CN105255858B - 一种变换核酸基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种变换核酸基因型的方法，其包括步骤：提供含有不同等位基因型的混合标本，对其中一种特定基因型核酸片段进行选择性破坏；利用被选择性破坏后的断裂片段以其他等位基因的目的基因型核酸片段作为模板进行核酸延伸反应；后面两个步骤的重复进行。本发明的方法在基因定性与定量分析方面具有应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及医学诊断和生物技术。
背景技术
选择性扩增核酸和选择性破坏核酸，在核酸分析领域已有许多成功的应用例证。一个选择性扩增核酸的最有价值的例子是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。PCR因其应用十分广泛，已获诺贝尔奖。另一个选择性扩增核酸的例子是采用一定比例的双脱氧单核甘酸介导的部分链终止法核酸扩增，也即Sanger’s经典测序技术，该技术也已获诺贝尔奖。
两个选择性破坏核酸的例子为采用识别核酸不同碱基的化学试剂对核酸进行部分降解，这是世界上最早出现的实用测序技术即化学裂解法测序，也已获诺贝尔奖。另一例子为核糖核酸酶保护分析用于核糖核酸的定性与定量分析。
核糖核酸酶保护法主要用于实验研究，该方法可用以从细胞中提取出来混杂的RNA样本中鉴定出单独的RNA或多种RNA。此技术可以在即使总浓度很低的情况下鉴定一种或多种已知序列的RNA分子。被提取出来的RNA首先与反义RNA或DNA探针相混合，探针是与被研究的序列相互补的，接下来互补链相互杂交以形成双链RNA(或DNA-RNA杂交分子)。然后将混合物使用具有特异性地切割仅为单链的RNA的核糖核酸酶，而不对双链核酸分子发挥酶解作用。当反应进行完全时，易受影响的RNA区域被降解为非常短的低聚物或单个核苷酸；存留下来的RNA片段是与之前所加进的反义链相互补的RNA，因此包含目的序列。获得保护的目的序列片段通过后续电泳或其他分析技术得以确认。但是，核糖酶保护分析法只应用了选择性破坏核酸，而未同时采用选择性扩增核酸。
上述例证都为单独应用选择性扩增核酸或选择性破坏核酸。但上述例子中的单独反应，在同时含有不同等位基因或野生序列片段和突变片段的混合标本，尤其是当混合标本中的大多数基因片段均为非目的片段而其中稀有的基因型为目的片段时，如何通过技术手段得到较高含量的稀有基因型产物，是常规基因扩增技术难以满足的难点。
而现实世界的许多生物标本，如尿液提取的游离核酸，粪便提取的游离核酸，血液提取的游离核酸，以及动植物的组织核酸提出物等，在用于基因克隆或基因突变分析时的难点是在大多数情况下，是特定目的基因型片段较少，或野生序列片段含量高而突变序列含量过低,以及特定基因片段较短等。一种有用的技术方案为首先对目的基因型片段进行富集。BEAMing技术平台即采用先富集突变序列然后再对其进行分析的技术路线。其存在的缺陷是：(1)富集效率较低；(2)此外，富集需要针对变化多样的不同种可能的突变序列；(3)富集难以对基因组数量巨大的突变序列设计和生产相应的富集材料。尽管PCR结合测序分析存在假阳性,但仍具有高敏感性,临床上得到较广泛应用。但是,当突变片段较设计的引物对包含的范围更段时,PCR不能扩增突变片段,从而测序也无法得到突变片段的信息。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以在混合有不同等位基因或混合有野生与突变基因片段的生物标本中选择性提高目的基因型基因片段的方法。通过破坏特定基因型对应的基因序列，利用DNA聚合酶对上述基因被破坏过程所产生的部分可延伸断裂片段进行延伸反应。延伸反应的产物中已转换基因型的部分在下一次反应中作为模板使用，而未转化基因型的部分产物将被基因破坏反应所破坏。
为了解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种体外变换核酸基因型的方法，其包含如下步骤:
(1)提供含有不同等位基因型的混合标本，其包括目的基因型核酸片段和特定基因型核酸片段；
(2)对其中一种特定基因型核酸片段进行选择性破坏；
(3)利用被选择性破坏后的断裂片段以其他等位基因的目的基因型核酸片段作为模板进行核酸延伸反应；
后面两个反应步骤按照顺序重复进行25-55次。
