JP2019504629A - Dna配列の標的特異的rna転写のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年2月12日出願の米国仮特許出願第62/294,875の利益を主張するものであり、その内容は、全体において参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書には、望ましい遺伝子位置にタグを挿入することによって望ましい遺伝子位置から配列を得る方法が開示される。場合によっては、タグは、遺伝子標的化技術、例えばCRISPR、TALENS、ジンクフィンガー、トランスポサーゼ、及び当業者に既知の他の方法を使用して、望ましい遺伝子位置に挿入される。タグは、望ましい遺伝子位置から増幅を可能にする配列を含むように設計される。タグは、望ましい増幅の方法に依存して選択される。場合によっては、望ましい遺伝子位置は転写により増幅される。望ましい遺伝子位置が転写により増幅されると、タグはプロモーター配列、例えば、T7、T3、SP6、又は他のバクテリオファージプロモーターなどのバクテリオファージプロモーターを含むように設計される。プロモーター配列は、場合によっては、pL、CMV、SV40、CaMV35S、又は他のウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターである。場合によっては、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、ALB、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、U6、又は他の哺乳動物プロモーターなどの哺乳動物プロモーターを使用することが望ましい。場合によっては、プロモーターはRNAポリメラーゼIプロモーターである。場合によっては、プロモーターはRNAポリメラーゼIIプロモーターである。場合によっては、プロモーターはRNAポリメラーゼIIIプロモーターである。場合によっては、プロモーターはRNAポリメラーゼIVプロモーターである。場合によっては、プロモーターはRNAポリメラーゼVプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、単一のサブユニットRNAポリメラーゼプロモーターである。
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EQ ID NO:445)、AGTCAGGAAACAACAGATGC(SEQ ID NO:446)、CGATAGTTTGCTGAGAATGA(SEQ ID NO:447)、AATTTTCAGCTTTTCTGCTC(SEQ ID NO:448)、ATACCCAGTAATGGGATTGC(SEQ ID NO:449)、GAGGAGCTGCGTTCCTTTGG(SEQ ID NO:450)、AATTGAACAATGAGAACACT(SEQ ID NO:451)、AATGCTAAATGACGAGTTAA(SEQ ID NO:452)、TTTTTTGCTTTCCATTTGCT(SEQ ID NO:453)、ATGAATGAAATGAAGTGAGA(SEQ ID NO:454)、ATTCTCAGCAAACTATCGCA(SEQ ID NO:455)、CAAGTTGGAAAACACTCTTC(SEQ ID NO:456)、ATCATTCTGATACCAAAGCC(SEQ ID NO:457)、ACAACCTACTCATCTGACAA(SEQ ID NO:458)、TAGCATCAACATCAACAAAA(SEQ ID NO:459)、CAGTTTCTTCCTAGCCTTGA(SEQ ID NO:460)、AATTTGGCTGTGAATCCATC(SEQ ID NO:461)、TTTGTGGTTTTATCTACCTT(SEQ ID NO:462)、GCTGATGGAGCTGAAAGCCA(SEQ ID NO:463)、TTAACTCGTCATTTAGCATT(SEQ ID NO:464)、TGATAGTTTGCTGAGAATGA(SEQ ID NO:465)、GTTTTGCCAGTATTTTATTG(SEQ ID NO:466)、ATCCAGCTTTGTTCTGTTGC(SEQ ID NO:467)、AAGAACTTGCTTTATGAATC(SEQ ID NO:468)、CCTGACCCCTTGCGCTTCCC(SEQ ID NO:469)、TTGGGAGGGTGTATGTGTCG(SEQ ID NO:470)、CAGACTAACAGCAGATCTCT(SEQ ID NO:471)、TTGCTGCCTGATCCTTCCTC(SEQ ID NO:472)、TCTAAAATTGACCACATAAT(SEQ ID NO:473)、CTCAAAGCCGCTCAACTACA(SEQ ID NO:474)、ATACAAAAATTAACTCAAGA(SEQ ID NO:475)、ACAGACGGCACCTGGAAAAT(SEQ ID NO:476)、TCACCAACATCAAAGACCAA(SEQ ID NO:477)、GTCCAGCTTTGTTCCGTTGC(SEQ ID NO:478)、ATACCCAGGCAAACAGGGTC(SEQ ID NO:479)、CGCCACACTGTCTTCCACAA(SEQ ID NO:480)、CTTCCAATACTATGTTGAAT(SEQ ID NO:481)、AGCAGCCGGGAAGCTCGAAC(SEQ ID NO:482)、ACTCCTATTCAACATAGTAT(SEQ ID NO:483)、GTGTTTTACTTCCAATTATG(SEQ ID NO:484)、AAAGGGATCAATTCAACAAG(SEQ ID NO:485)、AATGAGACAGAAAGTTAACA(SEQ ID NO:486)、GACGGACGCACCTGGAAAAT(SEQ ID NO:487)、CTTGAGTTAATTTTTGTATA(SEQ ID NO:488)、AAAATTTTCTCCCATGTTGT(SEQ ID NO:489)、GAAAATCCTCAATAAAATAC(SEQ ID NO:490)、TTTCTCCTGCCTGATTGCCC(SEQ ID NO:491)、ATATTAGCCCTTTGTCAGAT(SEQ ID NO:492)、GGTAACCCAACCTTTCTCTC(SEQ ID NO:493)、AAACTATCATCAGAGTGAAC(SEQ ID NO:494)、AAAACAGATATATAGACCAA(SEQ ID NO:495)、TGCCTCACCTGGGAAGCGCA(SEQ ID NO:496)、TGCCATTGCTTTTGGTGTTT(SEQ ID NO:497)、AGGAAGATCTACCAAGCCAA(SEQ ID NO:498)、TGCCTTTTTTTGTTTTCCAT(SEQ ID NO:499)、ATTCTCAGCAAACTATCACA(SEQ ID NO:500)、CTGGACTTTTTTTGGTTGGT(SEQ ID NO:501)、CAGTTTCTTCCTAGCCTCGA(SEQ ID NO:502)、TAGGAACACTTTTACACTGT(SEQ ID NO:503)、ACGAGACTATATCCCACACC(SEQ ID NO:504)、GAATATTGCGCTTTTCAGAC(SEQ ID NO:505)、TTTGAGTTCTTTGTAGATTC(SEQ ID NO:506)、ATGCACATGTATGTTTATTG(SEQ ID NO:507)、TCAGGGATTCAACTTCTTCC(SEQ ID NO:508)、ATGCACACATATGTTTATTG(SEQ ID NO:509)、GCAGGGCATAGCTGAACAAA(SEQ ID NO:510)、TCAGATCTCCAGCTGCATGC(SEQ ID NO:511)、AATAACAAGTTCTGAAATTG(SEQ ID NO:512)、TGTGAGATGATATCTCATAG(SEQ ID NO:513)、ATCATCCTGATACCAAAACC(SEQ ID NO:514)、AGGCCTCTGTTCTGTTCCAT(SEQ ID NO:515)、TGACCCCCGAGTAGCCTAAC(SEQ ID NO:516)、GCCCACGCCTATGTCCTGAA(SEQ ID NO:517)、TCAATTTCAGAACTTGTTAT(SEQ ID NO:518)、TACCATTCAGGACATAGGCG(SEQ ID NO:519)、CACCACATGTTCTCACTCAT(SEQ ID NO:520)、AGGACCCTCTGAGCCAGGTG(SEQ ID NO:521)、CATAATTGTCAGATTCACCA(SEQ ID NO:522)、and GAAGACCTTAAATGACCTGA(SEQ ID NO:523)。配列は5’から3’まで提示される。
