JP2004520843A - ポリメラーゼ連鎖反応法を用いた真菌病原体の検出 - Google Patents
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Abstract
本発明は、真菌の病原体であるコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの検出のためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおけるプライマーの使用に関する。特異的なプライマーは、ＰＣＲに基づく技術を用いた真菌単離物の同定に有用であることが認められる。生物体からのＤＮＡの単離において使用される新規な抽出緩衝溶液、組織からのＤＮＡの抽出方法、及び組織から抽出したＤＮＡについてのＰＣＲ分析の実施方法についてもまた、記載される。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核果植物及びナッツ、特別にはアーモンドの病原体、コレトトリカム・アクタツム（Colletotrichum acutatum）、アルテナリア属（Alternaria spp.）及びクラドスポリウム・カルポフィラム（Cladosporium carpophilum）の検出のためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおけるプライマーの使用に関する。これらのプライマーの使用は真菌病原体の特異的な単離物の検出及び植物の母集団における病気の発生をモニターすることを可能にする。本発明はまた、新規な抽出緩衝溶液、組織からのＤＮＡの抽出方法、及び組織から抽出されたＤＮＡについてのＰＣＲ分析の実施方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の病気は、農民には経済的な損失、そして世界の多くの場所では地域の人口に対する栄養の供給の不足の両方の結果に帰する、深刻な収獲の損失を年々ひき起こす。広範な殺菌剤の使用は植物の病原体の攻撃に対してかなりの安全性を与えた。しかしながら、殺菌剤への１０億ドル相当の支出にもかかわらず、世界的な収獲の損失は、１９８１年における収獲値の約１０％に及んだ（James, 1981 ; Seed Sci. & Technol. 9 : 675-685）。
【０００３】
病気の破壊的プロセスの重症度は、病原体の病原力及び宿主の応答に依存する。ほとんどの植物育種プログラムの目的の１つは、宿主植物の病気に対する耐性を高めることである。典型的には、病原体の異なる種は同一の作物種の異なる変種と特異的に相互作用し、そして多くの宿主の耐性源が特異的な病原体の種に対してのみ防御するものである。さらには、いくつかの病原体種は病気の症状の早期の徴候を示すが、上記作物には、わずかな損傷しかひき起こさない。Jones及びClifford（1983 ; Cereal Diseases, John Wiley）は、病原体の有毒な形態が、宿主である品種への耐性の導入に応じて病原体の母集団中に現れると予想されること、及びしたがって病原体の母集団をモニターすることが必要であることを報告する。加えて、特別の殺菌剤に対して耐性のある真菌の菌株の発生に関するいくつかの実証されたケースがある。１９８１年には早くも、FletcherとWolfe（1981；Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf.）が春オオムギのウドンコ病にかかった母集団の２４％及び冬オオムギのウドンコ病にかかった母集団の５３％が殺菌剤トリアジメノールに対しての反応性においてかなりの多様性を示し、そして、最も疑わしい変種が存在しても、より可能性の低い型の発生率が最も高いというように、これらの母集団の配分は変種間において多様である、との議論をした。殺菌剤に対する真菌の感受性における同様の多様性が小麦ウドンコ病（これもまたトリアジメノールに対して）、ボツリチス（Botrytis）（ベノミルに対して）、ピレノフォーラ（Pyrenophora）（有機水銀に対して）、シュードセルコスポレーラ（Pseudocercosporella）（ＭＢＣ−タイプの殺菌剤に対して）及びトリアゾールに対するミコスフェレラ・フィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）その他いくつかの例について実証されてきた（Jones and Clifford ; Cereal Diseases, John Wiley, 1983）。
【０００４】
商業的なアーモンドの栽培者は多様な方法で彼らの作物に感染する多数の真菌に直面している。これらの病原体の木の成長に対する影響は多くの因子に依存し、原因は、病気にかかった木が表すことのできる症状からは直ちに明らかでない。維管束性の病原体は侵入し、木部の管をつまらせ、それによって根からの水及び栄養分の上方への動きを停止させる（Integrated Pest Management for Almonds, U. California Division of Agriculture and Natural resources publication 3308 (1985)）。維管束組織が閉鎖すると、症状はしばしば部分的又は完全な、栄養分又は水からの遮断を反映する。したがって、葉及び枝の組織に感染した病原体によりひき起こされた立枯れ病と同様に、アーモンドの冠部の症状及び根腐れは互いに非常に類似して現れることができ；そして栄養分及び水の利用可能性そしてそれらの取り込みに影響する因子のような環境条件の結果に類似している。
【０００５】
いくつかの病原体は枝、葉、及び果実に限定される感染をひき起こす。アーモンドに病気を起こす真菌及び細菌のいくつかが秋の間に果樹園の果樹に感染し、宿主組織中で越冬することが発見された。春の間、それらは局在化された病変部、又はより大きな感染であって、近時の雨又は潅水のような環境条件が病原体の成長を促進した後に顕在化するものを生じさせる。
【０００６】
アーモンド果樹園の管理に経済的な問題をひき起こすものと同一の病原体は、他の作物にも影響を及ぼす。例えば、クラドスポリウム・カルポフィラムは、核果植物全体にわたる宿主の範囲を有する。例えば、それがアーモンドの収獲物に生じさせる腐敗病に加えて、Ｃ．カルポフィラムはモモ、ネクタリン、アプリコット、プラム及びチェリーにも腐敗病を生じさせる（Compendium of Stone Fruit Diseases, Ogawa, J.M.; Zehr, E.I.; Bird, G.W.; Ritchie, D.F.; Uriu, K.; Uyemoto, J.K. eds., p.11 (1995 APS Press, St. Paul, MN)）。
【０００７】
アルテナリア属は、多くの経済的に重要な作物に感染をひき起こすことが実証されている。今日まで、それはエンドウにアルテナリア胴枯れ病をひき起こすことが報告され、そしてアルテナリア斑点病がピーナッツ、アーモンド、トウモロコシ、綿、及び世界のすべての大豆栽培地域において以下の報告：（Compendium of Soybean Diseases, 4th Ed. Hartman, G.L.; Sinclair, J.B.; Rupe, J.C. eds., pp. 12-13 (1999, APS Press, St. Paul, MN)）; (Compendium of Cotton Diseases, Watkins, G.M. ed., p. 28 (1981, APS Press, St. Paul MN)) ; (Compendium of Pea Diseases, Hagedorn, D.J., ed., p. 15 (1984, APS Press, St. Paul MN)) ; (Compendium of Peanut Diseases, Porter, D.M.; Smith, D.H.; Rodriguez-Kabana, R. eds. Pp. 13 (1984, APS Press, St. Paul, MN)) ; (Compendium of Stone Fruit Diseases, Ogawa, J.M.; Zehr, E.I.; Bird, G.W.; Ritchie, D.F.; Uriu, K.; Uyemoto, J.K. eds., p. 11 (1995 APS Press, St. Paul, MN)) ; 及び（Compendium of Corn Diseases, 3rd Ed. White, D.G., ed., p. 25 (1999, APS Press, St. Paul, MN)）がされている。アルテナリア属は、ブラジル、カナダ、コスタリカ、コロンビア、チリ、東アフリカ、イギリス、メキシコ、米国、及びベネズエラにおける広汎な葉及びさやの斑点病の原因である（Compendium of Bean Diseases, Hall, R. ed., p. 14 (1991, APS Press, St. Paul, MN)）。アルテナリア属は、また、ジャガイモ及び他のナス科の作物の葉に病変を形成し；（Compendium of Potato Diseases, Hooker, W.J. ed., p. 44 (1981, APS Press, St. Paul, MN)）、そして２次的感染としてサトウダイコンの葉に現れる（Compendium of Beet Diseases and Insects, Whitney, E.D., Duffus, J.E. eds., p. 11 (1991, APS Press, St. Paul, MN)）。それは、モロコシ属に穀粒のカビを生じさせ（Compendium of Sorghum Diseases, Frederiksen, R.A. ed., p. 36 (1986, APS Press, St. Paul, MN)）、トマトのクロカビ病の１の原因である（Compendium of Tomato Diseases, Jones, J.B.; Jones, J.P.; Stall, R.E.; Zitter, T.A., eds., p. 46 (1991, APS Press, St. Paul, MN)）。アルテナリア属は、また、乾燥地域に位置する果樹園における、及びマンゴーの主要な病気である、果実の斑点をパパイヤに生じさせる（Compendium of Tropial Fruit Diseases, Ploetz, R.C.; Zentmyer, G.A.; Nishijima, W.T.; Rohrbach, K.G.; Ohr, H.D. eds., pp. 34 and 58 (1994, APS Press, St. Paul, MN)）。
【０００８】
コレトトリカム・アクタツムは、アボカド、イチゴ、アーモンド、リンゴ及びモモを含む多くの果実作物に感染することが報告されている。Ｃ．アクタツムは、アボカド及びマンゴーに収獲後の果実の病気を生じさせる。Ｃ．アクタツムはまた、開花後の落果及び柑橘作物の主要なライム炭疽病の両方をひき起こすことでも知られている（Freeman, S. et al., 1998, Plant Disease Vol. 82, No.6, pp. 596-605を参照のこと）。
【０００９】
上記の点から見て、感染の過程の初期に病原体となる真菌の特異的な種を同定しうる技術の開発に対する真の必要性がある。病気の症状が作物において明白になる前に病原体の特異的な種を同定することにより、農学者は病原体が同定された作物種における病原体のさらなる進展のありそうな影響を評価し、そのような適用が必要とみなされれば適切な殺菌剤を選択することができる。
【００１０】
発明の要約
本発明は、植物の病原体となる真菌の異なる病原型の同定方法へ導かれる。本発明は、異なる真菌の病原型の間で多様性を示す内部転写スペーサー（ＩＴＳ）ＤＮＡを提供する。そのようなＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた診断アッセイにおける使用のためのプライマーを得るのに使用されることができるため、本発明の方法において有用である。これらのプライマーは、特定の真菌の病原型によりＤＮＡテンプレートが提供されるＰＣＲ反応における特有のフラグメントを産生し、したがって病気の症状の発生前に宿主である植物中における特異的な病原型の存否を判定するのに用いられることができる。
【００１１】
好ましい実施態様においては、本発明は、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの検出のためのＩＴＳ由来の診断用プライマーを提供する。
【００１２】
本発明は、特異的な作物種における潜在的な損傷／病原体菌株の関係を評価し、利用可能な殺菌剤の多様な備蓄を賢明に利用する可能性を提供する。さらには、本発明は、拡張された地理的エリアにわたる特異的な病原体種の発生及び広がりについての詳細な情報を提供するのに用いられることができる。本発明は、長い潜伏相を伴う病気に特に好適な検出方法を提供する。
【００１３】
本発明の実施に有用なキットもまた提供される。上記キットは、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの同定における特別な使用を見出す。
【００１４】
本発明はまた、新規なＤＮＡ抽出緩衝液を用いた組織からのＤＮＡ抽出物の調製方法を提供する。本発明はさらに、上記新規なＤＮＡ抽出緩衝液を用いて組織から抽出されたＤＮＡについてのＰＣＲ分析の実施方法を準備する。
【００１５】
配列リスト中の配列の簡単な説明
配列番号：１ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ１
配列番号：２ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ２
配列番号：３ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ３
配列番号：４ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ４
配列番号：５ オリゴヌクレオチドプライマー ＦＯＲＷＡＲＤ
配列番号：６ オリゴヌクレオチドプライマー ＲＥＶＥＲＳＥ
配列番号：７ オリゴヌクレオチドプライマー ＣａＩＮＴ−１
配列番号：８ オリゴヌクレオチドプライマー ＣａＩＮＴ−２
配列番号：９ オリゴヌクレオチドプライマー ＣａＩｎｔ２
配列番号：１０ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７
【００１６】
配列番号：１１ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７８
配列番号：１２ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７９
配列番号：１３ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−１
配列番号：１４ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−２
配列番号：１５ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−３
配列番号：１６ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−４
配列番号：１７ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−５
配列番号：１８ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−６
配列番号：１９ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌｔ１
配列番号：２０ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌｔ２
【００１７】
配列番号：２１ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ１
配列番号：２２ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ２
配列番号：２３ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ３
配列番号：２４ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ４
配列番号：２５ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ５
配列番号：２６ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ６
配列番号：２７ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ７
配列番号：２８ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７．１
配列番号：２９ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７．２
配列番号：３０ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７．３
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、植物の病原体となる真菌の異なる病原型を同定するのに有用な独特のＤＮＡ配列を提供する。特別には、上記ＤＮＡ配列は、真菌の病原型の同定のためのＰＣＲに基づいた分析においてプライマーとして用いられることができる。本発明の上記ＤＮＡ配列は、特別の真菌病原体のリボソームＲＮＡ領域の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列を、上記特別の真菌病原体を同定することのできるこれらの領域から得られたプライマー同様に含む。種又は属中の異なるメンバー間で異なる、１の病原体の種又は属中の異なる病原型からのＩＴＳ ＤＮＡ配列は、それらの特異的なメンバーを同定するのに用いられることができる。
【００１９】