本发明一优选技术方案，特定基因型的核酸片段被选择性破坏后，产生的断裂片段有两种情形：(A)断裂片段三末端具有与目的基因型核酸片段不配对的碱基，(B)断裂片段三末端不具有与目的基因型核酸片段不配对的碱基。此时，断裂片段上与目的基因型核酸不配对的碱基位于断裂片段的五末端。
本发明一优选技术方案，核酸延伸反应为采用DNA聚合酶介导的化学反应。
作为本发明一优选技术方案，当断裂片段为情况(A)时，采用的DNA聚合酶为具有三末端向五末端外切功能的高保真DNA聚合酶。当断裂片段为情况(B)时，采用的DNA聚合酶为不具有三末端向五末端外切功能的DNA聚合酶。
本发明一优选技术方案，选择性破坏核酸等位基因型为核酸酶介导的具有破坏特定序列的化学反应。
优选地，核酸酶选自天然的限制性核酸内切酶，或者是基因工程核酸酶，包括但不限于CRISPR-cas9核酸酶，锌指核酸酶(ZFNs)，反因子核酸酶(TALENs)中的任意一种。且上述的核酸酶优选耐高温，具体而言例如，耐受95℃的高温而不失活。
本发明的优选技术方案之一，所述化学反应是具有破坏核酸特定序列的非生物酶类的化学试剂介导的化学反应。
本发明一优选技术方案中，其包含步骤如下:提供含有不同等位基因型的混合标本，其包括目的基因型核酸片段和特定基因型核酸片段；目的基因型样本片段通常为突变型基因型核酸片段；该特定基因型核酸片段通常为野生型基因型核酸片段；
在上述的混合样本中，加入对其中特定基因型核酸片段进行选择性破坏的耐高温核酸酶；
在上述混合样本中加入可扩增目的基因型核酸片段的引物和DNA聚合酶进行PCR反应。
在本发明的方法中，还可以在上述PCR反应体系中加入包含有目的基因型核酸片段的突变碱基的寡核苷酸单链。且加入的含有突变碱基的寡核苷酸单链，可以为正向突变碱基的寡核苷酸单链和/或反向突变碱基的寡核苷酸单链。
本发明方法中，耐高温核酸酶为可以耐受95℃的高温而不失活的核酸内切酶，例如耐高温核酸内切酶PstI，HaeIII。
本发明的方法可用于核酸定性和定量分析。
本发明的技术核心为将核酸破坏技术与DNA聚合酶对断裂的核酸片段进行延伸技术相偶联，达到基因型变换的效果。
通常，高保真聚合酶的产物表现出模板依赖性，而低保真聚合酶表现出引物依赖性。本发明中采用的选择性破坏特定基因型基因序列片段的反应，为目的基因型在作为模板获得模板依赖性延伸产物的反应中逐渐成为混合标本中的主要成分，达到基因型体外变换的目的。当不同基因型表现为断裂片段五末端与不会被破坏的基因型片段不完全相同时,使用低保真聚合酶对断裂片段进行延伸，已变换基因型的延伸产物在随后的破坏反应中不被破坏而再次作为目的基因型模板；未变换基因型的延伸产物在随后的破坏反应中被破坏。当不同基因型表现为断裂片段三末端与不会被破坏的基因型片段不完全相同时,使用高保真聚合酶对断裂片段进行延伸，该聚合酶利用其校正功能先对断裂片段三末端进行校正，然后进行模板依赖性延伸，使被破坏的基因型产物变换为目的基因型产物。
选择性破坏核酸是生物领域常用技术，如一些核糖核酸酶可选择性破坏核糖核酸而不破坏脱氧核糖核酸，反之亦然，一些脱氧核酸酶选择性破坏脱氧核糖核酸而不破坏核糖核酸；一些限制性核酸内切酶还能仅仅破坏具有特定序列的核酸，而对其他核酸序列没有破坏作用。具有对特定序列选择性破坏的核酸酶包含限制性核酸内切酶，锌指核酸酶(zinc finger nuclease)，反因子核酸酶(Transcription activator-like effectornuclease)，和CRISPR-cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat sequences-cas9)系统等。除上述蛋白质酶类外，核糖核酸本身也可作为一种核酸酶，破坏特定核酸，该发现在多年前已获诺贝尔奖。一些化学试剂，除前面提到的已得到诺贝尔奖的化学测序法中对单个核酸相关磷脂键具有破坏作用的化学试剂外，铯-EDTA与肽核苷酸结合能对特定序列脱氧核糖核酸进行破坏。
本发明中含有不同等位基因片段的样本，是指样本中包括控制某一性状的不同种类的基因类型，例如可以是指突变型与野生型的混合标本，突变型基因型核酸片段为目的基因型样本片段；野生型基因型核酸片段为待破坏的特定基因型核酸片段。
