CN102282257A - 含有耐热性dna聚合酶的酶制品及其制造方法、以及检测对象生物的检测方法 - Google Patents

含有耐热性dna聚合酶的酶制品及其制造方法、以及检测对象生物的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102282257A
CN102282257A CN2010800046471A CN201080004647A CN102282257A CN 102282257 A CN102282257 A CN 102282257A CN 2010800046471 A CN2010800046471 A CN 2010800046471A CN 201080004647 A CN201080004647 A CN 201080004647A CN 102282257 A CN102282257 A CN 102282257A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna polymerase
primer
gene
taq dna
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800046471A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102282257B (zh
Inventor
多叶田誉
南洋
仁井见英树
北岛勋
上野智浩
林史朗
森正之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hokkaido Mitsui Chemicals Inc
University of Toyama NUC
Original Assignee
Hokkaido Mitsui Chemicals Inc
University of Toyama NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hokkaido Mitsui Chemicals Inc, University of Toyama NUC filed Critical Hokkaido Mitsui Chemicals Inc
Publication of CN102282257A publication Critical patent/CN102282257A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102282257B publication Critical patent/CN102282257B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2549/00—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity
    • C12Q2549/10—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals
    • C12Q2549/101—Hot start
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

根据本发明能够提供一种耐热性DNA聚合酶制品，所述制品在利用基因扩增反应的样品微生物的检测中无限地降低假阳性的风险，因此即使在样品微生物的量较少、从其中提取的DNA也为微量的情况下也能够对用于样品微生物检测的DNA进行选择性扩增，并且可以降低制造成本。进而，能够提供一种使用本发明的制品迅速简便地以高灵敏度对检测对象生物进行定量或定量鉴定的方法。

Description

含有耐热性DNA聚合酶的酶制品及其制造方法、以及检测对象生物的检测方法
技术领域
本发明涉及一种含有耐热性DNA聚合酶的酶制品及其制造方法、以及检测对象生物的检测方法。
背景技术
近年，由于以特定的菌或细菌、病毒等的检测为目的的聚合酶锁式反应(PCR)在2小时左右的短时间内便可获知分析结果，所以在医疗领域或兽医领域、食品领域等普及起来。但是，在短时间内检测不特定的菌或细菌、病毒等的技术尚未确立。
从本来应该为无菌环境的场所检测鉴定极微量的非特定生物并进行定量，例如以血液、脑脊髓液、羊水、尿等作为样品进行分析，在初期检测鉴定人或家畜的感染，结合早期阶段的有效的抗生素给与，进而通过感染菌的定量值能够监测恢复情况等，能够期待获得非常大的益处。另外，能够迅速地检测鉴定在自来水、供水槽、空调循环水、加湿器、温泉水、池塘水等人在生活中可能吸入(饮水)的生活用水或食品、化妆品中不希望的不特定的细菌、真菌、病毒等生物的混入、并能够以高灵敏度监测混入水平等，在生活用水或食品、化妆品等的质量管理领域中也能期待获得很大的益处。预想如果能够如上所述确立高灵敏度、简便且迅速地对样品中的检测对象微生物进行定量或鉴定的方法，则技术的波及领域将非常广，人们迫切需求。
因严重的全身感染症而在确定诊断中必需对血液中的起因微生物进行检测·鉴定的败血症患者的数量，近年来随着癌治疗或脏器移植等医疗的高度化而增加。从院内感染的观点考虑，以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为代表的多药耐药菌多为败血症的起因菌，为了选择适当的抗生素挽救患者的生命，尽可能迅速地检测·鉴定血液中的起因微生物，在临床上是重要的。
另外，作为早产最大原因的子宫内感染症是导致胎儿死亡的严重感染症，尽可能迅速地检测·鉴定羊水中的起因微生物、在发病早期给与最合适的抗生素对挽救胎儿的生命至关重要。同样在兽医领域，例如牛的乳房炎是对奶牛而言相当严重的疾病，如果延误治疗则多数情况下束手无策只有将其淘汰，这在产业上也成为问题。
但是，由于现行的感染微生物检查法中通常使用包括培养瓶中的培养及使用选择培养基的培养的培养法，所以在获得结果前至少需要数日，在至判明结果为止的期间不得不基于经验实施治疗(empiric therapy)，不得已盲目地选择抗生素，这是临床上的现状，在要求迅速性的检查中成为严重缺陷。另外，由于微生物中也有时具有耐抗生素基因，所以多同时进行药敏试验，但与鉴定检查法同样，在获得结果前需要数日。其结果，产生因使用广谱抗生素而导致产生多药耐药菌、或由于选择不适当的抗生素而不能挽救败血症患者或子宫内感染症胎儿的生命的情况，或者产生不得不淘汰乳腺炎的奶牛的情况等。进而，由于检测异养菌时需要特殊的培养条件，所以产生假阴性的风险也很高。
鉴于上述背景，针对使用PCR的未鉴定菌检测进行研究，通过PCR扩增败血症起因微生物DNA的痕迹，使被扩增的起因微生物DNA与凭经验设定的在微生物中规定为目标的菌种固有的核苷酸探针形成混合物，尝试着对起因微生物进行检测·鉴定(日本特开平6-90799号公报)。进而，对谋求检测·鉴定的迅速性、以使用杂交探针的实时PCR为基本原理的败血症检查技术开发进行了探讨(生物试样分析，Vol.28，No5.(2005)，400-4040)。另外，研究了下述方法：通过以微生物DNA为模板使用特定引物组的PCR等进行基因扩增，然后通过解析对微生物特异的熔解温度(Tm值)的组合、或者各Tm值之间的差，迅速地检测鉴定起因菌(WO2007/097323)。但是，即使在使用PCR以短时间得到的结果中也必须确保精度，因此也可以说在PCR中同时实现高灵敏度和高特异度是重要的。上述现有技术是虽然应用利用了PCR的基因扩增技术，但是为一种限定于设想的目的微生物的方法，为设想外的微生物时则不能检测到，或者即使为以未鉴定的微生物为对象的检测鉴定方法，其定量技术尚未确立也是不可能实现的。
由于实时PCR是能够经时地表示扩增曲线的唯一方法，所以现在成为基因定量检查中不可或缺的实验方法。特别是使用SYBRGreen等嵌入剂的检测法廉价且简便，因此在世界上广泛应用。但是，使用了嵌入剂的实时PCR存在有时不仅目的物而且非特异性扩增产物也同样被检测、检测灵敏度下降的问题。特别是成为问题的非特异性扩增产物是引物二聚体(primer dimer)的形成。作为抑制引物二聚体形成的方法，公开了下述方法：对引物设计进行研究、或利用热启动(Hot Start)法、使用修饰引物的扩增法(日本特开2002-291490号公报)；使用经改良的PCR用试剂的热启动PCR(日本特开2003-259882号公报)、将结合在引物二聚体上的物质添加到样品中的方法(日本特开2006-254784号公报)等。但是，完全阻碍以引物二聚体为代表的上述非特异性扩增产物的形成非常困难，即使使用各种引物二聚体形成抑制方法，随着PCR循环数的增加也会检测非特异性扩增产物，这成为使用实时PCR的定量测定中灵敏度下降的主要原因。另外，在定性检查中每次测定必须检查Tm值(熔解温度：melting temperature)排除由引物二聚体引起的“假阳性”等，这对实时PCR的测定体系而言成为严重问题。
为了提供用于PCR的DNA聚合酶，对利用基因重组技术制造DNA聚合酶制品的方法进行了研究(日本特开2006-180886号公报)。PCR反应中通常使用的市售耐热性DNA聚合酶制品中，高纯度纯化制品也被市售，但即使为使用了这些高纯度纯化制品的PCR反应，在需要进行通常的30个循环程度以上的基因扩增反应的情况等中，也检测到原因不明的非特异性扩增产物，其使用存在限制。
为了确保PCR法中的高特异度，开发了多种方法。最简便的方法为嵌套式PCR法，但需要进行2次PCR费时费力。因此，提出了以1次PCR进行嵌套式PCR的“套匣扩增方法”(日本特开平05-292968号公报)。该方法为仅以1次热循环构成就能够进行嵌套式PCR的优异方法，也许是由于其申请时还没有简单地实际测定引物或扩增产物的Tm值的技术，所以未被实用化。该方法在具有实时PCR技术的现在是可以实用化的。另外，通常可以采用使用杂交探针的方法和TaqMan PCR法等，但并非任何人都能简单地制备探针，并且费用也昂贵等，因此现状是尚不存在迅速性·简便性·经济性均得到满足的方法。
如上所述，通常认为，如果能简便地扩增极微量的来自样品微生物的DNA，在短时间内进行分析，特别是进行定量或鉴定分析，则不仅甚至能够对到目前为止不能解析的极微量水平的基因进行解析，而且在医疗领域或兽医领域、生活用水或食品等各种样品的分析领域中也与迅速且正确的判断密切相关，但另一方面，在扩增极微量的样品微生物DNA时的PCR中，尚不能将灵敏度和特异度均控制在较高水平，也不能在以未鉴定的微生物为对象的情况下迅速地定量、或定量鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在使用PCR法的极微量的样品微生物DNA扩增中最适合的耐热性DNA聚合酶制品，并且提供一种分析方法，该分析方法使用该DNA聚合酶制品，适合用于极微量的样品微生物的新型检查。
本说明书中包括以下各发明。
(Ⅰ)一种耐热性DNA聚合酶制品，是含有耐热性DNA聚合酶的酶制品，其特征在于，
(1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码该耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对上述酶制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
(Ⅱ)一种耐热性DNA聚合酶制品的制造方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将编码耐热性DNA聚合酶的基因转化到真核细胞中，得到耐热性DNA聚合酶基因表达转化体细胞的步骤，
(2)培养上述转化体细胞的步骤，
(3)从经培养的转化体细胞中取得含有耐热性DNA聚合酶的提取物，对该提取物进行热处理的步骤；或对经培养的转化体细胞进行热处理后，从经热处理的转化体细胞中取得含有耐热性DNA聚合酶的提取物的步骤。
(Ⅲ)样品中的检测对象生物的检测方法，其特征在于，在对样品中的检测对象生物进行检测的方法中，包括以下步骤：
(1)扩增步骤，使用由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物、和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，和
(2)检测步骤，检测上述扩增步骤中的扩增产物中的上述靶基因的扩增产物，
其中，上述耐热性DNA聚合酶制品为下述(A)及(B)耐热性DNA聚合酶制品中的任一种，
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码该耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对上述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
(Ⅳ)样品中的检测对象生物的定量鉴定方法，其特征在于，在对样品中的检测对象生物进行定量鉴定的方法中，包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(B)及(M)、和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，
(2)第一定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第一扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，进行上述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
(3)第二扩增步骤，使用由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(F)、和以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，
(4)第二定量鉴定步骤，基于上述对靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第二扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对定量鉴定上述检测对象生物的第一定量鉴定步骤和上述第二扩增步骤中的扩增产物进行定量，根据所得的定量结果对上述样品中的检测对象生物进行定量鉴定，
其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(F)能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(M)对呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因进行特异性地扩增的引物组，
第一扩增步骤中的耐热性DNA聚合酶制品为下述(A)及(B)中的任一种，
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码该耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对上述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
(Ⅴ)样品中的检测对象生物的定量鉴定方法，其特征在于，在对样品中的检测对象生物进行定量鉴定的方法中，包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(B)、和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，
(2)第一定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第一扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，进行上述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
(3)第二扩增步骤，使用由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(F)、和以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，
(4)第二定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第二扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对定量鉴定上述检测对象生物的第一定量鉴定步骤和上述第二扩增步骤中的扩增产物进行定量，根据所得的定量结果对上述样品中的检测对象生物进行定量鉴定，
(5)第三扩增步骤，使用由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(M)、和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，和
(6)第三定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)，解析上述第三扩增步骤中的扩增产物的熔解温度(Tm值)，进行上述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(F)能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(M)对呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因进行特异性地扩增的引物组，
第一及第三扩增步骤中的耐热性DNA聚合酶制品为：
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，及
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码该耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对上述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
(Ⅵ)一种定量或鉴定用组合，所述组合用于对样品中所含的检测对象生物进行定量及/或鉴定，其特征在于，具有用于扩增由样品制备的核酸的耐热性DNA聚合酶制品和用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物，
上述耐热性DNA聚合酶制品为：
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，及
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码该耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对上述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
(Ⅶ)一种定量及/或鉴定用组合，所述组合用于对样品中所含的检测对象生物进行定量及/或鉴定，其特征在于，具有
用于扩增由样品制备的核酸的、为下述(A)及(B)中的任一种的耐热性DNA聚合酶制品，
用于扩增由样品制备的核酸的、以细菌细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，和
用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物，
其中，(A)及(B)耐热性DNA聚合酶制品如下所述，
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码该耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对上述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
(Ⅷ)一种定量及/或鉴定系统，其特征在于，所述系统用于进行上述的检测方法或定量鉴定方法，
在用于对样品中所含的检测对象生物进行定量及/或鉴定的系统中，具有
(1)扩增装置，用于使用下述物质进行核酸扩增反应，所述物质为由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物、和耐热性DNA聚合酶，
(2)定量装置，用于定量上述扩增步骤中的扩增产物，
(3)计算装置，根据上述扩增产物的定量结果，计算上述样品中检测对象生物的量，和
(4)数据库，用于根据上述靶基因的扩增产物的定量结果计算上述样品中检测对象生物的量。
根据本发明，能够提供耐热性DNA聚合酶制品，所述耐热性DNA聚合酶制品在利用基因扩增反应检测样品微生物中，即使在样品微生物量少、从其中提取的DNA也为微量的情况下，也可以对用于样品微生物检测的DNA进行选择性扩增，并且可以降低制造成本。