生物医学研究者は、感染した動物組織において病原体を検出するのに、しばらくの間ＰＣＲに基づいた技術を用い、そしてほどほどの成功を収めてきた。しかしながら、つい最近になってこの技術は植物の病原体を検出するために適用された。感染した小麦におけるガウマノミセス・グラミニス（Gaumannomyces graminis）の存在が、上記病原体のミトコンドリアゲノムに特異的な配列のＰＣＲを用いて検出され（Schlesser et al., 1991 ; Applied and Environ. Microbiol. 57 : 553-556）、そして、ランダムに増幅された多型性ＤＮＡ（すなわち、ＲＡＰＤ）マーカーは、針葉樹のスクレロデリス枝枯れ病の外来の媒体である、グレムニエラ・アビエティナ（Gremmeniella abietina）の数多くの種を識別することができた。米国特許第５，５８５，２３８号（本明細書中にそっくりそのまま参考文献として援用されている）は、セプトリア（Septoria）、シュードセルコスポレラ（Pseudocercosporella）、及びマイコスフェレラ（Mycosphaerella）の菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から得られたプライマー及びＰＣＲに基づいた技術を用いたこれらの真菌単離物の同定におけるそれらの使用について記載する。加えて、米国特許第５，９５５，２７４号（本明細書中にそっくりそのまま参考文献として援用されている）は、フザリウム（Fusarium）菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から得られたプライマー及び、ＰＣＲに基づいた技術を用いたこれらの真菌単離物の同定におけるそれらの使用について記載する。さらには、米国特許第５，８００，９９７号（本明細書中に、そっくりそのまま参考文献として援用されている）は、セルコスポラ（Cercospora）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）、カバティエラ（Kabatiella）、及びプシニア（Puccinia）菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から得られたプライマー及びＰＣＲに基づいた技術を用いたこれらの真菌単離物の同定におけるそれらの使用について記載する。
【００２０】
リボソームの遺伝子は、そのコピー数の高さによって、分子プローブターゲットとして使用するのに好適である。成熟したｒＲＮＡ配列間の高い保存性にもかかわらず、非転写の及び転写されるスペーサー配列は通常保存性が低く、したがって最近の進化上の分岐の検出のためのターゲット配列として好適である。真菌のｒＲＮＡ遺伝子は、ユニットとして組織化され、各ユニットは、１８Ｓ（小サブユニット）、５．８Ｓ、及び２８Ｓ（大サブユニット）の３の成熟したサブユニットをコードする。これらのサブユニットは、約３００塩基対の２の内部転写スペーサー、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２、により分離される（White et al., 1990 ; In : PCR Protocols ; Eds. : Innes et al.; pages 315-322）。加えて、上記転写ユニットは、転写されないスペーサー配列（ＮＴＳｓ）によって分離される。ＩＴＳ及びＮＴＳ配列は、異なる真菌病原体の特異的な病原型の検出のために、特別に好適である。
【００２１】
本発明の上記ＤＮＡ配列は、異なる植物の病原体のリボソームＲＮＡ遺伝子領域の内部転写スペーサー配列に由来する。ある病原体の種又は属内の異なる病原型からのＩＴＳ ＤＮＡ配列は、上記種又は属の異なるメンバー間で異なる。ある病原体のＩＴＳ配列がいったん決定されると、これらの配列は他のＩＴＳ配列ととも整列化されることができる。このように、プライマーは上記ＩＴＳ配列から得られることができる。すなわち、真菌の病原型間の配列の最大の相違を含むＩＴＳ配列中の領域に基づいて、プライマーはデザインされることができる。これらの配列及びこれらの配列に基づくプライマーは、特異的な病原体を同定するために用いられることができる。
【００２２】
ＩＴＳ配列から得られた代表的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列が配列番号：１〜４及び７〜３０に開示される。上記配列は、着目の病原体のＰＣＲに基づいた同定における使用を見出す。好ましい実施態様においては、上記プライマーは、配列番号：１０〜３０のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドプライマーの対を提供する。１の実施態様において、上記対は少なくとも１の配列番号：１〜４又は７〜３０のプライマーを含むか、又はそれから成る。好ましい実施態様において、上記対は、少なくとも１の配列番号：１０〜３０のプライマーから成る。
【００２４】
また他の実施態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーの対が以下の：配列番号：３０及び配列番号：４；配列番号：２７及び配列番号：４；配列番号：１６及び配列番号：１２；配列番号：１６及び配列番号：１８；配列番号：１７及び配列番号：１２；配列番号：１及び配列番号：２７；配列番号：２４及び配列番号：２５；そして配列番号：２１及び配列番号：４から成る群から選ばれる。
【００２５】
好ましい実施態様において、上記オリゴヌクレオチドプライマーの対は、以下の：配列番号：１６及び配列番号：１２；又は配列番号：１６及び配列番号：１８；又は配列番号：１７及び配列番号：１２；又は配列番号：２４及び配列番号：２５から成る。
【００２６】
本発明の上記プライマー配列のＰＣＲ分析における使用方法は、本分野において周知である。例として、Schlesser et al. (1991) Applied and Environ. Microbiol. 57 : 553-556と同様に、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号を参照せよ。また、Nazar et al. (1991 ; Physiol. and Molec. Plant Pathol. 39 : 1-11）、これは、バーティシリウム・アルボ−アトラム（Verticillium albo-atrum）及びバーティシリウム・ダリエ（Verticillium dahliae）のＩＴＳ領域における相違を開発し、したがって上記２の種を識別するためにＰＣＲ増幅法を用いた；及びJohanson and Jeger (1993 ; Mycol. Res. 97 : 670-674）、彼らはバナナの病原体であるミコスフェレラ・フィジェンシス及びミコスフェレラ・ムシコーラを識別するための同様の技術を用いた、を参照せよ。
【００２７】
本発明の上記ターゲットＤＮＡ配列は、本分野において知られた方法によって真菌病原体からクローン化されることができる。一般的には、真菌単離物からのＤＮＡの単離方法は知られている。以下の：Raeder & Broda (1985) Letters in Applied Microbiology 2 : 17-20 ; Lee et al. (1990) Fungal Genetics Newsletter 35 : 23-24 ; 及びLee and Taylor (1990) In : PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innes et al. (Eds.) ; pages 282-287を参照せよ。
【００２８】
上記ＩＴＳ ｒＤＮＡ配列は、異なる種及び／又は菌株を識別するためにＰＣＲ中でテストするのに有用であることのできる相違を位置づけるために、各病原体群内で比較される。相違の同定により、多くのプライマーが合成され、ＰＣＲ増幅法でテストされる。ＰＣＲ増幅法試験のために使用されるテンプレートは最初は精製された病原体ＤＮＡであり、続いて感染した宿主植物組織から単離されたＤＮＡである。したがって、診断に役立つ、すなわち１の特別な病原体の種又は菌株を同定するが、上記同一の病原体の他の種又は菌株は同定しない、プライマーの対を同定することが可能である。プライマーはまた、ある特別の病気をひき起こすいくつかの真菌の病原体のいずれかを同定するプライマーと同様に、属に特異的なプライマーを開発するために、種の間で高度に保存された領域に対してデザインされる。例えば、プライマーは、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムを識別するために開発される。
【００２９】
好ましいプライマーの組み合わせは、感染した宿主組織、すなわち特異的な病原体の属、種又は菌株に感染した宿主組織、における異なる種又は菌株を識別することができる。本発明は、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムを識別する数多くのプライマーの組み合わせを提供する。本発明のプライマーは、ＩＴＳ ｒＤＮＡ領域間の配列の相違に基づいてデザインされる。配列間の最小の相違である、１塩対の相違は、弁別的なプライマーのデザインを可能にすることができる。特異的な真菌のＤＮＡ配列に対してデザインされたプライマーは、種特異的なＰＣＲフラグメントを増幅するための相違を有する領域に隣接する保存配列領域に対して作成されたプライマーと併用されることができる。一般的には、プライマーは良好な感受性を達成するために約６０〜約７０℃の間の理論的な融点を有し、組み合わせたプライマーの間の３′側の重複及び明らかな２次構造に欠ける。好ましい実施態様において、プライマーは約５〜３０ヌクレオチド塩基の長さの中のどこでもよい。
【００３０】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）病原体に感染した植物組織からのＤＮＡの単離；
（ｂ）前記ＤＮＡを、少なくとも１の配列番号：１−４及び７−３０のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅法にかけること；そして、
（ｃ）前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅法の産物を可視化することにより、前記真菌病原体を検出すること
を含む、真菌病原体の検出方法を提供する。
【００３１】
好ましい実施態様において、上記プライマーは少なくとも１の配列番号：１０−３０のプライマーである。
他の実施態様において、上記検出方法は、上記真菌病原体がコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属又はクラドスポリウム・カルポフィラムである場合に用いられる。
他の実施態様においては、本発明は、以下のステップ：
（ａ）前記真菌病原体に感染した植物組織からのＤＮＡの単離；
（ｂ）少なくとも１の、配列番号：１−４又は７−１０のプライマーを含む又はそれらから成るプライマーの対を用いるポリメラーゼ連鎖反応法において、前記ＤＮＡをテンプレートとして使用して、前記真菌病原体の内部転写スペーサー配列の一部を増幅すること；そして
（ｃ）上記内部転写スペーサー配列の増幅された部分を可視化することにより、前記真菌病原体を検出すること
を含む、真菌病原体の検出方法を提供する。
【００３２】
好ましい実施態様において、上記方法は真菌病原体を検出し、ここで前記真菌病原体はコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、又はクラドスポリウム・カルポフィラムである。
さらに他の実施態様において、上記検出方法は、プライマーの対を使用し、ここで前記プライマーの対は、以下の：配列番号：３０及び配列番号：４；配列番号：２７及び配列番号：４；配列番号：１６及び配列番号：１２；配列番号：１６及び配列番号：１８；配列番号：１７及び配列番号：１２；配列番号：１及び配列番号：２７；配列番号：２４及び配列番号：２５；そして、配列番号：２１及び配列番号：４から成る群から選ばれる。
【００３３】
好ましい実施態様において、上記オリゴヌクレオチドプライマーの対は、以下の：配列番号：１６及び配列番号：１２；又は配列番号：１６及び配列番号：１８；又は配列番号：１７及び配列番号：１２；又は配列番号：２４及び配列番号：２５から成る。
【００３４】
本発明はまた、以下のステップ：
（ａ）生物体の母集団からの複数の無作為の組織サンプルの採取；
（ｂ）上記組織サンプルへの、実施例２に記載の抽出緩衝液の添加；
（ｃ）抽出物を形成するための、上記組織サンプル及び抽出緩衝液の解離；
（ｄ）上記解離された組織及び緩衝液からの上記抽出物の除去；そして
（ｅ）上記抽出物についてのＰＣＲ分析の実施
を含む、組織から抽出されたＤＮＡについてのＰＣＲ分析の実施方法を提供する。
【００３５】
他の実施態様においては、上記方法は上記抽出物を解離された組織及び緩衝液から除去した後に、上記抽出物を煮沸するステップをさらに含む。
さらに他の実施態様においては、上記方法は、上記抽出物を希釈するステップをさらに含む。
好ましい実施態様においては、上記方法は、植物の母集団である生物体の母集団を使用する。さらに好ましい実施態様においては、上記方法は、葉、茎、根、花、未成熟の花、花柄、外皮、果実、未成熟の果実、又は木質組織から選ばれる組織サンプルを使用する。
他の好ましい実施態様において、上記方法は、以下の：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む抽出緩衝液を使用する。
【００３６】
本発明は、上記プロセスを実行するために必要な要素を含む“キット”の調製に直ちに適している。そのようなキットは、チューブ又はバイアルのような１又はそれより多いコンテナをそこへしっかりとはめ込むように区画化された容器を含むことができる。コンテナのうちの１は非標識の又は検出可能であるように標識されたＤＮＡプライマーを含むことができる。上記標識されたＤＮＡプライマーは、適宜、凍結乾燥された形態として又は適当な緩衝液中に存在することができる。１又はそれより多いコンテナが、ＰＣＲ反応において利用される１又はそれより多い酵素又は試薬を含むことができる。これらの酵素は単独で、又は混合物として、凍結乾燥された形態又は適当な緩衝液中に存在することができる。
【００３７】
結局、上記キットは、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド３リン酸、濾紙、ゲル物質、転移物質、オートラジオグラフィーの備品、等のような本発明の技術を実行するのに必要なすべての付加的要素を含むことができる。
【００３８】
本発明の１の実施態様において、真菌病原体の検出に使用される上記診断キットは、上述の本発明のプライマーを含む。
さらに他の実施態様においては、真菌病原体の検出に使用される上記診断キットは、上述の本発明のプライマーの対を含む。本発明の上記プライマー、方法及びキットは、真菌病原体に感染した植物又は植物の部分のいずれかにおける真菌病原体の存在を検出するのに有用である。特別には、本発明はコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの検出に有用である。これらの病原体に感染した植物又は植物組織又は植物の部分の例は、核果植物、ナッツ、トマト及びジャガイモのようなナス科の植物、ピーナッツ、トウモロコシ、モロコシ、マメ、パパイヤ、アボカド、リンゴ、及びサトウダイコンを含むが、これらに限定されない。核果植物の例は、モモ、ネクタリン、チェリー、アプリコット及びプラムを含むが、これらに限定されない。ナッツの例は、ピーナッツ、アーモンド、クルミ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ブラジルナッツ等を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
以下の実施例は、好適なプライマー配列の選択、選択的及び診断的な有効性についてのプライマーの試験、及び病気と真菌単離物の検出のためのそのようなプライマーの使用において用いられることのできる典型的な実験手順を示す。そのような実施例は、説明として提供されるものであり、限定のためのものではない。
【実施例】
【００４０】
ここで用いる標準の組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) 及びT.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) 及びAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) により記述される。
【００４１】
実施例１：真菌単離物及びゲノムの真菌ＤＮＡの抽出
使用した真菌単離物及びそれらの供給源については表１を参照のこと。真菌をＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天（Potato Dextrose Agar)）プレート上で成長させる。培養物を２８℃で最長１０日間インキュベートする。菌糸体を液体窒素中で粉砕し、すべてのゲノムのＤＮＡをLee及びTaylorの手順を用いて抽出する（1990 ; In: PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications ; Eds.: Innes et al.; pages 282-287）。
【００４２】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００４３】
1 American Type Culture Collection ; Rockville, MD, USA
2 Jones, A.L.; Michigan State University, East Lansing, MI, USA (Phytopathology (1999) 89 : 100-108において実証された菌株）
3 Pryor, B.; University of California, Davis, CA, USA
4 Syngenta Biotechnology Inc.; P.O. Box 12257, 3054 Cornwallis Road, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA
【００４４】
実施例２：アーモンド組織からのＤＮＡ抽出
ＤＮＡを、変更を加えたＣＴＡＢ抽出緩衝液（Wang et al., 1993,“PCR amplification from single seeds, facilitating DNA marker-assisted breeding”Nucleic Acids Res. 21 : 2527）を用いたバルクの解離方法を用いてアーモンドの葉から抽出した。上記バルクの解離方法は、農地からのいくつかの自然に感染した組織からＤＮＡを単離するために使用された。変更されたＣＴＡＢ抽出緩衝液の緩衝液成分の可能な濃度範囲は、以下の：
約１００mMのトリス、pH８．０；
０．２−２．０Ｍ ＮａＣｌ；
１−２００mM エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；