本发明上述的混合样本中，加入的耐高温核酸酶可以对待破坏的基因型核酸片段进行选择性破坏，耐高温核酸酶优选为耐高温限制性核酸内切酶，可以耐受95℃的高温而不失活。野生型基因型核酸片段含有耐高温限制性核酸内切酶的酶切位点，而与之相对的突变型基因型核酸片段由于碱基发生突变，在其相应的位点则无法被酶切。在一些实施例中，碱基突变点处为某些核酸内切酶的酶切位点，则可以直接添加相应的酶进行PCR反应，进行基因型变换。在另一些实施例中，如果碱基突变点处不是核酸内切酶的酶切位点，则可以通过在该突变点处引入核酸内切酶的酶切位点，进行改造后，然后再混合样本中加入引入酶切位点的该核酸内切酶，然后加入相应可扩增目的基因型核酸片段的引物和DNA聚合酶进行PCR反应，最后得到目的基因型片段。
本发明的关键是在含有不同等位基因片段，如含有突变与野生片段的混合标本中对其中特定基因型片段进行选择性破坏并使其变换为目的基因型基因片段。这一效应通过以下三个反应中的两种或三种来达到目的：选择性破坏一种特定基因型基因片段，将破坏后的断裂片段进行依赖于另种基因型模板的修复，和以另种模板的延伸反应实现基因型的变换。
特定基因型的核酸片段被破坏后，产生的断裂片段的三末端有两种情形：一种是三末端具有与目的片段不配对的碱基，另一种是三末端不具有与目的基因型核酸片段不配对的碱基。后一种情形，断裂片段上与目的基因型核酸不配对的碱基位于断裂片段的五末端。
对于上述破坏反应后出现的第一种情形，基因型变换采用高保真聚合酶。此时，这种体外基因型的变换本身所发生的化学变换位于断裂片段所致位置，在特定基因型片段被破坏变成断裂片段后，具有三末端核酸外切酶的高保真DNA聚合酶以完整未被破坏的目的基因片段为模板，对断裂片段的三末端进行校正修复，然后在有dNTP等聚合反应条件下对其进行延伸反应，实现基因型的变换。
而对于上述破坏反应后出现的第二种情形，基因型变换采用低保真聚合酶。此时，基因型转换这一效应通过以下三个反应中的两种反应来达到目的：选择性破坏一种特定基因型基因片段，和以另种模板的延伸反应实现基因型的变换。
上述基因型的变换本身不需要不同等位基因片段之外的引物参与。反应后达到基因型变换的目的，基因型变换后的混合标本中的基因片段的总量不会增加，变换的是不同基因型的片段数量，或者说，本发明本身是在将一种基因型基因片段变换为另一种基因型基因片段。
当使用针对基因型不同的位置之外侧翼序列设计的引物，则可达到在基因型变换的同时，增加标本中基因片段的绝对数量。在这里，外侧引物的作用是增加基因片段的数量，而基因型的变换，则与有无使用引物没有关系。
本发明中，提供含有不同等位基因型的混合标本，可以采用本发明的实施例1或实施例4的方法来制备得到，可以根据具体的不同等位基因的情况进行制备，或者直接采用化学合成法合成,且这些制备方法为本领域常规的技术手段，是本领域技术人员公知和惯用的技术手段。当然，不同等位基因型的混合标本还可以通过医院临床提供的可疑病人样本或者各种医疗机构、研究机构提供的样本而获得。
本方法破坏的基因型可以是一种或多种，变换的目的基因型同样可以是一种或多种。但通常情况下，破坏的基因型为一种。这一点，对于肿瘤的早期检测，具有敏感和高效的价值。肿瘤是由突变所导致，利用基因体外变换技术，在诊断肿瘤相关突变时，只需要破坏野生序列这样一种特定的基因型，而对于待测标本中可能存在的不同基因突变型，则均可成为目的基因型，从而达到针对肿瘤热点突变的不同突变类型设计方便和高效的检测技术体系。基因型变换技术，还可用于一些耐药突变的早期诊断，以及用于检测自然环境中生物物种的基因变异。本发明采用的是通过重复使用选择性破坏特定基因型核酸序列并将已断裂的核酸片段通过以另种不被破坏的基因型片段为模板进行延伸，转化为目的所需要的基因型片段。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为野生型APC质粒测序图谱。
图2为含有APC热点突变的突变型APC质粒测序图谱。
图3为内切酶PstI消化野生型APC质粒的PCR产物后的电泳图。其中，从左到右，第1泳道为100bp标准参照，第2泳道为PCR产物，第3泳道为PCR产物PstI消化产物上样量为5ul。电泳图显示第3泳道野生型片段完全被消化。
图4为基因型转换后的基因片段用内切酶PstI消化检测的电泳图。其中，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为野生与突变为3比1比例，第3泳道为野生与突变为10比1比例，上样量为5ul。电泳图显示1泳道野生型可以被完全消化，第2、3泳道加入Oligo后片段全部转变成突变型，无法被限制性内切酶PstI消化。