如果使用上述耐热性DNA聚合酶制品并且使用掩蔽引物二聚体(masked Primer Dimer)法，则引物二聚体的形成不会成为使用嵌入剂的实时PCR法的阻碍因素，能够不降低灵敏度地进行定量检查，定性检查中也没有因引物二聚体引起的假阳性的风险。即，可以实现达至检测灵敏度界限的准确定量(高灵敏度定量法)。并且，与使用抗Taq抗体的热启动法等现有方法相比，本方法简便且经济。
进而，通过应用“套匣扩增法”(日本特开平05-292968号公报)或者对PCR的延伸时间进行研究，可以仅以1次PCR(One Step)迅速地实施通常需要2次PCR的高特异性的嵌套式PCR。另外，与杂交探针法、TaqMan法等相比，引物设计简便且经济。
通过使用本发明的耐热性DNA聚合酶制品并组合使用掩蔽引物二聚体法及一步嵌套式PCR(One Step nested PCR)法，能够迅速·简便地进行高灵敏度·高特异度的PCR。
根据本发明，能够迅速地提供利用基因检查的检测对象生物的高灵敏度且简易的定量或鉴定法。根据该方法，对于本来应该为无菌环境或者混入极微量的检测对象生物成为问题的任何样品均能够迅速·简便地以高灵敏度定量检测对象生物。进而，利用本定量或定量鉴定法，能够监测患者体内的菌数控制状态或菌数变化状态，如无菌状态或一定菌数的维持、根据感染菌量的变化进行治疗效果的确认等。另外，通过将样品的培养和本发明的高灵敏度定量法组合，能够进行迅速的药敏试验。
附图说明
[图1]是关于基于细菌16srRNA、真核细胞18srRNA基因序列进行的系统树解析的图。
[图2]为表示热处理后的SDS-PAGE照片的图。
[图3]为表示以大肠杆菌DNA作为模板使用耐热性DNA聚合酶制品的PCR的检测限的图。
[图4]为表示使用耐热性DNA聚合酶制品的非特异性核酸混入的验证结果的图。
[图5](A)为表示使用了AmpliTaq Gold LD的实时PCR的扩增曲线解析的图。(B)为表示使用了以S.cerevisiae作为宿主生产的耐热性DNA聚合酶制品的实时PCR的扩增曲线解析的图。
[图6](A)为表示使用了AmpliTaq Gold LD的实时PCR的熔解曲线解析的图。(B)为表示使用了以S.cerevisiae作为宿主生产的耐热性DNA聚合酶制品的实时PCR的熔解曲线解析的图。
[图7]为表示使用了以A.oryzae作为宿主生产的耐热性DNA聚合酶制品的非特异性核酸混入的验证结果的图。
[图8]为表示使用了掩蔽引物二聚体法的实时PCR的扩增曲线解析的图。(A)使用以S.cerevisiae作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品，(B)使用以S.cerevisiae作为宿主生产的来自突变P.furiosus的耐热性DNA聚合酶制品，(C)使用以S.cerevisiae作为宿主生产的来自突变T.gorgonarius的耐热性DNA聚合酶制品，(D)使用以P.pastoris作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品，(E)使用以TobaccoBY-2作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品。
[图9]为表示实时PCR的熔解曲线解析的图。(A)使用以S.cerevisiae作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品，(B)使用以S.cerevisiae作为宿主生产的来自突变P.furiosus的耐热性DNA聚合酶制品，(C)使用以S.cerevisiae作为宿主生产的来自突变T.gorgonarius的耐热性DNA聚合酶制品，(D)使用以P.pastoris作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品，(E)使用以Tobacco BY-2作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品。
[图10](A)为表示通常的PCR条件设定和其荧光检测点的图。(B)为表示掩蔽引物二聚体法的荧光检测点的图。
[图11](A)表示一步半嵌套式PCR(One Step semi-nestedPCR)法中的引物及扩增产物的配置。(B)表示一步嵌套式PCR法中的引物及扩增产物的配置。(C)表示由细菌得到的多个Tm值(Bac1～Bac5)、和它们与平均值(average)的相对值(d1～d5)。
[图12]为表示用于进行本发明的检测对象生物的定量及/或鉴定的系统的例子之一的方块图。
[图13]为利用表1程序条件实施解析的扩增曲线。图中A为E.coli中的扩增曲线，B为蒸馏水(D.W.)中的扩增曲线。
[图14]为利用表1程序条件实施解析的熔解曲线图。图中A为E.coli的熔解曲线，B为引物二聚体的熔解曲线。
[图15](A)为利用表2程序条件的实时PCR结果的扩增曲线图。图中A为E.coli中的扩增曲线，B为蒸馏水(D.W.)中的扩增曲线。(B)为表示以各试样的DNA提取液作为模板进行真菌的感染菌检查所得的结果的图。图中A为作为阳性对照的C.albicans中的扩增曲线，B为蒸馏水(D.W.)、自来水(Tap water)、泉水(Spring water)、温泉水(Hot spring water)、空调循环水(Air-conditioning water)中的扩增曲线。(C)为表示以各试样的DNA提取液作为模板进行细菌的感染菌检查所得的结果的图。图中，A～D分别为，A：作为阳性对照的E.coli(循环数14.47)中的扩增曲线，B：温泉水(Hot spring water：循环数30.54)中的扩增曲线，C：空调循环水(Air-conditioning water：循环数28.96)中的扩增曲线，及D：蒸馏水(D.W.)、自来水(Tap water)、泉水(Spring water)中的扩增曲线。
[图16]为表示以奶油泡芙作为样品时进行真菌的感染菌检查所得的结果的图。(A)为新鲜的奶油泡芙中的增殖曲线。图中，A为作为阳性对照的C.albicans(循环数23.78)中的增殖曲线，B为蒸馏水(D.W.)及奶油泡芙(奶油)(循环数45.71)中的增殖曲线。(B)为不新鲜的奶油泡芙中的增殖曲线，图中，A为作为阳性对照的C.albicans(循环数23.78)中的增殖曲线，B为蒸馏水(D.W.)及奶油泡芙(奶油)(循环数44.37)中的增殖曲线。
[图17]为表示以奶油泡芙作为样品时进行细菌的感染菌检查所得的结果的图。(A)为新鲜的奶油泡芙中的增殖曲线。图中，A为作为阳性对照的E.coli(循环数26.55)中的增殖曲线，B为蒸馏水(D.W.)及奶油泡芙(奶油)中的增殖曲线。(B)为不新鲜的奶油泡芙中的增殖曲线。图中，A为作为阳性对照的E.coli(循环数23.78)中的增殖曲线，B为奶油泡芙(奶油)(循环数24.48)中的增殖曲线，C为蒸馏水(D.W.)中的增殖曲线。
[图18]为表示使用由C.albicans引起的败血症患者A的血液样品的检查结果的图。(A)为真菌通用引物中的增殖曲线。图中，A为作为阳性对照的C.albicans(循环数27.51)中的增殖曲线，B为血液样品(患者A：循环数33.70)中的增殖曲线，C为蒸馏水(D.W.)中的增殖曲线。(B)为细菌通用引物中的增殖曲线。图中，A为作为阳性对照的E.coli(循环数33.70)中的增殖曲线，B为血液试样(患者A)及蒸馏水(D.W.)中的增殖曲线。
[图19]为表示使用由Bacillus species引起的败血症患者B的血液样品的检查结果的图。(A)为真菌通用引物中的增殖曲线。图中，A为作为阳性对照的C.albicans中的增殖曲线，B为血液样品(患者B)及蒸馏水(D.W.)中的增殖曲线。(B)为针对血液样品的细菌通用引物中的增殖曲线。图中，A为作为阳性对照的E.coli(循环数22.53)中的增殖曲线，B为血液样品(患者B：循环数34.07)中的增殖曲线，C为蒸馏水(D.W.)中的增殖曲线。(C)为针对血液培养试样的细菌通用引物中的增殖曲线。图中，A为血液培养试样(患者B：循环数14.47)中的增殖曲线，B为作为阳性对照的E.coli(循环数25.64)中的增殖曲线，C为蒸馏水(D.W.)中的增殖曲线。
[图20]为表示以MRSA的DNA作为模板、使用MRSA特异性引物的实时PCR的结果的图。A为Spa引物中的增殖曲线，B为mecA引物中的增殖曲线，C为细菌通用引物中的增殖曲线，D为真菌通用引物中的增殖曲线。
[图21](A)为对于被检测的表皮葡萄球菌，根据经时的增菌量检查庆大霉素(GM)和红霉素(EM)的药物敏感性的图。(B)为对于被检测的蜡状芽孢杆菌，根据经时的增菌率检查头孢唑林(CZ)、氨苄西林(AP)、红霉素(EM)各自的药物敏感性的图。
[图22](A)为表示子宫内感染症的羊水样品1的感染菌检查结果的图，(B)为表示先兆早产的羊水样品2的感染菌检查结果的图。需要说明的是，A～C为使用细菌通用引物尝试进行检测所得的结果。A：为蒸馏水，B：为作为阳性对照的E.coli，C：羊水样品。D～F为使用真菌通用引物尝试进行检测所得的结果，D：为蒸馏水，E：为作为阳性对照的C.albicans，F：为羊水样品。G～H为使用支原体属特异性引物尝试进行检测所得的结果，G：为蒸馏水，H：为支原体属阳性对照，I：为羊水样品。J～L为使用对尿素原体属为特异性的引物尝试进行检测所得的结果，J：为蒸馏水，K：为尿素原体阳性对照，L：为羊水样品。
[图23]将包括半嵌套式引物的3个引物混合，通过扩增产物的Tm值确认是否能顺利地进行嵌套式PCR。(A)表示只实施表3及表4的扩增1，只有外侧的扩增产物Ⅰ(Tm值87℃)被扩增。(B)表示只实施表3及表4的扩增2，只有内侧的嵌套式扩增产物Ⅱ(Tm值83℃)(其他为引物二聚体)被扩增。
[图24]使用实际的样品确认了通过合并使用e-DNAP及不显示法的高灵敏度检测方法和一步嵌套式PCR法顺利地进行了高灵敏度且高特异度的PCR。(A)为在E.Coli特异性的引物中实施了表3或表4的程序时的增殖曲线。图中，A为E.Coli中的增殖曲线，B为蒸馏水(D.W.)、S.aureus、Human DNA中的增殖曲线。(B)为在E.Coli特异性的引物中实施表3或表4的程序时的熔解曲线。A为E.Coli中的熔解曲线，B为蒸馏水(D.W.)、S.aureus、Human DNA中的熔解曲线。图中的扩增产物只为嵌套式内侧的扩增产物Ⅱ(Tm值83℃)，此外，蒸馏水(D.W.)、S.aureus、Human DNA的扩增产物未确认到。
[图25]将包括半嵌套式引物的3个引物混合，通过扩增产物的大小确认是否顺利地进行嵌套式PCR。只实施扩增1，只有外侧的扩增产物Ⅰ(548bp)被扩增，只实施扩增2，只有内侧的嵌套式扩增产物Ⅱ(110bp)被扩增。实施扩增1+2，只有内侧的嵌套式扩增产物Ⅱ(110bp)被扩增。
具体实施方式
(1)耐热性DNA聚合酶制品
本发明人等与市售的耐热性DNA聚合酶制品同样地利用将细菌用作宿主的基因重组生产耐热性DNA聚合酶，并针对所生产的耐热性DNA聚合酶制品在用于对样品中含有的检测对象微生物进行检测的PCR中的适用性进行探讨。然而，不能提供下述耐热性DNA聚合酶制品，即，在利用PCR的检测对象微生物的检测中，即使样品中所含的微生物量少、从其中获取的DNA也为微量的情况下，也能够使PCR的循环数增加且能够对用于检测对象微生物的检测的DNA进行选择性地扩增，并且能够降低制造成本。
因此，考虑到宿主的适合性和所生产的耐热性聚合酶的纯化效率等，以系统树(参见Carl R.Woese，“BacterialEvolution，”Micro.Biol.Reviews，51：221-271(1987)及图1)为参考，验证各生物的远缘关系，着眼于能够用作宿主的真核细胞。将真核细胞用作宿主对耐热性DNA聚合酶的生产进行了研究，结果发现所得的培养提取沉淀物中耐热性DNA聚合酶的大部分以不溶性的形式生产，通过对沉淀物及上清液进行加热处理可以不可逆地增溶，另外通过该步骤能够容易地回收具有活性并且被纯化为高纯度的耐热性DNA聚合酶。在进行各种研究中发现，该耐热性DNA聚合酶制品至少具有下述特征：对于在细菌16SrRNA基因扩增中不添加模板的情况，不发生DNA扩增。
以下详细地说明本发明。
本发明中使用的耐热性DNA聚合酶制品为含有耐热性DNA聚合酶的制品，具有以下(A)及(B)条件中的至少一者的特征。
(A)满足以下(1)及(2)的条件的耐热性DNA聚合酶制品。
(1)耐热性DNA聚合酶1单位中，除编码该耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下。
(2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对上述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
(B)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品。
所谓来自细菌的核酸的混入量为“10fg以下”，是指在下述实施例2-1的“(6-3)PCR的检测限”的检测方法中被判定为“10fg以下”的情况。
另一方面，本发明中的所谓“提取物”，只要为从细胞或菌体中取得含有耐热性DNA聚合酶的成分的物质即可，对于为了得到提取物而使用的溶剂和提取方法等没有特殊限定。作为得到提取物的方法，例如可以举出以下方法。
(1)利用酵母裂解酶、纤维素酶、壳多糖酶、壳二糖酶、壳聚糖酶、β-1、3-葡聚糖酶、溶菌酶等溶解细胞壁的酶对生产耐热性DNA聚合酶的真核细胞进行处理的方法。
(2)使用超声波、弗氏压碎器、玻璃珠等物理方法、通过加热破坏细胞壁、细胞膜的方法等，用水或缓冲液等溶剂提取细胞或菌体中含有的成分获得提取物的方法。
(3)采用通过在耐热性DNA聚合酶基因上游添加分泌信号肽等使该耐热性DNA聚合酶在细胞外分泌生产的方法等，并将由此生产的耐热性DNA聚合酶提取至菌体外，获得提取物的方法。
本发明中所谓的“耐热性DNA聚合酶制品”，是指含有耐热性DNA聚合酶的制品，作为上述提取物本身，进而可以为使用上述提取物经过纯化、稀释、与其他物质或化合物混合等各种处理而得到的物质。例如，作为制品也可以举出以下物质。
(A)为下述状态的物质，即，来自上述提取物的耐热性DNA聚合酶溶解在缓冲液中，所述缓冲液中作为具有缓冲作用的成分含有下述物质：磷酸、硼酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、TRIS、TRICINE、BIS-TRICINE、veronal、HEPES、PIPES、CAPS、TAPS、TES、MOPS、MES等。
(B)为下述状态的物质，即，与MgCl2或dNTPs等共同存在于溶液中。
(C)为下述干燥状态的物质，即，通过冷冻干燥等方法使上述(A)及(B)的溶液干燥。
作为由“提取物”得到“耐热性DNA聚合酶制品”的方法，可以举出纯化、稀释、与其他物质或化合物的混合等。
作为纯化方法，可以举出以下方法。
(Ⅰ)对含有耐热性DNA聚合酶的培养基等的提取物实施离子交换色谱法或羟基磷灰石色谱法等利用了电荷的方法。
(Ⅱ)亲和色谱法等利用了特异亲和性的方法、反相色谱法等利用了疏水性差异的方法。
(Ⅲ)采用凝胶过滤等利用分子量的差的方法等的柱色谱法。
(Ⅳ)使用硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、PEG沉淀、pH沉淀等进行分离的方法。
(Ⅴ)使用聚乙烯亚胺等的核酸除去法。
可以组合上述方法中的2种以上进行使用。通过上述方法可以浓缩提取物中含有的耐热性DNA聚合酶或者降低或除去来自宿主的夹杂蛋白质或核酸等。
作为稀释方法，可以举出将水或上述缓冲液等与提取物混合的溶剂添加到提取物中的方法。
另外，在与其他的物质或化合物混合的方法中，作为混合的物质或化合物，没有特殊限定，例如可以举出选自下述物质中的1种或2种以上，所述物质为氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠、乙酸钠、氯化锂、乙酸锂、氯化钙、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、DMSO、甘油、甲酰胺、四甲基氯化铵、PEG、Tween20、Tween80、Triton-X100、NP40、DNA、RNA、蛋白质(酶类、抗体、BSA等)、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、dNTPs、SYBR Green、EVERGREEN、SYTO9、蜡等。
所谓“嗜热菌”，是指在最适生长温度为45℃以上、或55℃以上的条件下生长的真细菌或古细菌(原始菌)。可适用于本发明中的嗜热菌只要符合上述定义即可，没有特殊限制。
所谓“超嗜热菌”，是指在最适生长温度为80℃以上、或者90℃以上的条件下生长的真细菌或古细菌(原始菌)。可适用于本发明的超嗜热菌只要符合上述定义即可，没有特殊限制。目前已经分离·鉴定了100种以上的嗜热菌、超嗜热菌，它们均可以适用于本发明。作为所述嗜热菌、超嗜热菌，可以举出属于栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、热球菌属(Thermococcus)、热球菌属(Pyrococcus)、气火菌属(Aeropyrum)、产液菌属(Aquifex)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、火叶菌属(Pyrolobus)、甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)的嗜热菌或超嗜热菌。
更具体而言，例如可以举出水生栖热菌(Thermus aquatics)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)、Geothermobacterium ferrireducens、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)、Thermotoga petrophila、Thermotoga naphthophila、下层酸菌(Acidianus infernus)、Aeropyrumpernix、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、深处古生球菌(Archaeoglobus profundus)、Caldivirga maquilingensis、Desulfurococcus amylolyticus、运动硫还原球菌(Desulfurococcusmobilis)、粘硫还原球菌(Desulfurococcus mucosus)、Ferroglobusplacidus、Geoglobus ahangari、丁醇栖高温菌(Hyperthermus butylicus)、Ignicoccus islandicus、Ignicoccus pacificus、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、Methanococcus fervens、火源甲烷球菌(Methanococcus igneus)、Methanococcus infernus、坎氏甲烷嗜热菌(甲烷嗜热菌)、炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)、集结甲烷嗜热菌(Methanothermus sociabilis)、Palaeococcusferrophilus、耐超高温热棒菌、Pyrobaculum calidifontis、冰岛热棒菌(Pyrobaculum islandicum)、Pyrobaculum oguniense、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、Pyrococcus abyssi、掘越式热球菌、沃氏热球菌(Pyrococcus woesei)、极端铁代谢嗜热菌、布氏热网菌(Pyrodictium brockii)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)、延胡索酸火叶菌、海葡萄嗜热菌(Staphylothermus marinus)、喜氢斯式菌、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、希氏硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)、硫化叶菌、Sulfophobococcus zilligii、Sulfurisphaera ohwakuensis、Thermococcus kodakaraensis、速生热球菌(Thermococcus celer)、极端嗜热细菌、Thermodiscus maritimus、下垂热丝菌(Thermofilum pendens)、附着热变形菌(Thermoproteustenax)、嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)、Thermosphaeraaggregans、Vulcanisaeta distributa、Vulcanisaeta souniana等。