０．１−５％ｗ／ｖ ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）；
０．１−５％ｗ／ｖ ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）；そして
０．０１−２％ｗ／ｖ アスコルビン酸
の通りである。
【００４５】
本発明の他の実施態様において、上記ＤＮＡ抽出緩衝液は１００mMトリス、pH８．０を含み；又は１．４Ｍ ＮａＣｌを含み；又は２０mM ＥＤＴＡを含み；又は２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢを含み；又は２％ｗ／ｖ ＰＶＰを含み；又は０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む。
しかしながら、好ましいバルクの解離方法においては、以下の濃度：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸が使用される。
【００４６】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）生物体の母集団からの複数の無作為の組織サンプルの採取；
（ｂ）上記組織サンプルへの上述のＤＮＡ抽出緩衝液の添加；
（ｃ）抽出物を形成するための、上記組織サンプル及び抽出緩衝液の解離；そして
（ｄ）上記解離された組織及び緩衝液からの上記抽出物の除去
を含む組織からのＤＮＡ抽出物の調製方法を提供する。
他の実施態様においては、上記抽出方法は植物の母集団から組織サンプルを採取する。さらに他の実施態様においては、上記組織サンプルは、葉、茎、根、花、未成熟の花、花柄、外皮、果実、未成熟の果実、又は木質組織から選ばれる。
好ましい実施態様においては、上記抽出方法は、以下の：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む抽出緩衝液を使用する。
【００４７】
ＤＮＡをアーモンドの組織から以下のように抽出する：
バルクの解離方法：
（１）所定の果樹園内の病気の疑いのある木から採取されたアーモンドの組織から成るサンプル。
（２）サンプルを個々に異なる一対の手袋を用いて個別に取り扱う。上記サンプルの調製に使用するいずれの器具も水で、そして７０％エタノールで各サンプル間で洗浄する。
（３）以下の組織：
Ａ．花、未成熟の花、及び花柄
Ｂ．昨シーズンのアーモンド（病気で萎縮した果実）及び古いクレセント（未成熟の果実）の外皮。アーモンドの果実の外側の部分であって、一時は多肉質であったが今やナッツの殻から分離できるもののみをテストする。
Ｃ．今シーズンの新鮮なアーモンド及びクレセントの外皮
これもまた果実の外側の、多肉質の部分のみをテストする。
Ｄ．木質組織
によって、サンプルをテストのために副次サンプルに分割する。
（４）上記サンプルをＢｉｏｒｅｂａ（Reinach, Switzerland）製の丈夫なプラスチックバッグ（カタログ番号＃４９０１００）に入れる。葉を入れたプラスチックバッグから風袋（プラスチックバッグの重さ）を引いたものとして、上記植物組織の重さを計る。
（５）よく混合したＣＴＡＢ抽出緩衝液の１容量（mL）を新鮮な状態のサンプルの重さ１ｇあたりに対して以下のように：
【表５】
加える。
ＣＴＡＢ抽出緩衝液：（１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；２％ｗ／ｖ ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）；２％ ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸。組織を９０にセットしたＢｉｏｒｅｂａ Ｈｏｍｅｘ ６ ホモジナイザー（Reinach, Switzerland, カタログ番号＃４００００５）を用いて解離する。上記サンプルを真菌のＤＮＡを遊離させるために、組織ができる限り破壊されたと見えるまで粉砕する。
（６）いったん解離が完了したら、上記抽出物を抽出バッグの底に圧縮する。清潔なハサミを用いて、ピペッターを汚染せずに１０又は２５mLのホールピペットが抽出物に届くような長さのところで上記バッグを切断する。
（７）ピペットで吸い上げと吐き出しを数回行うことにより、上記抽出液をホモジナイズする。
（８）１ミリリッターの抽出液を２のエッペンドルフチューブのそれぞれに移す。これらのチューブのうちの１を直ちに、対照として凍結保存する。もう一方はさらに加工する。
（９）上記のテストのための一定分量を５分間煮沸する。チューブが、ぽんと開かないことを確実にするために遠心キャップスリーブ（a centrifuge cap sleeve）を用いる。
（１０）煮沸された抽出物を２分間氷上で放冷する。
（１１）上記抽出物を１５，０００×Ｇで５分間遠心分離する。
（１２）抽出物を希釈し、そして直接テストする（１３Ａ）、又はテストの前に核酸をそれらから精製する（１３Ｂ）。
（１３Ａ）抽出物をテストのために希釈する。抽出物の上清を以下のスキーム：
【表６】
に従って氷温の水に添加する。
（１３Ｂ）核酸を、１mLのホモジナイズされた抽出液あたり等容量の２５：２４：１のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出を行って、アーモンド抽出物から精製する。この抽出物の水相を新しい遠心チューブに移し、０．５容量の氷温のイソプロパノールを添加する。−２０℃で２０分間インキュベートした後、沈澱を１５，０００rpmで１０分間遠心沈澱する。上清を捨て、ペレットを０．７mlの７０％エタノールで洗浄する。洗浄液を捨て、上記ペレットを放置して乾燥させる。上記ペレットをＲＮａｓｅを１０mg／mLの濃度で加えたトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０mMトリス塩基、１mM ＥＤＴＡ、pH８．０）に再懸濁する。ＤＮＡ濃度は分光光度計で読み取ることができ、１００ng／μＬに、ＴＥ緩衝液を加えることによって調整する。
【００４８】
【表７】
【００４９】
実施例３：ポリメラーゼ連鎖反応増幅法
ポリメラーゼ連鎖反応を、２５又は５０μＬの反応液中に５０mM ＫＣｌ、２．５mM ＭｇＣｌ2、１０mMトリス−ＨＣｌ、pH８．３、２００μＭのｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰをそれぞれ含み、５０μＭの各プライマー、０．２５Ｕ／μＬのＴａｑポリメラーゼ及び０．２ng／μＬのゲノムのＤＮＡを含むものを用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Foster City, CA ; part no. N808-0009）からのＧｅｎｅ Ａｍｐ ｋｉｔにより実施する。反応を９４℃で１５秒、５０℃−７０℃で１５秒、そして７２℃で４５秒を３０−４０サイクル、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ９６００又は９７００サーマルサイクラー中で行う。生成物を、１０μｌの各ＰＣＲサンプルを１．０％アガロースゲルに負荷し、電気泳動することにより、分析する。
【００５０】
実施例４：オリゴヌクレオチドの合成及び精製
オリゴヌクレオチド（プライマー）は、例えば、Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) 又はMidland Certified Reagent Company (Midland, Texas) のいずれかにより、合成する。
【００５１】
実施例：５ ｒＤＮＡのＩＴＳ領域のクローニング及び配列決定
ＩＴＳ領域の配列を実施例３に記載されたように、保存されたプライマーＩＴＳ１及びＩＴＳ４（配列番号：１及び４）を用いてＰＣＲ−増幅する。産物をＴＯＰＯ−ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Invitrogen, Carlsbad, CA ; part no. K4550-40）を使用して製造者の指示に従い、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＡ−クローニングベクター中へクローン化する。ＩＴＳフラグメントの挿入を含むクローンをＴＡクローニングベクターのＦＯＲＷＡＲＤ（５′−gtaaaacgacggccagt−３′；配列番号：５）及びＲＥＶＥＲＳＥ（５′−caggaaacagctatgac−３′；配列番号：６）プライマーを用いて配列決定する。配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（商標）ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California）上で実施する。
【００５２】
実施例６：種特異的ＰＣＲプライマーのデザイン
実施例６を、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムに特異的なプライマーのデザインを詳細に記述する３の小セクションに分ける。３のターゲット種のためのプライマーのデザインにおいて、いくつかの共通のステップが含まれる。各アッセイのデザインにおいて、内部転写スペーサー領域のＤＮＡ配列は、National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) のGenbankデータベースから、又は実施例５中の手順により実施例１の単離物からＰＣＲ−増幅され配列決定されたＤＮＡから得る。これらの配列について複数の配列アラインメントを作成する。上記アラインメントをターゲット配列間の相違及び他の真菌のＤＮＡの配列間の相違について分析する。上記相違は、ＰＣＲ反応においてターゲット配列を特異的に増幅するプライマーの開発を可能とする。オリゴヌクレオチドプライマーを、分析された種の間における最大の配列の相違を有するターゲット領域に対してデザインする。これらのプライマーは実施例４に従って合成する。加えて、発表されたリボソームの遺伝子に特異的なプライマー、ＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＩＴＳ３及びＩＴＳ４（White et al., 1990 ; In : PCR Protocols ; Eds.: Innes et al. pages 315-322）をＩＴＳ領域に特異的なプライマーと併用してテストするために合成する。真菌の保存されたＩＴＳ領域のプライマーを表３に示す。
【００５３】
【表８】
【００５４】
実施例６Ａ：コレトトリカム・アクタツムに特異的なＰＣＲプライマーのデザイン
プライマーをコレトトリカム・アクタツムを特異的に検出するためにデザインする。Ｃ．アクタツムのための内部転写スペーサー領域Ｉ ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースから得る。それらの配列は、カタログ番号Ｚ３２９０７、Ｚ３２９１３、Ｚ３２９１５、Ｚ３２９１６、Ｚ３２９１７、Ｚ３２９１８、Ｚ３２９２１、Ｚ３２９２２、Ｚ３２９２４、Ｚ３２９２５、Ｚ３２９２６、及びＺ３２９２８を含む。複数の配列アラインメントを、他のアーモンドの病原体のためのＩＴＳ Ｉ領域の配列（コレトトリカム・ココデス（Colletotrichum coccodes）のためのＺ３２９３０；Ｚ３２９３８、Ｃ．デマティウム（C. dematium）；Ｚ３２９４３、Ｃ．フラガリエ（C. fragariae）；Ｚ３２９６１、Ｃ．グレオスポリオイデス（C. gloeosporioides）；Ｚ３２９８１、Ｃ．グラミニコーラ（C. graminicola）；Ｚ３２９８４、Ｃ．リニコーラ（C. linicola）；Ｚ３３０００、Ｃ．トリケラム（C. trichellum)）とともにこれらの配列について作成する。上記アラインメントを、上記ターゲット配列と他の真菌のＤＮＡのための配列の間の相違について分析する。上記相違は、ＰＣＲ反応において用いられた場合に特異的にＣ．アクタツムのＩＴＳ領域ＤＮＡを増幅するプライマーの開発を許容する。オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６７７、ＪＢ６７７．１、ＪＢ６７７．２、ＪＢ６７７．３、及びＪＢ６７８（それぞれ配列番号：１０、２８、２９、３０、及び１１）は、Ｃ．アクタツムのＩＴＳ領域１のＤＮＡをターゲットとするようにデザインされる。プライマーＪＢ６７７、ＪＢ６７７．１、ＪＢ６７７．２及びＪＢ６７７．３は、ＩＴＳ１の同一の領域をターゲットとし、ターゲットに特異的な配列を含むプライマーへの塩基の付加又は除去が、上記同一のターゲットの検出において使用されるオリゴヌクレオチドの産生数をどのように多様に変化させられるか、を示す。
【００５５】
文献から得られた類似のアラインメントにおいて（Bailey et al., Phytopathology 86 : 1076-1083）、いくつかのコレトトリカム種のＩＴＳ領域２のＤＮＡ配列を比較する。この報告中のアラインメントは、Ｃ．アクタツムＩＴＳ領域２のプライマーをザデインする目的で比較される種の間の相違を見出すために使用される。オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６７９（配列番号：１２）をＣ．アクタツムのＩＴＳ領域２のＤＮＡをターゲットとするようにデザインする。上記Ｃ．アクタツムに特異的なプライマーを表４に示す。これらのプライマーは、Ｃ．アクタツムＤＮＡをターゲットとするために相互に組み合わせて、表３の保存されたプライマーの１と組み合わせて、又は文献中のＣ．アクタツム特異的なプライマーの１と組み合わせて用いることができる（Adaskaveg and Hartin, Phytopathology 87 : 979-987によるプライマー：ＣａＩＮＴ−１，５′−GGCGCCGGCCCCCACCACGGGGA-３′(配列番号：７）及びＣａＩＮＴ−２，５′−GGCGCCGGCCCCGTCACGGGGG−３′（配列番号：８）、又はSreenivasaprasad et al. Plant Pathology (1996) 45, 650-655によるプライマーＣａＩｎｔ ２，５′−GGGGAAGCCTCTCGCGG−３′（配列番号：９)）。
【００５６】
【表９】
【００５７】
実施例６Ｂ：アルテナリア属に特異的なＰＣＲプライマーのデザイン
プライマーを、アルテナリア属を特異的に検出するためにデザインする。Ａ．アルテナータのためのＩＴＳ領域のＤＮＡ配列を、アーモンドサンプル２０００＃４７から得られたプレート単離物（単離物のさらなる情報は表１を参照のこと。）と同様に、４のＡＴＣＣ単離物について実施例５で記載された通りに得た。加えて、Ａ．アルテナータＩＴＳ領域のためのＧｅｎＢａｎｋ配列を入手した（カタログ番号＃ＡＦ２２９４６１、ＡＦ２２９４６０、ＡＦ２２９４５９、ＡＦ２１８７９１、ＡＪ２７６０５９、ＡＪ２７６０５５、及びＡＦ０７１３４６）。これらの配列を、ＳｅｑＭａｎ II ｖｅｒ ３．６．０（DNA Star, Madison, WI, USA）において整列化した。これらの配列のコンセンサス配列を生成し、“アルテナリアＩＴＳ配列”とラベルした。
【００５８】
複数の配列アラインメントを、他のアーモンド病原体のためのＩＴＳ領域の配列と一緒にこの配列について作成する。これらは、コレトトリカム・グレオスポリオイデス（Colletotrichum gloeosporioides）（カタログ番号＃ＡＦ０９０８５５）、Ｃ．アクタツム（ＡＦ０９０８５３）、Ｃ．フラガリエ（C. fragariae）（ＡＦ０９０８５４）、ベンチュリア・カルポフィラ（Venturia carpophila）（合成のフシクラジウム・カルポフィラム（Fusicladium carpophilum）、クラドスポリウム・カルポフィラム）（ＡＦ０６５８４９）、モニリニア・フラクチゲナ（Monilinia fructigena）（Ｚ７３７８１）、Ｍ．ラクサ（M. laxa）（Ｚ７３７８６）、スクレロチニア・スクレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum）（Ｚ７３７９９）、及びボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）（Ｚ７３７６５）についてＧｅｎＢａｎｋから入手した配列を含む。実施例５と同様にＡＴＣＣフシクラジウム・カルポフィラム単離物５２９３５のために生成されたＩＴＳ領域の配列もまた上記複数の配列アラインメントに含まれる。
【００５９】
Ａ．アルテナータのコンセンサス配列ターゲット及び他の真菌の配列間の相違について、上記アラインメントを分析する。見出された相違は、ＰＣＲ反応において用いられた場合、アルテナリア属のＩＴＳ領域のＤＮＡを特異的に増幅するプライマーの開発に備えるものである。オリゴヌクレオチドプライマーＡｌａｌ−１、Ａｌａｌ−２、Ａｌａｌ−３、Ａｌａｌ−４、Ａｌａｌ−５、及びＡｌａｌ−６（配列番号：１３−１８）を、アルテナリア属のＩＴＳ領域のＤＮＡをターゲットとするようにデザインする（表５）。
【００６０】
加えて、これらのプライマーは、文献中の他のＩＴＳ由来のアルテナリア属プライマー（プライマー、ａｌｔ １，５′−ATTGCAATCAGCGTCAGTAAC−３′及びａｌｔ ２，５′−CAAGCAAAGCTTGAGGGTACA−３′ Zur et al. 1999. J. Food Production 62 (10) p 1191-1197）（それぞれ配列番号：１９及び２０）と同様に表３の保存されたＩＴＳ領域プライマーと共に用いることができる。
【００６１】
【表１０】
【００６２】
実施例６Ｃ：クラドスポリウム・カルポフィラムに特異的なＰＣＲプライマーのデザイン
プライマーを、クラドスポリウム・カルポフィラムを特異的に検出するためにデザインする。Ｃ．カルポフィラムのためのＩＴＳ領域のＤＮＡ配列を、６の単離物（ＢＳ−１、ＢＳ−２、ＢＳ−３、ＢＳ−４、ＢＳ−６、及びＡＴＣＣ単離物５２９３５）について、実施例５で記載された通りに得た。Ｃ．カルポフィラムＩＴＳ領域のＤＮＡのための１の追加の配列をＧｅｎＢａｎｋから入手した（カタログ番号＃ＡＦ０６５４８９）。これらの配列を、Ｓｅｑ Ｍａｎ II ｖｅｒ ３．６．０（DNA Star, Madison, WI, USA）において整列化した。これらの配列のコンセンサス配列を生成し、“Ｖカルポフィラ コンセンサス”とラベルした。
【００６３】
複数の配列アラインメントを、他のアーモンド病原体のためのＩＴＳ領域の配列と一緒にこの配列について作成する。これらは、コレトトリカム・グレオスポリオイデス（カタログ番号＃ＡＦ０９０８５５）、Ｃ．アクタツム（ＡＦ０９０８５３）、Ｃ．フラガリエ（ＡＦ０９０８５４）、モニリニア・フラクチゲナ（Ｚ７３７８１）、Ｍ．ラクサ（Ｚ７３７８６）、スクレロチニア・スクレロチオラム（Ｚ７３７９９）、及びボツリチス・シネレア（Ｚ７３７６５）についてＧｅｎＢａｎｋから入手した配列を含む。複数のアルテナリア・アルテナータの配列について実施例６Ｂで生成したコンセンサス配列もまた、上記複数の配列アラインメントに含まれる。