图5为在引物存在下的对APC野生基因型进行转换,PCR后加PstI消化的电泳图。其中，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为加OligoA+，第3泳道为加OligoA-，第4泳道为同时加OligoA+和OligoA-。本实验结果显示长度较短的突变序列片段的存在能导致野生片段的基因型转换。
图6为TP53的电泳图，其中，第1泳道为100bp DNA标准参照，第2泳道为纯野生型对照，第3-6泳道依次为W/T30:1、300:1、3000:1、30000:1。本实验结果显示，基因破坏与基因延伸偶联，在有突变片段存在时，能导致野生型基因片段转化为耐限制性酶消化的突变型基因片段。而仅有野生型片段时，基因破坏与基因延伸偶联则不能导致野生型基因片段向突变型基因片段的转化。
图7为实施例3的测序图谱。
图8为TP53野生型基因片段质粒测序图谱。
图9为TP53突变型基因片段质粒测序图谱。
图10为内切酶Hae III消化野生型TP53质粒的PCR产物后的电泳图；其中，从左到右，第1泳道为100bp标准参照，第2泳道为PCR产物，第3泳道为PCR产物Hae III消化产物上样量为5ul。
图11为在引物存在下的对TP53野生基因型进行转换,PCR后加Hae III消化的电泳图。其中，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为加Oligo TP53+，第3泳道为加OligoTP53-，第4泳道为同时加Oligo TP53+和Oligo TP53-。第5-8泳道依次为W/T30:1、300:1、3000:1、30000:1,第9泳道为50bp标准参照。实验结果显示，短的突变型寡核苷酸，和等长的突变型PCR产物，均能使野生序列转变为突变片段。野生片段能被核酸酶消化，而突变片段不能被核酸酶裂解。本实验中当野生片段与突变片段比例为30:1时，野生片段基本转换成为突变片段；当该比例为300:1时，部分野生片段转化为突变片段。
图12为实施例5中PCR完成后使用HaeIII酶对PCR产物进行酶切验证。
图13为实施例5中使用Taq酶进行PCR扩增，得到大量突变型基因序列后使用HaeIII酶酶切验证图谱。
图14为野生型序列PCR产物用HaeIII酶消化后电泳图。
图15为PCR反应完成后再用限制性内切酶HaeIII进行消化电泳图。
图16为W/T＝10:1基因转换实验测序图。
图17为W/T＝100:1基因转换实验测序图。
图18为W/T＝1000:1基因转换实验测序图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
此次实施例中所用的引物和Oilgo均为化学合成。PMD-19T质粒购自美国promega公司，耐高温核酸内切酶PST1，HaeIII酶购自美国Fermentas，Taq酶，高保真DNA聚合酶购自美国Fermentas。
一、对APC基因4012C>T基因型的转换实验：APC基因突变与多种肿瘤的发生和药物敏感性密切相关。本实施例针对APC基因4012C>T突变开展基因型的转换实验。
实施例1利用短的突变序列对APC野生序列进行基因型转换。
(一)：野生与突变模板的制备
APC4012C>T基因突变附近的序列如下(cDNA上4012处CTGCAG→CTGTAG)：
APC野生型基因片段序列，如Seq No.1所示，长度195bp；APC突变型基因片段序列，如Seq No.2所示。
为制备相关模板，使用下列四条引物：
P1+:GCTAAGCTTAGATCCTGTGAGCGAAG，如Seq No.3所示；
P1-:GCTGGATCCAGATTTCGCTCCTGAACA，如Seq No.4所示；
P2+:AACCCTACAGTCTGCTGGATTTGGTTC，如Seq No.5所示；
P2-:CCAGCAGACTGTAGGGTTCTAGTTTATC，如Seq No.6所示。
1.野生型模板构建操作步骤:
以基因组DNA为模板，P1+和P1-为引物，PCR，切胶纯化产物，用HindIII和BamHI酶切PCR产物，胶纯化；同时用HindIII和BamHI酶切PMD-19T质粒，切胶纯化。将纯化的PCR产物与PMD-19T载体连接，转化DH5α大肠杆菌，挑克隆送测序。
