JP6112652B2 - 標的dnaの特異的増幅方法 - Google Patents
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Description
環状DNAモデルに使用したpUC19はマルチクローニングサイト脇に特異的なM13ファージの配列を有する。この領域に特異的な配列をもつ9〜11merのRNAプライマー(表1)をデザインし、Phi29 DNA polymerase推奨の方法(メーカー名:Epicentre)で第1の鎖置換型DNA合成酵素によるDNA伸長反応を行った。まず、2μLのbuffer(メーカー名:Epicentre)、1fgのpUC19および200pmolのプライマーを全量10μLになるように加え、95℃1分間の熱変性後、30分かけて25℃まで徐々に温度を下げることによってプライマーアニーリング反応を行った。次に、プライマーアニーリング反応後の反応液に、Phi29 DNA polymerase推奨のRCA反応溶液(メーカー名:Epicentre)を、全量20μLになるように加え、30℃で16時間の等温増幅反応を行った。最後に65℃まで温度を上げ、Phi29 DNA polymeraseを失活させて反応を終了し、第1増幅反応の反応液を得た。第1のDNA伸長反応による増幅産物が1本鎖DNAであることは、EcoRI消化で切断されないことによって確かめた(図1)。図1において、各レーン1〜6は、それぞれ、第1の増幅反応に配列番号1〜6のプライマーを用いた場合の結果を示す。
増幅が終了した第1増幅反応の反応液5μLに対し、Phi29 DNA polymerase推奨の方法で調製した200pmolのM13 reverseプライマーを含むRCA反応液(メーカー名:Epicentre)を20μL加え、第1増幅反応と同様に等温増幅反応を行った。
増幅が終了した第1増幅反応の反応液10μLからエタノール沈殿によって反応液を除去し、DNA回収した。その沈殿を10μLのミリQで溶解し、これをDNAテンプレートとして、LA Taq polymerase(TaKaRa)を用い、製品プロトコルに従って、100pmolのM13 reverseプライマーを含むPCR反応液100μLを調製した。94℃を3分、55℃を5分、続いて72℃を2時間で相補鎖伸長反応を行った。
1011細胞/μL以下の濃度の大腸菌(E.coli JM109株)の菌液を107倍に希釈した菌液(103〜104細胞)に、1pg(約3.4x105分子)のpUC19を混合したものを鋳型(混合テンプレート)に使用したこと、およびpUC19のbla遺伝子(アンピシリン耐性遺伝子)の配列を基にして設計した以下の表3に示すRNAプライマーを使用したことのほかは、実施例1と同様の方法によって第1の増幅反応を行った。なお、対照として、鋳型を用いない増幅反応も行った。
以下の点を除き、実施例1と同様にして第1の増幅反応を行った。鋳型としては、1011細胞/μL以下の濃度の大腸菌(E.coli JM109株)の菌液を107、108、109、または1010倍に希釈した希釈大腸菌菌液(数〜104細胞)と、1011細胞/μL以下の濃度のシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescense)ATCC17400株の菌液を107、108、109、または1010倍に希釈した希釈シュードモナス菌液(数〜104細胞)と、同希釈倍率の希釈大腸菌菌液および希釈シュードモナス菌液を1:1で混合したものとを使用した。シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescense)ATCC17400株は非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)遺伝子を保持しているため、第1の増幅反応におけるRNAプライマーとしては、NRPSの配列をもとに設計した以下の表6に示すプライマーを用いた。
Claims (10)
- 標的DNAを含む環状DNAに、1種類の、標的DNAに対する特異的なプライマーを結合させ、次いで、鎖置換型DNA合成酵素を用いて一本鎖DNAを合成する工程を含むことを特徴とする、サンプルに含まれる標的DNAの特異的増幅方法。
- 合成された一本鎖DNAの相補鎖を合成して二本鎖DNAを合成する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 一本鎖DNAを合成する工程の前に、DNA結合酵素を用いて標的DNAを含む環状DNAを合成する工程を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 標的DNAに対する特異的なプライマーが非DNA核酸プライマーである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 非DNA核酸プライマーがRNAプライマーである、請求項4に記載の方法。
- 鎖置換型DNA合成酵素、鎖置換型DNA合成反応用緩衝液、およびデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
- 非DNA核酸プライマーを含む、請求項6に記載のキット。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法によって合成された核酸を検出することを含む、標的DNAの検出方法。
- 標識ヌクレオチドアナログを用いて請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法を行うことを特徴とする、標識DNAの製造方法。
- 標識ヌクレオチドアナログ、DNA結合酵素、鎖置換型DNA合成酵素、鎖置換型DNA合成反応用緩衝液、およびデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項9に記載の方法を行うためのキット。
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