本明細書に提供される方法によって、配列決定するのが困難となる当業者に既知の配列を有する核酸分子から的確且つ正確な配列情報を得ることが可能になる。本明細書の方法は、開始ゲノムDNA鋳型から直接線形の方法で増幅される、標的とされた核酸配列を使用する。当業者によって理解されるように、配列決定するのが困難であるゲノム領域は、TaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼによって引き起こされた、挿入、欠失、および置換などの、複製エラー率が増大したと知られている特性を有している。PCRなどの増幅方法では、これらのエラーは、増幅の各ラウンドで引き継がれ、元の鋳型を反映しない増幅特異的な配列決定の誤差を作り出す。
本明細書に開示される方法は、ゲノムDNA鋳型からの線形増幅された核酸の精製を提供する。幾つかの事例では、精製の方法は酵素法であり、それによって、ゲノムDNA鋳型は1つ以上のDNaseを使用して消化される。代替的に、精製の方法は、親和性に基づく精製であり、それによって、結果として生じる増幅核酸は標識され、および抗体などの試薬は標識された増幅核酸に結合し、結合していないゲノムDNA鋳型は結合された増幅核酸から洗い流される(washed away)。精製の方法はまた、蛍光ベースで選別する精製であると考えられ、それによって、蛍光標識された増幅核酸は、標識されていないゲノムDNA鋳型から選別されて除外される(sorted away)。増幅核酸が、増幅の各ラウンドの後に増幅反応から精製される、さらなる精製法が含まれる。さらなる方法では、増幅核酸は、増幅反応が完了した後に精製される。
本明細書には、ライブラリー構成分子がゲノムまたは他の核酸源内の可動因子位置を特定するために可動因子境界および可動因子に隣接する配列の両方を有するように核酸分子において対にされた、可動因子の縁または境界および可動因子に隣接するゲノム配列あるいは他の非可動因子の配列を含む分子を含む核酸ライブラリーが開示される。
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるようなライブラリーの産生に従って生成された核酸などの、線形増幅された核酸を配列決定する工程を随意に含む。幾つかの場合では、該方法は、線形増幅された核酸に対する配列決定に必要とされるオリゴヌクレオチドをアニールする工程を含む。幾つかの場合では、配列決定は、線形増幅された核酸に対する配列決定に必要とされるオリゴヌクレオチドをライゲートする工程を含む。幾つかの場合では、該方法は、線形増幅された核酸を配列決定するためにアダプター配列またはその部分を利用する工程を含む。
分子ビーコン、TaqManレポータープローブ消化、パイロシークエンシング、蛍光インサイチュ配列決定(fluorescent in situ sequencing)(FISSEQ)、FISSEQビーズ、ゆらぎ配列決定(wobble sequencing)、多重配列決定、重合コロニー(POLONY)配列決定;ナノグリッドローリングサークル配列決定(nanogrid rolling circle sequencing)(ROLONY)、対立遺伝子特異的なオリゴライゲーションアッセイ(例えば、オリゴライゲーションアッセイ(OLA)、ライゲートされた線形プローブを使用する単一の鋳型分子OLAおよびローリングサークル増幅(RCA)読み出し、ライゲートされたパドロックプローブ、及び/又はライゲートされた円形のパドロックプローブを使用する単一の鋳型分子OLAおよびローリングサークル増幅(RCA)読み出し)などを含む、様々な配列決定方法から選択される配列決定方法を使用して実行されると考えられる。随意に、Roche 454、Illumina Solexa、ABI−SOLiD、ION Torrents、Complete Genomics、Pacific Bioscience、Helicos、Polonatorのプラットフォームなどのプラットフォームを使用するサイクリックアレイ配列決定(cyclic array sequencing)などのハイスループット配列決定方法が利用される。
本明細書に開示される方法は、随意に、本明細書に提供される方法から得られた配列を使用して、ゲノム要素、例えば可動遺伝因子をマッピングする工程を含むと考えられる。代替的に、該方法は、CRISPRなどのゲノムDNA編集技術を使用する、ゲノム要素への、T7プロモーターなどのプロモーターを含む、核酸タグなどのタグの挿入を含む。
RNA分子は、挿入されたタグから転写され、これによって、ゲノム要素に隣接しているDNAと同じ配列を有するRNAの線形増幅が可能になる。線形増幅された核酸から得られた配列は、ゲノムにおいて、得られた配列を、参照ゲノムに利用可能な配列、例えばヒトゲノム配列と比較することによって対応する位置を見つけ、それによって、ゲノム要素の挿入をマッピングすることを可能にする。随意に、ゲノム要素の挿入は、遺伝子のコード配列にマッピングされる。代替的に、ゲノム要素の挿入は、遺伝子のイントロンにマッピングされる。ゲノム要素の挿入が、遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー配列にマッピングされることも考えられる。随意に、ゲノム要素の挿入は、遺伝子の5’または3’の非翻訳領域にマッピングされる。
本明細書には、従来の配列決定方法を使用する配列決定の困難性または課題を露呈する、つまり、ポリヌクレオチドを配列決定するのが困難なゲノムの領域を配列決定する方法が提供される。幾つかの場合では、ポリヌクレオチドを配列決定することの困難性は、低複雑性のポリヌクレオチド、反復ポリヌクレオチド、ジ−ヌクレオチドのリピートポリヌクレオチド(repeat polynucleotides)、トリ−ヌクレオチドのリピートポリヌクレオチド、GCが豊富なポリヌクレオチド、二次構造を有するポリヌクレオチド、5’−YGN1−2ARモチーフを有するポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含む。幾つかの場合では、ポリヌクレオチドを配列決定することの困難性は、CAGリピート、CGGリピート、GCCリピート、GAAリピート、またはCTGリピートなどの、トリヌクレオチドリピートを含む。幾つかの場合では、ポリヌクレオチドを配列決定することの困難性は、HLA−A遺伝子、HLA−B遺伝子、HLA−C遺伝子、HLA−E遺伝子、HLA−F遺伝子、HLA−G遺伝子、HLA−DP遺伝子、HLA−DQ遺伝子、またはHLA−DR遺伝子を含む、HLA遺伝子などの、配列決定することが困難な遺伝子を含む。
関連する定義の部分的なリストは以下の通りである。
