86
NIE-059 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과 178.1 1.85
NIE-060 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과 711.2 1.97
NIE-061 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과 195.0 1.88
NIE-062 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 522.4 1.98
NIE-063 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 224.4 1.97
NIE-064 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 140.3 1.77
NIE-065 Repomucenus olidus 강주걱양태 농어목 돛양태과 154.9 1.88
NIE-066 Repomucenus olidus 강주걱양태 농어목 돛양태과 737.4 1.98
NIE-067 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과 646.0 1.96
NIE-068 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과 574.5 2.02
NIE-069 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과 531.6 1.98
NIE-070 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 266.7 1.95
NIE-071 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 448.9 1.96
NIE-072 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 1426.7 2.06
NIE-073 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리 잉어목 잉어과 모래무지아과 1956.7 2.00
NIE-074 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리 잉어목 잉어과 모래무지아과 501.3 1.95
NIE-075 Culter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과 1239.7 1.97
NIE-076 Culter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과 378.5 1.95
NIE-077 Acheilognathus yamatsutae 줄납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 471.7 1.95
NIE-078 Acheilognathus yamatsutae 줄납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 744.2 2.04
NIE-079 Tachysurus nitidus 밀자개 메기목 동자개과 3009.9 1.96
NIE-080 Tachysurus nitidus 밀자개 메기목 동자개과 1787.6 1.89
NIE-081 Carassius carassius 붕어 잉어목 잉어과 잉어아과 504.9 2.00
NIE-082 Carassius carassius 붕어 잉어목 잉어과 잉어아과 295.3 1.95
NIE-083 Siniperca scherzeri 쏘가리 농어목 꺽지과 260.7 1.88
NIE-084 Siniperca scherzeri 쏘가리 농어목 꺽지과 384.9 2.01
NIE-085 Pseudobagrus emarginatus 대농갱이 메기목 동자개과 623.2 1.98
NIE-086 Pseudobagrus emarginatus 대농갱이 메기목 동자개과 492.3 1.98
NIE-087 Sarcocheilichthys czerskii 중고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 57.7 2.03
NIE-088 Sarcocheilichthys czerskii 중고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 106.6 2.06
NIE-089 Acheilognathus rhombeus 납지리 잉어목 잉어과 납자루아과 53.9 2.04
NIE-090 Acheilognathus rhombeus 납지리 잉어목 잉어과 납자루아과 88.9 2.19
NIE-091 Nipponocypris koreanus 참갈겨니 잉어목 잉어과 피라미아과 1435.0 2.00
NIE-092 Nipponocypris koreanus 참갈겨니 잉어목 잉어과 피라미아과 696.6 1.97
NIE-093 Opsarichthys uncirostris amurensis 끄리 잉어목 잉어과 피라미아과 451.6 1.90
NIE-094 Iksookimia hugowolfeldi 남방종개 잉어목 잉어과 미꾸리과 442.5 1.98
NIE-095 Cobitis hankugensis 기름종개 잉어목 잉어과 미꾸리과 523.1 1.85
NIE-096 Cobitis tetralineata 줄종개 잉어목 잉어과 미꾸리과 147.5 1.76
NIE-097 Cobitis pacifica 북방종개 잉어목 잉어과 미꾸리과 249.3 2.01
NIE-098 Kichulchoia brevifasciata 좀수수치 잉어목 잉어과 미꾸리과 86.2 1.98
NIE-099 Kichulchoia brevifasciata 좀수수치 잉어목 잉어과 미꾸리과 94.4 1.77
NIE-100 Kichulchoia brevifasciata 좀수수치 잉어목 잉어과 미꾸리과 103.5 1.83
(실시예 2) 일반 PCR 증폭과 정제
설계된 PCR 프라이머 조합들을 이용하여 어류 100개체의 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 전체 또는 좀수수치 특이적인 영역을 증폭하기 위해 이용한 정방향 프라이머의 염기서열은 5'-GATCCTRCAAAYTCYTAGTTAACAGCTA-3'이었으며, 역방향 프라이머의 염기서열은 5'-TGRAATCCTARTTGHGWGGG-3'이었다. 이를 포함해 AccuPower® PCR PreMix & Master Mix (Bioneer, 대한민국)를 이용하여 아래와 같이 PCR 반응액을 조제하였다(표 2).