2.突变型模板构建操作步骤：
采用重叠延伸PCR的方法构建突变型质粒。以野生型质粒为模板，P1+和P2+为引物PCR，得到产物A，再以P1-和P2-为引物PCR，得到产物B，再以产物A和B为模板，P1+和P1-为引物PCR，达到大片段终产物。用HindIII和BamHI酶切PCR产物，切胶纯化产物，将纯化的PCR产物与PMD-19T载体连接，转化DH5α大肠杆菌，挑克隆送测序。
(二)将前述制备的野生型质粒PCR扩增APC基因片段，用PstI酶消化产物
引物序列:
APB+:AGCTAAGCTTA GAT CCT GCG AGC GAAG，如Seq No.7所示；
APB-:AGCTTCTAGACATGAGTGGGGTCTCC，如Seq No.8所示；
以野生型APC质粒为模板，APB+和APB-为引物，高保真DNA聚合酶的作用下PCR，得到APC野生型基因片段产物。再将PCR产物用PST1酶37℃孵育，消化完全，取消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。其中，限制性内切酶PstI识别位点CTGCAG。
PCR体系如下
以上体系在PCR仪上按如下程序反应：95℃预变性2分钟，进入三步循环(95℃-10秒钟、58℃-15秒钟、72℃-15秒钟共35个循环)。反应完成后再用限制性内切酶PstI进行消化，取5微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图3。图中从左到右，第1泳道为100bp标准参照，第2泳道为PCR产物，第3泳道为PCR产物，PstI消化产物上样量为5ul，电泳图显示3泳道野生型片段完全被消化。
(三)基因型转换
合成寡核苷酸单链
OligoA+:GCACCAAATCCAGCAGACTGTAGGGTTCTAGTTTATCTTC，如Seq No.9所示；
OligoA-:GCAGATAAACTAGAACCCTACAGTCTGCTGGATTTGGTTC，如Seq No.10所示；
1.将野生PCR产物消化后片段与正向寡核苷酸单链(OligoA+，如Seq No.9所示)按照3:1-10:1比例混合，例如按照1.5×1011:0.5×1011和1.5×1011:1.5×1010的拷贝数比例混合，体系内加入耐高温核酸内切酶PST1酶和Oligo A+片段。
PCR体系如下
以上体系在PCR仪上按如下程序反应：先37℃-10分钟,接着95℃预变性2分钟，进入三步循环(95℃-10秒钟、58℃-15秒钟、72℃-15秒钟、37℃-5分钟共40个循环)，最后72℃延伸10分钟；4℃过夜。
2.反应完成后再用限制性内切酶PstI进行消化，取5微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图4，其中，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为野生与突变为3比1比例，第3泳道为野生与突变为10比1比例，上样量为5ul。电泳图显示1泳道野生型可以被完全消化，2、3泳道加入Oligo后片段全部转变成突变型，无法被限制性内切酶PstI消化。
实施例2 在引物存在下的对APC野生基因型进行转换
以实施例1中(二)部分制备的消化完全的PCR产物为模板，分别加入正常引物浓度1/10的OligoA+、OligoA-、OligoA+和OligoA-到PCR体系中。PCR反应后分别加PST1消化，取消化后的产物进行琼脂糖电泳。
PCR体系如下
以上体系在PCR仪上按如下程序反应：先37℃-10分钟,接着95℃预变性2分钟，进入三步循环(95℃-10s、58℃-15s、72℃-15s、37℃-5分钟共40个循环)，反应完成后再用限制性内切酶PstI进行消化，取5微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到图5的电泳图。其中，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道加OligoA+，第3泳道加OligoA-，第4泳道同时加OligoA+和OligoA-。本实验结果显示长度较短的突变序列片段的存在能导致野生片段的基因型转换。
