JP2021052714A - バラタナゴ類の判別方法及び判別キット - Google Patents
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Abstract
Description
(1) ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法であって、
対象バラタナゴの核DNAを鋳型として、以下に示す4種類のプライマーを用いてPCR法で増幅産物を得る核DNA増幅工程と、
1)配列番号1で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーA;
2)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーB;
3)バラタナゴの18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーC;
4)バラタナゴの5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーD;
前記センスプライマーA及び前記アンチセンスプライマーDにより増幅された増幅産物Xが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーC及び前記アンチセンスプライマーBにより増幅された増幅産物Yが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別し、
前記増幅産物X及び前記増幅産物Yが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する判別工程と、
を含む、バラタナゴ類の判別方法。
(2) 前記センスプライマーCが配列番号3で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(1)に記載のバラタナゴ類の判別方法。
(3) 前記アンチセンスプライマーDが配列番号4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(1)又は(2)に記載のバラタナゴ類の判別方法。
(4) 前記核DNA増幅工程の前に、又は、前記判別工程の後に、
対象バラタナゴのミトコンドリアDNAを鋳型として、以下に示す2種のプライマーセットを用いてPCR法で増幅産物を得るミトコンドリアDNA増幅工程と、
5)ニッポンバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーE及びアンチセンスプライマーFからなるプライマーセット;
6)タイリクバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーG及びアンチセンスプライマーHからなるプライマーセット;
前記センスプライマーE及び前記アンチセンスプライマーFにより増幅された増幅産物Wが検出された場合には、ミトコンドリアDNAの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーG及び前記アンチセンスプライマーHにより増幅された増幅産物Vが検出された場合には、ミトコンドリアDNAの遺伝子型がタイリクバラタナゴであると判別するミトコンドリアDNAの遺伝子型判別工程と、
を更に含む、(1)〜(3)のいずれか一つに記載のバラタナゴ類の判別方法。
(5) 前記センスプライマーEは、配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーFは、配列番号6で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(4)に記載のバラタナゴ類の判別方法。
(6) 前記センスプライマーGは、配列番号7で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーHは、配列番号8で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(4)又は(5)に記載のバラタナゴ類の判別方法。
1)配列番号1で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーA;
2)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーB;
3)バラタナゴの18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーC;
4)バラタナゴの5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーD
(8) 前記センスプライマーCが配列番号3で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(7)に記載のバラタナゴ類の判別キット。
(9) 前記アンチセンスプライマーDが配列番号4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(7)又は(8)に記載のバラタナゴ類の判別キット。
(10) 以下に示す2種のプライマーセットを更に備える、(7)〜(9)のいずれか一つに記載のバラタナゴ類の判別キット。
5)ニッポンバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーE及びアンチセンスプライマーFからなるプライマーセット;
6)タイリクバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーG及びアンチセンスプライマーHからなるプライマーセット
(11) 前記センスプライマーEは、配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーFは、配列番号6で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(10)に記載のバラタナゴ類の判別キット。
(12) 前記センスプライマーGは、配列番号7で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーHは、配列番号8で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、(10)又は(11)に記載のバラタナゴ類の判別キット。
本実施形態のバラタナゴ類の判別方法(以下、単に「本実施形態の判別方法」と略記する場合がある)は、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法である。本実施形態の判別方法は、核DNA増幅工程と、判別工程とを含む。
核DNA増幅工程では、対象バラタナゴの核DNAを鋳型として、以下に示す4種類のプライマーを用いてPCR法で増幅産物を得る。
1)配列番号1で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーA;
2)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーB;
3)バラタナゴの18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーC;
4)バラタナゴの5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーD
前記センスプライマーC及び前記アンチセンスプライマーBにより増幅された増幅産物Yが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
前記増幅産物X及び前記増幅産物Yが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する。
本実施形態の判別方法は、後述する実施例に示すように、各亜種に特異的なプライマーを含むプライマーセットを用いることで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを簡便且つ確実に判別することができる。
核DNA増幅工程では、対象バラタナゴの核DNAを鋳型として、以下に示す4種類のプライマーを用いてPCR法で増幅産物を得る。
1)配列番号1で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーA;
2)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーB;