Reagent
AccuPower® PCR MasterMix 10 μl
Genomic DNA (20 ng/μl) 1 μl
Forward primer (5 pmol) 1 μl
Reverse primer (5 pmol) 1 μl
Nuclease-free water 7 μl
Total 20 μl
ProFlex PCR System (Life Technologies, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다(표 3). 이때 PCR 기계가 초기변성반응(initial denaturation)이 일어나는 온도(95℃)에 도달했을 때 모든 PCR 반응용액이 포함된 PCR 튜브를 PCR 증폭기에 넣어 PCR 증폭반응을 시작하는, 즉 hot-start PCR 증폭반응을 수행하였다.
Temperature Time No. cycles
Initial denaturation 95℃ 5 min 1
Denaturation 95℃ 30 s 35
Annealing 55℃ 30 s
Elongation 72℃ 1 min
Final elongation 72℃ 5 min 1
Storage 4℃ ∞ 1
AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer, 대한민국)의 사용자 매뉴얼에 따라 PCR 증폭산물을 정제하였다.
추출된 게놈 DNA를 대상으로 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 PCR 증폭반응을 수행하였던 결과 모든 시료들에서 성공적으로 예상되는 크기의 PCR 증폭산물들이 확인되었다(도 1).
(실시예 3) DNA 서열정보 해독과 분석
(주)마크로젠에 PCR 증폭산물들의 DNA 서열정보의 해독을 의뢰하였다. 해독된 DNA 서열정보는 BioEdit 7.2.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit. html)를 이용하여 오류를 수정하고 적절히 잘라낸(trimming) 후 콘티그(contig)를 만드는 편집을 진행하였다.
유전자은행에서 확보한 염기서열을 포함한 매트릭스는 아래와 같다. 모든 개체들에서 총 1,140 bp의 COB유전자 염기서열을 성공적으로 확보할 수 있었다(도 2).
COB 염기서열 매트릭스를 비교 분석하여 좀수수치에서만 증폭이 가능한 좀수수치 검출용 프라이머 세트(서열번호 1 및 2) 및 프로브(서열번호 3)를 아래와 같이 제작하였다(표 4).
이름 염기서열(5'→3') 비고
Kbr-0423f2 AGGRGCCACAGTGATC 서열번호 1
Kbr-0777r AGGTGTTACTAGGGGGTTA 서열번호 2
Kbr-0568fp Cy5-GCCGCAGCCACTATTTTACA-BHQ3 택맨(TaqMan) 프로브
(서열번호 3)
상기 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다.
상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NED, JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, BHQ3, NFQ 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어 상기 프로브(Kbr-0568fp)는 Cy5-GCCGCAGCCACTATTTTACA-BHQ3 로 정의될 수 있다.
상기 프로브는 택맨(TaqMan) 프로브로서, 5' 말단은 리포터인 형광표지 인자(FAM, Cy5 등)로, 3' 말단은 억제자(quencher) 물질(TAMRA, BHQ2 등)로 이루어져, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드와 함께 이용하는 것이 바람직하다.
상기 프로브는 PCR 과정 중 어닐링(annealing) 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하며, 연장(extension) 단계에서 중합효소의 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 프로브만 분해되어 형광표지 인자가 프로브에서 유리되어 억제자에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
(실시예 4) 좀수수치의 식별
확보한 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하여 PCR 반응을 수행하였다.
본 발명은 서열번호 1 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 이용해 좀수수치의 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 좀수수치 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 및 상기 프로브를 포함하는 좀수수치 검출용 조성물을 제공한다.
상기 좀수수치 검출용 PCR 프라이머 세트 또는 조성물을 이용해 PCR을 수행한 후 전기영동으로 확인하는 단계에서 좀수수치의 경우 353~355 bp 밴드가 검출되었으나, 다른 어류에서는 상기 밴드가 관찰되지 않았다.
(실시예 5) 환경수 시료 확보
(시료명 : KBC, KBP 시료들)
좀수수치가 서식하고 있는 것으로 알려져 있는 영산강 3지점에서 하천수 1,000 ml 채수하여 일회용 Celluose Nitrate 여과지(pore size 0.45㎛)를 이용해 여과하여 여과지만을 실리카겔과 함께 지퍼백에 밀봉하여 환경 DNA를 추출하기 전까지 -60℃ 이하로 급속 냉동하여 보관하였다.