本发明涉及的耐热性DNA聚合酶制品的制造方法是使用宿主细胞生产耐热性DNA聚合酶的方法，使用真核细胞作为宿主细胞。
作为真核细胞可以举出菌类、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等，作为宿主细胞只要为来自真核生物的细胞即可，没有特殊限定。作为菌类，可以举出酵母或霉等子囊菌、丝状菌、担子菌、接合菌等，其中，优选酵母或丝状菌，作为具体例，可以举出酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、耶罗维亚酵母属、丝孢酵母(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidi)属、曲霉(Aspergillus)属、镰孢霉(Fusarium)属、木霉(Trichoderma)属等。
作为更详细的具体例，可以举出酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、博伊丁丝酵母(Candida boidini)、毕赤嗜甲醇酵母、安格斯毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、异常毕赤酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、鲁式酵母、解脂耶式酵母、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillusoryzae)及里氏木霉等。
作为动物细胞，可以举出来自人的培养细胞、来自小鼠的培养细胞等，作为具体例，可以举出CHO细胞、Hela细胞等。作为植物细胞，只要为由植物衍生的细胞即可，优选为株化的培养细胞，可以举出烟草(Nicotiana)属细胞、拟南芥(Arabidopsis)属细胞、番薯(Ipomoea)属细胞、胡萝卜(Daucus)属细胞、水稻(Oryza)属细胞等，具体而言可以举出烟草BY-2培养细胞、阿拉伯芥培养细胞、番薯培养细胞、胡萝卜培养细胞、水稻培养细胞等。作为昆虫细胞，只要为由昆虫衍生的细胞即可，优选为株化的培养细胞，可以举出来自斜纹夜蛾近似种草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞的培养细胞sf9株、sf21株、蚕(Bombix mori)培养细胞Bm-N株等。作为宿主细胞，优选为酵母等增殖快的微生物或真核生物，例如可以举出以酿酒酵母等酵母属为代表的酵母、以烟草等烟草(Nicotiana)属植物的培养细胞为代表的植物细胞、以米曲霉等曲霉(Aspergillus)属为代表的丝状菌。
使用真核细胞生产耐热性DNA聚合酶时，例如可以举出在真核细胞内导入基因使其表达来生产该耐热性DNA聚合酶的方法等，所述基团含有至少一个以上的编码耐热性DNA聚合酶的基因。
另外本说明书中的编码耐热性DNA聚合酶的基因可以为编码耐热性DNA聚合酶的cDNA、基因组DNA、合成DNA等任意基因，另外可以为单链、或具有其互补链的双链，也可以包含天然、或人工的核苷酸衍生物。进而，耐热性DNA聚合酶来自生物时，对于该耐热性DNA聚合酶的由来没有特殊限定。
DNA聚合酶根据生物的种类存在各种同属体。
作为本发明中使用的耐热性DNA聚合酶的具体例，可以举出来自水生栖热菌(Thermus aquatics)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆(Bacillus stearother mophilus)、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis KOD1、沃氏热球菌(Pyrococcus woesei)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、Aeropyrum pernix、Aquifex aeolicus、硫化叶菌、延胡索酸火叶菌、或甲烷嗜热菌的耐热性DNA聚合酶。
耐热性DNA聚合酶包括基因工程学上人工合成的耐热性DNA聚合酶。
另外，耐热性DNA聚合酶优选来自具有耐热性的生物，较优选来自产甲烷菌、嗜热嗜酸菌、嗜热菌、超嗜热菌等原核生物。
本发明的耐热性DNA聚合酶基因优选具有下述碱基序列，所述碱基序列采用在转化的宿主生物中多使用的密码子用法。
例如，在酿酒酵母中导入耐热性DNA聚合酶基因时的密码子用法，如下所述。
基于酵母属等异种生物的密码子用法改变原有的耐热性DNA聚合酶基因时，优选该密码子用法对来自天然的耐热性DNA聚合酶基因的碱基序列的70％以上适用，较优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选该密码子用法对全部的密码子均适用。
作为本发明的耐热性DNA聚合酶基因的优选形态，可以举出采用酿酒酵母的密码子用法设计来自水生栖热菌的耐热性DNA聚合酶基因的碱基序列而得到的耐热性DNA聚合酶基因。其中，优选方案为具有序列号11的序列、或由这些碱基序列形成的耐热性DNA聚合酶基因。
另外，耐热性DNA聚合酶基因中，优选不含使mRNA不稳定化的序列，作为使mRNA不稳定化的序列，可以举出明显重复的序列和耐热性DNA聚合酶基因的GC含量高的基因序列等。作为除去使mRNA不稳定化的序列的目标，具体而言可以举出：将10bp左右的基因序列的出现频率抑制至编码耐热性DNA聚合酶的基因的2％以下，或将耐热性DNA聚合酶基因整体的GC含量设在约20％以上、约45％以下等。
作为本发明的耐热性DNA聚合酶基因，优选具有至少一种下述特征，所述特征为适用要导入的宿主生物中的密码子用法、不含引起mRNA不稳定化的序列、合适的GC含量。较优选具有2种以上的特征，最优选具有3种特征。另外，该耐热性DNA聚合酶基因中，优选适用宿主生物中的密码子用法。特别是在以酵母属、特别是以酿酒酵母为宿主进行转化时，优选适用酿酒酵母中的密码子用法。
进而，耐热性DNA聚合酶基因中，特别优选如下设计，即，使编码区中不具有基因克隆步骤上不合适的限制酶位点。具体而言，优选不含有ECoRⅠ、HindⅢ、NotⅠ、SnaBⅠ等位点。另一方面，如果考虑基因克隆操作，优选在编码区的外侧具有操作上有用的限制酶位点。例如，可以在编码区的上游、或下游具有ECoRⅠ、HindⅢ、NotⅠ、SnaBⅠ等限制酶位点。
作为耐热性DNA聚合酶基因同系物，例如可以举出与所述DNA在严格条件下杂交的DNA聚合酶基因同系物。即，与上述任一种DNA聚合酶基因的整体或一部分或其互补链在严格条件下杂交的DNA聚合酶基因同系物。所述同系物同时编码具有DNA聚合酶活性的蛋白质。
所谓在严格条件下杂交的耐热性DNA聚合酶基因同系物，例如包括下述DNA，即，以选择一个或多个下述序列所得到的DNA作为探针DNA，使用本领域技术人员公知的杂交技术(CurrentProtocols I Molecular Biology edit.Ausubel et al.，(1987)Publish、John Wily&Sons Sectoin 6.3-6.4)等进行杂交的DNA，所述序列为原有碱基序列的任意的至少20个、优选25个、较优选至少30个的连续序列。
此处作为严格条件，为在50％甲酰胺存在下杂交温度为37℃，作为较严格条件，为杂交温度约42℃。作为更严格条件，为在50％甲酰胺存在下杂交温度约65℃。
需要说明的是，氨基酸序列中的突变数，没有限制，只要能够维持原有的蛋白质功能即可，但优选为全部氨基酸的70％以内，较优选为30％以内，更优选为20％以内。
另外，上述耐热性DNA聚合酶基因同系物优选为下述DNA，即，含有相对于原有的DNA碱基序列的编码区具有至少80％、优选为90％以上同源性的碱基序列的DNA、或者由该碱基序列构成的DNA。需要说明的是，DNA的碱基序列的同源性可以根据基因解析程序BLAST等确定。
需要说明的是，耐热性DNA聚合酶基因也可以化学合成，也可以采用作为长链DNA合成方法已知的藤本等的方法(藤本英也、合成基因的制备法、植物细胞工程学系列7植物的PCR实验方案、1997、秀润社、p95-100)。
另外，氨基酸序列中的改变，可以使用位点特异性诱变法(Current Protocols I Molecular Biology edit.Ausubel et al.，(1987)Publish.John Wily&Sons Sectoin 8.1-8.5)等，在想要改变的氨基酸序列中适当导入取代、缺失、插入及/或添加突变而进行。另外，所述改变不限于人工导入突变或合成突变，也包括基于人工突变处理、或不限于此通过自然界中的氨基酸的突变所引起的改变。
作为本发明中能够优选利用的耐热性DNA聚合酶基因，可以举出由序列号1、81及82表示的碱基序列构成的基因(以下给出对应的氨基酸序列)。
序列号1
aagcttacgt atacaacatg agaggtatgc ttccattgtt
cgaacctaaa ggtagagtat     60
tgttggttga tggtcatcat ctagcttaca gaactttcca
cgctctaaaa ggtttaacaa    120
catcaagagg tgaacctgtt caagctgtat acggttttgc
taagtcttta ctaaaagcat    180
tgaaggaaga cggtgacgcc gttattgttg ttttcgatgc
taaggcacca agttttagac    240
atgaagcata cggtggttat aaggctggaa gagcaccaac
tcctgaagac ttccctagac    300
aattggcact aatcaaggaa ctagtcgact tactaggtct
tgcaagatta gaagtcccag    360
gttatgaggc agatgatgta ctagcctctt tagcaaagaa
ggcagaaaag gagggttatg    420
aagttagaat tttaaccgct gataaggact tatatcaatt
gctatctgat aggattcatg    480
tgttacaccc tgaaggttat ttgataactc cagcttggtt
atgggagaag tacggtttga    540
ggccagacca atgggccgat tatagagctt taaccggcga
cgagtcagac aatcttccag    600
gtgttaaagg aattggcgaa aagactgcta ggaagttgtt
ggaagagtgg ggctccttgg    660
aggccttact taaaaatttg gacaggctaa aaccagcaat
cagggaaaag atactagctc    720
acatggatga tcttaaattg tcttgggact tagccaaggt
cagaactgat ttgcctttag    780
aggtcgactt cgctaagaga agggaacctg atagggaaag
gttaagagcc ttcttggaaa    840
gacttgagtt tggatcatta ttgcatgaat ttggtttatt
agaatcccct aaggccttgg    900
aagaagcacc atggccacct ccagaaggtg cctttgtagg
cttcgtctta agcaggaaag    960
aaccaatgtg ggcagactta ttggctctag ctgctgccag
aggaggaaga gtgcatagag   1020
ccccagaacc atataaagcc ttgagagact tgaaggaagc
aagaggtttg ttagctaaag   1080
atttgagcgt attagccttg agggaaggtt taggactacc
accaggtgac gacccaatgt   1140
tgcttgctta tttgcttgat ccatcaaaca caacacctga
aggagtagct agaaggtatg   1200
gtggagaatg gactgaagag gctggagaga gagccgctct
atctgagaga ttgtttgcta   1260
atttgtgggg tagacttgaa ggtgaggaaa gattgttgtg
gctatacagg gaagtagaaa   1320
ggccattatc tgcagtattg gctcatatgg aggccacagg
cgttagatta gatgttgctt   1380
acttaagagc tttgtcattg gaagtcgccg aagaaattgc
aagacttgaa gctgaggtgt    1440
tcagacttgc cggtcatcca ttcaatctta atagtagaga
ccagctagaa agagtgttat    1500
tcgacgagct tggattacca gcaatcggaa agacagaaaa
gactggtaaa aggtctacaa    1560
gtgccgccgt tttggaagca ttgagggagg cccatccaat
tgttgaaaag atattgcagt    1620
atagagaatt gacaaaatta aaatcaactt atatcgatcc
acttccagac ttaatccatc    1680
caaggacagg cagattacac accaggttta accagaccgc
aactgctaca ggcagattat    1740
catcttcaga tcctaactta caaaacattc ctgtaaggac
tccactaggt cagagaatta    1800
gaagagcttt tatcgctgag gaaggctggt tgcttgtggc
tttagattat agtcaaattg    1860
agttaagggt cttggctcac ttgtctggtg acgaaaatct
tatcagagtt tttcaggaag    1920
gtagggatat acatacagag accgcctcat ggatgtttgg
tgttccaagg gaggccgtcg    1980
atccactaat gaggagagca gccaaaacta ttaactttgg
agtattgtat ggtatgagtg    2040
ctcacagatt atcccaagag ttggccatcc cttacgagga
agcacaggct tttatagaaa    2100
ggtatttcca gtcttttcct aaggttagag catggattga
aaagacacta gaggaaggta    2160
ggaggagggg ttacgtggag accttattcg gaagaaggag
atacgttcca gacttagagg    2220
ctagagtgaa atcagttaga gaagccgcag agagaatggc
attcaatatg ccagtacaag   2280
gcactgccgc agatttgatg aaactagcca tggttaagct
atttccaaga ttggaagaaa   2340
tgggagctag aatgctatta caagttcatg atgaacttgt
tttagaggct cctaaagaaa   2400
gggctgaagc agtggccagg ttagctaaag aagtaatgga
gggcgtttac ccattggcag   2460
ttcctttaga ggtcgaagtg ggtataggtg aagactggct
atctgcaaag gaataagaat   2520
tc
2522
序列号81
atgattttag atgtggatta cataactgaa gaaggaaaac
ctgttattag gctattcaaa     60
aaagagaacg gaaaatttaa gatagagcat gatagaactt
ttagaccata catttacgct    120
cttctcaggg atgattcaaa gattgaagaa gttaagaaaa
taacggggga aaggcatgga    180
aagattgtga gaattgttga tgtagagaag gttgagaaaa
agtttctcgg caagcctatt    240
accgtgtgga aactttattt ggaacatccc caagatgttc
ccactattag agaaaaagtt    300
agagaacatc cagcagttgt ggacatcttc gaatacgata
ttccatttgc aaagagatac    360
ctcatcgaca aaggcctaat accaatggag ggggaagaag
agctaaagat tcttgccttc    420
gatatagaaa ccctctatca cgaaggagaa gagtttggaa
aaggcccaat tataatgatt    480
agttatgcag atgaaaatga agcaaaggtg attacttgga
aaaacataga tcttccatac    540
gttgaggttg tatcaagcga gagagagatg ataaagagat
ttctcaggat tatcagggag    600
aaggatcctg acattatagt tacttataat ggagactcat
tcgacttccc atatttagcg    660
aaaagggcag aaaaacttgg gattaaatta accattggaa
gagatggaag cgagcccaag    720
atgcagagaa taggcgatat gacggctgta gaagtcaagg
gaagaataca tttcgacttg    780
tatcatgtaa taacaaggac aataaatctc ccaacataca
cactagaggc tgtatatgaa    840
gcaatttttg gaaagccaaa ggagaaggta tacgccgacg
agatagcaaa agcctgggaa    900
agtggagaga accttgagag agttgccaaa tactcgatgg
aagatgcaaa ggcaacttat    960
gaactcggga aagaattcct tccaatggaa attcagcttt
caagattagt tggacaacct   1020
ttatgggatg tttcaaggtc aagcacaggg aaccttgtag
agtggttctt acttaggaaa   1080
gcctacgaaa gaaacgaagt agctccaaac aagccaagtg
aagaggagta tcaaagaagg   1140
ctcagggaga gctacacagg tggattcgtt aaagagccag
aaaaggggtt gtgggaaaac   1200
atagtatacc tagattttag agccctatat ccctcgatta
taattaccca caatgtttct   1260
cccgatactc taaatcttga gggatgcaag aactatgata
tcgctcctca agtaggccac   1320
aagttctgca aggacatccc tggttttata ccaagtctct
tgggacattt gttagaggaa   1380
agacaaaaga ttaagacaaa aatgaaggaa actcaagatc
ctatagaaaa aatactcctt   1440
gactatagac aaaaagcgat aaaactctta gcaaattctt
tctacggata ttatggctat   1500
gcaaaagcaa gatggtactg taaggagtgt gctgagagcg
ttactgcctg gggaagaaag   1560
tacatcgagt tagtatggaa ggagctcgaa gaaaagtttg
gatttaaagt cctctacatt   1620
gacactgatg gtctctatgc aactatccca ggaggagaaa
gtgaggaaat aaagaaaaag   1680
gctctagaat ttgtaaaata cataaattca aagctccctg
gactgctaga gcttgaatat   1740
gaagggtttt ataagagggg attcttcgtt acgaagaaga
ggtatgcagt aatagatgaa   1800
gaaggaaaag tcattactcg tggtttagag atagttagga
gagattggag tgaaattgca   1860
aaagaaactc aagctagagt tttggagaca atactaaaac