实施例3.利用PCR引物对APC基因PCR产物进行基因型转换
将野生PCR产物消化后片段与突变型片段按照30:1300:13000:130000:1的拷贝数比例混合，PCR反应体系中加入耐高温核酸内切酶，进行PCR，PCR后进行短暂时间的消化，2％琼脂糖凝胶电泳。
PCR体系如下：
以上体系在PCR仪上按如下程序反应：37℃-10分钟,接着95℃预变性2分钟，进入三步循环(95℃-10秒钟、58℃-15秒钟、72℃-15秒钟、37℃-5分钟共40个循环)。
反应完成后再用限制性内切酶PST1进行消化，取6微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图6，其中，从左到右，第1泳道为100bp DNA标准参照，第2泳道为纯野生型对照，第3-6泳道拷贝数比例依次为W/T30:1、300:1、3000:1、30000:1。本实验结果显示，基因破坏与基因延伸偶联，在有突变片段存在时，能导致野生型基因片段转化为耐限制性酶消化的突变型基因片段。而仅有野生型片段时，基因破坏与基因延伸偶联则不能导致野生型基因片段向突变型基因片段的转化。
将上述拷贝数比例W/T为30000:1样本的PCR产物送测序，得到测序图谱7，显示大的产物为突变型。
二、TP53基因747位点G>T突变型片段的基因型转换
实施例4 TP53(747G>T)突变型片段在引物存在下的基因型转换
(一)野生型基因片段模板与突变型基因片段模板的制备
TP53基因突变附近的序列如下(cDNA747上处GGCC→GTCC)：
TP53野生型基因片段序列：如Seq No.11所示，TP53突变型基因片段序列：如SeqNo.12所示。
为制备相关模板，使用下列引物：
P53W+:AGCTGGTCGACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATG，如SeqNo.13所示。
P53W-CAGCTGGATCCGTCTTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGC，如SeqNo.14所示。
P53W+:AGCTGGTCGACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATG，如SeqNo.13所示。
P53T-:CAGCTGGATCCGTCTTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGACTCCGGTTCATGC,如SeqNo.15所示。
1.野生型模板构建操作步骤:
以TP53基因组DNA为模板，P53W+和P53W-为引物进行PCR，切胶纯化PCR产物，用HindIII和BamHI酶切PCR产物，胶纯化；同时用HindIII和BamHI酶切PMD-19T质粒，切胶纯化；将纯化的PCR产物与PMD-19T载体连接，然后转化DH5α大肠杆菌，最后挑克隆送测序,如图8所示，显示构建成功。
2.突变型模板构建操作步骤：
以前面构建的野生型质粒为模板，P53W+和P53T-为引物进行PCR，切胶纯化产物，用HindIII和BamHI酶切PCR产物，切胶纯化产物，将纯化的PCR产物与PMD-19T载体连接，然后转化DH5α大肠杆菌，最后挑克隆送测序，如图9所示，显示构建成功。
(二).将野生型的质粒用HaeIII酶37℃孵育，至消化完全
限制性内切酶HaeIII识别位点GGCC
P53M+：CTTCTAGACATCCACTACAAC,，如Seq No.16所示；
P53M-：GCTGGATCCGTCTTCCAGTG，如Seq No.17所示。
OligoTP53+：
GGGCGGCATGAACCGGAGTCCCATCCTCACCATCATCA，如Seq No.18所示；
OligoTP53-:TGATGATGGTGAGGATGGGACTCCGGTTCATGCCGCCC，如Seq No.19所示。
以前述制备得到的野生TP53质粒为模板，P53M+和P53M-为模板，高保真DNA聚合酶的作用下进行PCR，再将PCR产物用HaeIII进行消化，将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。PCR体系如下