【００６４】
Ｃ．カルポフィラムのコンセンサス配列ターゲット及び他の真菌の配列間の相違について、上記アラインメントを分析する。見出された相違は、ＰＣＲ反応において用いられた場合、Ｃ．カルポフィラムのＩＴＳ領域のＤＮＡを特異的に増幅するプライマーの開発に備えるものである。オリゴヌクレオチドプライマー、Ｖｃａｒｐ１、Ｖｃａｒｐ２、Ｖｃａｒｐ３、Ｖｃａｒｐ４、Ｖｃａｒｐ５、Ｖｃａｒｐ６、及びＶｃａｒｐ７（配列番号：２１−２７）を、Ｃ．カルポフィラムのＩＴＳ領域のＤＮＡをターゲットとするようにデザインする（表６）。これらのプライマーは、表３中の保存されたＩＴＳ領域プライマーと共に用いることができる。
【００６５】
【表１１】
【００６６】
実施例７Ａ：精製された真菌のゲノムＤＮＡに対するプライマー特異性の判定
単一の特異的なフラグメントを増幅する試みにおいて、異なるプライマーの組み合わせを用いて実施例３に従ってＰＣＲを実施する（表７）。着目の各真菌の種の核ｒＤＮＡのＩＴＳ領域からデザインされたプライマーにより、特異的なＰＣＲ増幅法の産物が作成される。
最初の特異性についてのスクリーニングにおいて、ＰＣＲ反応混合物を表７中の各プライマー対について実施例３に従って作成する。これらについてバックグラウンドの増幅のテストのために、ネガティブコントロール（ＤＮＡを添加しない）、正常なアーモンド組織コントロール（実施例２に従って調製する）を対照として、及び実施例１に記載した通りに調製した、表１に列挙された既知の各種の真菌ＤＮＡの１０mgを対照として実験を行う。
【００６７】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【００６８】
エチジウム ブロマイドで染色したゲル上で可視化した場合、いくつかのプライマーの対は満足のいく結果：ターゲット種の複数の単離物からのターゲットＤＮＡの良好な増幅と特異的及び非特異的な反応産物の両方を生成しない他のすべての反応（ネガティブコントロール、アーモンドバックグラウンド、及び他の真菌ＤＮＡ）を示す。いくつかは、非特異的な増幅、ターゲットＤＮＡが増幅しない、及び上記ターゲット以外の真菌の種に由来するＤＮＡの増幅を含む不満足な結果を示す。特異的なターゲットについての交差増幅のない良好な増幅を示すプライマーの対を表８に要約する。
【００６９】
【表１７】
【００７０】
実施例７Ｂ：アーモンド組織ＤＮＡ抽出物のパネルに対するアーモンド病原体のＰＣＲアッセイのバリデーション
所定のターゲットの最良の増幅を示すプライマーの対（Ｃ．アクタツムについてＪＢ６７７．３及びＩＴＳ４、アルテナリア属についてＡｌａｌ−４及びＡｌａｌ−２、並びにＣ．カルポフィラムについてＩＴＳ１及びＶｃａｒｐ７）のそれぞれについて、表２に列挙した組織から実施例２の通りに調製したアーモンド組織抽出物のパネルに対してＰＣＲ反応を行う。この実験において、“１９９９”と命名されたサンプルからの抽出物を希釈し、直接テストした。核酸は“２０００”と命名されたサンプルの抽出液から精製し、その後１反応あたり１００ngの濃度でテストする。結果は、陽性とみなされる可視的な産物、及びあっても記録された産物が非特異的である場合に陽性（＋）又は陰性（−）のいずれかに評価する。これらのテストの結果を表９に示す。
【００７１】
【表１８】
【００７２】
テストした１３の単離物について上記アッセイは、アーモンド組織中のコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムを検出し、識別した。この実験は、病気の存在を確認するためのアーモンド組織抽出液の直接的な特徴づけにおけるこれらのプライマーの有用性を実証する。
【００７３】
実施例８：アーモンド組織から採取した未知の真菌単離物のパネルに対するアーモンド病原体のＰＣＲアッセイのバリデーション
アーモンドサンプルから採取した未知の真菌単離物（表１、下部）から、実施例１中の方法によりＤＮＡを抽出する。これらの精製ＤＮＡ抽出物を、表８中の各プライマーの組み合わせについて、実施例３に従って作製したＰＣＲ反応混合物を用いてテストした。表１０はアーモンド組織から成長した精製真菌単離物の特徴づけにおけるこれらのアッセイの有用性を示す。
【００７４】
【表１９】
【００７５】
ここで引用されるすべての文献は、そっくりそのまま参考文献として援用されている。
【００７６】
付録Ｉ：
Ｃ．アクタツムプライマーの開発において、使用したＧｅｎＢａｎｋの配列
Ｚ３２９０７
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（４８８５）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483613|emb|Z32907.1|CAITS1A[483613]
Ｚ３２９１３
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（１７９）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483614|emb|Z32913.1|CAITS1B[483614]
Ｚ３２９１５
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（３９７）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483615|emb|Z32915.1|CAITS1D[483615]
Ｚ３２９１６
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（４９３／ＢＯＸ８８）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483616|emb|Z32916.1|CAITS1E[483616]
Ｚ３２９１７
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（４９５／１７７２９）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483617|emb|Z32917.1|CAITS1F[483617]
Ｚ３２９１８
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（５３４／９０．３６８）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483618|emb|Z32918.1|CAITS1G[483618]
Ｚ３２９２１
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（５４７／９０．４１０）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483621|emb|Z32921.1|CAITS1J[483621]
Ｚ３２９２２
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（５４９）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483622|emb|Z32922.1|CAITS1K[483622]
Ｚ３２９２４
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（６０２／９１．３２６）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483624|emb|Z32924.1|CAITS1M[483624]
Ｚ３２９２５
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（６１５／９１．４１４）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483625|emb|Z32925.1|CAITS1N[483625]
Ｚ３２９２６
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（６１６／９１．４１４）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483626|emb|Z32926.1|CAITS1O[483626]
Ｚ３２９２８
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（ＮＩ９０）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483627|emb|Z32928.1|CAITS1Q[483627]
Ｚ３２９３０
ＩＴＳ１のためのＣ．ココデス（５２７．７７）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483630|emb|Z32930.1|CCITS1B[483630]
Ｚ３２９３８
ＩＴＳ１のためのＣ．デマティウム（２８８８１０）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483639|emb|Z32938.1|CDITS1A[483639]
Ｚ３２９４３
ＩＴＳ１のためのＣ．フラガリエ（６３−１）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483643|emb|Z32943.1|CFITS1B[483643]
Ｚ３２９６１
ＩＴＳ１のためのＣ．グレオスポリオイデス（５６１）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483673|emb|Z32961.1|CGITS1Q[483673]
Ｚ３２９８１
ＩＴＳ１のためのＣ．グラミニコーラ（８４０３２）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483657|emb|Z32981.1|CGITS1AM[483657]
Ｚ３２９８４
ＩＴＳ１のためのＣ．リニコーラ（１０３８４４）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483685|emb|Z32984.1|CLITS1A[483685]
Ｚ３３０００
ＩＴＳ１のためのＣ．トリケラム（１８０．５２）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483713|emb|Z33000.1|CTITS1A[483713]
【００７７】
付録II：
アルテナリア属プライマーの開発において使用したＧｅｎＢａｎｋの配列
ＡＦ２２９４６１
アルテナリア・アルテナータＢＭＰ２１−４１−１０菌株の内部転写スペーサー１、部分配列；５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列；及び内部転写スペーサー２、部分配列
gi|7546946|gb|AF229461.1|AF229461[7546946]
ＡＦ２２９４６０
アルテナリア・アルテナータＢＭＰ２１−４１−０７菌株の内部転写スペーサー１、部分配列；５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列；及び内部転写スペーサー２、部分配列
gi|7546945|gb|AF229460.1|AF229460[7546945]
ＡＦ２２９４５９
アルテナリア・アルテナータＡＴＣＣ２８３２９菌株の内部転写スペーサー１、部分配列；５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列；及び内部転写スペーサー２、部分配列
gi|7546944|gb|AF229459.1|AF229459[7546944]
ＡＦ２１８７９１
アルテナリア・アルテナータ内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列；並びに１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列
gi|6715474|gb|AF218791.1|AF218791[6715474]
ＡＪ２７６０５９
アルテナリア・アルテナータ５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子並びにＩＴＳ１及び２、ＭＺ２０菌株
gi|7208649|emb|AJ276059.1|AAL276059[7208649]
ＡＪ２７６０５５
アルテナリア・アルテナータ５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子並びにＩＴＳ１及び２、ＭＺ７菌株
gi|7208647|emb|AJ276055.1|AAL276055[7208647]
ＡＦ０７１３４６
アルテナリア・アルテナータ１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列；内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|5031121|gb|AF071346.1|AF071346[5031121]
ＡＦ０９０８５５
コレトトリカム・グレオスポリオイデス内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|6650331|gb|AF090855.1|AF090855[6650331]
ＡＦ０６５８４９
ベンチュリア・カルポフィラ内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列
gi|4185734|gb|AF065849.1|AF065849[4185734]
ＡＦ０９０８５4
コレトトリカム・フラガリエ内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|6650330|gb|AF090854.1|AF090854[6650330]
ＡＦ０９０８５３
コレトトリカム・アクタツム１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列；内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|6650329|gb|AF090853.1|AF090853[6650329]
Ｚ７３７８１
Ｍ．フラクチゲナの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125846|emb|Z7378.1|MFRUCITSE[2125846]
Ｚ７３７９９
Ｓ．スクレロチオラムの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125909|emb|Z73799.1|SSCLEITSA[2125909]
Ｚ７３７８６
Ｍ．ラクサの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125857|emb|Z73786.1|MLAXAITSC[2125857]
Ｚ７３７６５
Ｂ．シネレアの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125789|emb|Z73765.1|BCINEITSB[2125789]
【０００１】
本発明は、核果植物及びナッツ、特別にはアーモンドの病原体、コレトトリカム・アクタツム（Colletotrichum acutatum）、アルテナリア属（Alternaria spp.）及びクラドスポリウム・カルポフィラム（Cladosporium carpophilum）の検出のためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおけるプライマーの使用に関する。これらのプライマーの使用は真菌病原体の特異的な単離物の検出及び植物の母集団における病気の発生をモニターすることを可能にする。本発明はまた、新規な抽出緩衝溶液、組織からのＤＮＡの抽出方法、及び組織から抽出されたＤＮＡについてのＰＣＲ分析の実施方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の病気は、農民には経済的な損失、そして世界の多くの場所では地域の人口に対する栄養の供給の不足の両方の結果に帰する、深刻な収獲の損失を年々ひき起こす。広範な殺菌剤の使用は植物の病原体の攻撃に対してかなりの安全性を与えた。しかしながら、殺菌剤への１０億ドル相当の支出にもかかわらず、世界的な収獲の損失は、１９８１年における収獲値の約１０％に及んだ（James, 1981 ; Seed Sci. & Technol. 9 : 675-685）。
【０００３】
病気の破壊的プロセスの重症度は、病原体の病原力及び宿主の応答に依存する。ほとんどの植物育種プログラムの目的の１つは、宿主植物の病気に対する耐性を高めることである。典型的には、病原体の異なる種は同一の作物種の異なる変種と特異的に相互作用し、そして多くの宿主の耐性源が特異的な病原体の種に対してのみ防御するものである。さらには、いくつかの病原体種は病気の症状の早期の徴候を示すが、上記作物には、わずかな損傷しかひき起こさない。Jones及びClifford（1983 ; Cereal Diseases, John Wiley）は、病原体の有毒な形態が、宿主である品種への耐性の導入に応じて病原体の母集団中に現れると予想されること、及びしたがって病原体の母集団をモニターすることが必要であることを報告する。加えて、特別の殺菌剤に対して耐性のある真菌の菌株の発生に関するいくつかの実証されたケースがある。１９８１年には早くも、FletcherとWolfe（1981；Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf.）が春オオムギのウドンコ病にかかった母集団の２４％及び冬オオムギのウドンコ病にかかった母集団の５３％が殺菌剤トリアジメノールに対しての反応性においてかなりの多様性を示し、そして、最も疑わしい変種が存在しても、より可能性の低い型の発生率が最も高いというように、これらの母集団の配分は変種間において多様である、との議論をした。殺菌剤に対する真菌の感受性における同様の多様性が小麦ウドンコ病（これもまたトリアジメノールに対して）、ボツリチス（Botrytis）（ベノミルに対して）、ピレノフォーラ（Pyrenophora）（有機水銀に対して）、シュードセルコスポレーラ（Pseudocercosporella）（ＭＢＣ−タイプの殺菌剤に対して）及びトリアゾールに対するミコスフェレラ・フィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）その他いくつかの例について実証されてきた（Jones and Clifford ; Cereal Diseases, John Wiley, 1983）。