acggagatgt tgaagaagct   1920
gtgagaatag taaaagaagt aatacaaaag cttgccaatt
atgaaattcc accagagaag   1980
ctcgcaatat atgagcagat aacaagacca ttacatgagt
ataaggcgat aggtcctcac   2040
gtagctgttg caaagaaact agctgctaaa ggagttaaaa
taaagccagg aatggtaatt   2100
ggatacatag tacttagagg cgatggtcca attagcaata
gggcaattct agctgaggaa   2160
tacgatccca aaaagcacaa gtatgacgca gaatattaca
ttgagaacca ggttcttcca   2220
gcggtactta ggatattgga gggatttgga tacagaaagg
aagacctcag ataccaaaag   2280
acaagacaag tcggcctaac ttcctggctt aacattaaaa
aatcctag
2328
序列号82
atgatcctcg atacagacta cataactgag gatggaaagc
ccgtcatcag gatcttcaag     60
aaggagaacg gcgagttcaa aatagactac gacagaaact
ttgagccata catctacgcg    120
ctcttgaagg acgactctgc gattgaggac gtcaagaaga
taactgccga gaggcacggc    180
actaccgtta gggttgtcag ggccgagaaa gtgaagaaga
agttcctagg caggccgata    240
gaggtctgga agctctactt cactcacccc caggacnnnc
ccgcaatcag ggacaagata    300
aaggagcatc ctgccgttgt ggacatctac gagtacgaca
tccccttcgc gaagcgctac    360
ctcatagaca aaggcttaat cccgatggag ggcgacgagg
aacttaagat gctcgccttc    420
gacatcgaga cgctctatca cgagggcgag gagttcgccg
aagggcctat cctgatgata    480
agctacgccg acgaggaagg ggcgcgcgtt attacctgga
agaatatcga ccttccctat    540
gtcgacgtcg tttccaccga gaaggagatg ataaagcgct
tcctcaaggt cgtcaaggaa    600
aaggatcccg acgtcctcat aacctacaac ggcgacaact
tcgacttcgc ctacctcaag    660
aagcgctccg agaagctcgg agtcaagttc atcctcggaa
gggaagggag cgagccgaaa    720
atccagcgca tgggcgatcg ctttgcggtg gaggtcaagg
gaaggattca cttcgacctc    780
taccccgtca ttaggagaac gattaacctc cccacttaca
cccttgaggc agtatatgaa    840
gccatctttg gacagccgaa ggagaaggtc tacgctgagg
agatagcgca ggcctgggaa    900
acgggcgagg gattagaaag ggtggcccgc tactcgatgg
aggacgcaaa ggtaacctat    960
gaactcggaa aagagttctt ccctatggaa gcccagctct
cgcgcctcgt aggccagagc   1020
ctctgggatg tatctcgctc gagtaccgga aacctcgtcg
agtggttttt gctgaggaag   1080
gcctacgaga ggaatgaact tgcaccaaac aagccggacg
agagggagct ggcaagaaga   1140
agggagagct acgcgggtgg atacgtcaag gagcccgaaa
ggggactgtg ggagaacatc   1200
gtgtatctgg acttccgctc cctgtatcct tcgataataa
tcacccataa cgtctcccct   1260
gatacactca acagggaggg ttgtgaggag tacgacgtgg
ctcctcaggt aggccataag   1320
ttctgcaagg acttccccgg cttcatccca agcctcctcg
gagacctctt ggaggagaga   1380
cagaaggtaa agaagaagat gaaggccact atagacccaa
tcgagaagaa actcctcgat    1440
tacaggcaac gagcaatcaa aatccttgct aatagcttct
acggttacta cggctatgca    1500
aaggcccgct ggtactgcaa ggagtgcgcc gagagcgtta
ccgcttgggg caggcagtac    1560
atcgagacca cgataaggga aatagaggag aaatttggct
ttaaagtcct ctacgcggac    1620
acagatggat ttttcgcaac aatacctgga gcggacgccg
aaaccgtcaa aaagaaggca    1680
aaggagttcc tggactacat caacgccaaa ctgcccggcc
tgctcgaact cgaatacgag    1740
ggcttctaca agcgcggctt cttcgtgacg aagaagaagt
acgcggttat agacgaggag    1800
gacaagataa cgacgcgcgg gcttgaaata gttaggcgtg
actggagcga gatagcgaag    1860
gagacgcagg cgagggttct tgaggcgata ctaaagcacg
gtgacgttga agaagcggta    1920
aggattgtca aagaggttac ggagaagctg agcaagtacg
aggttccacc ggagaagctg    1980
gtcatctacg agcagataac ccgcgacctg aaggactaca
aggccaccgg gccgcatgtg    2040
gctgttgcaa aacgcctcgc cgcaaggggg ataaaaatcc
ggcccggaac ggtcataagc    2100
tacatcgtgc tcaaaggctc gggaaggatt ggggacaggg
ctataccctt tgacgaattt    2160
gacccggcaa agcacaagta cgatgcagaa tactacatcg
agaaccaggt tcttccagct    2220
gtggagagga ttctgagggc ctttggttac cgtaaagaag
atttaaggta tcagaaaacg   2280
cggcaggttg gcttgggggc gtggctaaaa cctaagacat
ga
2322
·与由序列号1的碱基序列构成的基因相对应的氨基酸序列
MRGMLPLFEP KGRVLLVDGH HLAYRTFHAL KGLTTSRGEP
VQAVYGFAKS LLKALKEDGD           60
AVIVVFDAKA PSFRHEAYGG YKAGRAPTPE DFPRQLALIK
ELVDLLGLAR LEVPGYEADD          120
VLASLAKKAE KEGYEVRILT ADKDLYQLLS DRIHVLHPEG
YLITPAWLWE KYGLRPDQWA          180
DYRALTGDES DNLPGVKGIG EKTARKLLEE WGSLEALLKN
LDRLKPAIRE KILAHMDDLK          240
LSWDLAKVRT DLPLEVDFAK RREPDRERLR AFLERLEFGS
LLHEFGLLES PKALEEAPWP          300
PPEGAFVGFV LSRKEPMWAD LLALAAARGG RVHRAPEPYK
ALRDLKEARG LLAKDLSVLA          360
LREGLGLPPG DDPMLLAYLL DPSNTTPEGV ARRYGGEWTE
EAGERAALSE RLFANLWGRL          420
EGEERLLWLY REVERPLSAV LAHMEATGVR LDVAYLRALS
LEVAEEIARL EAEVFRLAGH          480
PFNLNSRDQL ERVLFDELGL PAIGKTEKTG KRSTSAAVLE
ALREAHPIVE KILQYRELTK          540
LKSTYIDPLP DLIHPRTGRL HTRFNQTATA TGRLSSSDPN
LQNIPVRTPL GQRIRRAFIA          600
EEGWLLVALD YSQIELRVLA HLSGDENLIR VFQEGRDIHT
ETASWMFGVP REAVDPLMRR           660
AAKTINFGVL YGMSAHRLSQ ELAIPYEEAQ AFIERYFQSF
PKVRAWIEKT LEEGRRRGYV           720
ETLFGRRRYV PDLEARVKSV REAAERMAFN MPVQGTAADL
MKLAMVKLFP RLEEMGARML           780
LQVHDELVLE APKERAEAVA RLAKEVMEGV YPLAVPLEVE
VGIGEDWLSA
KE                832
·与由序列号81的碱基序列构成的基因相对应的氨基酸序列
MILDVDYITE EGKPVIRLFK KENGKFKIEH DRTFRPYIYA
LLRDDSKIEE VKKITGERHG           60
KIVRIVDVEK VEKKFLGKPI TVWKLYLEHP QDVPTIREKV
REHPAVVDIF EYDIPFAKRY          120
LIDKGLIPME GEEELKILAF DIETLYHEGE EFGKGPIIMI
SYADENEAKV ITWKNIDLPY          180
VEVVSSEREM IKRFLRIIRE KDPDIIVTYN GDSFDFPYLA
KRAEKLGIKL TIGRDGSEPK          240
MQRIGDMTAV EVKGRIHFDL YHVITRTINL PTYTLEAVYE
AIFGKPKEKV YADEIAKAWE          300
SGENLERVAK YSMEDAKATY ELGKEFLPME IQLSRLVGQP
LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK          360
AYERNEVAPN KPSEEEYQRR LRESYTGGFV KEPEKGLWEN
IVYLDFRALY PSIIITHNVS          420
PDTLNLEGCK NYDIAPQVGH KFCKDIPGFI PSLLGHLLEE
RQKIKTKMKE TQDPIEKILL          480
DYRQKAIKLL ANSFYGYYGY AKARWYCKEC AESVTAWGRK
YIELVWKELE EKFGFKVLYI          540
DTDGLYATIP GGESEEIKKK ALEFVKYINS KLPGLLELEY
EGFYKRGFFV TKKRYAVIDE          600
EGKVITRGLE IVRRDWSEIA KETQARVLET ILKHGDVEEA
VRIVKEVIQK LANYEIPPEK          660
LAIYEQITRP LHEYKAIGPH VAVAKKLAAK GVKIKPGMVI
GYIVLRGDGP ISNRAILAEE          720
YDPKKHKYDA EYYIENQVLP AVLRILEGFG YRKEDLRYQK
TRQVGLTSWL NIKKS               775
·与由序列号82的碱基序列构成的基因相对应的氨基酸序列
MILDTDYITE DGKPVIRIFK KENGEFKIDY DRNFEPYIYA
LLKDDSAIED VKKITAERHG            60
TTVRVVRAEK VKKKFLGRPI EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI
KEHPAVVDIY EYDIPFAKRY           120
LIDKGLIPME GDEELKMLAF DIETLYHEGE EFAEGPILMI
SYADEEGARV ITWKNIDLPY           180
VDVVSTEKEM IKRFLKVVKE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK
KRSEKLGVKF ILGREGSEPK           240
IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE
AIFGQPKEKV YAEEIAQAWE           300
TGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS
LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK           360
AYERNELAPN KPDERELARR RESYAGGYVK EPERGLWENI
VYLDFRSLYP SIIITHNVSP           420
DTLNREGCEE YDVAPQVGHK FCKDFPGFIP SLLGDLLEER
QKVKKKMKAT IDPIEKKLLD           480
YRQRAIKILA NSFYGYYGYA KARWYCKECA ESVTAWGRQY
IETTIREIEE KFGFKVLYAD           540
TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLDYINAK LPGLLELEYE
GFYKRGFFVT KKKYAVIDEE          600
DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV
RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL          660
VIYEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS
YIVLKGSGRI GDRAIPFDEF          720
DPAKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY  RKEDLRYQKT
RQVGLGAWLK
PKT             773
对用于向宿主中导入上述耐热性DNA聚合酶基因的DNA构筑物进行说明。使用本发明的耐热性DNA聚合酶基因对宿主细胞进行转化，使由该DNA编码的蛋白质表达，由此根据其DNA聚合酶活性在宿主细胞中产生DNA聚合酶。
转化时，使用可以使由上述耐热性DNA聚合酶基因构成的DNA片段在宿主细胞内表达的DNA构筑物。作为用于转化的DNA构筑物的方案，没有特殊限制，可以根据外来基因的导入形态(染色体外或染色体内)或宿主细胞的种类选择采用质粒(DNA)、噬菌体(DNA)、反转录转座子(DNA)、人工染色体(YAC、PAC、BAC、MAC等)。因此，该DNA构筑物除了上述耐热性DNA聚合酶基因之外，可以具有上述任一种方案的载体的构成片段。
优选的原核细胞性载体、真核细胞性载体、动物细胞性载体、植物细胞性载体在该领域是公知的。
需要说明的是，作为质粒DNA，例如可以举出pRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123等YCp型大肠杆菌-酵母穿梭载体、pYES32或YEp13等YEp型大肠杆菌-酵母穿梭载体、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135等YIp型大肠杆菌-酵母穿梭载体等。作为噬菌体DNA，可以举出λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt100、gt11、zap)、φX174、M13mp18或M13mp19等。
作为反转录转座子，可以举出Ty因子等。作为YAC，可以举出pYACC2等。
制备该DNA构筑物时，用合适的限制酶切断含有上述耐热性DNA聚合酶基因的片段等，插入到使用的载体DNA的限制酶位点或多克隆位点等。
该DNA构筑物的第1方案具有启动子片段，所述启动子片段可表达地连接有由上述耐热性DNA聚合酶基因构成的DNA片段。即，通过启动子控制，在所述启动子的下游侧连接上述耐热性DNA聚合酶基因片段。
上述耐热性DNA聚合酶基因的表达中，如果使用酵母中表达的启动子，则优选使用例如gal1启动子、gal10启动子、丙酮酸脱羧酶基因启动子、热休克蛋白质启动子、MFα1启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、AOX1启动子等。
另外，作为该DNA构筑物其他方案的第2DNA构筑物，除了该DNA之外，还具有用于在宿主染色体中进行同源重组的DNA片段。同源重组用DNA片段是与宿主染色体中将要导入上述耐热性DNA聚合酶基因的靶位点附近的DNA序列相同的DNA序列。至少具有1个同源重组用DNA片段，优选具有2个。例如，优选使2个同源重组用DNA片段为与染色体上的靶位点上游侧和下游侧的DNA相同的DNA序列，并且在上述DNA片段间连接上述耐热性DNA聚合酶基因。
通过同源重组在宿主染色体上导入上述耐热性DNA聚合酶基因时，可以由宿主染色体上的启动子可控制地导入该DNA。此时，通过靶基因的导入，同时破坏本来应该由该启动子控制的内在性基因，可以使外来的上述耐热性DNA聚合酶基因代替该内在性基因进行表达。该启动子为在宿主细胞中高度表达的启动子时特别有用。
以下，对利用上述的DNA构筑物进行的宿主转化进行说明。一旦DNA构筑物被构筑，则可以使用下述各种适当的方法中的任一种将其导入适当的宿主细胞中，所述方法为转化法、转染法、接合法、原生质体融合、电穿孔法、脂质转染法、乙酸锂法、基因枪法、磷酸钙沉淀法、农杆菌法、PEG法、直接显微注射法等。导入DNA构筑物后，其接收细胞在选择培养基中培养。
通过DNA构筑物转化的转化体中，DNA构筑物的构成成分存在于染色体上或染色体外因子(包括人工染色体)上。
确认期望的启动子下是否导入了上述耐热性DNA聚合酶基因，可以利用PCR法或southern杂交法进行。例如，由转化体制备DNA，利用导入位点特异性引物进行PCR，通过在电泳中检测所预期的条带，可以对PCR产物确认。或者也可以用以荧光色素等标记的引物进行PCR来确认。上述方法在本领域技术人员中是公知的。
酵母为宿主细胞时，可以使用破坏了酵母基因的菌株。例如，导入基因时，如果尿嘧啶合成酶基因存在于质粒中，则可以使用尿嘧啶缺陷型株选拔导入了质粒的酵母。另外，可以使用蛋白酶缺失株抑制在酵母细胞内过量表达的蛋白质的分解。所述方法在本领域技术人员中是公知的。
以下，对使用上述转化体制造耐热性DNA聚合酶制品进行说明。对导入DNA构筑物所得到的转化体进行培养，由此在培养物中生成作为外来基因的表达产物的耐热性DNA聚合酶。通过进行从培养物中分离耐热性DNA聚合酶的步骤，可以获得耐热性DNA聚合酶制品。需要说明的是，本发明中所谓培养物，包括培养细胞或菌体、细胞或菌体的破碎物。
本发明的转化体的培养中，可以根据转化体的种类选择培养条件。所述培养条件在本领域技术人员中是公知的。
作为培养以酵母为宿主得到的转化体的培养基，只要为含有微生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等、且能够有效地进行转化体的培养的培养基即可，没有特殊限定，可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种，但样品微生物为微量时，为了生产可适用的耐热性DNA聚合酶制品，优选使用合成培养基。作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化物、乙酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇。作为氮源，除了可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐或其他的含氮化合物之外，还可以使用胨、肉浸膏、玉米浆等。