以上体系在PCR仪上按如下程序反应：95℃预变性2分钟，进入三步循环(95℃-10秒钟、55℃-15秒钟、72℃-15秒钟共35个循环)。
反应完成后再用限制性内切酶HaeIII进行消化，取5微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图10，其中，从左到右，第1泳道为100bp标准参照，第2泳道为PCR产物，第3泳道为PCR产物HaeIII消化产物，上样量为5ul。
(三).在引物存在下的对TP53野生基因型进行转换
以上述消化完全的PCR产物为模板，分别加入正常引物浓度1/4的OligoTP53+、OligoTP53-、OligoTP53+和OligoTP53-到PCR体系中，同时将野生PCR产物消化后片段与突变型片段按照30:1300:13000:130000:1的比例混合，PCR反应体系中加入耐高温核酸内切酶，进行PCR，PCR后进行短暂时间的消化，PCR后分别加HaeIII消化，取消化后的产物进行琼脂糖电泳。
PCR体系如下：
以上体系在PCR仪上按如下程序反应：37℃-10分钟,然后95℃预变性2分钟，进入三步循环(95℃-10秒钟、55℃-15秒钟、72℃-15秒钟共35个循环)，最后37℃-10分钟。
反应完成后再用限制性内切酶HaeIII进行消化，取6微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图11，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为加OligoA+，第3泳道为加OligoA-，第4泳道为同时加Oligo TP53+和Oligo TP53-。第5-8泳道依次为W/T30:1、300:1、3000:1、30000:1,第9泳道为50bp标准参照。.实验结果显示，短的突变型寡核苷酸，和等长的突变型PCR产物，均能使野生序列转变为突变片段。野生片段能被核酸酶消化，而突变片段不能被核酸酶裂解。本实验中当野生片段与突变片段比例为30:1时，野生片段基本转换成为突变片段；当该比例为300:1时，部分野生片段转化为突变片段。
三、CDH1基因67位点C>T突变型片段的基因型转换
CDH1基因c.67位点C>T突变型片段的基因型转换
实施例5 CDH1(c.67C>T)突变型片段在引物存在下的基因型转换
(一)野生型基因片段模板与突变型基因片段模板的制备
为制备CDH1基因相关模板，合成下列寡核苷酸单链：
WCDOLIGO1:TCTCCTCTTGGCTCTGCCAGGAGCCGGAGCCCTGCCACCCTGGCTTTGACGCCGAGAG，如Seq No.20所示；
WCDOLIGO2:AGGACGCGGCCTCTCTCCAGGTGGCGCCGGGGCACCGTGAACGTGTAGCTCTCG，如Seq No.21所示。
MCD+：ATGACTGAACTGTCTCCTCTTGGCTCGGC，如Seq No.22所示；
MCD-：AATAGGACGCGGCCTCACTCCAG，如Seq No.23所示；
TCD+：TCTCCTCTTGGCTCGGCTAGGAGCCGGAGCCCT，如SeqNo.24所示。
1.野生型模板构建操作步骤:
将WCDOLIGO1和WCDOLIGO2两条单链DNA互为模板和引物，进行PCR扩增，得到大量野生序列模板。
2.野生型模板引入酶切位点操作步骤：
将上述得到的野生型序列作为模板，MCD+和MCD-为引物，使用Taq酶进行PCR扩增。引入HaeIII酶切位点GGCC。PCR完成后使用HaeIII酶对PCR产物进行酶切验证，如图12所示，显示引入酶切位点成功。
3.突变型模板构建操作步骤：
将上述得到的成功引入酶切位点的野生型序列为模板，TCD+和MCD-为引物，使用Taq酶进行PCR扩增，得到大量突变型基因序列。使用HaeIII酶酶切验证，如图13所示，其中，从左到右，第1泳道为100bp标准参照，第2泳道为未酶切的野生型PCR产物，第3泳道为酶切后的野生型HaeIII消化产物，第3泳道为酶切后的突变型HaeIII消化产物，电泳结果显示突变型序列构建成功。
(二).将野生型序列PCR产物用HaeIII酶37℃孵育，至消化完全。取5微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图如图14所示，其中，从左到右，第1泳道为100bp标准参照，第2泳道为野生型序列PCR产物，第3泳道为野生型PCR产物HaeIII消化产物，上样量为5ul。