【０００４】
商業的なアーモンドの栽培者は多様な方法で彼らの作物に感染する多数の真菌に直面している。これらの病原体の木の成長に対する影響は多くの因子に依存し、原因は、病気にかかった木が表すことのできる症状からは直ちに明らかでない。維管束性の病原体は侵入し、木部の管をつまらせ、それによって根からの水及び栄養分の上方への動きを停止させる（Integrated Pest Management for Almonds, U. California Division of Agriculture and Natural resources publication 3308 (1985)）。維管束組織が閉鎖すると、症状はしばしば部分的又は完全な、栄養分又は水からの遮断を反映する。したがって、葉及び枝の組織に感染した病原体によりひき起こされた立枯れ病と同様に、アーモンドの冠部の症状及び根腐れは互いに非常に類似して現れることができ；そして栄養分及び水の利用可能性そしてそれらの取り込みに影響する因子のような環境条件の結果に類似している。
【０００５】
いくつかの病原体は枝、葉、及び果実に限定される感染をひき起こす。アーモンドに病気を起こす真菌及び細菌のいくつかが秋の間に果樹園の果樹に感染し、宿主組織中で越冬することが発見された。春の間、それらは局在化された病変部、又はより大きな感染であって、近時の雨又は潅水のような環境条件が病原体の成長を促進した後に顕在化するものを生じさせる。
【０００６】
アーモンド果樹園の管理に経済的な問題をひき起こすものと同一の病原体は、他の作物にも影響を及ぼす。例えば、クラドスポリウム・カルポフィラムは、核果植物全体にわたる宿主の範囲を有する。例えば、それがアーモンドの収獲物に生じさせる腐敗病に加えて、Ｃ．カルポフィラムはモモ、ネクタリン、アプリコット、プラム及びチェリーにも腐敗病を生じさせる（Compendium of Stone Fruit Diseases, Ogawa, J.M.; Zehr, E.I.; Bird, G.W.; Ritchie, D.F.; Uriu, K.; Uyemoto, J.K. eds., p.11 (1995 APS Press, St. Paul, MN)）。
【０００７】
アルテナリア属は、多くの経済的に重要な作物に感染をひき起こすことが実証されている。今日まで、それはエンドウにアルテナリア胴枯れ病をひき起こすことが報告され、そしてアルテナリア斑点病がピーナッツ、アーモンド、トウモロコシ、綿、及び世界のすべての大豆栽培地域において以下の報告：（Compendium of Soybean Diseases, 4th Ed. Hartman, G.L.; Sinclair, J.B.; Rupe, J.C. eds., pp. 12-13 (1999, APS Press, St. Paul, MN)）; (Compendium of Cotton Diseases, Watkins, G.M. ed., p. 28 (1981, APS Press, St. Paul MN)) ; (Compendium of Pea Diseases, Hagedorn, D.J., ed., p. 15 (1984, APS Press, St. Paul MN)) ; (Compendium of Peanut Diseases, Porter, D.M.; Smith, D.H.; Rodriguez-Kabana, R. eds. Pp. 13 (1984, APS Press, St. Paul, MN)) ; (Compendium of Stone Fruit Diseases, Ogawa, J.M.; Zehr, E.I.; Bird, G.W.; Ritchie, D.F.; Uriu, K.; Uyemoto, J.K. eds., p. 11 (1995 APS Press, St. Paul, MN)) ; 及び（Compendium of Corn Diseases, 3rd Ed. White, D.G., ed., p. 25 (1999, APS Press, St. Paul, MN)）がされている。アルテナリア属は、ブラジル、カナダ、コスタリカ、コロンビア、チリ、東アフリカ、イギリス、メキシコ、米国、及びベネズエラにおける広汎な葉及びさやの斑点病の原因である（Compendium of Bean Diseases, Hall, R. ed., p. 14 (1991, APS Press, St. Paul, MN)）。アルテナリア属は、また、ジャガイモ及び他のナス科の作物の葉に病変を形成し；（Compendium of Potato Diseases, Hooker, W.J. ed., p. 44 (1981, APS Press, St. Paul, MN)）、そして２次的感染としてサトウダイコンの葉に現れる（Compendium of Beet Diseases and Insects, Whitney, E.D., Duffus, J.E. eds., p. 11 (1991, APS Press, St. Paul, MN)）。それは、モロコシ属に穀粒のカビを生じさせ（Compendium of Sorghum Diseases, Frederiksen, R.A. ed., p. 36 (1986, APS Press, St. Paul, MN)）、トマトのクロカビ病の１の原因である（Compendium of Tomato Diseases, Jones, J.B.; Jones, J.P.; Stall, R.E.; Zitter, T.A., eds., p. 46 (1991, APS Press, St. Paul, MN)）。アルテナリア属は、また、乾燥地域に位置する果樹園における、及びマンゴーの主要な病気である、果実の斑点をパパイヤに生じさせる（Compendium of Tropial Fruit Diseases, Ploetz, R.C.; Zentmyer, G.A.; Nishijima, W.T.; Rohrbach, K.G.; Ohr, H.D. eds., pp. 34 and 58 (1994, APS Press, St. Paul, MN)）。
【０００８】
コレトトリカム・アクタツムは、アボカド、イチゴ、アーモンド、リンゴ及びモモを含む多くの果実作物に感染することが報告されている。Ｃ．アクタツムは、アボカド及びマンゴーに収獲後の果実の病気を生じさせる。Ｃ．アクタツムはまた、開花後の落果及び柑橘作物の主要なライム炭疽病の両方をひき起こすことでも知られている（Freeman, S. et al., 1998, Plant Disease Vol. 82, No.6, pp. 596-605を参照のこと）。
【０００９】
上記の点から見て、感染の過程の初期に病原体となる真菌の特異的な種を同定しうる技術の開発に対する真の必要性がある。病気の症状が作物において明白になる前に病原体の特異的な種を同定することにより、農学者は病原体が同定された作物種における病原体のさらなる進展のありそうな影響を評価し、そのような適用が必要とみなされれば適切な殺菌剤を選択することができる。
【００１０】
発明の要約
本発明は、植物の病原体となる真菌の異なる病原型の同定方法へ導かれる。本発明は、異なる真菌の病原型の間で多様性を示す内部転写スペーサー（ＩＴＳ）ＤＮＡを提供する。そのようなＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた診断アッセイにおける使用のためのプライマーを得るのに使用されることができるため、本発明の方法において有用である。これらのプライマーは、特定の真菌の病原型によりＤＮＡテンプレートが提供されるＰＣＲ反応における特有のフラグメントを産生し、したがって病気の症状の発生前に宿主である植物中における特異的な病原型の存否を判定するのに用いられることができる。
【００１１】
好ましい実施態様においては、本発明は、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの検出のためのＩＴＳ由来の診断用プライマーを提供する。
【００１２】
本発明は、特異的な作物種における潜在的な損傷／病原体菌株の関係を評価し、利用可能な殺菌剤の多様な備蓄を賢明に利用する可能性を提供する。さらには、本発明は、拡張された地理的エリアにわたる特異的な病原体種の発生及び広がりについての詳細な情報を提供するのに用いられることができる。本発明は、長い潜伏相を伴う病気に特に好適な検出方法を提供する。
【００１３】
本発明の実施に有用なキットもまた提供される。上記キットは、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの同定における特別な使用を見出す。
【００１４】
本発明はまた、新規なＤＮＡ抽出緩衝液を用いた組織からのＤＮＡ抽出物の調製方法を提供する。本発明はさらに、上記新規なＤＮＡ抽出緩衝液を用いて組織から抽出されたＤＮＡについてのＰＣＲ分析の実施方法を準備する。
【００１５】
配列リスト中の配列の簡単な説明
配列番号：１ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ１
配列番号：２ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ２
配列番号：３ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ３
配列番号：４ オリゴヌクレオチドプライマー ＩＴＳ４
配列番号：５ オリゴヌクレオチドプライマー ＦＯＲＷＡＲＤ
配列番号：６ オリゴヌクレオチドプライマー ＲＥＶＥＲＳＥ
配列番号：７ オリゴヌクレオチドプライマー ＣａＩＮＴ−１
配列番号：８ オリゴヌクレオチドプライマー ＣａＩＮＴ−２
配列番号：９ オリゴヌクレオチドプライマー ＣａＩｎｔ２
配列番号：１０ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７
【００１６】
配列番号：１１ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７８
配列番号：１２ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７９
配列番号：１３ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−１
配列番号：１４ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−２
配列番号：１５ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−３
配列番号：１６ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−４
配列番号：１７ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−５
配列番号：１８ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌａｌ−６
配列番号：１９ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌｔ１
配列番号：２０ オリゴヌクレオチドプライマー Ａｌｔ２
【００１７】
配列番号：２１ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ１
配列番号：２２ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ２
配列番号：２３ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ３
配列番号：２４ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ４
配列番号：２５ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ５
配列番号：２６ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ６
配列番号：２７ オリゴヌクレオチドプライマー Ｖｃａｒｐ７
配列番号：２８ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７．１
配列番号：２９ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７．２
配列番号：３０ オリゴヌクレオチドプライマー ＪＢ６７７．３
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、植物の病原体となる真菌の異なる病原型を同定するのに有用な独特のＤＮＡ配列を提供する。特別には、上記ＤＮＡ配列は、真菌の病原型の同定のためのＰＣＲに基づいた分析においてプライマーとして用いられることができる。本発明の上記ＤＮＡ配列は、特別の真菌病原体のリボソームＲＮＡ領域の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列を、上記特別の真菌病原体を同定することのできるこれらの領域から得られたプライマー同様に含む。種又は属中の異なるメンバー間で異なる、１の病原体の種又は属中の異なる病原型からのＩＴＳ ＤＮＡ配列は、それらの特異的なメンバーを同定するのに用いられることができる。
【００１９】
生物医学研究者は、感染した動物組織において病原体を検出するのに、しばらくの間ＰＣＲに基づいた技術を用い、そしてほどほどの成功を収めてきた。しかしながら、つい最近になってこの技術は植物の病原体を検出するために適用された。感染した小麦におけるガウマノミセス・グラミニス（Gaumannomyces graminis）の存在が、上記病原体のミトコンドリアゲノムに特異的な配列のＰＣＲを用いて検出され（Schlesser et al., 1991 ; Applied and Environ. Microbiol. 57 : 553-556）、そして、ランダムに増幅された多型性ＤＮＡ（すなわち、ＲＡＰＤ）マーカーは、針葉樹のスクレロデリス枝枯れ病の外来の媒体である、グレムニエラ・アビエティナ（Gremmeniella abietina）の数多くの種を識別することができた。米国特許第５，５８５，２３８号（本明細書中にそっくりそのまま参考文献として援用されている）は、セプトリア（Septoria）、シュードセルコスポレラ（Pseudocercosporella）、及びマイコスフェレラ（Mycosphaerella）の菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から得られたプライマー及びＰＣＲに基づいた技術を用いたこれらの真菌単離物の同定におけるそれらの使用について記載する。加えて、米国特許第５，９５５，２７４号（本明細書中にそっくりそのまま参考文献として援用されている）は、フザリウム（Fusarium）菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から得られたプライマー及び、ＰＣＲに基づいた技術を用いたこれらの真菌単離物の同定におけるそれらの使用について記載する。さらには、米国特許第５，８００，９９７号（本明細書中に、そっくりそのまま参考文献として援用されている）は、セルコスポラ（Cercospora）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）、カバティエラ（Kabatiella）、及びプシニア（Puccinia）菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から得られたプライマー及びＰＣＲに基づいた技術を用いたこれらの真菌単離物の同定におけるそれらの使用について記載する。
【００２０】
リボソームの遺伝子は、そのコピー数の高さによって、分子プローブターゲットとして使用するのに好適である。成熟したｒＲＮＡ配列間の高い保存性にもかかわらず、非転写の及び転写されるスペーサー配列は通常保存性が低く、したがって最近の進化上の分岐の検出のためのターゲット配列として好適である。真菌のｒＲＮＡ遺伝子は、ユニットとして組織化され、各ユニットは、１８Ｓ（小サブユニット）、５．８Ｓ、及び２８Ｓ（大サブユニット）の３の成熟したサブユニットをコードする。これらのサブユニットは、約３００塩基対の２の内部転写スペーサー、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２、により分離される（White et al., 1990 ; In : PCR Protocols ; Eds. : Innes et al.; pages 315-322）。加えて、上記転写ユニットは、転写されないスペーサー配列（ＮＴＳｓ）によって分離される。ＩＴＳ及びＮＴＳ配列は、異なる真菌病原体の特異的な病原型の検出のために、特別に好適である。
【００２１】
本発明の上記ＤＮＡ配列は、異なる植物の病原体のリボソームＲＮＡ遺伝子領域の内部転写スペーサー配列に由来する。ある病原体の種又は属内の異なる病原型からのＩＴＳ ＤＮＡ配列は、上記種又は属の異なるメンバー間で異なる。ある病原体のＩＴＳ配列がいったん決定されると、これらの配列は他のＩＴＳ配列ととも整列化されることができる。このように、プライマーは上記ＩＴＳ配列から得られることができる。すなわち、真菌の病原型間の配列の最大の相違を含むＩＴＳ配列中の領域に基づいて、プライマーはデザインされることができる。これらの配列及びこれらの配列に基づくプライマーは、特異的な病原体を同定するために用いられることができる。
【００２２】
ＩＴＳ配列から得られた代表的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列が配列番号：１〜４及び７〜３０に開示される。上記配列は、着目の病原体のＰＣＲに基づいた同定における使用を見出す。好ましい実施態様においては、上記プライマーは、配列番号：１０〜３０のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドプライマーの対を提供する。１の実施態様において、上記対は少なくとも１の配列番号：１〜４又は７〜３０のプライマーを含むか、又はそれから成る。好ましい実施態様において、上記対は、少なくとも１の配列番号：１０〜３０のプライマーから成る。
【００２４】