作为无机物，可以使用磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养通常在振荡培养或通气搅拌培养等好氧条件下、在30℃下进行24～72小时。培养期间，优选pH保持在5.0～7.0。另外，pH的调节可以使用无机或有机酸、碱溶液等进行。
作为培养以植物细胞作为宿主得到的转化体的培养基，只要为含有碳源、氮源、无机盐类、有机物等并能够培养植物细胞的培养基即可，没有特殊限定，作为例子，可以举出通常使用的MS培养基、LS培养基、Gamborg B5培养基、WP培养基、White培养基等。作为碳源，可以举出葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物、乙酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇，其中，优选蔗糖、葡萄糖。作为氮源，除了硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙等硝酸盐、磷酸铵、硝酸铵、硫酸铵等铵盐或有机酸的铵盐或者其他的含氮化合物之外，还可以举出胨、肉浸膏、玉米浆、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、鸟氨酸等氨基酸等。作为无机盐类，可以举出磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。作为有机物，作为维生素类，除了可以举出盐酸硫胺、烟酸、盐酸吡多辛、生物素、叶酸、对氨基苯甲酸等之外，还可以举出肌醇、椰奶、酪蛋白水解产物等。另外，作为植物激素，可以举出吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸等茁长素类、玉米素、6-苄基腺嘌呤、激动素等细胞分裂素类、脱落酸、赤霉酸等，但是只要能够培养植物细胞即可，可以含有也可以不含有上述植物激素。培养通常在振荡培养或通气搅拌培养等好氧条件下、在25℃下进行5天～6周。
作为培养以动物细胞作为宿主得到的转化体的培养基，可以使用通常使用的RPMI1640培养基、DMEM培养基或在上述培养基中添加有胎牛血清等得到的培养基。培养通常在5％CO2存在下、37℃下进行1～30天。培养中根据需要也可以在培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
培养结束后，能够从培养液或培养菌体等培养物中以所期望的形态得到耐热性DNA聚合酶。例如为了得到含有耐热性DNA聚合酶的制品，可以利用之前举出的方法。进而，也可以从利用之前举出的提取物制备法得到的提取物(例如粗提取成分)中分离纯化耐热性DNA聚合酶，将其作为纯化品。
对上述提取物实施各种色谱法、电泳等可以得到纯化酶样品。例如通过适当选择下述方法或者将它们组合可以获得经纯化的目的基因产物，所述方法为使用Sephadex、UltraGel或Biogel等的凝胶过滤、离子交换色谱、使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法、使用亲合色谱、反相色谱等的分离法。需要说明的是，经纯化的基因产物具有的氨基酸序列可以根据公知的氨基酸分析法进行分析。上述培养法、纯化法只是一个例子，并不限定于此。
特别是本发明中，培养产物中大部分耐热性DNA聚合酶以不溶性的形式被生成，通过对其加热能够具有活性、提高溶解度、纯度。通过在直至得到耐热性DNA聚合酶的所期望形态(例如制品或纯化品)为止的适当阶段中进行加热处理，能够使由宿主菌生产的耐热性DNA聚合酶增溶及活化。例如，在培养菌体破碎后进行离心分离，分开上清液、沉淀，对沉淀部分、或者对在菌体内生产蓄积耐热性DNA聚合酶的菌体进行加热处理，由此可以同时达成耐热性DNA聚合酶的增溶和活化。该加热处理优选在50℃～100℃、较优选在70℃～80℃、更优选在73℃～75℃下进行1小时左右，较理想。另外，通过对培养产物的上清液部分进行加热，也可以使来自宿主的蛋白质不溶化，提高纯度。对培养产物的上清液部分的加热优选在50℃～100℃、较优选在70℃～80℃、更优选在73℃～75℃下进行1小时左右，较理想。
本发明的耐热性DNA聚合酶制品的制造中，以真核细胞作为宿主导入对耐热性DNA聚合酶进行编码的基因、使其表达，由此可以获得耐热性DNA聚合酶制品，且该耐热性DNA聚合酶制品中来自细菌DNA的核酸等的混入完全不存在、或者极度降低。因此在得到纯化品时，也能够获得下述效果，即，纯化步骤所要求的与上述核酸等的混入相关的纯化精度或步骤被减少，实现制造成本的降低。
(2)PCR法
作为使用本发明的耐热性DNA聚合酶制品的PCR法，只要为用于扩增靶基因的PCR法即可，可以使用各种PCR法，所述靶基因用于对检测对象生物进行检测。
作为优选的PCR法，可以举出以下方法。
(A)通常的PCR法，或PCR的变形方法，所谓变形方法是单独使用以下的a、b、c或者组合使用A和B或A和C的PCR法。
a.PCR法：使用了嵌入剂的实时PCR法，包括以下步骤。
(a1)设计引物，使用作目标的PCR扩增产物的Tm值高于引物二聚体自身的值。
(a2)将实时PCR的荧光检测时的温度设定在它们的中间。
b.PCR法：是用于试样中靶核酸内的序列的半嵌套式扩增的方法，包含以下阶段。
(b1)在扩增反应混合物中混合上述试样，所述扩增反应混合物含有外侧的PCR用引物对及半嵌套式引物。
(b2)为了提供外侧的扩增序列，将阶段b1的扩增反应混合物在以下温度的扩增反应中进行处理，所述温度为在用作模板的DNA上将外侧的PCR用引物对退火并使其延伸、且半嵌套式引物不工作的温度。
(b3)为了提供半嵌套式扩增产物，将阶段b2的混合物在下述扩增反应中进行处理，即，在只有外侧的PCR用引物的一个和半嵌套式引物退火的温度下、或使其延伸的延伸时间下进行的扩增反应。
c.PCR法：是用于试样中靶核酸内的序列的嵌套式扩增的方法，包括以下阶段。
(c1)在扩增反应混合物中混合上述试样，所述扩增反应混合物含有外侧的PCR用引物对及嵌套式引物对。
(c2)为了提供外侧的扩增序列，将阶段(c1)的扩增反应混合物在以下温度的扩增反应中进行处理，所述温度为在用作模板的DNA上将外侧的PCR用引物对退火并使其延伸、且嵌套式引物对不工作的温度。
(c3)为了提供嵌套式扩增产物，对阶段(c2)的混合物在下述扩增反应中进行处理，即，在只有嵌套式引物对进行退火的温度下、或使其延伸的延伸时间下进行的扩增反应。
(B)PCR法：是作为涉及定量法的PCR变形方法的、使用了嵌入剂的实时PCR法，包括以下步骤。
(a1)设计引物，使用作目标的PCR扩增产物的Tm值高于引物二聚体自身的值。
(a2)将实时PCR的荧光检测时的温度设定在它们的中间。
(2-3)与本发明的检测法及定量法相关的PCR变形方法，是用于试样中靶核酸内的序列的半嵌套式扩增的方法，是包括以下阶段而成的PCR法。
(b1)在扩增反应混合物中混合上述试样，所述扩增反应混合物含有外侧的PCR用引物对及半嵌套式引物，
(b2)为了提供外侧的扩增序列，将阶段b1的扩增反应混合物在以下温度的扩增反应中进行处理，所述温度为在用作模板的DNA上将外侧的PCR用引物对进行退火并使其延伸、且半嵌套式引物不工作的温度。
(b3)为了提供半嵌套式扩增产物，对阶段b2的混合物在下述扩增反应中进行处理，即，在只有外侧的PCR用引物的一个和半嵌套式引物退火的温度下、或使其延伸的延伸时间下进行的扩增反应。
(C)PCR法：是作为用作检测法及定量法的PCR变形方法的、用于试样中靶核酸内的序列嵌套式扩增的方法，包括以下阶段。
(c1)在扩增反应混合物中含有上述试样，所述扩增反应混合物含有外侧的PCR用引物对及嵌套式引物对。
(c2)为了提供外侧的扩增序列，将阶段c1的扩增反应混合物在以下温度的扩增反应中进行处理，所述温度为在用作模板的DNA上将外侧的PCR用引物对进行退火并使其延伸、且在干涉引物对的阻碍作用下嵌套式引物对不工作的温度。
(c3)为了提供嵌套式扩增产物，将阶段c2的混合物在下述的扩增反应中进行处理，即，在只有嵌套式引物对退火的温度下、或使其延伸的延伸时间下进行的扩增反应。
与本发明的耐热性DNA聚合酶制品组合时有用的PCR变形方法之一为掩蔽引物二聚体法(A法)。掩蔽引物二聚体法与现有的引物二聚体的形成抑制方法不同，是仅将引物二聚体不显示的方法。该方法是考虑到“由于引物二聚体作为扩增产物较小，所以存在其Tm值较低的倾向”，以下述步骤进行使用了嵌入剂的实时PCR的方法：
(a1)设计引物，使成为目的的PCR扩增产物的Tm值高于引物二聚体的Tm值，
(a2)将实时PCR的荧光检测时的温度设定为它们的中间值。
由于通过进行以上步骤只有引物二聚体从双链解离为单链，所以嵌入剂不能结合。其结果，引物二聚体不荧光发光，监测器上仅引物二聚体不显示，能够正常地绘出目的扩增产物的扩增曲线。
A法中使用的引物的设计，只要使成为目的的PCR扩增产物的Tm值高于引物二聚体自身的值即可，没有特殊限制，具体而言，可以如下设计，即，使成为目的的PCR扩增产物的Tm值在引物二聚体自身Tm值的5℃以上，优选在10℃以上。A法中，实时PCR的荧光检测时的温度只要设定为成为目的的PCR扩增产物的Tm值与引物二聚体的Tm值的中间值即可，但根据扩增产物与引物二聚体的Tm值的差的程度，可以使中间值具有中间值前后、例如前后1～4℃左右的幅度。但是，荧光检测温度优选为上述范围内的尽可能低的温度。
使用了嵌入剂的实时PCR，可以使用装置、方法等通常已知的实时PCR，例如，可以举出利用SYBR Green I等荧光色素作为嵌入剂的实时PCR。
与本发明的耐热性DNA聚合酶制品组合时有用的PCR变形方法的另一方法为，应用套匣扩增法、或研究PCR延伸时间。通过应用套匣扩增法或研究PCR延伸时间，可以无需如通常的嵌套式PCR法那样分2次PCR进行，而仅以1次的PCR进行嵌套式PCR(一步嵌套式PCR)。该一步嵌套式PCR法，只要加入通过简单设计得到的“嵌套式引物”便可以立刻施行，因此任何人都可以简单地实施。
一步嵌套式PCR法是下述B法或C法的PCR变形方法。
B法：该PCR变形方法是用于试样中靶核酸内的序列的半嵌套式扩增的方法，包括以下阶段。
(b1)在扩增反应混合物中混合试样，所述扩增反应混合物含有外侧的PCR用引物对及半嵌套式引物，
(b2)为了提供外侧的扩增序列，将阶段b1的扩增反应混合物在以下温度的扩增反应中进行处理，所述温度为在用作模板的DNA上将外侧的PCR用引物对退火并使其延伸、且半嵌套式引物不退火的温度。
(b3)为了提供半嵌套式扩增产物，将阶段b2的混合物在以下温度的扩增反应中进行处理，所述温度为外侧的两个PCR用引物和半嵌套式引物退火、但只有嵌套的内侧的PCR扩增产物变性的温度。或者在只有嵌套的内侧的PCR扩增产物能够延伸的延伸时间的扩增反应中进行处理。
B法中，扩增反应混合物由3种引物构成。即，第1引物为外侧的PCR用引物对中的一个，第2引物为半嵌套式引物，第3引物为外侧PCR用引物对中的另一个，且与半嵌套式引物也能成对。
B法中，阶段b2中，只使外侧的PCR用引物对退火并使其延伸、且半嵌套式引物不退火的温度是必要的。另外，阶段b3中，提供用于外侧的PCR扩增产物不变性、只使内侧的嵌套式PCR扩增产物变性从而延伸的温度是必要的。或者在阶段b3中，提供不使外侧的PCR扩增产物延伸、只使内侧的嵌套式PCR扩增产物延伸的延伸时间是必要的。B法中，用于将半嵌套式引物对退火的温度优选比用于将外侧的PCR用引物对退火的合适温度低5℃～20℃。
B法的阶段a1中，优选引物以一定的温度存在于扩增反应混合物中。
B法中，优选第1引物与第3引物的Tm值相同。B法中，优选第2引物被设定在内侧以使其与第1、3中的任一个引物成为半嵌套式，且第2引物的Tm值比第1、3引物的Tm值低5～20℃。B法中，优选与嵌套的内侧的扩增产物相比，外侧的扩增产物足够(约300bp以上)大。
C法：该PCR变形方法为用于试样中靶核酸内的序列嵌套式扩增的方法，包括以下阶段。
(c1)在扩增反应混合物中混合试样，所述扩增反应混合物含有外侧的PCR用引物对及嵌套式引物对。
(c2)为了提供外侧的扩增序列，将阶段c1的扩增反应混合物在以下温度的扩增反应中进行处理，所述温度为在用作模板的DNA上将外侧的PCR用引物对退火并使其延伸、且嵌套式引物对不退火的温度。
(c3)为了提供嵌套式扩增产物，将阶段c2的混合物在仅有嵌套的内侧的PCR扩增产物变性的温度下的扩增反应中进行处理。或者在只有嵌套的内侧的PCR扩增产物能够延伸的延伸时间下的扩增反应中进行处理。
C法中，扩增反应混合物由4种引物构成。即，第4、第5引物为外侧的PCR用引物对，第6、第7引物为嵌套式引物对。C法中，在阶段c2中，只使外侧的PCR用引物对退火并延伸、使嵌套式引物对不工作的温度是必要的。另外，阶段c3中，提供外侧的PCR扩增产物不变性、只使内侧的嵌套式PCR产物变性从而延伸的温度是必要的。或者在阶段c3中，提供外侧的PCR扩增产物不能延伸、只有内侧的嵌套式PCR产物能够延伸的延伸时间是必要的。
C法中，用于使嵌套式引物对退火的温度优选比用于使外侧的PCR用引物对退火的合适温度低5℃～20℃。
C法中，阶段c1中，优选第4～7引物以一定的温度存在于扩增反应混合物中。C法中，优选第6、第7引物的Tm值比第4、第5引物的低5℃～20℃。C法中，优选第4、第5两个引物的Tm值相同。C法中，优选第6、第7两个引物的Tm值相同。C法中，优选与嵌套的内侧的扩增产物相比，外侧的扩增产物足够(约300bp以上)大。
<掩蔽引物二聚体法>
以下所示的通常的PCR条件设定中，荧光检测点设定在延伸反应(extension)后的72℃。
·设定温度：94℃、55℃、72℃
·恒温时间：10秒
·温度变化率：20.00[℃/s]
·循环数：60
由此，如图13所示的扩增曲线所示，蒸馏水(distilled water：D.W.)中检测到引物二聚体(pd)。此时，观察例如E.Coli检测时的熔解曲线(melting curve)，引物二聚体的Tm值为76℃左右、目的(E.coli)的PCR扩增产物的Tm值为91℃左右(图14)。
因此，有意地设计引物，使目的PCR产物的Tm值比引物二聚体的Tm值高10℃左右，将荧光检测点(FDP)设定在其中间值前后(例如如以下条件，为86℃)(图10：也可以为不在延伸后的其他处)。
·设定温度：94℃、55℃、72℃、86℃
·恒温时间：：10秒(94℃、55℃、72℃)；1秒(86℃)
·温度变化率：20.00[℃/s]
·循环数：60
由此，完全未检测到引物二聚体。即，由于不显示引物二聚体，所以如果与本发明的耐热性DNA聚合酶制品组合，则如图15(A)所示，能够得到在蒸馏水(D.W.)中完全未扩增的扩增曲线。
通过上述的“不显示法+本发明的耐热性DNA聚合酶制品+细菌的通用引物”的组合，能够测定细菌至检测限(图14)、进而由于标准曲线至检测限为止表现出直线性，所以表明至检测限为止可以准确地定量。也就是说，通过在本发明方法上结合掩蔽引物二聚体法，利用使用了嵌入剂的实时PCR法，首次能够以高灵敏度准确地定量测定细菌。
<一步嵌套式PCR法>
设计下述引物(参见图11(A))。
(a)使外侧的PCR产物(扩增产物Ⅰ)的正向及反向引物各自的Tm值相同或相近。
(b)在内侧设定引物(引物Ⅱ)，所述引物(引物Ⅱ)与外侧的PCR产物的任一方的引物成为半嵌套式。
(c)设计半嵌套式引物，使其Tm值比外侧的PCR产物的引物的Tm值低5～20℃。
(d)设计扩增产物Ⅰ为约400bp以上的引物，使外侧的PCR产物(扩增产物Ⅰ)的Tm值为89℃以上。
(e)设计扩增产物Ⅱ为约100bp的引物，使半嵌套式PCR产物(扩增产物Ⅱ)的Tm值为86℃～87℃。
进行特异度更高的嵌套式PCR时，设计如下的新引物(参见图11(B))。
(a)使外侧的PCR产物(扩增产物Ⅰ)的正向及反向引物各自的Tm值相同或相近。
(b)以成为嵌套式的2个引物(引物Ⅱ)的Tm值与扩增产物Ⅰ的引物的Tm值相比足够(5～20℃)的低的方式进行设定。
(c)设计扩增产物Ⅰ为约500bp以上的引物，使扩增产物Ⅰ的Tm值为89℃以上。
(d)设计扩增产物Ⅱ为约100bp的引物，使扩增产物Ⅱ的Tm值为86℃～87℃。
(e)设计扩增产物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ均为约300bp以上的引物，使扩增产物Ⅲ、Ⅳ各自的Tm值为89℃以上。
(3)检测对象生物的检测方法
(检测方法)
检测本发明的样品中的检测对象生物的方法的特征在于，包括以下步骤：
(1)扩增步骤，使用由上述样品配制的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物、和本发明的耐热性DNA聚合酶制品，进行核酸扩增反应，
(2)检测步骤，检测上述扩增步骤中的扩增产物中的上述靶基因的扩增产物。
上述检测方法中，优选在靶基因之外的靶外基因的扩增被抑制的条件下进行扩增步骤。上述靶外基因的扩增抑制中可以优选利用使用了抗DNA聚合酶抗体的热启动法。此时，优选相对于1U耐热性DNA聚合酶，使用过量的抗DNA聚合酶抗体。
检测步骤以下述方式进行，即，可检测出上述靶基因的扩增产物，不能检测出靶基因之外的靶外基因的扩增产物。作为用于此的方法，优选下述方法，即，以下述方式设定可检测出靶基因的扩增产物、不能检测出靶基因之外的靶外基因的扩增产物的条件，由此只检测出靶基因的扩增产物，所述方式为：
(1)设计上述引物，使靶基因扩增产物的熔解温度(TmA)高于靶外基因的扩增产物的熔解温度(TmB)，
(2)在TmA和TmB之间的温度下进行扩增产物的检测。
进而，可以使用下述方法，即，通过使用显示扩增产物的量的显示装置的实时PCR进行扩增步骤和检测步骤，使靶外基因的扩增产物在上述显示装置中不显示的方法。
在扩增产物的检测中，可以使用具有检测用标记的嵌入剂。
检测步骤可以通过在凝胶上展开扩增产物而进行。扩增产物可以通过凝胶电泳展开并可视化。
作为检测对象生物，可以举出选自细菌、真菌、病毒中的1种或2种以上。
根据本发明的检测方法，能够实现样品中的感染症病原菌的高灵敏度检测。进而，本发明的检测方法能够优选适用于下述情况，即，为选自用于血液、脑脊髓液、羊水、尿、食品(也包括食品加工环境的污染检查)、饮料、化妆品、水质检查、生物实验环境的污染检查的样品的应该为无菌环境的样品。作为用于水质检查的样品，可以举出自来水、来自蓄水或供水槽的水、空调循环水、加湿器水、温泉水或池塘水。
检测步骤中，通过定量靶基因的扩增产物、并利用其定量结果，能够进行样品中检测对象生物的定量、个体数的测定、存在量的掌握、定量鉴定等。以下，对样品中的检测对象生物的定量方法进行说明。
(定量方法)
本发明的定量样品中的检测对象生物的方法包括以下步骤：
(1)扩增步骤，使用由样品制备的DNA、用于扩增对检测对象生物为特异性的靶基因的引物、和本发明的耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，和
(2)定量步骤，定量上述扩增步骤中的扩增产物，根据所得的定量结果定量上述样品中的检测对象生物。
作为检测对象生物，只要具有用于传递信息的核酸即可，例如可以举出细菌(真细菌、古细菌)、真菌、病毒等。使用了本发明的耐热性DNA聚合酶制品的本发明的定量方法特别适合细菌的定量。定量可以通过将扩增产物的检测结果与使用标准的生物的结果相比较而进行。根据本发明的定量方法，能够对样品中的检测对象生物的个体数或整体质量进行定量。进而，能够通过选择检测对象生物的鉴定用基因作为靶基因，根据靶基因的扩增产物的定量结果，定量并鉴定样品中所含的检测对象生物。
作为来自样品的核酸，可以利用从样品中得到的DNA、以及基于从样品中得到的RNA制备的cDNA。另外，根据目的也可以以RNA作为直接扩增对象。
作为样品，可以举出应该为无菌环境的样品。作为所述应该为无菌环境的样品，可以举出血液、脑脊髓液、羊水或尿等从人或家畜的生物体取样所得的试样。进而，作为样品，可以利用用于水质检查的样品。作为上述用于水质检查的样品，可以举出自来水、来自蓄水或供水槽的水、空调循环水、加湿器水、温泉水或池塘水。进而，作为样品也可以利用食品、饮料或化妆品、生物系统实验环境下的细胞培养液等含有有机物、且细菌或真菌的混入或增殖会导致质量劣化的样品。
由样品制备DNA，可以按照常规方法进行，供应至扩增步骤时，根据需要可以除去除DNA之外的成分、或调整DNA浓度。
扩增步骤中，能够适用PCR、其中优选适用实时PCR。扩增产物的检测中，可以利用各种公知的方法。例如可以举出使用具有标记功能的嵌入剂的方法、或使用在对扩增的DNA序列特异性杂交的核苷酸上结合有荧光物质的探针的方法等。作为嵌入剂，可以举出溴化乙锭、SYBR Green Ⅰ等。优选的嵌入剂为SYBR Green Ⅰ。需要说明的是，使用与全部的细菌DNA反应的通用引物时，应该使用的SYBR Green Ⅰ优选使用将来自重组宿主的细菌DNA的混入抑制为最小限度的高纯度的SYBR Green Ⅰ。