(실시예 6) 환경 DNA 추출 및 실시간 PCR 검증
DNeasy Tissue & Blood Kit (Qiagen, 미국)을 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 환경 DNA를 추출하였다.
실시간 PCR 증폭 반응의 검량선을 작성하기 위해 좀수수치 검출용 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)와 최적의 결합온도(64℃)에서 좀수수치 종 특이적 형광 프로브(서열번호 3)를 이용하여 순수 좀수수치 게놈 DNA 농도별 실시간 PCR 증폭반응을 수행하였다. 이때 좀수수치 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 플라스미드를 1×106 copies/μl의 농도에서 10배씩 6번 희석하여 실시간 PCR 증폭반응에 사용하였다.
실시간 PCR 증폭반응을 수행하기 위해 AccuPower® Plus DualStar™ qPCR PreMix & Master Mix (Bioneer, 대한민국)를 이용하여 아래와 같이 PCR 반응액을 조제하였다(표 5).
Reagent
AccuPower® Plus DualStar™ qPCR PreMix & Master Mix 10 μl
Genomic DNA or environmental DNA 2 μl
Forward primer (5 pmoles) 1 μl
Reverse primer (5 pmoles) 1 μl
Probe (5 pmoles) 1 μl
Nuclease-free water 5 μl
Total 20 μl
QuantStudio5 (Life Technologies, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다(표 6).
Temperature Time No. cycles
Initial denaturation 95℃ 2 min 1
Denaturation 95℃ 15 sec 45
Annealing/elongation 64℃ 1 min
그 결과 실시간 PCR 증폭반응을 통해 확인한 CT 값은 좀수수치 게놈 DNA의 농도에 반비례하여 높아지는 것을 확인할 수 있었다(도 3, r 2=0.998). 따라서 정량분석이 가능한 것으로 판단되었다.
본 발명은 상기 좀수수치 검출용 PCR 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)와, 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 이용해 실시간 PCR을 수행할 시 유의미한 사이클을 의미하는 CT(critical threshold)가 최대 사이클 이하에서 검출될 때 좀수수치로 판정하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 올리고뉴클레오티드 혼합물을 이용해 실시간 PCR을 수행할 시 CT 값에 따라 상대정량을 실시함으로써 정량분석을 할 수 있는 것이 특징이다.
따라서 본 발명은 좀수수치 검출용 PCR 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법이 신속 정확하며, 감도가 우수하여 미량의 좀수수치 시료의 검출에 효율성과 실용성이 매우 높다.
좀수수치를 비롯한 어류 44종(표 7)을 대상으로 좀수수치 검출용 프라이머 세트와 프로브의 특이성을 검증하였던 결과는 아래와 같았다(도 4). 좀수수치에서만 실시간 PCR 증폭반응이 확인되어 그 특이성이 검증되었으며, CT 값 45까지 base line이 안정적이었다. 따라서 종 특이성이 매우 높았으며, 위음성(false-negative)으로 인해 발생할 수 있는 오류가 없음을 알 수 있다.