Tm=81.5+16.6(log 10[Na+])0.41(%[G+C])−675/n−1.0m、
核酸が0.5M以下のカチオン濃度を有している水溶液中のあるときに、(G+C)含量は30%から70%の間であり、nは塩基の数であり、およびmは塩基対ミスマッチの割合である(例えば、Sambrook J et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)を参照)。他の基準は、より精巧な計算を含み、これは、Tmの計算のために構造的特徴に加えて配列特徴を考慮に入れる。
本明細書における開示は、番号が付けられた実施形態の以下に示す部分的なリストに関してさらに明確にされる。1.核酸分子の既知の配列の領域に隣接している配列を判定する方法であって、該方法はa)核酸分子の既知の領域に、プロモーター配列を含む核酸フラグメントを付着させる工程;b)プロモーターによって方向付けられたNAポリメラーゼに核酸フラグメントを接触させる工程;および、c)複数のRNA分子を合成する工程;を含み、ここで、複数のRNA分子のコンセンサス配列は核酸分子の既知の領域に隣接している配列を表す。2.コンセンサス配列は長さが少なくとも10キロベースである、実施形態1の方法である。3.複数のRNA分子の合成後に、DNaseを使用して核酸分子を処理する工程を含む、実施形態1または2のいずれか1つの方法。4.複数のRNA分子を逆転写する工程を含む、実施形態1〜3のいずれか1つの方法。5.複数のRNA分子の核酸配列を判定する工程を含む、実施形態1〜4のいずれか1つの方法。6.複数のRNA分子のコンセンサス配列は、核酸分子から直接合成された分子の配列を含む、実施形態1〜5のいずれか1つの方法。7.付着工程は、核酸分子の既知の領域にプロモーター配列を含む核酸フラグメントを挿入する工程を含む、実施形態1〜6のいずれか1つの方法。8.付着工程は、核酸分子の既知の配列の領域にプロモーター配列を含む核酸フラグメントを挿入する工程を含む、実施形態1〜7のいずれか1つの方法。9.付着工程は、核酸分子の既知の配列の領域の配列特異的な切断工程を含む、実施形態1〜8のいずれか1つの方法。10.付着工程は、CRISPR核酸タンパク質複合体に、核酸分子の既知の領域を接触させる工程を含む、実施形態1〜9のいずれか1つの方法。11.CRISPR核酸タンパク質複合体は、SEQ ID NO:3を含むガイドRNAを含む、実施形態10の方法。12.付着工程は、プロモーター配列を含む核酸フラグメントをライゲートする工程を含む、実施形態1〜11のいずれか1つの方法。13.プロモーター配列を含む核酸フラグメントは、ウイルスプロモーターを含む、実施形態1〜12のいずれか1つの方法。14.ウイルスプロモーターは、ウイルスRNAポリメラーゼを結合し、およびT7、T3、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、およびCaMV35Sから成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態13の方法。15.プロモーター配列を含む核酸フラグメントは、バクテリアプロモーターを含む、実施形態1〜12のいずれか1つの方法。16.バクテリアプロモーターは、バクテリアRNAポリメラーゼを結合し、およびaraBAD、trp、lac、およびPtacから成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態15の方法。17.プロモーター配列を含む核酸フラグメントは、真核生物プロモーターを含む、実施形態1〜12のいずれか1つの方法。18.真核生物プロモーターは、真核生物のRNAポリメラーゼを結合し、およびEF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、ALB、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、およびU6から成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態17の方法。19.真核生物プロモーターは、RNA pol Iプロモーター、RNA pol IIプロモーター、およびRNA pol IIIプロモーターから成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態17の方法。20.核酸分子の既知の領域は反復要素を含む、実施形態1〜19のいずれか1つの方法。21.反復要素は可動挿入因子を含む、実施形態20の方法。22.反復要素は、LINE要素、SINE要素、Aluリピート、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、セントロメア反復、およびテロメア反復の少なくとも1つを含む、実施形態20の方法。23.LINE要素はSEQ ID NO:1を含む、実施形態20の方法。24.核酸サンプル内の、遺伝子座に隣接する複数の配列を判定する方法であって、該方法は、a)プロモーターを含む核酸を要素に挿入する工程、b)プロモーターによって方向づけられた複数の核酸分子を生成する工程、およびc)複数の核酸分子の配列を判定する工程を含み、ここで、核酸分子は核酸サンプルから直接合成され、および複数の核酸分子は遺伝子座に隣接する配列に及ぶ。25.核酸分子はRNAを含む、実施形態24の方法。26.核酸分子は核酸合成を刺激することができない、実施形態24の方法。27.核酸サンプルは癌細胞核酸を含む、実施形態24の方法。28.核酸サンプルは単一の核ゲノムを含む、実施形態24の方法。29.核酸サンプルは単一細胞から得られる、実施形態24の方法。30.複数のRNA分子の合成後に、DNaseを使用して核酸サンプルを処理する工程を含む、実施形態24の方法。31.複数のRNA分子を逆転写する工程を含む、実施形態24の方法。32.複数の核酸分子はRNA分子を含む、実施形態24の方法。33.複数のRNA分子のコンセンサス配列は、核酸分子から直接合成された分子の配列を含む、実施形態24の方法。34.付着工程は、核酸分子の既知の領域にプロモーター配列を含む核酸フラグメントを挿入する工程を含む、実施形態24の方法。35.付着工程は、核酸分子の既知の領域にプロモーター配列を含む核酸フラグメントを挿入する工程を含む、実施形態24の方法。36.付着工程は、核酸分子の既知の領域の配列特異的な切断工程を含む、実施形態24の方法。37.付着工程は、CRISPR核酸タンパク質複合体に、核酸分子の既知の領域を接触させる工程を含む、実施形態24の方法。38.CRISPR核酸タンパク質複合体は、SEQ ID NO:3を含むガイドRNAを含む、実施形態24の方法。39.付着工程は、プロモーター配列を含む核酸フラグメントをライゲートする工程を含む、実施形態24の方法。40.プロモーター配列を含む核酸フラグメントは、ウイルスプロモーターを含む、実施形態24の方法。41.ウイルスプロモーターは、T7、T3、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、およびCaMV35Sから成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態40の方法。42.プロモーター配列を含む核酸フラグメントは、バクテリアプロモーターを含む、実施形態24つの方法。43.バクテリアプロモーターは、araBAD、trp、lac、およびPtacから成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態42の方法。44.プロモーター配列を含む核酸フラグメントは、真核生物プロモーターを含む、実施形態24の方法。45.