上述方法中的扩增步骤优选在靶基因之外的靶外基因的扩增被抑制的条件下进行。在所述靶外基因的扩增抑制中，例如可以举出热启动法、使用修饰引物的方法、在样品中添加与引物二聚体结合的物质的方法、在含有耐热性DNA聚合酶的基因扩增溶液中添加化学物质的方法等，其中，优选热启动法。作为热启动法，可以举出使用抗DNA聚合酶抗体的方法、直至蜡的熔解温度为止分离酶和引物的蜡法等。进行使用抗DNA聚合酶抗体的方法时，优选使用耐热性DNA聚合酶的酶活性被100％阻碍的量以上的过量的抗DNA聚合酶抗体。
(不显示法)
进而，利用不显示法进行扩增产物的定量，由此可以简便且高灵敏度地定量。所述不显示法是在使靶基因的扩增产物为可检测到的状态，靶基因之外的靶外基因的扩增产物为不可检测到状态的条件下进行扩增产物的检测的方法。
具体而言，通过如下方式设定靶基因的扩增产物可检测到、除靶基因之外的靶外基因的扩增产物不可检测到的条件：
(1)设计上述引物，使上述靶基因扩增产物的熔解温度(TmA)高于上述靶外基因的扩增产物的熔解温度(TmB)，
(2)在TmA和TmB之间的温度下进行上述扩增产物的定量。
该不显示法可以优选适用于实时PCR法，所述实时PCR法使用显示扩增产物的量的显示装置进行靶基因的扩增和扩增产物的定量。使用该装置时，在扩增产物的定量分析时靶外基因的扩增产物在显示装置上不显示、可以排除靶外基因的扩增产物对灵敏度造成的影响。
作为靶外基因特别成为问题的是引物二聚体。由样品制备的DNA的量为微量时，在扩增初期，相对于由样品制备的DNA，引物过量地存在，如果形成引物二聚体，则以此为基础形成扩增产物，不能监测本来应该检测到的DNA的扩增产物，或者不能定量。对于所述引物二聚体的产生，优选利用热启动法及/或不显示法。
完全阻碍引物二聚体(Primer Dimer)的形成是非常困难的，即使使用各种引物二聚体形成抑制方法，随着PCR循环数的增加，有时也可检测到引物二聚体。其结果，成为利用实时PCR进行定量测定的灵敏度降低的主要原因。另外，即使在定性检查中，采取每次测定检查Tm值(熔解温度：melting temperature)，排除由引物二聚体产生的“假阳性”的方法有时也是必要的。
不显示法与现有的引物二聚体的形成抑制方法不同，为只使引物二聚体不显示的方法(掩蔽引物二聚体)，是考虑到“由于引物二聚体作为扩增产物较小，所以存在其Tm值较低的倾向”而得到的方法。
利用实时PCR进行掩蔽引物二聚体法中，设定以下条件。
(1)设计引物，使成为目的的PCR扩增产物的Tm值为比引物二聚体的Tm值高的值。
(2)将实时PCR的扩增产物检测时的温度设定为它们的中间值。
通过以上的条件设定，在扩增产物检测时，只有引物二聚体从双链解离为单链。检测扩增产物(双链DNA)时，使用不检测单链DNA、只检测双链DNA的标记、例如嵌入剂，由此由于只有引物二聚体从双链解离为单链，所以嵌入剂不能结合。其结果，不产生基于引物二聚体的检测信号，显示装置(监测器)上只有引物二聚体不显示，能够正常地绘制目的扩增产物的扩增曲线。
使用上述不显示法时的引物的设计，只要使成为目的的PCR扩增产物的Tm值高于引物二聚体自身的值即可，没有特殊限定，可以如下设计引物，即，使成为目的的PCR扩增产物的Tm值为引物二聚体自身的Tm值的5℃以上，优选10℃以上。需要说明的是，扩增产物的Tm值根据测定系统而设定。
具体而言，
(1)利用现有的设计方法设计难以生成引物二聚体的引物。
(2)将引物自身的Tm值设计为60℃以下。
(3)通过用最近邻分析法计算，将成为目的的PCR扩增产物的Tm值设计为约87℃或其以上。
使用上述引物扩增的扩增产物的大小，只要为能够设计成比引物二聚体自身的Tm值高的大小即可，没有特殊限定，利用实时PCR的扩增中优选如下设计引物，即，使扩增产物的大小为理想的50bp～1000bp、优选为50bp～500bp左右。
实时PCR的荧光检测时的温度，只要设定为成为目的的PCR扩增产物的Tm值与引物二聚体的Tm值的中间值即可，但根据扩增产物与引物二聚体的Tm值差的程度，可以使中间值具有中间值前后、例如前后约1～4℃的幅度。但是，考虑到双链DNA的稳定性，优选将荧光检测时的温度设定为尽可能低的温度。
使用了嵌入剂的实时PCR，可以使用装置、方法等通常已知的实时PCR，例如，可以举出利用SYBR Green(SYBR Green Ⅰ)作为嵌入剂的实时PCR。
根据掩蔽引物二聚体法，引物二聚体的形成不会成为使用了嵌入剂的实时PCR法的阻碍要因，可以不降低灵敏度地进行定量检查，定性检查中也没有由引物二聚体引起的假阳性的风险。并且，与使用了抗DNA聚合酶抗体的热启动法等现有方法相比，本发明方法简便且经济。
利用该不显示法，可以进行测定至检测限为止，进而标准曲线至检测限为止显示出直线性，所以利用实时PCR法，能够以高灵敏度准确地进行定量测定。
(来自扩增产物的检测对象生物的PCR法定量)
根据扩增产物的量判定检测对象生物的量(也包括不存在的情况)时，可以优选利用基于标准曲线进行的方法，所述标准曲线是根据在进行扩增时的条件(方案)下的已知的检测对象生物量求出的。例如，利用以某特定的方案绘制的标准曲线，如果检测限(灵敏度)为0.1CFU/ml，且为35次循环，则可以进行35次循环的PCR反应，基于标准曲线显示的基准算出检测对象生物的量。需要说明的是，方案中如果加入样品的浓缩步骤、或乙醇沉淀处理，则可以进一步提高检测限(灵敏度)(例如大概至60次循环为止)。由此，也可以将灵敏度设定为非常高，例如为0.000001CFU/ml。另外，能够设定的检测灵敏度可以预先算出。例如，利用“检测对象的高灵敏度定量方法”的生活用水的定量中，细菌的通用引物的PCR检测灵敏度为10fg/μl，真菌的通用引物的PCR检测灵敏度为10pg/μl，所以如果使用换算为GFU/ml的换算式、进而在最初追加将50ml样品颗粒化提取DNA，则变为
细菌：3.0×10-1CFU/ml
真菌：2.8CFU/ml。
需要说明的是，通过改变方案，也能够改变检测灵敏度。
(来自扩增产物的检测对象生物的凝胶展开法定量)
利用琼脂糖凝胶等展开扩增产物(也包括使用热启动法的情况)，根据对其量进行荧光检测时的荧光强度等，也可以简便地进行检测对象生物的定量。
(判定细菌是否存在的方法)
本发明的耐热性DNA聚合酶可以优选用于以下方法。
(Ⅰ)判定样品中是否存在细菌的方法，其特征在于，在判定样品中是否存在细菌的方法中，包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用用于扩增对上述细菌为特异性的靶基因的引物(B)、和以真核细胞作为宿主制造的含有耐热性DNA聚合酶的制品，进行核酸增殖反应，和
(2)将上述第一扩增步骤中的扩增产物可视化的步骤，
其中，上述引物(B)为：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组、及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物。
作为将上述扩增产物可视化的方法可以使用凝胶电泳。
(Ⅱ)掌握样品中的细菌的存在量的方法，其特征在于，掌握样品中的细菌的存在量的方法中包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用用于扩增对上述细菌为特异性的靶基因的引物(B)、和以真核细胞作为宿主制造的含有耐热性DNA聚合酶的制品，进行核酸增殖反应，和
(2)将上述第一扩增步骤中的扩增产物数值化的步骤，
其中，上述引物(B)为，
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物。
作为将上述扩增产物数值化的方法，可以使用吸光度测定法或光密度测定法。
(定量鉴定方法)
上述样品中的检测对象生物的定量方法可以优选适用于以下进行检测对象生物的定量并鉴定的方法。
(A)样品中的检测对象生物的定量鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用由上述样品制备的DNA、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(B)及(M)、和本发明的耐热性DNA聚合酶制品，进行核酸扩增反应，
(2)第一定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第一扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，进行上述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
(3)第二扩增步骤，使用由上述样品制备的DNA、和用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(F)、和以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，进行核酸扩增反应，和
(4)第二定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第二扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对定量鉴定上述检测对象生物的第一定量鉴定步骤和上述第二扩增步骤中的扩增产物进行定量，根据所得的定量结果，对上述样品中的检测对象生物进行定量鉴定，
其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(F)能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(M)对呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因进行特异性地扩增的引物组，
(B)样品中的检测对象生物的定量鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用由上述样品制备的核酸、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(B)、和本发明的耐热性DNA聚合酶制品，进行核酸扩增反应，
(2)第一定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第一扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，进行上述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
(3)第二扩增步骤，使用由上述样品制备的DNA、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(F)、和以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，进行核酸扩增反应，
(4)第二定量鉴定步骤，基于对上述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析上述第二扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对定量鉴定上述检测对象生物的第一定量鉴定步骤和上述第二扩增步骤中的扩增产物进行定量，根据所得的定量结果对上述样品中的检测对象生物进行定量鉴定，
(5)第三扩增步骤，使用由上述样品制备的DNA、用于扩增对上述检测对象生物为特异性的靶基因的引物(M)、和本发明的耐热性DNA聚合酶制品，进行核酸扩增反应，和
(6)第三定量鉴定步骤，基于上述对靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)解析上述第三扩增步骤中的扩增产物的熔解温度(Tm值)，对上述样品中的检测对象生物进行定量鉴定，
其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，各引物可以从含有全部或1/3以上碱基序列的引物中选择，
(F)能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的多个区域的引物组，各引物可以从含有全部或1/3以上碱基序列的引物中选择，
(M)对呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因进行特异性地扩增的引物组，
需要说明的是，本申请发明中作为含有构成各引物组的引物的一部分的物质，只要不破坏作为通用引物的功能(识别特定通用区域的功能)即可，例如可以举出对作为通用引物设计的碱基序列削除或追加1～3个碱基所得的物质。
作为细菌的16SrRNA基因的扩增区域，优选设定3～10的扩增区域。另外，作为真菌的18SrRNA基因的扩增区域，优选设定3～10。
进而，通过增加下述步骤，能够进行更高精度的测定，所述步骤为使用“能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组、及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物组”中的任一种，每次测定标准Tm值，由此校正上述扩增产物的Tm值的测定误差。
另外，可以加入下述步骤，即，作为用于鉴定检测对象生物的算法，不仅利用上述Tm值本身的组合，而且也可以利用各Tm值间的差的组合进行鉴定，由此使测定误差的影响为最小限度。
另外，作为校正设备每次试行的测定误差且不需要上述“每次测定标准Tm值”的方法，可以利用“算出Tm值的组合的平均值，各Tm值与该平均值的相对值的组合”。即，为以Tm值的组合的配置作为“形状”进行鉴定的方法。Tm值的组合的配置所呈的2维“形状”不受测定误差的影响。例如，使检测对象生物的特异性Tm值的组合(n个)为T1db～Tndb(db为database)、使与该平均值的相对值分别为d1db～dndb(图11(C)：n为1～5的例子)。同样地使从样品得到的未知的检测对象生物的Tm值的组合(n个)为T1ref～Tnref(ref为reference)，使与该平均值的相对值分别为d1ref～dnref(图11(C))。接下来，与database比较，将“相对值的组合近似的情况＝Tm值的组合的配置的“形状”近似的情况”作为鉴定算法。因此，以下的计算式：
Figure BPA00001405947300581
最接近0时，可以鉴定为所求的检测对象生物。
以上的算法可以以计算机上数据库型鉴定软件的形式利用。
上述的方法(A)及(B)，是应用对下述内容进行深入研究的结果(WO2007/097323)而最先完成的，所述内容为：在利用本发明的耐热性DNA聚合酶制品所得的定量化技术上，以最近邻分析法的“熔解温度(melting temperature：Tm值)由碱基序列决定”这一理论根据为基础，将每个菌种的Tm值的差异应用到检测对象生物的鉴定上。
以下，具体说明上述方法。
(1)已知细菌的16SrRNA具有7～10处几乎所有细菌共有的碱基序列区域(20～40个碱基)。
通过在上述全部或部分处分别设定正向和反向的引物，制备3～10个基因扩增区域。
(2)基因扩增区域约为150～200个碱基，除了设定引物的共有的保存区域之外，各个细菌还具有固有的碱基序列。
因此，Tm值也反应碱基序列的不同，表示固有的值，可以推定每个细菌具有1～10种特征Tm值。因此，研究与细菌种类相应的1～10个Tm值，将其数据库化。利用该数据库能够鉴定未知的细菌。
(3)进而，通过同时使用真菌固有的引物3～10个、和呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因的引物，能够针对未知的起因菌鉴定细菌感染和其种类(包括耐抗生素基因的有无)、或者真菌感染和其种类。
(4)产生非特异性的基因产物，显示出与目的Tm值接近的值时，产生假阳性的风险。
上述情况，通过使基因扩增后的扩增产物流过琼脂糖凝胶，确认条带的大小，能够对结果进行双重检验。
即，使用现有的利用基因扩增的检测法采用双重检验系统，能够实现提高检查精度。
另外，通过“掩蔽引物二聚体法等引物二聚体的解决法+本发明的耐热性DNA聚合酶制品+细菌的通用引物”的组合，能够基本完全避免由非特异性扩增产物引起的假阳性的风险。
(5)采用实时PCR作为基因扩增方法时，利用其定量性、在治疗前后对菌量进行相对定量，由此可以实现治疗效果的监测的提高。
(6)实时PCR仪中，有利用加热模块进行温度控制的模块型、和通过空气进行温度控制的空气浴型2种，利用加热模块型在每次试行产生±0.1～0.3℃(根据厂家而不同)的Tm值测定误差(在相同试行次数中样品间误差为±0.2℃左右)。为了使该测定误差不妨碍菌种鉴定，优选采用在判定中利用相同试行次数的各Tm值间的差异图案的方法。另一方面，利用空气浴型的Rotor gene 6000(QIAGEN公司)，管间的温度均一性为±0.01℃，很难产生Tm值测定误差，为优选。
(7)感染多个菌时，利用实时PCR建立扩增曲线后，如果在达到稳态(plateau)的时刻停止扩增循环，继续进行Tm值的解析，则只能鉴定感染量最多(一般认为有可能为主要的感染微生物)的微生物。
引物如下所示。
<组合组1>
(1-1)从所有的细菌的16SrRNA基因共有的序列区域中选出5处，设定正向引物和反向引物(扩增产物为4个)。
具体而言，为以下含有全部或1/3以上引物碱基序列的引物。
(B1)扩增与大肠杆菌(E.Coli)的16SrRNA基因的第809位到第905位相当的97个碱基的DNA的引物组(细菌引物1：Bac.1)。
·序列号80.GATTAGATACCCTGGTAGTCCACG(24mer)正向
·序列号2.CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT(21mer)反向
(B2)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第927位到第1092位相当的166个碱基的DNA的引物组(细菌引物2：Bac.2)。
·序列号3.AAACTCAAAGGAATTGACGGG(21mer)正向
·序列号4.CGCTCGTTGCGGGAC(15mer)反向
(B3)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第1108位到1218位相当的111个碱基的DNA的引物组(细菌引物3：Bac.3)。
·序列号5.GTCCCGCAACGAGCG(15mer)正向
·序列号6.ATTGTAGCACGTGTGTAGCCC(21mer)反向
(B4)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第1240位到1369位相当的130个碱基的DNA的引物组(细菌引物4：Bac.4)。
·序列号7.GGGCTACACACGTGCTACAAT(21mer)正向
·序列号8.CCGGGAACGTATTCACC(17mer)反向。
(1-2)对所有的真菌的18SrRNA基因共有的序列区域进行选择，设定1组来自其的正向引物和反向引物。
具体而言，为以下含有全部或1/3以上引物碱基序列的引物。
(F1)真菌的18SrRNA基因的引物组(真菌引物：Fungi)
·序列号9.GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG(28mer)正向
·序列号10.TAACTGCAACAACTTTAATATACGC(25mer)反向。
(1-3)呈现甲氧西林耐性的mecA基因的引物，使用LightCycler Probe Design 2软件，选定得分最高的引物设计。
具体而言，为以下引物。
(M1)呈现甲氧西林耐性的mecA基因的引物组(mecA引物：mecA)
·序列号13.ATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTA(30mer)正向
·序列号14.CCAATAACTGCATCATCTTTATAGCC(26mer)反向。
<组合组2>
(2-1)从所有的细菌的16SrRNA基因共有的序列区域中选出10处，设定正向引物和反向引物。
具体而言，为以下含有全部或1/3以上引物碱基序列的引物。
(B5)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第8位至345位相当的338个碱基的DNA的引物组(细菌引物5：Bac.5)。
·序列号15.AGAGTTTGATCATGGCTCAG(20mer)正向
·序列号16.CGTAGGAGTCTGGACCGT(18mer)反向
(B6)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第336位到第534位相当的199个碱基的DNA的引物组(引物6：Bac.6)。
·序列号17.GACTCCTACGGGAGGCA(17mer)正向
·序列号18.TATTACCGCGGCTGCTG(17mer)反向
(B7)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第519位至第805位相当的287个碱基的DNA的引物组(细菌引物7：Bac.7)。