また他の実施態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーの対が以下の：配列番号：３０及び配列番号：４；配列番号：２７及び配列番号：４；配列番号：１６及び配列番号：１２；配列番号：１６及び配列番号：１８；配列番号：１７及び配列番号：１２；配列番号：１及び配列番号：２７；配列番号：２４及び配列番号：２５；そして配列番号：２１及び配列番号：４から成る群から選ばれる。
【００２５】
好ましい実施態様において、上記オリゴヌクレオチドプライマーの対は、以下の：配列番号：１６及び配列番号：１２；又は配列番号：１６及び配列番号：１８；又は配列番号：１７及び配列番号：１２；又は配列番号：２４及び配列番号：２５から成る。
【００２６】
本発明の上記プライマー配列のＰＣＲ分析における使用方法は、本分野において周知である。例として、Schlesser et al. (1991) Applied and Environ. Microbiol. 57 : 553-556と同様に、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号を参照せよ。また、Nazar et al. (1991 ; Physiol. and Molec. Plant Pathol. 39 : 1-11）、これは、バーティシリウム・アルボ−アトラム（Verticillium albo-atrum）及びバーティシリウム・ダリエ（Verticillium dahliae）のＩＴＳ領域における相違を開発し、したがって上記２の種を識別するためにＰＣＲ増幅法を用いた；及びJohanson and Jeger (1993 ; Mycol. Res. 97 : 670-674）、彼らはバナナの病原体であるミコスフェレラ・フィジェンシス及びミコスフェレラ・ムシコーラを識別するための同様の技術を用いた、を参照せよ。
【００２７】
本発明の上記ターゲットＤＮＡ配列は、本分野において知られた方法によって真菌病原体からクローン化されることができる。一般的には、真菌単離物からのＤＮＡの単離方法は知られている。以下の：Raeder & Broda (1985) Letters in Applied Microbiology 2 : 17-20 ; Lee et al. (1990) Fungal Genetics Newsletter 35 : 23-24 ; 及びLee and Taylor (1990) In : PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innes et al. (Eds.) ; pages 282-287を参照せよ。
【００２８】
上記ＩＴＳ ｒＤＮＡ配列は、異なる種及び／又は菌株を識別するためにＰＣＲ中でテストするのに有用であることのできる相違を位置づけるために、各病原体群内で比較される。相違の同定により、多くのプライマーが合成され、ＰＣＲ増幅法でテストされる。ＰＣＲ増幅法試験のために使用されるテンプレートは最初は精製された病原体ＤＮＡであり、続いて感染した宿主植物組織から単離されたＤＮＡである。したがって、診断に役立つ、すなわち１の特別な病原体の種又は菌株を同定するが、上記同一の病原体の他の種又は菌株は同定しない、プライマーの対を同定することが可能である。プライマーはまた、ある特別の病気をひき起こすいくつかの真菌の病原体のいずれかを同定するプライマーと同様に、属に特異的なプライマーを開発するために、種の間で高度に保存された領域に対してデザインされる。例えば、プライマーは、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムを識別するために開発される。
【００２９】
好ましいプライマーの組み合わせは、感染した宿主組織、すなわち特異的な病原体の属、種又は菌株に感染した宿主組織、における異なる種又は菌株を識別することができる。本発明は、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムを識別する数多くのプライマーの組み合わせを提供する。本発明のプライマーは、ＩＴＳ ｒＤＮＡ領域間の配列の相違に基づいてデザインされる。配列間の最小の相違である、１塩対の相違は、弁別的なプライマーのデザインを可能にすることができる。特異的な真菌のＤＮＡ配列に対してデザインされたプライマーは、種特異的なＰＣＲフラグメントを増幅するための相違を有する領域に隣接する保存配列領域に対して作成されたプライマーと併用されることができる。一般的には、プライマーは良好な感受性を達成するために約６０〜約７０℃の間の理論的な融点を有し、組み合わせたプライマーの間の３′側の重複及び明らかな２次構造に欠ける。好ましい実施態様において、プライマーは約５〜３０ヌクレオチド塩基の長さの中のどこでもよい。
【００３０】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）病原体に感染した植物組織からのＤＮＡの単離；
（ｂ）前記ＤＮＡを、少なくとも１の配列番号：１−４及び７−３０のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅法にかけること；そして、
（ｃ）前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅法の産物を可視化することにより、前記真菌病原体を検出すること
を含む、真菌病原体の検出方法を提供する。
【００３１】
好ましい実施態様において、上記プライマーは少なくとも１の配列番号：１０−３０のプライマーである。
他の実施態様において、上記検出方法は、上記真菌病原体がコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属又はクラドスポリウム・カルポフィラムである場合に用いられる。
他の実施態様においては、本発明は、以下のステップ：
（ａ）前記真菌病原体に感染した植物組織からのＤＮＡの単離；
（ｂ）少なくとも１の、配列番号：１−４又は７−１０のプライマーを含む又はそれらから成るプライマーの対を用いるポリメラーゼ連鎖反応法において、前記ＤＮＡをテンプレートとして使用して、前記真菌病原体の内部転写スペーサー配列の一部を増幅すること；そして
（ｃ）上記内部転写スペーサー配列の増幅された部分を可視化することにより、前記真菌病原体を検出すること
を含む、真菌病原体の検出方法を提供する。
【００３２】
好ましい実施態様において、上記方法は真菌病原体を検出し、ここで前記真菌病原体はコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、又はクラドスポリウム・カルポフィラムである。
さらに他の実施態様において、上記検出方法は、プライマーの対を使用し、ここで前記プライマーの対は、以下の：配列番号：３０及び配列番号：４；配列番号：２７及び配列番号：４；配列番号：１６及び配列番号：１２；配列番号：１６及び配列番号：１８；配列番号：１７及び配列番号：１２；配列番号：１及び配列番号：２７；配列番号：２４及び配列番号：２５；そして、配列番号：２１及び配列番号：４から成る群から選ばれる。
【００３３】
好ましい実施態様において、上記オリゴヌクレオチドプライマーの対は、以下の：配列番号：１６及び配列番号：１２；又は配列番号：１６及び配列番号：１８；又は配列番号：１７及び配列番号：１２；又は配列番号：２４及び配列番号：２５から成る。
【００３４】
本発明はまた、以下のステップ：
（ａ）生物体の母集団からの複数の無作為の組織サンプルの採取；
（ｂ）上記組織サンプルへの、実施例２に記載の抽出緩衝液の添加；
（ｃ）抽出物を形成するための、上記組織サンプル及び抽出緩衝液の解離；
（ｄ）上記解離された組織及び緩衝液からの上記抽出物の除去；そして
（ｅ）上記抽出物についてのＰＣＲ分析の実施
を含む、組織から抽出されたＤＮＡについてのＰＣＲ分析の実施方法を提供する。
【００３５】
他の実施態様においては、上記方法は上記抽出物を解離された組織及び緩衝液から除去した後に、上記抽出物を煮沸するステップをさらに含む。
さらに他の実施態様においては、上記方法は、上記抽出物を希釈するステップをさらに含む。
好ましい実施態様においては、上記方法は、植物の母集団である生物体の母集団を使用する。さらに好ましい実施態様においては、上記方法は、葉、茎、根、花、未成熟の花、花柄、外皮、果実、未成熟の果実、又は木質組織から選ばれる組織サンプルを使用する。
他の好ましい実施態様において、上記方法は、以下の：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む抽出緩衝液を使用する。
【００３６】
本発明は、上記プロセスを実行するために必要な要素を含む“キット”の調製に直ちに適している。そのようなキットは、チューブ又はバイアルのような１又はそれより多いコンテナをそこへしっかりとはめ込むように区画化された容器を含むことができる。コンテナのうちの１は非標識の又は検出可能であるように標識されたＤＮＡプライマーを含むことができる。上記標識されたＤＮＡプライマーは、適宜、凍結乾燥された形態として又は適当な緩衝液中に存在することができる。１又はそれより多いコンテナが、ＰＣＲ反応において利用される１又はそれより多い酵素又は試薬を含むことができる。これらの酵素は単独で、又は混合物として、凍結乾燥された形態又は適当な緩衝液中に存在することができる。
【００３７】
結局、上記キットは、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド３リン酸、濾紙、ゲル物質、転移物質、オートラジオグラフィーの備品、等のような本発明の技術を実行するのに必要なすべての付加的要素を含むことができる。
【００３８】
本発明の１の実施態様において、真菌病原体の検出に使用される上記診断キットは、上述の本発明のプライマーを含む。
さらに他の実施態様においては、真菌病原体の検出に使用される上記診断キットは、上述の本発明のプライマーの対を含む。本発明の上記プライマー、方法及びキットは、真菌病原体に感染した植物又は植物の部分のいずれかにおける真菌病原体の存在を検出するのに有用である。特別には、本発明はコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの検出に有用である。これらの病原体に感染した植物又は植物組織又は植物の部分の例は、核果植物、ナッツ、トマト及びジャガイモのようなナス科の植物、ピーナッツ、トウモロコシ、モロコシ、マメ、パパイヤ、アボカド、リンゴ、及びサトウダイコンを含むが、これらに限定されない。核果植物の例は、モモ、ネクタリン、チェリー、アプリコット及びプラムを含むが、これらに限定されない。ナッツの例は、ピーナッツ、アーモンド、クルミ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ブラジルナッツ等を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
以下の実施例は、好適なプライマー配列の選択、選択的及び診断的な有効性についてのプライマーの試験、及び病気と真菌単離物の検出のためのそのようなプライマーの使用において用いられることのできる典型的な実験手順を示す。そのような実施例は、説明として提供されるものであり、限定のためのものではない。
【実施例】
【００４０】
ここで用いる標準の組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) 及びT.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) 及びAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) により記述される。
【００４１】
実施例１：真菌単離物及びゲノムの真菌ＤＮＡの抽出
使用した真菌単離物及びそれらの供給源については表１を参照のこと。真菌をＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天（Potato Dextrose Agar)）プレート上で成長させる。培養物を２８℃で最長１０日間インキュベートする。菌糸体を液体窒素中で粉砕し、すべてのゲノムのＤＮＡをLee及びTaylorの手順を用いて抽出する（1990 ; In: PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications ; Eds.: Innes et al.; pages 282-287）。
【００４２】
【表１】
1 American Type Culture Collection ; Rockville, MD, USA
2 Jones, A.L.; Michigan State University, East Lansing, MI, USA (Phytopathology (1999) 89 : 100-108において実証された菌株）
3 Pryor, B.; University of California, Davis, CA, USA
4 Syngenta Biotechnology Inc.; P.O. Box 12257, 3054 Cornwallis Road, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA
【００４４】
実施例２：アーモンド組織からのＤＮＡ抽出
ＤＮＡを、変更を加えたＣＴＡＢ抽出緩衝液（Wang et al., 1993,“PCR amplification from single seeds, facilitating DNA marker-assisted breeding”Nucleic Acids Res. 21 : 2527）を用いたバルクの解離方法を用いてアーモンドの葉から抽出した。上記バルクの解離方法は、農地からのいくつかの自然に感染した組織からＤＮＡを単離するために使用された。変更されたＣＴＡＢ抽出緩衝液の緩衝液成分の可能な濃度範囲は、以下の：
約１００mMのトリス、pH８．０；
０．２−２．０Ｍ ＮａＣｌ；
１−２００mM エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；
０．１−５％ｗ／ｖ ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）；
０．１−５％ｗ／ｖ ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）；そして
０．０１−２％ｗ／ｖ アスコルビン酸
の通りである。
【００４５】
本発明の他の実施態様において、上記ＤＮＡ抽出緩衝液は１００mMトリス、pH８．０を含み；又は１．４Ｍ ＮａＣｌを含み；又は２０mM ＥＤＴＡを含み；又は２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢを含み；又は２％ｗ／ｖ ＰＶＰを含み；又は０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む。
しかしながら、好ましいバルクの解離方法においては、以下の濃度：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸が使用される。
【００４６】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）生物体の母集団からの複数の無作為の組織サンプルの採取；
（ｂ）上記組織サンプルへの上述のＤＮＡ抽出緩衝液の添加；
（ｃ）抽出物を形成するための、上記組織サンプル及び抽出緩衝液の解離；そして
（ｄ）上記解離された組織及び緩衝液からの上記抽出物の除去
を含む組織からのＤＮＡ抽出物の調製方法を提供する。
他の実施態様においては、上記抽出方法は植物の母集団から組織サンプルを採取する。さらに他の実施態様においては、上記組織サンプルは、葉、茎、根、花、未成熟の花、花柄、外皮、果実、未成熟の果実、又は木質組織から選ばれる。
好ましい実施態様においては、上記抽出方法は、以下の：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む抽出緩衝液を使用する。
【００４７】
ＤＮＡをアーモンドの組織から以下のように抽出する：
バルクの解離方法：
（１）所定の果樹園内の病気の疑いのある木から採取されたアーモンドの組織から成るサンプル。
（２）サンプルを個々に異なる一対の手袋を用いて個別に取り扱う。上記サンプルの調製に使用するいずれの器具も水で、そして７０％エタノールで各サンプル間で洗浄する。
（３）以下の組織：
Ａ．花、未成熟の花、及び花柄
Ｂ．昨シーズンのアーモンド（病気で萎縮した果実）及び古いクレセント（未成熟の果実）の外皮。アーモンドの果実の外側の部分であって、一時は多肉質であったが今やナッツの殻から分離できるもののみをテストする。
Ｃ．今シーズンの新鮮なアーモンド及びクレセントの外皮
これもまた果実の外側の、多肉質の部分のみをテストする。
Ｄ．木質組織
によって、サンプルをテストのために副次サンプルに分割する。
（４）上記サンプルをＢｉｏｒｅｂａ（Reinach, Switzerland）製の丈夫なプラスチックバッグ（カタログ番号＃４９０１００）に入れる。葉を入れたプラスチックバッグから風袋（プラスチックバッグの重さ）を引いたものとして、上記植物組織の重さを計る。
（５）よく混合したＣＴＡＢ抽出緩衝液の１容量（mL）を新鮮な状態のサンプルの重さ１ｇあたりに対して以下のように：
【表５】
ＣＴＡＢ抽出緩衝液：（１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；２％ｗ／ｖ ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）；２％ ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸。組織を９０にセットしたＢｉｏｒｅｂａ Ｈｏｍｅｘ ６ ホモジナイザー（Reinach, Switzerland, カタログ番号＃４００００５）を用いて解離する。上記サンプルを真菌のＤＮＡを遊離させるために、組織ができる限り破壊されたと見えるまで粉砕する。
（６）いったん解離が完了したら、上記抽出物を抽出バッグの底に圧縮する。清潔なハサミを用いて、ピペッターを汚染せずに１０又は２５mLのホールピペットが抽出物に届くような長さのところで上記バッグを切断する。
（７）ピペットで吸い上げと吐き出しを数回行うことにより、上記抽出液をホモジナイズする。
（８）１ミリリッターの抽出液を２のエッペンドルフチューブのそれぞれに移す。これらのチューブのうちの１を直ちに、対照として凍結保存する。もう一方はさらに加工する。
（９）上記のテストのための一定分量を５分間煮沸する。チューブが、ぽんと開かないことを確実にするために遠心キャップスリーブ（a centrifuge cap sleeve）を用いる。