真核生物プロモーターは、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、ALB、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、およびU6から成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態44の方法。46.真核生物プロモーターは、RNA pol Iプロモーター、RNA pol IIプロモーター、およびRNA pol IIIプロモーターから成るリストから選択された少なくとも1つのプロモーターである、実施形態44の方法。47.核酸分子の既知の領域は反復要素を含む、実施形態24の方法。48.反復要素は可動挿入因子を含む、実施形態47の方法。49.反復要素は、LINE要素、SINE要素、Aluリピート、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、セントロメア反復、およびテロメア反復の少なくとも1つを含む、実施形態47の方法。50.LINE要素はSEQ ID NO:1を含む、実施形態47の方法。51.核酸サンプル内の、反復可動因子の境界の少なくとも90%に対する境界隣接配列をコードする核酸を含む核酸ライブラリー。52.ライブラリー成分と核酸サンプル間の不一致が独立して抽出される、実施形態51の核酸ライブラリー。53.前記反復要素の境界の少なくとも50%が、少なくとも100の複製に存在する、実施形態51の核酸ライブラリー。54.ライブラリー成分は核酸サンプルから直接抽出される、実施形態51の核酸ライブラリー。55.ライブラリー構成要素は、配列決定に先立ってクローン的に増幅されない、実施形態51の核酸ライブラリー。56.核酸サンプルは単一の細胞に由来する、実施形態51の核酸ライブラリー。57.核酸ライブラリーはRNA中間体から逆転写される、実施形態51の核酸ライブラリー。58.核酸ライブラリーはRNAを含む、実施形態51の核酸ライブラリー。59.核酸ライブラリー成分はプロモーター配列を含む、実施形態51の核酸ライブラリー。60.RNAプロモーター配列は、T7、T3、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、CaMV35S、araBAD、trp、lac、Ptac、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、ALB、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、およびU6の少なくとも1つを含む、実施形態59の核酸ライブラリー。61.少なくとも1つの境界隣接配列は、細胞周期調節、DNA修復および成長調節の少なくとも1つに関係する、遺伝子における欠陥を示す、実施形態51の核酸ライブラリー。62.核酸ライブラリーが、核酸サンプル内の、反復可動因子の境界の少なくとも95%に対する境界隣接配列をコードする核酸を含む、実施形態51の核酸ライブラリー。63.核酸ライブラリーが、核酸サンプル内の、反復可動因子の境界の少なくとも99%に対する境界隣接配列をコードする核酸を含む、実施形態62の核酸ライブラリー。64.ライブラリー成分核酸の少なくとも50%は、可動因子の境界から20kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。65.ライブラリー成分核酸の少なくとも75%は、可動因子の境界に隣接した、可動因子の境界から20kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。66.ライブラリー成分核酸の少なくとも90%は、可動因子の境界から20kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。67.ライブラリー成分核酸の少なくとも50%は、可動因子の境界から10kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。68.ライブラリー成分核酸の少なくとも75%は、可動因子の境界に隣接した、可動因子の境界から10kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。69.ライブラリー成分核酸の少なくとも90%は、可動因子の境界から10kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。70.ライブラリー成分核酸の少なくとも50%は、可動因子の境界から5kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。71.ライブラリー成分核酸の少なくとも75%は、可動因子の境界に隣接した、可動因子の境界から5kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。72.ライブラリー成分核酸の少なくとも90%は、可動因子の境界から5kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。73.ライブラリー成分核酸の少なくとも50%は、可動因子の境界から1kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。74.ライブラリー成分核酸の少なくとも75%は、可動因子の境界に隣接した、可動因子の境界から1kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。75.ライブラリー成分核酸の少なくとも90%は、可動因子の境界から1kb以内の核酸に位置づけられる、実施形態51の核酸ライブラリー。76.平均のフラグメント長さは約500ベースである、実施形態51〜75のいずれか1つの核酸ライブラリー。77.平均のフラグメント長さは約1000ベースである、実施形態51
〜75のいずれか1つの核酸ライブラリー。78.中央値のフラグメント長さは約500ベースである、実施形態51〜75のいずれか1つの核酸ライブラリー。79.中央値のフラグメント長さは約1000ベースである、実施形態51〜75のいずれか1つの核酸ライブラリー。80.標的とする配列およびプロモーターを含む組成物であって、該標的とする配列は、核酸配列内の1つ以上の特定位置への組成物の挿入を導く核酸配列を含み、および該プロモーターはプロモーターの挿入に隣接したサンプル配列からの核酸合成を導く核酸配列を含む。81.標的とする配列は特定位置と一致する核酸配列を含む、実施形態80の組成物。82.標的とする配列は特定位置と塩基対合する核酸配列を含む、実施形態80の組成物。83.標的とする配列は特定位置とハイブリダイズする核酸配列を含む、実施形態80の組成物。84.標的とする配列は、クラスター化して規則的な配置の短い回分配列リピート(CRISPR)配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)配列、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)配列の少なくとも1つを含む、実施形態80〜83のいずれか1つの組成物。85.CRISPR配列はSEQ ID NO:3を含む配列を伴うガイドRNAを含む、実施形態84の組成物。86.ポロモーターは、バクテリアプロモーター、ウイルスプロモーター、および真核生物プロモーターの少なくとも1つを含む、実施形態80〜85のうちのいずれか1つの組成物。87.バクテリアプロモーターは、araBAD、trp、lac、およびPtacの少なくとも1つを含む、実施形態86の組成物。88.ウイルスプロモーターは、T7、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、およびCaMV35Sの少なくとも1つを含む、実施形態86の組成物。