3)バラタナゴの18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーC;
4)バラタナゴの5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーD
判別工程では、上記核DNA増幅工程で得られた増幅産物を検出することで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する。
具体的には、前記センスプライマーA及び前記アンチセンスプライマーDにより増幅された増幅産物Xが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別する。
前記センスプライマーC及び前記アンチセンスプライマーBにより増幅された増幅産物Yが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
前記増幅産物X及び前記増幅産物Yが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する。
なお、上記増幅産物の検出では、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴに共通する18SrRNA遺伝子−ITS1領域−5.8SrRNA遺伝子の全長または一部からなるDNA断片(以下、「増幅産物Z」と称する場合がある)も検出される。
ミトコンドリア増幅工程では、対象バラタナゴのミトコンドリアDNAを鋳型として、以下に示す2種のプライマーセットを用いてPCR法で増幅産物を得る。
5)ニッポンバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーE及びアンチセンスプライマーFからなるプライマーセット;
6)タイリクバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーG及びアンチセンスプライマーHからなるプライマーセット
ミトコンドリアDNAの遺伝子型判別工程では、上記ミトコンドリアDNA増幅工程で得られた増幅産物を検出することで、対象バラタナゴのミトコンドリアDNAの遺伝子型、すなわち、母系の遺伝子型を判別する。
具体的には、前記センスプライマーE及び前記アンチセンスプライマーFにより増幅された増幅産物Wが検出された場合には、ミトコンドリアDNAの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別する。
前記センスプライマーG及び前記アンチセンスプライマーHにより増幅された増幅産物Vが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別する。
本実施形態のバラタナゴ類の判別キット(以下、単に「本実施形態の判別キット」と略記する場合がある)は、以下に示す4種のプライマーを含むプライマーセットを備える。
1)配列番号1で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーA;
2)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーB;
3)バラタナゴの18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーC;
4)バラタナゴの5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーD
5)ニッポンバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーE及びアンチセンスプライマーFからなるプライマーセット;
6)タイリクバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーG及びアンチセンスプライマーHからなるプライマーセット
1.サンプルの収集
ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びその交雑個体のサンプルは、2017年から2018年までの期間に、ハンドネット又はキャスティングネットを使用して、九州の5つの河川(六角川、筑後川、菊池川、瑞梅寺川及び鹿島川)、並びに、本州東部の夷隅川で収集された。これらのサンプリング場所は、以前の研究に基づいて選択された。捕獲された各個体から尾びれの一部を切り取り、切り取った組織は直ちに99%エタノールで固定された。その後、捕獲された全ての個体は、各サンプリング場所で直ちに放流された。DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen社製)を使用して、固定した組織から全DNAを分離した。
ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴのミトコンドリアシトクロームb遺伝子の参照塩基配列を日本DNAデータバンク(DDBJ)から入手した。ニッポンバラタナゴのアクセッション番号は、AB109000、AB109010、AB366504−AB366507、AB769511−AB769515である。タイリクバラタナゴのアクセッション番号は、AB109009、AB366512−AB366513、AB620133、AB769516−AB769519、KF410776である。これらの塩基配列をMEGA7ソフトウェア(参考文献1:「Kumar S et al., “MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.”, Mol Biol Evol., Vol. 33, Issue 7, pp. 1870-1874, 2016.)を使用して分析し、ミトコンドリアシトクロームb遺伝子における各亜種に特異的な変異(種間変異)を特定した。
図1から、シトクロームb遺伝子の2亜種に特異的な増幅産物が得られることが確認された。ニッポンバラタナゴ特異的な増幅産物は、348塩基対(bp)であり、タイリクバラタナゴ特異的な増幅産物は193bpであった。
次いで、ニッポンバラタナゴ(六角川から採取されたサンプルNo.1)及びタイリクバラタナゴ(夷隅川から採取されたサンプルNo.31)の核DNA中のリボソームRNA遺伝子の内部転写スペーサー(internal transcribed spacer 1;ITS1)領域の配列を分析した。「Kanno K et al., “Morphological, distributional, and genetic characteristics of Cottus pollux in the Kyushu Island, Japan: indication of fluvial and amphidromous life histories within a single lineage”, Ichthyological Research, Vol. 65, Issue 4, pp.462-470, 2018.(参考文献2)」に記載の18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するフォワードプライマー(18SrRNAF;5’−TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAG−3’(配列番号3))及び5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列を有するリバースプライマー(5.8SrRNAR;5’−GTCCTGCAATTCACATTAGTTC−3’(配列番号4))を用いてPCRを行い、344bpのITS1領域の増幅産物を得た。具体的には、5μLのEmeraldAmp(登録商標) PCR Master Mix(TaKaRa社製)、0.5μLの各プライマー(混合物の総容量に対する濃度が10μM(μmol/L))、3.5μLの超純水及び0.5μLの鋳型DNAを含む10μLの反応混合物を調製して、PCRを行った。PCRの条件は、98℃で30秒間インキュベートした後、次に示すサイクルを30サイクル実行した:98℃で15秒間、50℃で15秒間、72℃で15秒間。サイクル終了後、72℃で2分間保持した。
1)Rok_ITS1_shortF(配列番号1)
2)Roo_ITS1_shortR(配列番号2)
3)18SrRNAF(配列番号3)
4)5.8SrRNAR(配列番号4)