·序列号19.AGCAGCCGCGGTAATA(16mer)正向
·序列号20.GGACTACCAGGGTATCTAATCCT(23mer)反向
(B8)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第780到第960位相当的181个碱基的DNA的引物组(细菌引物8：Bac.8)。
·序列号21.AACAGGATTAGATACCCTGGTAG(23mer)正向
·序列号22.AATTAAACCACATGCTCCACC(21mer)反向
(B9)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第951位到第1070位相当的120个碱基的DNA的引物组(细菌引物9：Bac.9)。
·序列号23.TGGTTTAATTCGATGCAACGC(21mer)正向
·序列号24.GAGCTGACGACAGCCAT(17mer)反向
(B10)扩增与大肠杆菌(E.coIi)的16SrRNA基因的第1084位到1192位相当的109个碱基的DNA的引物组(细菌引物10：Bac.10)。
·序列号25.TTGGGTTAAGTCCCGC(16mer)正向
·序列号26.CGTCATCCCCACCTTC(16mer)反向
(B 11)扩增与大肠杆菌(E.coli)的16SrRNA基因的第1220位到第1385位相当的166个碱基的DNA的引物组(细菌引物11：Bac.11)。
·序列号27.GGCTACACACGTGCTACAAT(20mer)正向
·序列号28.CCGGGAACGTATTCACC(17mer)反向。
(2-2)从真菌的18SrRNA基因中共有的序列区域中选出7处，设定正向引物和反向引物。
具体而言，为以下含有全部或1/3以上引物碱基序列的引物。
(F2)扩增与念珠菌(C.Albicans)的18SrRNA基因(序列号16)的第149位到第407位相当的259个碱基的DNA的引物组(真菌引物2：Fungi2)
·序列号29.GTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGC(26mer)正向
·序列号30.GGTAGCCGTTTCTCAGG(17mer)反向
(F3)扩增与念珠菌(C.Albicans)的18SrRNA基因的第390位到第551位相当的162个碱基的DNA的引物组(真菌引物3：Fungi3)
·序列号31.GCCTGAGAAACGGCTACCA(19mer)正向
·序列号32.CCTCCAATTGTTCCTCGTTAAG(22mer)反向
(F4)扩增与念珠菌(C.Albicans)的18SrRNA基因的第531位到第762位相当的232个碱基的DNA的引物组(真菌引物4：Fungi4)
·序列号33.TTAACGAGGAACAATTGGAGGG(22mer)正向
·序列号34.GCCTGCTTTGAACACTCTAATTT(23mer)反向
(F5)扩增与念珠菌(C.Albicans)的18SrRNA基因的第989位到第1134位相当的146个碱基的DNA的引物组(真菌引物5：Fungi 5)
·序列号35.ATACCGTCGTAGTCTTAACCA(21mer)正向
·序列号36.GTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCT(24mer)反向
(F6)扩增与念珠菌(C.Albicans)的18SrRNA基因的第1260位到第1428位相当的169个碱基的DNA的引物组(真菌引物6：Fungi6)
·序列号37.CATGGCCGTTCTTAGTTGG(19mer)正向
·序列号38.GGGCATCACAGACCTGTT(18mer)反向
(F7)扩增与念珠菌(C.Albicans)的18SrRNA基因的第1414位到第1630位相当的217个碱基的DNA的引物组(真菌引物7：Fungi7)
·序列号39.AGGTCTGTGATGCCCTTAG(19mer)正向
·序列号40.CGGGCGGTGTGTACAAA(17mer)反向
(2-3)呈现甲氧西林耐性的mecA基因的引物，使用LightCycler Probe Design 2软件，选定得分最高的引物设计。
具体而言，为以下引物。
(M2)呈现甲氧西林耐性的mecA基因的引物组(mecA引物2：mecA2)
·序列号43.CAAACTACGGTAACATTGATCGC(23mer)正向
·序列号44.ATGTATGCTTTGGTCTTTCTGC(22mer)反向
本发明中，所谓Tm值，是PCR产物的50％与其互补链解离时的温度。另外，以利用最近邻分析法的Tm值计算式的“Tm值由碱基序列决定”的理论根据为基础，能够以各菌种的碱基序列的不同作为Tm值的组合的不同，应用于鉴定起因菌。因此，“根据Tm值，排除测定误差的影响”在准确地鉴定上是最重要的。因此，采用以下方法排除测定误差的影响。
首先，由于Tm值在缓冲液的组成等不同的实验条件下变化，所以通过使用氯化镁浓度固定的SYBR Green Ⅰ作为反应用缓冲液，使得不产生因反应液的组成引起的测定误差。然后，由于实时PCR仪自身在每次试行时产生测定误差，所以在设定作为对照的标准Tm值的同时，将相同试行次数的各Tm值间的差异图案用于判定。或者，利用“‘与平均值的相对值’的组合近似的为检测对象生物”的鉴定算法。
本发明中，为了校正测定仪的试行间误差，可以使用基准Tm值。具体而言，使用一定浓度的大肠杆菌标准株的DNA作为模板，使用对细菌的16SrRNA基因的一个区域进行扩增的1个引物组，测定每次Tm值，校正每次试行的Tm值的偏移。即，如果为相同模板与相同引物的组合，则理论上每次的Tm值相同。
但是，实际上所得的Tm测定值偏移时，由于其为试行间误差，所以只进行其偏移部分的校正即可。
本发明的方法(A)及(B)的具体顺序如下所示。
(i)由样品制备DNA。
(ii)使用之前举出的细菌、耐抗生素基因、及真菌的引物组对所得的DNA进行基因扩增后，同时测定各Tm值，得到细菌、耐抗生素基因、及真菌的Tm值的组合。
(iii)判定是否为真菌。
[上述(ii)的Tm值的组合中，首先通过使用能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的一个区域～多个区域的引物组对所得的真菌的特异性Tm值进行解析，判定是否为真菌、或者判定真菌的种类。]
(iv)判定有无耐抗生素基因。
[上述(ii)的Tm值的组合中，使用特异性地扩增呈现甲氧西林耐性的mecA基因等、随着当时的流行而产生的抗生素耐性基因的引物组对所得的抗生素耐性菌固有的基因扩增进行解析，判定有无耐抗生素基因。]
(v)锁定为何种细菌。
[上述(ii)的Tm值的组合中，使用能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组对所得的细菌特异性的Tm值的组合进行解析，鉴定细菌的种属。]
细菌的锁定，具体而言如下进行：关注细菌的一个Tm值(根据情况，首先用标准Tm值校正)，缩小范围至与该Tm值为接近值的菌种，依次取Tm值的差进行锁定，或者直接取包括标准Tm值的各Tm值间的差，以上述差的组合作为指纹进行鉴定。或者利用“‘与平均值的相对值”的组合近似的为检测对象生物’”的鉴定算法。
另外，迅速、简便地鉴定检测对象生物是否为细菌、真菌、或抗生素耐性的方法，存在下述方法，即，不利用Tm值，提取未知的微生物DNA，以其作为模板，使用下述物质进行PCR，在琼脂糖凝胶上进行电泳，确定目的尺寸的条带，其中，所述物质为：
[1]真菌的18SrRNA基因的所有真菌共有的、且特异性地检测真菌的1个引物、和以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品、
[2]特异性地检测呈现甲氧西林耐性的mecA基因等、随着当时的流行而产生的抗生素耐性基因的引物各1个、和本发明的耐热性DNA聚合酶制品或以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品、和
[3]细菌的16SrRNA基因的所有细菌共有的、且特异性地检测细菌的1个引物、和本发明的耐热性DNA聚合酶制品。
根据以上方法能够得到以下效果。
(1)以4～18个、优选4～16个引物组为基础实施实时PCR等基因扩增，将所得的Tm值与数据库对照，由此可以进行在抗菌药选择上必要的起因菌菌种的鉴定、及确认有无耐抗生素基因。
(2)为血液样品时，从DNA提取到Tm值的解析、以及鉴定所需要的时间约为2小时，能够迅速诊断。
(3)提取DNA的血液样品的量为一定时，能够定量菌量的相对量，能够监测给与抗菌药后的治疗效果。
(4)通过分别使用以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品和本发明的耐热性DNA聚合酶制品，能够基本完全避免非特异性扩增等假阳性的风险。
另一方面，真菌的鉴定中，优选利用拓扑异构酶Ⅱ、线粒体DNA或26S核糖体RNA的通用引物的组合得到Tm值的组合、并基于此进行鉴定。
(定量或鉴定用组合)
本发明能够提供一种组合，所述组合至少使用下述物质用于进行样品中所含的检测对象生物的定量及/或鉴定，所述物质为：
用于扩增由样品制备的DNA的本发明的耐热性DNA聚合酶制品、和用于扩增检测对象生物的特异性的靶基因的引物。
进而，所述组合可以至少使用下述物质构成：
用于扩增由样品制备的DNA的本发明的耐热性DNA聚合酶制品，
用于扩增由样品制备的DNA的以细菌细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，和
用于扩增对检测对象生物为特异性的靶基因的引物。
作为上述的组合的引物，可以利用之前举出的引物(B)、(F)及(M)。
(定量鉴定系统)
使用以下各装置，能够构成用于利用上述方法的进行样品中所含的检测对象生物的定量或鉴定的系统。
(1)扩增装置，用于进行核酸扩增反应，使用由样品制备的DNA、用于扩增对检测对象生物为特异性的靶基因的引物、和耐热性DNA聚合酶制品。
(2)定量装置，用于对扩增步骤中的扩增产物进行定量。
(3)计算装置，根据扩增产物的定量结果计算样品中的检测对象生物的量。
(4)数据库，用于根据靶基因的扩增产物的定量结果计算样品中的检测对象生物的量。
作为扩增装置及定量装置，可以优选利用PCR装置、特别是其中的实时PCR装置。另外，作为计算装置，可以利用基于下述程序进行工作的计算机系统等，所述程序预先设定为利用上述数据库、进行检测对象生物的定量及/或鉴定。
以下给出用于进行本发明的检测对象生物的定量及/或鉴定的系统的一个例子。该系统可以具有以下的各要素(单位)。
(1)PCR反应装置
(2)用于进行数据处理及输出数据处理后的结果的计算机系统
(3)写入数据处理所必要的程序的数据处理用软件
(4)数据处理中必要的数据库
(5)具有控制PCR反应装置的程序的控制机构
(6)显示数据处理结果的显示装置
上述装置的关系的例子之一示于图12。该系统具有PCR反应装置1、计算机系统2、数据处理部3、数据处理用程序(软件)6、数据处理中必要的数据库4、控制PCR反应装置的控制机构5a及5b及显示装置7。需要说明的是，上述要素可以以其中2个以上一体化的方式进行设计。另外，各单位间的信息的传送通过信号S1～S7进行。定量装置可以至少由计算机系统2构成。
利用PCR反应装置进行用于定量及/或鉴定上述检测对象生物的PCR反应。可以通过控制机构5对其进行控制。作为控制机构5中的控制项目的例子之一可以举出以下的项目。
A)扩增反应开始时的条件设定
B)用于扩增所用的循环数和温度控制的条件设定
C)用于测定Tm值的条件设定
D)用于结束反应的条件设定
E)用于在显示装置上不显示靶外基因的扩增的条件设定
根据目的可以从上述的条件设定中选择设定控制项目。条件设定和其实行可以根据预先设定的程序进行。该程序可以预先记录在控制机构5a或5b中的介质中。或者，该程序也可以预先储存在另外准备的可移动(携带)的介质中，或收载在介质中使其可通过因特网散布，使用时连接到控制机构5a或5b上进行利用。利用计算机系统2中设置的、或另外准备的数据处理部3中的数据处理结果进行PCR反应装置的控制时，来自数据处理部3的数据处理的结果被送到计算机系统2中，基于其结果将来自控制机构5b的用于控制PCR反应装置的信号输送到PCR反应装置内的控制机构5a中，实行控制。根据PCR反应的目的，仅PCR反应装置侧的控制充分时，只利用控制机构5a进行PCR反应的控制。
计算机系统2以可根据目的对来自各单位的信号进行处理的方式进行程序化。数据处理部2中，例如可以进行以下处理。
i)PCR反应装置中得到的PCR扩增反应结果(例如关于荧光强度的信号)的处理
ii)用于使用PCR扩增反应结果进行检测对象生物的定量及/或鉴定的演算处理
iii)用于控制PCR反应装置中的PCR反应条件的信号输出处理
iv)对PCR扩增反应的结果(包括经时监测)、检测对象生物的定量及/或鉴定的结果在显示装置上显示进行指令的处理。
上述处理基于根据目的数据处理而设定的数据处理用程序6实行。进而，数据处理中必需数据库时，利用数据库4中收载的信息。例如，可以预先将下述数据等数据库化进行收载，所述数据为：在处理通过利用PCR的扩增反应得到的信号对检测对象生物进行定量及/或鉴定时使用用作基准的已知的生物所得的数据、和如上所述在利用Tm值对测定对象生物进行定量及/或鉴定时从已知生物得到的Tm值(包括由多个Tm值进行定量鉴定时的Tm值的组合)等。
数据处理用程序6及数据库4可以事先收载在计算机系统2内的介质中。或者，可以将它们中的至少1个事先储存在另外准备的可移动(携带)的介质中、或事先收载在介质中使其在可利用因特网散布，使用时连接到数据处理部3上进行利用。
实施例
以下，给出参考例、实施例详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
另外，只要没有特别记载，操作步骤基于产品试剂盒中附带的说明书进行。
(实施例1-1)
(1)DNA的合成
由GenScript公司合成了来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的全DNA序列。此时，将密码子序列在酵母宿主、S.cerevisiae中进行最适化。合成的DNA被插入到由GenScript公司提供的质粒pUC57中，得到载体pUC-TA01。编码耐热性DNA聚合酶的基因以5’末端序列中存在HindⅢ限制酶位点，3’末端序列中存在EcoR Ⅰ限制酶位点的方式进行设计。
(2)来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶表达用载体的构筑
将合成的编码来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的基因插入到质粒pYES2(invitrogen公司)中，构筑载体pYES-TA01。编码耐热性DNA聚合酶的基因，用限制酶HindⅢ、EcoRⅠ(TaKaRa Bio)消化pUC-TA01，用1％琼脂糖凝胶(Wako)进行电泳，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)回收编码耐热性DNA聚合酶的基因。质粒pYES2用EcoRⅠ、HindⅢ(TaKaRa Bio)消化，用DNA连接试剂盒Ver.2.1(TaKaRa Bio)连接编码耐热性DNA聚合酶的基因和pYES2。
(3)S.cerevisiae的转化
将所得的载体pYES-TA01导入到酵母(Saccharomycescerevisiae X2180株)中。宿主如果为尿嘧啶缺陷株，则也可以使用其他的酵母。转化使用FastTrackTM-酵母转化试剂盒(GenoTechnology公司)。
(4)利用S.cerevisiae生产来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶
将得到的转化体用100ml SD培养基(0.67％细菌用酵母氮源基础，2％半乳糖、)进行28℃、72小时的振荡培养。将它们在5000rpm下离心分离10分钟，收集菌体，将其悬浊在破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl)中，使用0.5mm玻璃珠破碎菌体后，在12000rpm下进行30分钟离心分离，得到酵母破碎液上清液及沉淀物，作为细胞提取物。
(5)利用热处理的耐热性DNA聚合酶增溶条件的研究
对细胞提取物，进行耐热性DNA聚合酶的利用热处理的增溶条件的研究。图2为对将酵母破碎沉淀物悬浊在等量的破碎用缓冲液中所得的悬浊液在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃下进行热处理，并在12000rpm下、4℃下离心分离30分钟后，将所得的上清液进行SDS-PAGE所得的图。在50℃以上的热处理中，检测到作为目的蛋白质的耐热性DNA聚合酶的条带，通过65℃到70℃下的热处理，来自宿主的夹杂蛋白质混入量减少。通过进行50℃以上的热处理，耐热性DNA聚合酶被增溶，并且具有耐热性DNA聚合酶活性。
(6)DNA聚合酶活性
(6-1)λDNA内区域的扩增
以λDNA(NIPPON GENE)作为模板，进行活性检测。配制反应液使其组成为10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mMKCl、200μM dNTPs，添加引物，使序列号83、84分别变为0.4μM。
序列号83  gatgagttcg tgtccgtaca act
序列号84  ggttatcgaa atcagccaca gcgcc
配制耐热性DNA聚合酶制品的稀释系列，使上述离心分离上清液变为1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，然后添加1μl所得产物和0.2μgλDNA，用超纯水将它们的总量调至50μl。以下述程序实施PCR程序：94℃1分钟、50℃30秒、72℃1分钟，将其重复30次。各PCR反应溶液用1％琼脂糖凝胶进行电泳，使扩增产物可视化。
(6-2)耐热性DNA聚合酶活性的定义
根据Procedures in nucleic acid reseach(Richardson，C.C.(1966)DNA polymerase from Escherichia coli，pp.263-276 In G.L.Cantoniand D.R.Davies(ed.))的方法确定所得的耐热性DNA聚合酶的单位。使用活化鲑精子DNA作为模板/引物，在活性测定用反应液(含有25mM TAPS(pH9.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM β-巯基乙醇、各200μM的dATP，dGTP，dTTP、100μM[α-32P]·dCTP(0.05-0.1Ci/mmol)、0.25mg/ml活化鲑精子DNA，总量50μl)中，在74℃下经30分钟将10nmol的全核苷酸掺入酸不溶性沉淀物中的活性作为1U。
(6-3)PCR的检测限
图3为以大肠杆菌DNA作为模板、求出PCR中的检测限的图。从100ng到10fg检测到PCR扩增条带，从10fg到1fg之间未检测到扩增条带。用DNA提取试剂盒FastPure DNA Kit(TaKaRa公司制)从大肠杆菌JM109(ToYoBo公司制)中提取、纯化大肠杆菌DNA。配制反应液，使其组成为10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、200μM dNTPs，添加引物，使序列号85、86分别变为0.4μM。
序列号85  agcagccgcg gtaat
序列号86  ggactaccag ggtatctaat cct
添加模板，从100ng到1fg按照分别相差10-1制成大肠杆菌DNA稀释系列。添加1U耐热性DNA聚合酶制品，用超纯水调制，使其总量为20μl。以下述程序实施PCR程序：94℃1分钟、50℃30秒、72℃30分钟，将其重复60次。将各PCR反应溶液用1％琼脂糖凝胶进行电泳，使扩增产物可视化。
(7)来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶表达用载体的构筑
将编码来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的基因插入到质粒pPIC ZA(invitrogen公司)中，构筑载体pPIC-TA01。使用pYES-TA01作为模板，使用KOD Plus(ToYoBo)利用PCR进行编码耐热性DNA聚合酶的基因的扩增。PCR中使用的引物(序列号87、88)以5’末端序列存在EcoR Ⅰ限制酶位点、3’末端序列中存在Not Ⅰ限制酶位点的方式进行设计。
序列号87  cccgaattca tgagggggat gttgccattg
序列号88  aaagcggccg ctcattcctt tgcggataac