89.真核生物プロモーターは、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、ALB、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、およびU6の少なくとも1つを含む、実施形態86の組成物。90.核酸配列における特定位置は低複雑性核酸配列を含む、実施形態80〜89のいずれか1つの組成物。91.核酸配列における特定位置は反復核酸配列を含む、実施形態80〜90のいずれか1つの組成物。92.低複雑性核酸配列または反復核酸配列は、トリ−ヌクレオチドリピート、縦列反復、およびヒト白血球抗原遺伝子の少なくとも1つを含む、実施形態80〜91のいずれか1つの組成物。93.核酸配列における特定位置は可動遺伝因子を含む、実施形態80〜91のいずれか1つの組成物。94.可動因子は、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、DNAトランスポゾン、挿入配列、プラスミド、バクテリオファージ、グループIIイントロン、グループIイントロン、Alu要素、MIR要素、IAP(intracisternal A particle)、ETn、ウイルス、およびそれらのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態93の組成物。95.レトロトランスポゾンは、転位因子、LINE、SINE、およびそれらのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態94の組成物。96.LINEはSEQ ID NO:1を含む、実施形態94の組成物。97.ウイルスはレトロウイルスまたはそのフラグメントを含む、実施形態94の組成物。98.核酸合成はRNA転写およびDNA合成の少なくとも1つを含む、実施形態80〜97のいずれか1つの組成物。99.対象の核酸配列に隣接した核酸配列を判定する方法であって、該方法は:(a)標的とする配列およびプロモーターを含む、標的とする核酸配列を、対象の核酸配列内の1つ以上の特定位置に挿入する工程、(b)プロモーターからの核酸合成を導く工程、および(c)合成された核酸を配列決定する工程、を含む。100.標的とする配列は、クラスター化して規則的な配置の短い回分配列リピート(CRISPR)配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)配列、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)配列の少なくとも1つを含む、実施形態99の方法。101.CRISPR配列はSEQ ID NO:3を含む配列を伴うガイドRNAを含む、実施形態100の組成物。102.プロモーターは、バクテリアプロモーター、ウイルスプロモーター、および真核生物プロモーターの少なくとも1つを含む、実施形態99〜101のいずれか1つの実施形態の方法。103.バクテリアプロモーターは、araBAD、trp、lac、およびPtacの少なくとも1つを含む、実施形態102の方法。104.ウイルスプロモーターは、T7、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、およびCaMV35Sの少なくとも1つを含む、実施形態102の方法。105.真核生物プロモーターは、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、およびU6の少なくとも1つを含む、実施形態102の方法。106.対象の配列は低複雑性核酸配列を含む、実施形態99〜105のいずれか1つの方法。107.対象の配列は反復核酸配列を含む、実施形態99〜106のいずれか1つの方法。108.対象の配列は、トリ−ヌクレオチドリピート、縦列反復、およびヒト白血球抗原遺伝子の少なくとも1つを含む、実施形態99〜107のいずれか1つの方法。109.対象の配列は可動遺伝因子を含む、実施形態99〜108のいずれか1つの方法。110.可動遺伝因子は、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、DNAトランスポゾン、挿入配列、プラスミド、バクテリオファージ、グループIIイントロン、グループIイントロン、Alu要素、MIR要素、IAP(intracisternal A particle)、ETn、ウイルス、およびそれらのフラグメントを含む、実施形態109の方法。111.レトロトランスポゾンは、転位因子、LINE、SINE、およびそれらのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態110の方法。112.LINEはSEQ ID NO:1を含む、実施形態111の方法。113.ウイルスは、レトロウイルスおよびそのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態110の方法。114.核酸合成はRNA転写およびDNA合成の少なくとも1つを含む、実施形態99〜113のいずれか1つの方法。115.RNA転写はRNAポリメラーゼの使用を含む、実施形態114の方法。116.RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、RNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼIV、RNAポリメラーゼV、および単一のサブユニットRNAポリメラーゼの少なくとも1つを含む、実施形態115の方法。117.DNA合成はDNAポリメラーゼの使用を含む、実施形態99〜114のいずれか1つの方法。118.DNAポリメラーゼは、T7 DNAポリメラーゼ、T3 DNAポリメラーゼ、SP6 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼII、DNAポリメラーゼIII、Taq DNAポリメラーゼ、およびPfu DNAポリメラーゼの少なくとも1つを含む、実施形態117の方法。119.核酸合成はプライマーを必要とする、実施形態99〜118のいずれか1つの方法。120.合成された核酸は、対象の核酸配列から直接合成される、実施形態99〜119のいずれか1つの方法。121.核酸は突然変異の導入なしで合成される、実施形態99〜120のいずれか1つの方法。122.突然変異は点突然変異、欠失、挿入およびキメラの少なくとも1つである、実施形態121の方法。123.合成された核酸はDNAを含む、実施形態99〜122のいずれか1つの方法。124.合成された核酸はcDNAを含む、実施形態99〜122のいずれか1つの方法。125.合成された核酸はリボヌクレアーゼで処理される、実施形態123または実施形態124の方法。126.合成された核酸はaRNAを含む、実施形態99〜122のいずれか1つの方法。127.合成された核酸はDNaseで処理される、実施形態126の方法。128.配列決定は、サンガー法、次世代配列決定、ピロシーケンス、MPSS法(Massively parallel signature sequencing)、単分子リアルタイム配列決定、イオントレントシーケンサー、合成による配列決定、およびライゲーションによる配列決定の少なくとも1つを含む、実施形態99〜127のいずれか1つの方法。129.方法は、被験体における突然変異を検知する、実施形態99〜128のいずれか1つの方法。130.方法は、被験体から得た組織サンプルにおける突然変異を検知する、実施形態99〜128のいずれか1つの方法。131.組織サンプルは、腫瘍、血液、唾液、痰、皮膚、および上皮組織の少なくとも1つを含む、実施形態130の方法。132.