（１０）煮沸された抽出物を２分間氷上で放冷する。
（１１）上記抽出物を１５，０００×Ｇで５分間遠心分離する。
（１２）抽出物を希釈し、そして直接テストする（１３Ａ）、又はテストの前に核酸をそれらから精製する（１３Ｂ）。
（１３Ａ）抽出物をテストのために希釈する。抽出物の上清を以下のスキーム：
【表６】
（１３Ｂ）核酸を、１mLのホモジナイズされた抽出液あたり等容量の２５：２４：１のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出を行って、アーモンド抽出物から精製する。この抽出物の水相を新しい遠心チューブに移し、０．５容量の氷温のイソプロパノールを添加する。−２０℃で２０分間インキュベートした後、沈澱を１５，０００rpmで１０分間遠心沈澱する。上清を捨て、ペレットを０．７mlの７０％エタノールで洗浄する。洗浄液を捨て、上記ペレットを放置して乾燥させる。上記ペレットをＲＮａｓｅを１０mg／mLの濃度で加えたトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０mMトリス塩基、１mM ＥＤＴＡ、pH８．０）に再懸濁する。ＤＮＡ濃度は分光光度計で読み取ることができ、１００ng／μＬに、ＴＥ緩衝液を加えることによって調整する。
【００４８】
【表７】
実施例３：ポリメラーゼ連鎖反応増幅法
ポリメラーゼ連鎖反応を、２５又は５０μＬの反応液中に５０mM ＫＣｌ、２．５mM ＭｇＣｌ2、１０mMトリス−ＨＣｌ、pH８．３、２００μＭのｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰをそれぞれ含み、５０μＭの各プライマー、０．２５Ｕ／μＬのＴａｑポリメラーゼ及び０．２ng／μＬのゲノムのＤＮＡを含むものを用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Foster City, CA ; part no. N808-0009）からのＧｅｎｅ Ａｍｐ ｋｉｔにより実施する。反応を９４℃で１５秒、５０℃−７０℃で１５秒、そして７２℃で４５秒を３０−４０サイクル、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ９６００又は９７００サーマルサイクラー中で行う。生成物を、１０μｌの各ＰＣＲサンプルを１．０％アガロースゲルに負荷し、電気泳動することにより、分析する。
【００５０】
実施例４：オリゴヌクレオチドの合成及び精製
オリゴヌクレオチド（プライマー）は、例えば、Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) 又はMidland Certified Reagent Company (Midland, Texas) のいずれかにより、合成する。
【００５１】
実施例：５ ｒＤＮＡのＩＴＳ領域のクローニング及び配列決定
ＩＴＳ領域の配列を実施例３に記載されたように、保存されたプライマーＩＴＳ１及びＩＴＳ４（配列番号：１及び４）を用いてＰＣＲ−増幅する。産物をＴＯＰＯ−ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Invitrogen, Carlsbad, CA ; part no. K4550-40）を使用して製造者の指示に従い、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯＴＡ−クローニングベクター中へクローン化する。ＩＴＳフラグメントの挿入を含むクローンをＴＡクローニングベクターのＦＯＲＷＡＲＤ（５′−gtaaaacgacggccagt−３′；配列番号：５）及びＲＥＶＥＲＳＥ（５′−caggaaacagctatgac−３′；配列番号：６）プライマーを用いて配列決定する。配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（商標）ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California）上で実施する。
【００５２】
実施例６：種特異的ＰＣＲプライマーのデザイン
実施例６を、コレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムに特異的なプライマーのデザインを詳細に記述する３の小セクションに分ける。３のターゲット種のためのプライマーのデザインにおいて、いくつかの共通のステップが含まれる。各アッセイのデザインにおいて、内部転写スペーサー領域のＤＮＡ配列は、National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) のGenbankデータベースから、又は実施例５中の手順により実施例１の単離物からＰＣＲ−増幅され配列決定されたＤＮＡから得る。これらの配列について複数の配列アラインメントを作成する。上記アラインメントをターゲット配列間の相違及び他の真菌のＤＮＡの配列間の相違について分析する。上記相違は、ＰＣＲ反応においてターゲット配列を特異的に増幅するプライマーの開発を可能とする。オリゴヌクレオチドプライマーを、分析された種の間における最大の配列の相違を有するターゲット領域に対してデザインする。これらのプライマーは実施例４に従って合成する。加えて、発表されたリボソームの遺伝子に特異的なプライマー、ＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＩＴＳ３及びＩＴＳ４（White et al., 1990 ; In : PCR Protocols ; Eds.: Innes et al. pages 315-322）をＩＴＳ領域に特異的なプライマーと併用してテストするために合成する。真菌の保存されたＩＴＳ領域のプライマーを表３に示す。
【００５３】
【表８】
実施例６Ａ：コレトトリカム・アクタツムに特異的なＰＣＲプライマーのデザイン
プライマーをコレトトリカム・アクタツムを特異的に検出するためにデザインする。Ｃ．アクタツムのための内部転写スペーサー領域Ｉ ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースから得る。それらの配列は、カタログ番号Ｚ３２９０７、Ｚ３２９１３、Ｚ３２９１５、Ｚ３２９１６、Ｚ３２９１７、Ｚ３２９１８、Ｚ３２９２１、Ｚ３２９２２、Ｚ３２９２４、Ｚ３２９２５、Ｚ３２９２６、及びＺ３２９２８を含む。複数の配列アラインメントを、他のアーモンドの病原体のためのＩＴＳ Ｉ領域の配列（コレトトリカム・ココデス（Colletotrichum coccodes）のためのＺ３２９３０；Ｚ３２９３８、Ｃ．デマティウム（C. dematium）；Ｚ３２９４３、Ｃ．フラガリエ（C. fragariae）；Ｚ３２９６１、Ｃ．グレオスポリオイデス（C. gloeosporioides）；Ｚ３２９８１、Ｃ．グラミニコーラ（C. graminicola）；Ｚ３２９８４、Ｃ．リニコーラ（C. linicola）；Ｚ３３０００、Ｃ．トリケラム（C. trichellum)）とともにこれらの配列について作成する。上記アラインメントを、上記ターゲット配列と他の真菌のＤＮＡのための配列の間の相違について分析する。上記相違は、ＰＣＲ反応において用いられた場合に特異的にＣ．アクタツムのＩＴＳ領域ＤＮＡを増幅するプライマーの開発を許容する。オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６７７、ＪＢ６７７．１、ＪＢ６７７．２、ＪＢ６７７．３、及びＪＢ６７８（それぞれ配列番号：１０、２８、２９、３０、及び１１）は、Ｃ．アクタツムのＩＴＳ領域１のＤＮＡをターゲットとするようにデザインされる。プライマーＪＢ６７７、ＪＢ６７７．１、ＪＢ６７７．２及びＪＢ６７７．３は、ＩＴＳ１の同一の領域をターゲットとし、ターゲットに特異的な配列を含むプライマーへの塩基の付加又は除去が、上記同一のターゲットの検出において使用されるオリゴヌクレオチドの産生数をどのように多様に変化させられるか、を示す。
【００５５】
文献から得られた類似のアラインメントにおいて（Bailey et al., Phytopathology 86 : 1076-1083）、いくつかのコレトトリカム種のＩＴＳ領域２のＤＮＡ配列を比較する。この報告中のアラインメントは、Ｃ．アクタツムＩＴＳ領域２のプライマーをザデインする目的で比較される種の間の相違を見出すために使用される。オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６７９（配列番号：１２）をＣ．アクタツムのＩＴＳ領域２のＤＮＡをターゲットとするようにデザインする。上記Ｃ．アクタツムに特異的なプライマーを表４に示す。これらのプライマーは、Ｃ．アクタツムＤＮＡをターゲットとするために相互に組み合わせて、表３の保存されたプライマーの１と組み合わせて、又は文献中のＣ．アクタツム特異的なプライマーの１と組み合わせて用いることができる（Adaskaveg and Hartin, Phytopathology 87 : 979-987によるプライマー：ＣａＩＮＴ−１，５′−GGCGCCGGCCCCCACCACGGGGA-３′(配列番号：７）及びＣａＩＮＴ−２，５′−GGCGCCGGCCCCGTCACGGGGG−３′（配列番号：８）、又はSreenivasaprasad et al. Plant Pathology (1996) 45, 650-655によるプライマーＣａＩｎｔ ２，５′−GGGGAAGCCTCTCGCGG−３′（配列番号：９)）。
【００５６】
【表９】
実施例６Ｂ：アルテナリア属に特異的なＰＣＲプライマーのデザイン
プライマーを、アルテナリア属を特異的に検出するためにデザインする。Ａ．アルテナータのためのＩＴＳ領域のＤＮＡ配列を、アーモンドサンプル２０００＃４７から得られたプレート単離物（単離物のさらなる情報は表１を参照のこと。）と同様に、４のＡＴＣＣ単離物について実施例５で記載された通りに得た。加えて、Ａ．アルテナータＩＴＳ領域のためのＧｅｎＢａｎｋ配列を入手した（カタログ番号＃ＡＦ２２９４６１、ＡＦ２２９４６０、ＡＦ２２９４５９、ＡＦ２１８７９１、ＡＪ２７６０５９、ＡＪ２７６０５５、及びＡＦ０７１３４６）。これらの配列を、ＳｅｑＭａｎ II ｖｅｒ ３．６．０（DNA Star, Madison, WI, USA）において整列化した。これらの配列のコンセンサス配列を生成し、“アルテナリアＩＴＳ配列”とラベルした。
【００５８】
複数の配列アラインメントを、他のアーモンド病原体のためのＩＴＳ領域の配列と一緒にこの配列について作成する。これらは、コレトトリカム・グレオスポリオイデス（Colletotrichum gloeosporioides）（カタログ番号＃ＡＦ０９０８５５）、Ｃ．アクタツム（ＡＦ０９０８５３）、Ｃ．フラガリエ（C. fragariae）（ＡＦ０９０８５４）、ベンチュリア・カルポフィラ（Venturia carpophila）（合成のフシクラジウム・カルポフィラム（Fusicladium carpophilum）、クラドスポリウム・カルポフィラム）（ＡＦ０６５８４９）、モニリニア・フラクチゲナ（Monilinia fructigena）（Ｚ７３７８１）、Ｍ．ラクサ（M. laxa）（Ｚ７３７８６）、スクレロチニア・スクレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum）（Ｚ７３７９９）、及びボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）（Ｚ７３７６５）についてＧｅｎＢａｎｋから入手した配列を含む。実施例５と同様にＡＴＣＣフシクラジウム・カルポフィラム単離物５２９３５のために生成されたＩＴＳ領域の配列もまた上記複数の配列アラインメントに含まれる。
【００５９】
Ａ．アルテナータのコンセンサス配列ターゲット及び他の真菌の配列間の相違について、上記アラインメントを分析する。見出された相違は、ＰＣＲ反応において用いられた場合、アルテナリア属のＩＴＳ領域のＤＮＡを特異的に増幅するプライマーの開発に備えるものである。オリゴヌクレオチドプライマーＡｌａｌ−１、Ａｌａｌ−２、Ａｌａｌ−３、Ａｌａｌ−４、Ａｌａｌ−５、及びＡｌａｌ−６（配列番号：１３−１８）を、アルテナリア属のＩＴＳ領域のＤＮＡをターゲットとするようにデザインする（表５）。
【００６０】
加えて、これらのプライマーは、文献中の他のＩＴＳ由来のアルテナリア属プライマー（プライマー、ａｌｔ １，５′−ATTGCAATCAGCGTCAGTAAC−３′及びａｌｔ ２，５′−CAAGCAAAGCTTGAGGGTACA−３′ Zur et al. 1999. J. Food Production 62 (10) p 1191-1197）（それぞれ配列番号：１９及び２０）と同様に表３の保存されたＩＴＳ領域プライマーと共に用いることができる。
【００６１】
【表１０】
実施例６Ｃ：クラドスポリウム・カルポフィラムに特異的なＰＣＲプライマーのデザイン
プライマーを、クラドスポリウム・カルポフィラムを特異的に検出するためにデザインする。Ｃ．カルポフィラムのためのＩＴＳ領域のＤＮＡ配列を、６の単離物（ＢＳ−１、ＢＳ−２、ＢＳ−３、ＢＳ−４、ＢＳ−６、及びＡＴＣＣ単離物５２９３５）について、実施例５で記載された通りに得た。Ｃ．カルポフィラムＩＴＳ領域のＤＮＡのための１の追加の配列をＧｅｎＢａｎｋから入手した（カタログ番号＃ＡＦ０６５４８９）。これらの配列を、Ｓｅｑ Ｍａｎ II ｖｅｒ ３．６．０（DNA Star, Madison, WI, USA）において整列化した。これらの配列のコンセンサス配列を生成し、“Ｖカルポフィラ コンセンサス”とラベルした。
【００６３】
複数の配列アラインメントを、他のアーモンド病原体のためのＩＴＳ領域の配列と一緒にこの配列について作成する。これらは、コレトトリカム・グレオスポリオイデス（カタログ番号＃ＡＦ０９０８５５）、Ｃ．アクタツム（ＡＦ０９０８５３）、Ｃ．フラガリエ（ＡＦ０９０８５４）、モニリニア・フラクチゲナ（Ｚ７３７８１）、Ｍ．ラクサ（Ｚ７３７８６）、スクレロチニア・スクレロチオラム（Ｚ７３７９９）、及びボツリチス・シネレア（Ｚ７３７６５）についてＧｅｎＢａｎｋから入手した配列を含む。複数のアルテナリア・アルテナータの配列について実施例６Ｂで生成したコンセンサス配列もまた、上記複数の配列アラインメントに含まれる。
【００６４】
Ｃ．カルポフィラムのコンセンサス配列ターゲット及び他の真菌の配列間の相違について、上記アラインメントを分析する。見出された相違は、ＰＣＲ反応において用いられた場合、Ｃ．カルポフィラムのＩＴＳ領域のＤＮＡを特異的に増幅するプライマーの開発に備えるものである。オリゴヌクレオチドプライマー、Ｖｃａｒｐ１、Ｖｃａｒｐ２、Ｖｃａｒｐ３、Ｖｃａｒｐ４、Ｖｃａｒｐ５、Ｖｃａｒｐ６、及びＶｃａｒｐ７（配列番号：２１−２７）を、Ｃ．カルポフィラムのＩＴＳ領域のＤＮＡをターゲットとするようにデザインする（表６）。これらのプライマーは、表３中の保存されたＩＴＳ領域プライマーと共に用いることができる。
【００６５】
【表１１】
実施例７Ａ：精製された真菌のゲノムＤＮＡに対するプライマー特異性の判定
単一の特異的なフラグメントを増幅する試みにおいて、異なるプライマーの組み合わせを用いて実施例３に従ってＰＣＲを実施する（表７）。着目の各真菌の種の核ｒＤＮＡのＩＴＳ領域からデザインされたプライマーにより、特異的なＰＣＲ増幅法の産物が作成される。
最初の特異性についてのスクリーニングにおいて、ＰＣＲ反応混合物を表７中の各プライマー対について実施例３に従って作成する。これらについてバックグラウンドの増幅のテストのために、ネガティブコントロール（ＤＮＡを添加しない）、正常なアーモンド組織コントロール（実施例２に従って調製する）を対照として、及び実施例１に記載した通りに調製した、表１に列挙された既知の各種の真菌ＤＮＡの１０mgを対照として実験を行う。
【００６７】
【表１２】
エチジウム ブロマイドで染色したゲル上で可視化した場合、いくつかのプライマーの対は満足のいく結果：ターゲット種の複数の単離物からのターゲットＤＮＡの良好な増幅と特異的及び非特異的な反応産物の両方を生成しない他のすべての反応（ネガティブコントロール、アーモンドバックグラウンド、及び他の真菌ＤＮＡ）を示す。いくつかは、非特異的な増幅、ターゲットＤＮＡが増幅しない、及び上記ターゲット以外の真菌の種に由来するＤＮＡの増幅を含む不満足な結果を示す。特異的なターゲットについての交差増幅のない良好な増幅を示すプライマーの対を表８に要約する。
【００６９】
【表１７】
実施例７Ｂ：アーモンド組織ＤＮＡ抽出物のパネルに対するアーモンド病原体のＰＣＲアッセイのバリデーション
所定のターゲットの最良の増幅を示すプライマーの対（Ｃ．アクタツムについてＪＢ６７７．３及びＩＴＳ４、アルテナリア属についてＡｌａｌ−４及びＡｌａｌ−２、並びにＣ．カルポフィラムについてＩＴＳ１及びＶｃａｒｐ７）のそれぞれについて、表２に列挙した組織から実施例２の通りに調製したアーモンド組織抽出物のパネルに対してＰＣＲ反応を行う。この実験において、“１９９９”と命名されたサンプルからの抽出物を希釈し、直接テストした。核酸は“２０００”と命名されたサンプルの抽出液から精製し、その後１反応あたり１００ngの濃度でテストする。結果は、陽性とみなされる可視的な産物、及びあっても記録された産物が非特異的である場合に陽性（＋）又は陰性（−）のいずれかに評価する。これらのテストの結果を表９に示す。
【００７１】
【表１８】
テストした１３の単離物について上記アッセイは、アーモンド組織中のコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムを検出し、識別した。この実験は、病気の存在を確認するためのアーモンド組織抽出液の直接的な特徴づけにおけるこれらのプライマーの有用性を実証する。
【００７３】
実施例８：アーモンド組織から採取した未知の真菌単離物のパネルに対するアーモンド病原体のＰＣＲアッセイのバリデーション
アーモンドサンプルから採取した未知の真菌単離物（表１、下部）から、実施例１中の方法によりＤＮＡを抽出する。これらの精製ＤＮＡ抽出物を、表８中の各プライマーの組み合わせについて、実施例３に従って作製したＰＣＲ反応混合物を用いてテストした。表１０はアーモンド組織から成長した精製真菌単離物の特徴づけにおけるこれらのアッセイの有用性を示す。
【００７４】
【表１９】
ここで引用されるすべての文献は、そっくりそのまま参考文献として援用されている。
【００７６】
付録Ｉ：
Ｃ．アクタツムプライマーの開発において、使用したＧｅｎＢａｎｋの配列
Ｚ３２９０７