図2から、ニッポンバラタナゴではUNIF及びROKFが検出され、一方で、タイリクバラタナゴではUNIF及びROOFが検出された。このことから、共通の増幅産物に加えて、各亜種に特異的な増幅産物が検出されることが確認された。ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑個体では、UNIF、ROKF及びROOFの3種類の増幅産物が検出された。
以上のことから、本プライマーセットを使用してPCR解析を行なうことで、ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及び交雑個体の簡易的判別が可能であることが示唆された。
上記「2.ミトコンドリアDNAにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング」及び「3.核DNAにおける種特異的プライマーを用いたジェノタイピング」の分析結果をまとめて、各個体の遺伝子型を以下の6種類に分類した。結果を図3に示す。図3において、「st.1」、「st.2」、「st.3」、「st.4」、「st.5」、「st.6」はそれぞれ六角川、筑後川、菊池川、瑞梅寺川、鹿島川及び夷隅川で収集したサンプルを示す。
(1)母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ(mat−Rok)、核DNAの遺伝子型がニッポンバラタナゴ(homo−Rok)
(2)母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ(mat−Rok)、核DNAの遺伝子型が交雑種(hetero)
(3)母系の遺伝子型がニッポンバラタナゴ(mat−Rok)、核DNAの遺伝子型がタイリクバラタナゴ(homo−Roo)
(4)母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ(mat−Roo)、核DNAの遺伝子型がニッポンバラタナゴ(homo−Rok)
(5)母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ(mat−Roo)、核DNAの遺伝子型が交雑種(hetero)
(6)母系の遺伝子型がタイリクバラタナゴ(mat−Roo)、核DNAの遺伝子型がタイリクバラタナゴ(homo−Roo)
Claims (12)
- ニッポンバラタナゴ、タイリクバラタナゴ及びそれらの交雑種のうちいずれのバラタナゴであるかを判別する方法であって、
対象バラタナゴの核DNAを鋳型として、以下に示す4種類のプライマーを用いてPCR法で増幅産物を得る核DNA増幅工程と、
1)配列番号1で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーA;
2)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーB;
3)バラタナゴの18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーC;
4)バラタナゴの5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーD;
前記センスプライマーA及び前記アンチセンスプライマーDにより増幅された増幅産物Xが検出された場合には、ニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーC及び前記アンチセンスプライマーBにより増幅された増幅産物Yが検出された場合には、タイリクバラタナゴであると判別し、
前記増幅産物X及び前記増幅産物Yが検出された場合には、ニッポンバラタナゴ及びタイリクバラタナゴの交雑種であると判別する判別工程と、
を含む、バラタナゴ類の判別方法。 - 前記センスプライマーCが配列番号3で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項1に記載のバラタナゴ類の判別方法。
- 前記アンチセンスプライマーDが配列番号4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項1又は2に記載のバラタナゴ類の判別方法。
- 前記核DNA増幅工程の前に、又は、前記判別工程の後に、
対象バラタナゴのミトコンドリアDNAを鋳型として、以下に示す2種のプライマーセットを用いてPCR法で増幅産物を得るミトコンドリアDNA増幅工程と、
5)ニッポンバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーE及びアンチセンスプライマーFからなるプライマーセット;
6)タイリクバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーG及びアンチセンスプライマーHからなるプライマーセット;
前記センスプライマーE及び前記アンチセンスプライマーFにより増幅された増幅産物Wが検出された場合には、ミトコンドリアDNAの遺伝子型がニッポンバラタナゴであると判別し、
前記センスプライマーG及び前記アンチセンスプライマーHにより増幅された増幅産物Vが検出された場合には、ミトコンドリアDNAの遺伝子型がタイリクバラタナゴであると判別するミトコンドリアDNAの遺伝子型判別工程と、
を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のバラタナゴ類の判別方法。 - 前記センスプライマーEは、配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーFは、配列番号6で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項4に記載のバラタナゴ類の判別方法。
- 前記センスプライマーGは、配列番号7で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーHは、配列番号8で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項4又は5に記載のバラタナゴ類の判別方法。
- 以下に示す4種のプライマーを含むプライマーセットを備える、バラタナゴ類の判別キット。
1)配列番号1で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーA;
2)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーB;
3)バラタナゴの18SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するセンスプライマーC;
4)バラタナゴの5.8SrRNA遺伝子の塩基配列の一部に相補的な配列からなるポリヌクレオチドを有するアンチセンスプライマーD - 前記センスプライマーCが配列番号3で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項7に記載のバラタナゴ類の判別キット。
- 前記アンチセンスプライマーDが配列番号4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項7又は8に記載のバラタナゴ類の判別キット。
- 以下に示す2種のプライマーセットを更に備える、請求項7〜9のいずれか一項に記載のバラタナゴ類の判別キット。
5)ニッポンバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーE及びアンチセンスプライマーFからなるプライマーセット;
6)タイリクバラタナゴのシトクロームb遺伝子の転写産物を増幅するためのセンスプライマーG及びアンチセンスプライマーHからなるプライマーセット - 前記センスプライマーEは、配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーFは、配列番号6で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項10に記載のバラタナゴ類の判別キット。
- 前記センスプライマーGは、配列番号7で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド有し、前記アンチセンスプライマーHは、配列番号8で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する、請求項10又は11に記載のバラタナゴ類の判別キット。
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