被験体からの核酸サンプルにおける、DNA要素の挿入部位をマッピングする方法であって、該方法は:i)ゲノムDNAを、標的とする配列、および標的とする配列をDNA要素に挿入するのに十分な1つ以上の試薬と接触させることによって、標的とする配列およびプロモーターを含む標的とする核酸配列を挿入する工程;ii)プロモーターからの核酸合成を触媒する1つ以上の酵素に、挿入された標的とする配列を接触させ、それによって増幅された核酸を生じさせることで、増幅された核酸をゲノムDNAから直接生成する工程;iii)増幅された核酸を配列決定する工程、を含む。133.標的とする配列は、クラスター化して規則的な配置の短い回分配列リピート(CRISPR)配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)配列、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)配列の少なくとも1つを含む、実施形態132の方法。134.CRISPR配列はSEQ ID NO:3を含む配列を伴うガイドRNAを含む、実施形態133の組成物。135.プロモーターは、バクテリアプロモーター、ウイルスプロモーター、および真核生物プロモーターの少なくとも1つを含む、実施形態132〜134のいずれか1つの方法。136.バクテリアプロモーターは、araBAD、trp、lac、およびPtacの少なくとも1つを含む、実施形態135の方法。137.ウイルスプロモーターは、T7、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、およびCaMV35Sの少なくとも1つを含む、実施形態135の方法。138.真核生物プロモーターは、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、およびU6の少なくとも1つを含む、実施形態135の方法。139.DNA要素は低複雑性核酸配列を含む、実施形態132〜138のいずれか1つの方法。140.DNA要素は反復核酸配列を含む、実施形態132〜139のいずれか1つの方法。141.DNA要素は、トリ−ヌクレオチドリピート、および縦列反復の少なくとも1つを含む、実施形態132〜140のいずれか1つの方法。142.DNA要素は可動遺伝因子を含む、実施形態132〜141のいずれか1つの方法。143.可動因子は、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、DNAトランスポゾン、挿入配列、プラスミド、バクテリオファージ、グループIIイントロン、グループIイントロン、Alu要素、MIR要素、IAP(intracisternal A particle)、ETn、ウイルス、およびそれらのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態142の方法。144.レトロトランスポゾンは、転位因子、LINE、SINE、およびそれらのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態143の方法。145.LINEはSEQ ID NO:1を含む、実施形態144の方法。146.ウイルスはレトロウイルスまたはそ
のフラグメントを含む、実施形態143の方法。147.酵素はRNAポリメラーゼを含む、実施形態132〜146の方法。148.RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、RNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼIV、RNAポリメラーゼV、および単一のサブユニットRNAポリメラーゼの少なくとも1つを含む、実施形態147の方法。149.酵素はDNAポリメラーゼである、実施形態132〜148のいずれか1つの方法。150.DNAポリメラーゼは、T7 DNAポリメラーゼ、T3 DNAポリメラーゼ、SP6 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼII、DNAポリメラーゼIII、Taq DNAポリメラーゼ、およびPfu DNAポリメラーゼの少なくとも1つを含む、実施形態149の方法。151.核酸合成はプライマーを必要とする、実施形態132〜150のいずれか1つの方法。152.合成された核酸は、対象の核酸配列から直接合成される、実施形態132〜151のいずれか1つの方法。153.核酸は突然変異の導入なしで合成される、実施形態132〜152のいずれか1つの方法。154.突然変異は点突然変異、欠失、挿入およびキメラの少なくとも1つである、実施形態153の方法。155.合成された核酸はDNAである、実施形態132〜154のいずれか1つの方法。156.合成された核酸はcDNAである、実施形態132〜154のいずれか1つの方法。157.合成された核酸はRNaseで処理される、実施形態155の方法。158.合成された核酸はRNAである、実施形態132〜154のいずれか1つの方法。159.合成された核酸はDNaseで処理される、実施形態158の方法。160.配列決定は、サンガー法、次世代配列決定、ピロシーケンス、MPSS法(Massively parallel signature sequencing)、単分子リアルタイム配列決定、イオントレントシーケンサー、合成による配列決定、およびライゲーションによる配列決定の少なくとも1つを含む、実施形態132〜159のいずれか1つの方法。161.方法は、被験体における突然変異を検知する、実施形態132〜160のいずれか1つの方法。162.方法は、被験体から得た組織サンプルにおける突然変異を検知する、実施形態132〜160のいずれか1つの方法。163.組織サンプルは、腫瘍、血液、唾液、痰、皮膚、および上皮組織の少なくとも1つを含む、実施形態162の方法。164.反復ゲノム領域を配列決定する方法であって、該方法は:i)ゲノムDNAを、標的とする配列、および標的とする配列を反復ゲノム領域に挿入するのに十分な1つ以上の試薬と接触させることによって、標的とする配列およびプロモーターを含む標的とする核酸配列を挿入する工程;ii)プロモーターからの核酸合成を触媒する1つ以上の酵素に、挿入された標的とする配列を接触させ、それによって増幅された核酸を生じさせることで、増幅された核酸をゲノムDNAから直接生成する工程;iii)増幅された核酸を配列決定する工程、を含む。165.標的とする配列は、クラスター化して規則的な配置の短い回分配列リピート(CRISPR)配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)配列、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)配列の少なくとも1つを含む、実施形態164の方法。166.CRISPR配列はSEQ ID NO:3を含む配列を伴うガイドRNAを含む、実施形態165の組成物。167.プロモーターは、バクテリアプロモーター、ウイルスプロモーター、および真核生物プロモーターの少なくとも1つを含む、実施形態164〜166のいずれか1つの方法。168.バクテリアプロモーターは、araBAD、trp、lac、およびPtacの少なくとも1つを含む、実施形態167の方法。169.ウイルスプロモーターは、T7、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、およびCaMV35Sの少なくとも1つを含む、実施形態167の方法。170.真核生物プロモーターは、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、およびU6の少なくとも1つを含む、実施形態167の方法。171.