시료명 학명 국명 분류군
NIE-001 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과
NIE-004 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과
NIE-007 Pseudogobio esocinus 모래무지 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-009 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과
NIE-012 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과
NIE-015 Moroco oxycephalus 버들치 잉어목 잉어과 황어아과
NIE-017 Channa argus 가물치 농어목 가물치과
NIE-019 Coreoperca herzi 꺽지 농어목 꺽지과
NIE-021 Odontobutis interrupta 얼룩동사리 농어목 망둑어과
NIE-023 Pseudobagrus fulvidraco 동자개 메기목 동자개과
NIE-025 Silurus asotus 메기 메기목 메기과
NIE-028 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과
NIE-031 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과
NIE-034 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과
NIE-037 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과
NIE-040 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과
NIE-043 Monopterus albus 드렁허리 드렁허리목 드렁허리과
NIE-045 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과
NIE-048 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-051 Gobiobotia naktongensis 흰수마자 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-053 Gobiobotia macrocephala 꾸구리 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-055 Pseudopungtungia nigra 감돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-057 Gobiobotia brevibarba 돌상어 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-059 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-062 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-065 Repomucenus olidus 강주걱양태 농어목 돛양태과
NIE-067 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-070 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-073 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-075 Erythroculter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과
NIE-077 Acheilognathus yamatsute 줄납자루 잉어목 잉어과 납자루아과
NIE-079 Leiocassis nitidus 밀자개 메기목 동자개과
NIE-081 Carassius carassius 붕어 잉어목 잉어과 잉어아과
NIE-083 Siniperca scherzeri 쏘가리 농어목 꺽지과
NIE-085 Pseudobagrus emarginatus 대농갱이 메기목 동자개과
NIE-087 Sarcochelichthys czerskii 중고기 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-089 Acheilognathus rhombeus 납지리 잉어목 잉어과 납자루아과
NIE-091 Nipponocypris koreanus 참갈겨니 잉어목 잉어과 피라미아과
NIE-093 Opsarichthys uncirostris amurensis 끄리 잉어목 잉어과 피라미아과
NIE-094 Iksookimia hugowolfeldi 남방종개 잉어목 잉어과 미꾸리과
NIE-095 Cobitis hankugensis 기름종개 잉어목 잉어과 미꾸리과
NIE-096 Cobitis tetralineata 줄종개 잉어목 잉어과 미꾸리과
NIE-097 Cobitis pacifica 북방종개 잉어목 잉어과 미꾸리과
NIE-098 Kichulchoia brevifasciata 좀수수치 잉어목 잉어과 미꾸리과
좀수수치 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 플라스미드 1×105 copies/μl, 좀수수치 시험용 환경 DNA 시료(eDNA test)를 이용하여 실시간 PCR 증폭반응을 수행한 결과, 좀수수치 게놈 DNA는 CT 값 19.99에서 확인되었으며, 좀수수치 시험용 환경수 시료(KBP8)는 CT 값 35.20에서 확인되었다. 작성한 검량선에 대입하여 환산하면 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 플라스미드 1×105 copies/μl 시료는 플라스미드 농도로 102,736 copies/μl, 좀수수치 시험용 환경수 시료 KBP8은 플라스미드 농도로 3 copies/μl에 해당하였다(표 8).
번호 시료명 Ct 값 플라스미드 환산값(copies/ul) 검출**
1 KBP8 35.20 3 ○
2 Positive control
(플라스미드 1×105 copies/μl)		 19.99 102,736 ○
3 Negative control
(3차 증류수)		 ND* 0.000 -
*ND: Not detected, **검출 판단기준(검출: ○, 미검출: -)
<110> NATIONAL INSTITUTE OF ECOLOGY <120> PCR primer set and probe for environmental DNA detection of Kichulchoia brevifasciata and real-time PCR method using the same <130> PNC-2020-011 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kbr-0423f2 <400> 1 aggrgccaca gtgatc 16 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kbr-0777r <400> 2 aggtgttact agggggtta 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kbr-0568fp <400> 3 gccgcagcca ctattttaca 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
    다른 담수어류와 좀수수치를 식별할 수 있는 좀수수치 검출용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브;를 포함하고,
    다른 담수어류와 좀수수치를 식별할 수 있는 좀수수치 검출용 조성물.
  4. 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 DNA; 및 제1항의 프라이머 세트 또는 제3항의 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
    상기 증폭된 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 좀수수치를 검출하는 방법에 있어서,
    상기 전기영동으로 확인하는 단계는 353~355 bp가 검출되면 좀수수치로 판정하는 것을 특징으로 하는 좀수수치를 검출하는 방법.
  5. 어류 또는 환경수로부터 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 DNA; 및 제1항의 프라이머 세트 또는 제3항의 조성물을 혼합하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
    상기 증폭된 산물의 CT(threshold cycle) 값을 확인하는 단계를 포함하는 좀수수치를 검출하는 방법에 있어서,
    상기 증폭된 산물의 CT 값을 확인하는 단계는 최대 사이클 수 이하에서 CT가 나타날 때 좀수수치로 판정하는 것을 특징으로 하는 좀수수치를 검출하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
송하윤 외 3인 Korean Journal of Ichthyology, Vol. 29, No. 1, 1-12, March 2017
환경부 국립생물자원관 2018년도 최종보고서 <차세대염기서열 분석기반 동물자원 디지털염기서열 활용연구> (2018.12.)

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