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（４８８５）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483613|emb|Z32907.1|CAITS1A[483613]
Ｚ３２９１３
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（１７９）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483614|emb|Z32913.1|CAITS1B[483614]
Ｚ３２９１５
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（３９７）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483615|emb|Z32915.1|CAITS1D[483615]
Ｚ３２９１６
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（４９３／ＢＯＸ８８）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483616|emb|Z32916.1|CAITS1E[483616]
Ｚ３２９１７
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（４９５／１７７２９）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483617|emb|Z32917.1|CAITS1F[483617]
Ｚ３２９１８
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（５３４／９０．３６８）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483618|emb|Z32918.1|CAITS1G[483618]
Ｚ３２９２１
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（５４７／９０．４１０）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483621|emb|Z32921.1|CAITS1J[483621]
Ｚ３２９２２
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（５４９）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483622|emb|Z32922.1|CAITS1K[483622]
Ｚ３２９２４
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（６０２／９１．３２６）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483624|emb|Z32924.1|CAITS1M[483624]
Ｚ３２９２５
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（６１５／９１．４１４）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483625|emb|Z32925.1|CAITS1N[483625]
Ｚ３２９２６
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（６１６／９１．４１４）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483626|emb|Z32926.1|CAITS1O[483626]
Ｚ３２９２８
ＩＴＳ１のためのＣ．アクタツム（ＮＩ９０）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483627|emb|Z32928.1|CAITS1Q[483627]
Ｚ３２９３０
ＩＴＳ１のためのＣ．ココデス（５２７．７７）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483630|emb|Z32930.1|CCITS1B[483630]
Ｚ３２９３８
ＩＴＳ１のためのＣ．デマティウム（２８８８１０）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483639|emb|Z32938.1|CDITS1A[483639]
Ｚ３２９４３
ＩＴＳ１のためのＣ．フラガリエ（６３−１）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483643|emb|Z32943.1|CFITS1B[483643]
Ｚ３２９６１
ＩＴＳ１のためのＣ．グレオスポリオイデス（５６１）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483673|emb|Z32961.1|CGITS1Q[483673]
Ｚ３２９８１
ＩＴＳ１のためのＣ．グラミニコーラ（８４０３２）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483657|emb|Z32981.1|CGITS1AM[483657]
Ｚ３２９８４
ＩＴＳ１のためのＣ．リニコーラ（１０３８４４）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483685|emb|Z32984.1|CLITS1A[483685]
Ｚ３３０００
ＩＴＳ１のためのＣ．トリケラム（１８０．５２）ＤＮＡ（小サブユニットと５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の間）
gi|483713|emb|Z33000.1|CTITS1A[483713]
【００７７】
付録II：
アルテナリア属プライマーの開発において使用したＧｅｎＢａｎｋの配列
ＡＦ２２９４６１
アルテナリア・アルテナータＢＭＰ２１−４１−１０菌株の内部転写スペーサー１、部分配列；５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列；及び内部転写スペーサー２、部分配列
gi|7546946|gb|AF229461.1|AF229461[7546946]
ＡＦ２２９４６０
アルテナリア・アルテナータＢＭＰ２１−４１−０７菌株の内部転写スペーサー１、部分配列；５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列；及び内部転写スペーサー２、部分配列
gi|7546945|gb|AF229460.1|AF229460[7546945]
ＡＦ２２９４５９
アルテナリア・アルテナータＡＴＣＣ２８３２９菌株の内部転写スペーサー１、部分配列；５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列；及び内部転写スペーサー２、部分配列
gi|7546944|gb|AF229459.1|AF229459[7546944]
ＡＦ２１８７９１
アルテナリア・アルテナータ内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列；並びに１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列
gi|6715474|gb|AF218791.1|AF218791[6715474]
ＡＪ２７６０５９
アルテナリア・アルテナータ５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子並びにＩＴＳ１及び２、ＭＺ２０菌株
gi|7208649|emb|AJ276059.1|AAL276059[7208649]
ＡＪ２７６０５５
アルテナリア・アルテナータ５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子並びにＩＴＳ１及び２、ＭＺ７菌株
gi|7208647|emb|AJ276055.1|AAL276055[7208647]
ＡＦ０７１３４６
アルテナリア・アルテナータ１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列；内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|5031121|gb|AF071346.1|AF071346[5031121]
ＡＦ０９０８５５
コレトトリカム・グレオスポリオイデス内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|6650331|gb|AF090855.1|AF090855[6650331]
ＡＦ０６５８４９
ベンチュリア・カルポフィラ内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列
gi|4185734|gb|AF065849.1|AF065849[4185734]
ＡＦ０９０８５4
コレトトリカム・フラガリエ内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|6650330|gb|AF090854.1|AF090854[6650330]
ＡＦ０９０８５３
コレトトリカム・アクタツム１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列；内部転写スペーサー１、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び内部転写スペーサー２、完全配列；並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列
gi|6650329|gb|AF090853.1|AF090853[6650329]
Ｚ７３７８１
Ｍ．フラクチゲナの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125846|emb|Z7378.1|MFRUCITSE[2125846]
Ｚ７３７９９
Ｓ．スクレロチオラムの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125909|emb|Z73799.1|SSCLEITSA[2125909]
Ｚ７３７８６
Ｍ．ラクサの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125857|emb|Z73786.1|MLAXAITSC[2125857]
Ｚ７３７６５
Ｂ．シネレアの５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、内部転写スペーサー１及び内部転写スペーサー２
gi|2125789|emb|Z73765.1|BCINEITSB[2125789]
Claims (35)
- 配列番号：１０〜３０から成る群から選ばれる、オリゴヌクレオチドプライマー。
- オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、少なくとも１の請求項１に記載のプライマーから成る前記対。
- オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、以下の：
ａ）配列番号：３０及び配列番号：４；
ｂ）配列番号：２７及び配列番号：４；
ｃ）配列番号：１６及び配列番号：１２；
ｄ）配列番号：１６及び配列番号：１８；
ｅ）配列番号：１７及び配列番号：１２；
ｆ）配列番号：１及び配列番号：２７；
ｇ）配列番号：２４及び配列番号：２５；そして
ｈ）配列番号：２１及び配列番号：４
から成る群から選ばれる、前記対。 - オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、配列番号：１６及び配列番号：１２から成る前記対。
- オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、配列番号：１６及び配列番号：１８から成る前記対。
- オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、配列番号：１７及び配列番号：１２から成る前記対。
- オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、配列番号：２４及び配列番号：２５から成る前記対。
- 真菌病原体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）病原体に感染した植物組織からのＤＮＡの単離；
（ｂ）少なくとも１の請求項１によるプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅法に前記ＤＮＡをかけること；そして
（ｃ）前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅法の産物を可視化することによって、前記真菌病原体を検出すること
を含む、前記方法。 - 前記真菌病原体がコレトトリカム・アクタツム（Colletotrichum acutatum）、アルテルナリア属（Alternaria spp.）及びクラドスポリウム・カルポフィラム（Cladosporium carpophilum）である、請求項８に記載の上記方法。
- 真菌病原体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記真菌病原体に感染した植物組織からのＤＮＡの単離；
（ｂ）請求項２に記載のプライマーの対を用いたポリメラーゼ連鎖反応増幅法において前記ＤＮＡをテンプレートとして用いた、前記真菌病原体の内部転写スペーサー（Internal Transcripted Spacer）配列の部分の増幅；そして
（ｃ）内部転写スペーサー配列の上記増幅された部分を可視化することによる、前記真菌病原体の検出
を含む、前記方法。 - 前記真菌病原体がコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムである、請求項１０に記載の上記方法。
- 前記プライマーの対が請求項３〜７のいずれか１項に記載された、請求項１０に記載の前記方法。
- 真菌病原体の検出に使用される診断キットであって、請求項１に記載の上記プライマーを含む、前記キット。
- 真菌病原体の検出に使用される診断キットであって、請求項２〜７のいずれか１項に記載された上記プライマーの対を含む、前記キット。
- ＤＮＡ抽出緩衝液であって、以下の：
（ａ）約１００mMのトリス、pH８．０；
（ｂ）０．２〜２．０Ｍ ＮａＣｌ；
（ｃ）１〜２００mM エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）；
（ｄ）０．１〜５％ｗ／ｖ ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）；
（ｅ）０．１〜５％ｗ／ｖ ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）；そして
（ｆ）０．０１〜２％ｗ／ｖ アスコルビン酸
を含む、前記緩衝液。 - 請求項１５に記載の上記ＤＮＡ抽出緩衝液であって、以下の：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰそして０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む、前記緩衝液。
- １００mMトリス、pH８．０を含む、請求項１５に記載の上記ＤＮＡ抽出緩衝液。
- １．４Ｍ ＮａＣｌを含む、請求項１５に記載の上記ＤＮＡ抽出緩衝液。
- ２０mM ＥＤＴＡを含む、請求項１５に記載の上記ＤＮＡ抽出緩衝液。
- ２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢを含む、請求項１５に記載の上記ＤＮＡ抽出緩衝液。
- ２％ｗ／ｖ ＰＶＰを含む、請求項１５に記載の上記ＤＮＡ抽出緩衝液。
- ０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む、請求項１５に記載の上記ＤＮＡ抽出緩衝液。
- 組織からのＤＮＡ抽出物の調製方法であって、以下のステップ：
（ａ）生物体の母集団からの複数の無作為の組織サンプルの採取；
（ｂ）上記組織サンプルへの、請求項１５に記載の上記抽出緩衝液の添加；
（ｃ）抽出物を形成するための、上記組織サンプルと抽出緩衝液の解離；そして
（ｄ）上記解離された組織及び緩衝液からの上記抽出物の除去
を含む、前記方法。 - 上記生物体の母集団が植物の母集団である、請求項２３に記載の上記方法。
- 上記組織サンプルが葉、茎、根、花、未成熟の花、花柄、外皮、果実、未成熟の果実、又は木質組織から選ばれる、請求項２４に記載の上記方法。
- 上記抽出緩衝液が以下の：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む、請求項２３に記載の上記方法。
- 組織から抽出されたＤＮＡについてＰＣＲ分析を実施する方法であって、以下のステップ：
（ａ）生物体の母集団からの複数の無作為の組織サンプルの採取；
（ｂ）上記組織サンプルへの、請求項２６に記載の上記抽出緩衝液の添加；
（ｃ）抽出物を形成するための、上記組織サンプル及び抽出緩衝液の解離；
（ｄ）上記解離された組織及び緩衝液からの上記抽出物の除去；そして
（ｅ）上記抽出物についてのＰＣＲ分析の実施
を含む、前記方法。 - 上記抽象物を上記解離された組織及び緩衝液から除去後に煮沸するステップをさらに含む、請求項２７に記載の上記方法。
- 上記抽出物を希釈するステップをさらに含む、請求項２８に記載の上記方法。
- 上記抽出緩衝液が、以下の：１００mMトリス、pH８．０；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０mM ＥＤＴＡ；２％ｗ／ｖ ＣＴＡＢ；２％ｗ／ｖ ＰＶＰ及び０．１％ｗ／ｖ アスコルビン酸を含む、請求項２７に記載の上記方法。
- 上記生物体の母集団が植物の母集団である、請求項２９に記載の上記方法。
- 上記植物組織が核果植物の母集団に由来する、請求項３１に記載の上記方法。
- 上記組織サンプルが葉、茎、根、花、未成熟の花、花柄、外皮、果実、未成熟の果実、又は木質組織から選ばれる、請求項３１に記載の上記方法。
- 上記植物組織が核果植物に由来する、請求項８に記載の上記方法。
- 上記植物組織がアーモンドに由来する、請求項８に記載の上記方法。
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