反復ゲノム領域は低複雑性核酸配列を含む、実施形態164〜170のいずれか1つの方法。172.反復ゲノム領域は反復核酸配列を含む、実施形態164〜171のいずれか1つの方法。173.反復ゲノム領域は、トリ−ヌクレオチドリピート、および縦列反復の少なくとも1つを含む、実施形態164〜172のいずれか1つの方法。174.反復ゲノム領域は可動遺伝因子を含む、実施形態164〜173のいずれか1つの方法。175.可動因子は、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、DNAトランスポゾン、挿入配列、プラスミド、バクテリオファージ、グループIIイントロン、グループIイントロン、Alu要素、MIR要素、IAP(intracisternal A particle)、ETn、ウイルス、およびそれらのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態174の方法。176.レトロトランスポゾンは、転位因子、LINE、SINE、およびそれらのフラグメントの少なくとも1つを含む、実施形態175の方法。177.LINEはSEQ ID NO:1を含む、実施形態176の方法。178.ウイルスはレトロウイルスまたはその破片を含む、実施形態175の方法。179.酵素はRNAポリメラーゼを含む、実施形態164〜178の方法。180.RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、RNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼIV、RNAポリメラーゼV、および単一のサブユニットRNAポリメラーゼの少なくとも1つを含む、実施形態179の方法。181.酵素はDNAポリメラーゼを含む、実施形態164〜178のいずれか1つの方法。182.DNAポリメラーゼは、T7 DNAポリメラーゼ、T3 DNAポリメラーゼ、SP6 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼII、DNAポリメラーゼIII、Taq DNAポリメラーゼ、およびPfu DNAポリメラーゼの少なくとも1つを含む、実施形態181の方法。183.核酸合成はプライマーを必要とする、実施形態164〜182のいずれか1つの方法。184.合成された核酸は、対象の核酸配列から直接合成される、実施形態164〜183のいずれか1つの方法。185.核酸は突然変異の導入なしで合成される、実施形態164〜184のいずれか1つの方法。186.突然変異は点突然変異、欠失、挿入およびキメラの少なくとも1つである、実施形態185の方法。187.合成された核酸はDNAである、実施形態164〜186のいずれか1つの方法。188.合成された核酸はcDNAである、実施形態164〜186のいずれか1つの方法。189.合成された核酸はRNaseで処理される、実施形態187または実施形態188の方法。190.合成された核酸はa RNAである、実施形態164〜186のいずれか1つの方法。191.合成された核酸はDNaseで処理される、実施形態190の方法。192.配列決定は、サンガー法、次世代配列決定、ピロシーケンス、MPSS法(Massively parallel signature sequencing)、単分子リアルタイム配列決定、イオントレントシーケンサー、合成による配列決定、およびライゲーションによる配列決定の少なくとも1つを含む、実施形態164〜191のいずれか1つの方法。193.方法は、被験体における突然変異を検知する、実施形態164〜192のいずれか1つの方法。194.方法は、被験体から得た組織サンプルにおける突然変異を検知する、実施形態164〜192のいずれか1つの方法。195.組織サンプルは、腫瘍、血液、唾液、痰、皮膚、および上皮組織の少なくとも1つを含む、実施形態194の方法。
HLA領域は、ショートリードシーケンサーで構築するのが困難なことで有名である。それらは非常に多形性であると共に、非常に反復的である。例となる座標chr6:29,940,000−29,942,000においてHLA−A遺伝子プロモーターの上流に設計されたガイドRNAは、配列の約5kbにおいて全HLA遺伝子に及ぶT7転写されたRNA生成物を生成する潜在力を有するだろう。
LINE−1再配置は、20の細胞分裂ごとに1回、ゲノム物質を再配置させると推測される。転位の背後のメカニズムは、標準LINE−1要素配列の外側のゲノムDNA配列のコピー・アンド・ペーストを含む場合もあり、および新しい位置にその配列を挿入し得る。この「タグに沿う」ゲノム物質の公開されている例は、場合によっては長さ10キロベースもある。短い読み取り配列は、マッピングを基にした集合体が、短い読み取り集合体に使用された基準ゲノムと矛盾している新たな位置に、組み換えられたゲノム物質に対応する短い読み取りを配置しないため、これらの事象をマッピングする性能を持っていない。10キロベースを超える長さの隣接する分子を通じた、および隣接するゲノム配列への配列決定能力は、これらの事象を特定し定量化する能力を有する。ヒトLINE−1要素の保存領域に対して相補的な標的配列を有するガイドRNAは、保存されたLINE−1診断配列から隣接する配列の方への、T7に基づく転写を可能にする。腫瘍と生成物の正常な配列決定の比較は、比類ない精度で体細胞のLINE−1再配置を明らかにする。保存されたLINE−1要素配列にわたり、同様に3’および5’末端の両方に沿った多数のT7挿入は、腫瘍内の完全長の体細胞L1転位を特定する能力を付加する。腫瘍の60%が体細胞L1事象を有すると推測される。
ハンチントン病は、筋協調、認知能力および行動に影響する神経変性の遺伝病である。ハンチンチン遺伝子における十分に立証された突然変異が疾病の原因であり、それは常染色体顕性遺伝する。突然変異は、遺伝子のコード配列で見つかったCAGトリヌクレオチドのリピート伸張の、家族のある世代から次の世代への伸長である。このCAGトリヌクレオチドはアミノ酸グルタミンをコードし、したがってCAGリピートの伸張は、結果としてもたらされるタンパク質におけるポリグルタミンの伸張をもたらす。伸長したポリヌクレオチド領域の正確な配列を得ることが課題である。リピート領域のサイズが患者の疾患状態に影響するため、リピート領域の配列およびしたがってサイズを判定することが望ましい。
遺伝子のゲノム座において、ゲノムの標的部位における二本鎖切断を生成するためのCRISPR/CASを使用して、Cyp2d6遺伝子を配列決定のために選択する。標的部位の1つの鎖を露出しているエキソヌクレアーゼでDNAサンプルを処理することにより、二本鎖切断を粘着末端にする。タグ付き核酸は、露出した鎖、T7プロモーター、および自己補足的でヘアピン型を形成する部分に相補的な核酸配列を有する部分を含む。DNAリガーゼは、標的部位に核酸をライゲートし、それによってCyp2d6遺伝子の近くにT7プロモーターを組み込む。ヘアピンタグは、標的部位にタグをライゲートするのに効果的であり、およびその部位は標的とされたCyp2d6遺伝子のRNA転写への準備ができている。タグは、Cyp2d6遺伝子がCyp2d6偽遺伝子と区別され、配列決定のために独自にタグ付けされることを可能にする。
インビトロでの転写を、T7プロモーターを挿入されたDNAを含む1ngのDNAサンプルにおいて行なった。反応は、12時間行われた。MEGAscript T7およびAmpliScribe T7の両方を、転写を推進するために使用した。反応物を、転写後に1時間、DNAseと共にインキュベートした。RNAを、Qubit High Sensitivity RNA Assayキットを使用して定量化した。RNA分析を、High Sensitivity Pico mRNA Bioanalyzerを使用して行なった。