(三).在引物存在下对CDH1野生基因型进行转换
以上述消化完全的PCR产物为模板，以MCD+和MCD-为引物，同时将野生PCR产物消化后片段与突变型片段按照10:1,100:1,1000:1的比例混合作为扩增模板，PCR反应体系中加入耐高温核酸内切酶HaeIII，进行以Pfu酶介导的PCR扩增。PCR后分别加HaeIII消化，取消化后的产物进行琼脂糖电泳。
PCR体系如下：
以上体系在PCR仪上按如下程序反应：95℃预变性5分钟，进入三步循环(95℃-15秒钟、55℃-20秒钟、72℃-10秒钟、37度-10分钟共40个循环)。
反应完成后再用限制性内切酶HaeIII进行消化，取6微升反应液在2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图15，从左到右，第1泳道为100bp标准参照，第2泳道为纯野生序列模板对照，第3泳道为W/T＝10:1，第4泳道为W/T＝100:1，第5泳道为W/T＝1000:1。实验结果显示等长的突变型PCR产物，能使野生序列转变为突变片段。野生片段能被核酸酶消化，而突变片段不能被核酸酶裂解。W/T＝10:1、W/T＝100:1、W/T＝1000:1的基因转换实验测序图如图16-18所示。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种变换核酸基因型的方法，其特征在于，其包含如下步骤：
(1)提供含有不同等位基因型的混合样本，其包括目的基因型核酸片段和特定基因型核酸片段；
(2)在步骤(1)的混合样本中，加入对其中一种特定基因型核酸片段进行选择性破坏的耐高温核酸内切酶；所述选择性破坏特定基因型核酸片段为所述核酸内切酶介导的破坏特定序列的化学反应，所述核酸内切酶选自天然的核酸内切酶，或者是基因工程核酸内切酶；
(3)在所述混合样本中加入用于扩增目的基因型核酸片段的引物和DNA聚合酶，利用被选择性破坏后的断裂片段以其他等位基因的所述目的基因型核酸片段作为模板进行DNA聚合酶介导的PCR反应；
其中，在步骤(2)的选择性破坏产生的断裂片段为以下情形(A)时，在步骤(3)中加入的所述DNA聚合酶为具有三末端向五末端外切功能的高保真DNA聚合酶：(A)断裂片段三末端具有与目的基因型核酸片段不配对的碱基；
在步骤(2)的选择性破坏产生的断裂片段为以下情形(B)时，在步骤(3)中加入的DNA聚合酶为不具有三末端向五末端外切功能的DNA聚合酶：(B)断裂片段三末端不具有与目的基因型核酸片段不配对的碱基，此时，断裂片段上与目的基因型核酸不配对的碱基位于断裂片段的五末端；
并且其中，步骤(2)的对其中一种特定基因型核酸片段进行选择性破坏和步骤(3)的PCR反应中的核酸延伸反应重复进行25-55次。
2.根据权利要求1所述的变换核酸基因型的方法，其特征在于，在步骤(2)中的所述耐高温核酸内切酶为耐95℃的核酸内切酶。
3.根据权利要求1所述的变换核酸基因型的方法，其特征在于，在步骤(3)的进行所述PCR反应的体系中还加入包含有目的基因型核酸片段的突变碱基的寡核苷酸单链，作为引物待测模板进行反应。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201510684160.7A CN105255858B (zh) | 2015-10-20 | 2015-10-20 | 一种变换核酸基因型的方法 |
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| A real-time polymerase chain reaction assay for quantification of allele ratios and correction of amplification bias;Weber M et al;《Analytical Biochemistry》;20030915;第320卷(第2期);摘要、第253页"Materials and methods"，第254页 "Results and discussion"，图1-3 * |
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