Claims (33)
- 対象の核酸配列に隣接している核酸配列を判定する方法であって、該方法は:(a)対象の核酸配列における1つ以上の特定の位置に、標的配列及びプロモーターを含む標的核酸配列を挿入する工程、(b)プロモーターからの核酸の合成を導く工程、及び(c)合成された核酸を配列決定する工程を含む、方法。
- 標的配列は、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)配列、及びTALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)配列のうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- CRISPR配列は、SEQ ID NO:3を含む配列と共にガイドRNAを含む、ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- プロモーターは、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、及び真核生物プロモーターのうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 細菌プロモーターは、araBAD、trp、lac、及びPtacのうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- ウイルスプロモーターは、T7、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40、及びCaMV35Sのうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 真核生物プロモーターは、EF1a、PGK1、Ubc、ベータアクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、ポリヘドリン、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1、及びU6のうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 対象の配列は、低複雑性の核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 対象の配列は、反復核酸配列を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 対象の配列は、トリヌクレオチドリピート、タンデムリピート、及びヒト白血球抗原遺伝子のうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 対象の配列は、可動遺伝因子を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 可動遺伝因子は、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、DNAトランスポゾン、挿入配列、プラスミド、バクテリオファージ、グループIIイントロン、グループIイントロン、Alu要素、MIR要素、嚢内A粒子(IAP)、ETn、ウイルス、又はそれらのフラグメントを含む、ことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- レトロトランスポゾンは、転位因子、LINE、SINE、及びそれらのフラグメントのうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- LINEはSEQ ID NO:1を含む、ことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- ウイルスは、レトロウイルス及びそのフラグメントのうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 核酸合成は、RNA転写とDNA合成のうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- RNA転写は、RNAポリメラーゼの使用を含む、ことを特徴とする請求項16に記載の方法。
- RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、RNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼIV、RNAポリメラーゼV、及び単一のサブユニットのRNAポリメラーゼのうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項17に記載の方法。
- DNA合成は、DNAポリメラーゼの使用を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- DNAポリメラーゼは、T7 DNAポリメラーゼ、T3 DNAポリメラーゼ、SP6 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼII、DNAポリメラーゼIII、Taq DNAポリメラーゼ、及びPfu DNAポリメラーゼのうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 核酸合成はプライマーを必要とする、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 合成された核酸は、対象の核酸配列から直接合成される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 核酸は突然変異の導入無しに合成される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 突然変異は、点突然変異、欠失、挿入、及びキメラのうち少なくとも1つである、ことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 合成された核酸はDNAを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 合成された核酸はcDNAを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 合成された核酸はRNaseで処理される、ことを特徴とする請求項25又は26に記載の方法。
- 合成された核酸はRNAである、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 合成された核酸はDNaseで処理される、ことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 配列決定は、サンガー配列決定、次世代配列決定、パイロシークエンシング、大規模並列シグネチャー配列決定、単一分子リアルタイム配列決定、イオントレント配列決定、合成による配列決定、及びライゲーションによる配列決定のうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は被験体の突然変異を検出する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、被験体から得られた組織サンプルの突然変異を検出する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 組織サンプルは、腫瘍、血液、唾液、痰、皮膚、及び上皮の組織のうち少なくとも1つを含む、ことを特徴とする請求項32に記載の方法。
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