以下述程序实施PCR程序，94℃加热2分钟后，重复30次下述程序：94℃15秒、56℃30秒、68℃2分30秒。然后用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)回收PCR片段。PCR扩增物、pPICZ A都用EcoR Ⅰ、Not Ⅰ(TaKaRaBio)进行消化，用DNA连接试剂盒Ver.2.1(TaKaRa Bio)连接PCR扩增片段和质粒pPICZ A。
(8)E.coli的转化、载体提取
将连接的载体导入到E.coli感受态细胞DH5α(ToYoBo)中。为了使大肠杆菌转化体具有博来霉素作为选择性标记，使其在SOC(ToYoBo)培养基中恢复1小时后，接种到含有25μl/ml博来霉素(Invitrogen)的Lenox(Difco)琼脂培养基中，在37℃下静置培养16小时。由琼脂板接种大肠杆菌菌落，进行直接菌落PCR，解译碱基序列，可确认准确地插入了耐热性DNA聚合酶基因后，得到载体pPIC-TA01。
(9)P.pastoris的转化
将载体pYES-TA01导入到酵母(Pichia pastoris GS115株)中。使用FastTrackTM-酵母转化试剂盒(Geno Technology公司)进行转化。为了使酵母转化体具有博来霉素作为选择性标记，在YPD培养基(Difco)中培养3小时使其恢复后，接种到含有100μg/ml博来霉素的YPDS(Difco)琼脂板上。然后，琼脂板在28℃下静置培养3天。
(10)转化体的选拔
为了获得耐热性DNA聚合酶高生产株，由转化的琼脂板接种菌落，在博来霉素含有浓度以500μg/ml～2000μg/ml的顺序上升的YPDS(Difco)琼脂板上进行培养，选拔插入基因的多拷贝转化体。琼脂板在博来霉素浓度为500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml下分3阶段进行培养，均在28℃下静置培养3天。将博来霉素浓度为2000μg/ml的YPDS(Difco)琼脂板上生长的转化体用于下述的耐热性DNA聚合酶生产实验。
(11)来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的生产
将转化体接种到100ml BMGY培养基中，在28℃下振荡培养1天，增加菌体量。然后为了诱导蛋白质的生产，添加0.5％甲醇，在28℃下培养3天。将它们在5000rpm下离心分离10分钟，收集菌体，悬浊在破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl)中，使用0.5mm玻璃珠破碎菌体。然后在70℃下进行60分钟的热处理，在12000rpm下离心分离30分钟，得到含有来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的上清液。
(12)来自P.furiosus的耐热性DNA聚合酶表达用载体的构筑
将编码来自P.furiosus的耐热性DNA聚合酶的基因插入到质粒pYES2中，构筑载体pYES-PF01。以P.furiosus基因组DNA(ATCC43587D-5)作为模板利用PCR合成编码耐热性DNA聚合酶的基因。PCR中使用的引物(序列号89、90)以5’末端序列中存在Kpn Ⅰ限制酶位点，3’末端序列中存在Not Ⅰ限制酶位点的方式进行设计，使用KOD Plus进行PCR。
序列号89  gggggtacca tgattttaga tgtggattac
序列号90  cccgcggccg cctaggattt tttaatg
按照下述程序实施PCR程序，94℃加热2分钟后，重复30次下述程序：94℃15秒、56℃30秒、68℃2分30秒。然后用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，利用QIAquick凝胶提取试剂盒回收PCR片段。PCR扩增物、pYES2都用Kpn Ⅰ、Not Ⅰ进行消化，利用DNA连接试剂盒Ver.2.1连接PCR扩增片段和pYES2。
将连接的载体导入到E.coli感受态细胞JM 109(ToYoBo)中。将大肠杆菌转化体接种到含有50μl/ml氨苄西林的LB琼脂培养基中，在37℃静置培养16小时。由琼脂板接种大肠杆菌菌落，进行直接菌落PCR，解译碱基序列，确认准确地插入耐热性DNA聚合酶基因，得到载体pYES-PF01。
(13)来自T.gorgonarius的耐热性DNA聚合酶表达用载体的构筑
将编码来自T.gorgonarius的耐热性DNA聚合酶的基因插入到质粒pYES2中，构筑载体pYES-TG01。以T.gorgonarius的基因组DNA(ATCC 700654D)作为模板利用PCR合成编码耐热性DNA聚合酶的基因。PCR中使用的引物(序列号91、92)以5’末端序列中存在Kpn Ⅰ限制酶位点，3’末端序列中存在Not Ⅰ限制酶位点的方式进行设计，使用KOD Plus进行PCR。
序列号91  gggggtacca tgatcctcga tacagac
序列号92  cccgcggccg ctcatgtctt aggttttag
按照以下的程序实施PCR程序，94℃下加热2分钟后，重复30次下述程序：94℃15秒、60℃30秒、68℃2分30秒。然后用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，利用QIAquick凝胶提取试剂盒回收PCR片段。PCR扩增物、pYES2质粒都用Kpn Ⅰ、Not Ⅰ进行消化，利用DNA连接试剂盒Ver.2.1连接PCR扩增片段和质粒pYES2。
将连接的载体转化到E.coli感受态细胞JM 109中。将大肠杆菌转化体接种到含有50μ/ml氨苄西林的LB琼脂培养基中。然后，将琼脂板在37℃下静置培养16小时。由琼脂板接种大肠杆菌菌落，进行直接菌落PCR，解译碱基序列，确认准确地插入耐热性DNA聚合酶基因，得到载体pYES-TG01。
(14)酵母的转化
将上述得到的载体pYES-PF01、pYES-TG01导入到酵母(Saccharomyces cerevisiae×2180株)中。使用FastTrackTM-酵母转化试剂盒进行转化。
(15)来自P.furiosus、T.gorgonarius的耐热性DNA聚合酶的生产
将所得的转化体用100ml SD培养基(0.67％细菌用酵母氮源基础、2％半乳糖、)在28℃下振荡培养72小时。将它们在5000rpm下离心分离10分钟，收集菌体，悬浊在破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl)中，使用0.5mm玻璃珠破碎菌体后进行离心分离，得到酵母破碎液沉淀。在该沉淀中添加为沉淀湿重量2倍量的破碎用缓冲液，悬浊，在70℃下进行60分钟的热处理，在12000rpm下离心分离30分钟，得到含有耐热性DNA聚合酶的上清液。
(16)利用PCR检查非特异性核酸混入
图4为1％琼脂糖电泳的照片，表示使用上述得到的各耐热性DNA聚合酶制品和TaKaRa Taq(TaKaRa)、AmpliTaq Gold LD(ABI)调查是否混入非特异的核酸的实例。泳道1、4、7、10、13、16为利用40循环、泳道2、5、8、11、14、17为利用60循环在不添加模板的情况下进行PCR。另外，泳道3、6、9、12、15、18是以1μg大肠杆菌作为模板通过30循环进行PCR。引物使用可以使259bp的大肠杆菌16SrRNA基因扩增的序列号85、86，温度条件、PCR溶液组成利用与(6-3)同样的操作进行。由此，尽管未添加模板，但TaKaRa Taq通过40循环、AmpliTaq Gold LD通过60循环检测到来自细菌16SrRNA的基因的扩增产物。另外，利用本专利的制造方法生产的耐热性DNA聚合酶尽管利用40、60循环的PCR也未检测到扩增产物，确认了即使未进行复杂的纯化步骤也未发现混入非特异性核酸，可以实施PCR。
(17)利用实时PCR解析扩增曲线、熔解曲线(非特异性核酸混入的调查)
为了调查上述得到的耐热性DNA聚合酶制品的非特异性核酸混入，使用实时PCR进行扩增曲线、熔解曲线的解析。图5(A)及图5(B)为表示解析扩增曲线的图，图6(A)及图6(B)为表示解析熔解曲线的图。另外，图5(A)及图6(A)为使用AmpliTaq GoldLD实施解析的图，图5(B)及图6(B)为使用以S.cerevisiae为宿主生产的耐热性DNA聚合酶制品实施解析的图。实线为添加大肠杆菌作为模板，虚线为未添加模板。作为实时PCR试剂，相对于LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ(Roche公司)的1b管，加入10μl的超纯水，成为×10Buffer。该管内除了含有最适合于Taq DNA聚合酶的缓冲试剂之外，还含有dNTPs和SYBR Green Ⅰ。除此之外，添加1.5mM MgCl2、各0.4μM引物(序列号85、86)、1μg大肠杆菌作为模板、1单位耐热性DNA聚合酶制品，用超纯水调至总量为20μl，利用热启动法进行实时PCR(60循环)。AmpliTaqGold LD中在32循环左右扩增曲线开始上升，熔解曲线中在添加、未添加模板的情况下均在相同程度的位置出峰，能够确认混入非特异性核酸。相对于此，利用本专利的制造方法制造的耐热性DNA聚合酶，在未添加模板时扩增曲线、熔解曲线均未见。使用真核细胞作为宿主生产的耐热性DNA聚合酶制品中未确认到存在由非特异的核酸混入产生的扩增产物，使用细菌作为宿主生产的、且为了使细菌DNA的污染被抑制到最小而进行了纯化的耐热性DNA聚合酶制品，确认到由非特异性核酸的混入产生的扩增产物，根据该结果可以认为在具有大气和水环境中存在的细菌的混入等多种非特异性核酸的混入的可能性中，其主要要因是耐热性DNA聚合酶的生产过程中来自宿主的DNA对耐热性DNA聚合酶制品的混入。
(18)载体pYES-PF01的诱变
对编码来自P.furiosus的耐热性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶的基因进行诱变。即，对DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶进行改变，调节活性(Kong等(1993)、journal of biological chemistry、vol.268、1965-1975)。具体而言，使用诱变中使用的引物(序列号61、62)、作为模板的载体pYES2-PF01、KOD Plus进行PCR。
序列号61 GATTCTTGCCTTCGCGATCGCAACCCTCTATCACGAAGG
序列号62 CCTTCGTGATAGAGGGTTGCGATCGCGAAGGCAAGAATC
按照以下程序实施PCR程序，94℃加热2分钟后，重复15次下述程序：94℃15秒、56℃30秒、68℃7秒。反应后，利用限制酶Dpnl消化PCR溶液中的模板，导入到E.coli感受态细胞JM109中。将大肠杆菌转化体接种到含有50μl/ml氨苄西林的LB琼脂培养基中，在37℃下静置培养16小时。由琼脂板接种大肠杆菌菌落，解译碱基序列，确认在目的位置进行了诱变，得到载体pYES-PF-M01。另外，与实施例(14)、(15)同样地进行转化、生产，得到来自P.furiosus的突变耐热性DNA聚合酶制品。
(19)载体pYES-TG01的诱变
对编码来自T.gorgonarius的耐热性DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶的基因进行诱变。利用与(18)同样的方法使用诱变中使用的引物(序列号63、64)、使用载体pYES2-TG01作为模板进行诱变。
序列号63 GATGCTCGCCTTCGCGATCGCAACGCTCTATCACGAGGGCG
序列号64 CGCCCTCGTGATAGAGCGTTGCGATCGCGAAGGCGAGCATC
解译碱基序列，确认在目的位置进行了诱变，得到载体pYES-TG-M01。另外，与实施例(14)、(15)同样地进行转化、生产，得到来自T.gorgonarius的突变耐热性DNA聚合酶制品。
(20)使用宿主Tobacco-BY2的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶的生产
(20-1)转录因子表达用DNA片段导入用载体的构筑
作为用于将转录因子表达用DNA片段导入到宿主细胞(TobaccoBY2细胞)中的载体(以下称作转录因子表达用DNA片段导入用载体)，使用Ti质粒pER8(-Stu)(Dohi，K.，Nishikiori，M.，Tamai，A.，Ishikawa，M.，Meshi，T.，Mori，T.(2006)Induciblevirus-mediated expression of a foreign protein in suspension-culturedcells.Archives of Virology151，1075-1084)。pER8(-Stu)如下构筑：在通常的启动子PG10-90的下游连接对含有雌激素受体的融合转录因子LexA-VP16-hER进行编码的基因、终止子TE9，进而插入作为耐药性标记物的耐潮霉素基因(Hygr)。
(20-2)蛋白质表达用DNA片段导入用载体的构筑
使用ToMV突变体，该ToMV突变体是以编码来自T.aquaticus的DNA聚合酶的基因(序列号65)取代编码ToMV的外被蛋白质的基因得到的。
序列号65
ATGAGGGGGATGTTGCCATTGTTTGAACCTAAAGGGAGGGTTTTACTCGTGGATGGCCATCACCTTGCT
TATCGTACTTTCCACGCTCTCAAAGGTTTAACAACCTCTAGGGGAGAGCCAGTTCAAGCTGTGTACGGG
TTTGCAAAGTCACTCCTTAAAGCCTTGAAGGAGGACGGTGATGCCGTTATCGTGGTATTCGATGCTAAA
GCACCAAGTTTTAGACACGAGGCTTACGGAGGCTATAAGGCTGGACGTGCACCAACTCCCGAGGATTTC
CCAAGACAACTCGCCCTGATAAAGGAGTTGGTTGACCTACTTGGATTGGCTAGGTTAGAAGTTCCCGGT
TACGAAGCTGACGACGTTTTGGCCTCACTTGCTAAGAAAGCAGAAAAGGAGGGCTACGAAGTTCGTATA
CTCACAGCCGATAAAGACTTGTATCAACTGTTATCTGATAGGATTCATGTGCTTCACCCCGAAGGGTAC
CTTATCACCCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGGCTCAGACCTGACCAGTGGGCTGATTACCGTGCA
CTCACCGGTGACGAGAGTGACAATCTTCCTGGCGTGAAAGGAATAGGTGAAAAGACAGCTAGAAAATTG
CTAGAAGAGTGGGGGTCCCTCGAGGCACTTTTGAAGAACCTTGATAGGTTAAAACCAGCTATTAGAGAA
AAGATACTGGCCCATATGGATGACTTGAAACTATCATGGGACTTAGCTAAAGTCAGAACCGATTTACCT
TTGGAAGTGGATTTTGCTAAGAGAAGGGAACCAGATAGAGAGAGGCTTAGAGCATTCTTGGAGCGTCTG
GAATTTGGATCTTTACTCCACGAGTTCGGTTTGCTTGAGTCTCCCAAGGCACTGGAAGAGGCACCATGG
CCTCCACCTGAAGGCGCTTTTGTTGGGTTCGTTCTCAGTAGGAAGGAACCTATGTGGGCAGACTTGCTC
GCCCTAGCAGCTGCAAGAGGGGGAAGAGTGCATAGGGCTCCCGAACCTTATAAGGCACTCAGAGATCTT
AAGGAGGCTAGGGGCCTCTTGGCAAAGGACCTATCCGTGCTTGCACTCAGGGAAGGATTGGGACTCCCA
CCCGGTGATGACCCTATGTTATTGGCTTACTTGCTTGACCCATCCAATACCACACCCGAGGGAGTTGCC
CGTAGGTATGGGGGCGAGTGGACTGAGGAAGCTGGTGAGAGGGCCGCATTGAGTGAGAGGCTATTTGCC
AACTTATGGGGGAGGTTGGAGGGGGAGGAACGTCTGCTATGGCTTTACAGAGAGGTGGAGCGTCCCTTG
AGTGCTGTATTAGCTCACATGGAAGCTACAGGCGTCCGTCTAGATGTTGCTTACTTAAGGGCTCTAAGT
TTGGAAGTTGCAGAAGAGATCGCCAGATTAGAAGCTGAAGTTTTCAGGTTAGCAGGACACCCTTTTAAT
CTCAATAGTAGGGACCAACTCGAACGTGTGTTATTTGATGAACTGGGCCTCCCCGCTATAGGGAAAACC
GAGAAAACAGGGAAAAGGTCCACATCTGCAGCTGTATTGGAAGCCCTTAGAGAAGCACATCCTATTGTG
GAGAAAATACTACAGTACAGGGAGCTAACCAAATTAAAGAGTACCTACATAGATCCATTGCCTGATCTT
ATTCACCCAAGGACCGGAAGGCTTCACACCCGTTTCAATCAAACCGCAACAGCTACTGGGAGGTTATCA
TCTTCCGACCCTAACTTGCAAAATATACCTGTTCGTACCCCACTCGGACAGAGAATACGTAGAGCTTTC
ATTGCCGAAGAGGGATGGCTCTTGGTTGCTTTGGATTATAGTCAGATTGAACTTAGAGTTCTAGCACAC
CTTAGTGGCGACGAAAACCTCATCAGGGTGTTTCAGGAGGGGAGAGATATACACACCGAAACTGCTTCA
TGGATGTTTGGGGTGCCCAGGGAAGCCGTAGACCCCCTCATGAGAAGGGCTGCTAAAACAATTAATTTC
GGCGTGTTGTACGGAATGTCCGCTCACAGGCTATCACAAGAGTTGGCAATCCCCTATGAAGAGGCTCAA
GCCTTCATTGAGAGGTATTTTCAGTCCTTTCCAAAGGTGCGTGCTTGGATAGAGAAAACTTTAGAGGAA
GGTAGAAGGAGAGGGTATGTGGAAACTCTATTTGGCAGACGTAGGTACGTTCCTGACCTCGAAGCTAGA
GTTAAGTCCGTCAGAGAGGCAGCTGAACGTATGGCATTCAATATGCCTGTTCAAGGAACAGCTGCAGAC
TTAATGAAATTAGCTATGGTGAAGTTGTTCCCAAGGTTAGAGGAAATGGGTGCAAGAATGCTCCTACAG
GTCCATGATGAGCTAGTGTTGGAAGCACCTAAAGAGAGGGCAGAGGCAGTAGCCAGGTTGGCAAAGGAG
GTTATGGAAGGGGTGTATCCACTTGCTGTCCCCTTGGAGGTGGAAGTCGGGATCGGTGAGGACTGGTTA
TCCGCAAAGGAATGAGCTCACTAGT
由GenScript公司合成了来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的全基因序列。此时，将密码子序列在Tobacco BY2细胞中最优化。作为转化用载体，使用具有可用雌激素进行转录诱导的启动子OLexA-46的Ti质粒，在OLexA-46的下游连接ToMV突变体的cDNA，进而构筑用于将在其3’末端插入了烟草环斑卫星病毒的核酶序列S-Rz、35S终止子(35ST)的蛋白质表达用DNA片段导入到宿主细胞(Tobacco BY2细胞)中的载体pBICER8-ToMV/Taq-SRz。
(20-3)第一转化步骤：转录因子表达用DNA片段向宿主细胞内的导入
利用农杆菌法将转录因子表达用DNA片段导入用载体pER8(-Stu)导入到Tobacco BY2细胞中。首先利用电穿孔法将pER8(-Stu)导入到Agrobacterium tumefacince LBA4404系统中。使其在含有壮观霉素(50mg/l)的AB蔗糖培养基中进行预培养。然后与Tobacco BY2细胞混合，移到培养皿中，在26℃下在暗处静置42～48小时，转化Tobacco BY2细胞。用Tobacco BY2细胞用培养基清洗后，扩散到含有羧苄西林(100mg/l)及潮霉素(20mg/l)的TobaccoBY2细胞用固体培养基中，使转化Tobacco BY2细胞增殖。
(20-4)选拔步骤：转录因子高表达转化体的选拔
在转化Tobacco BY2细胞中，根据Northern杂交法的结果，选拔转录因子的表达量高的细胞线。此处所谓“细胞线”，是指通过使转化细胞增殖而形成的各个菌落。
(20-5)第二转化步骤：蛋白质表达用DNA片段的导入
利用农杆菌法在上述得到的转录因子高表达Tobacco BY2细胞线中导入病毒载体(pBICER8-ToMV/Taq-SRz)，得到转化细胞。
(20-6)Tobacco BY2细胞的培养、蛋白质表达、提取
将上述得到的转化细胞保持在15ml液体培养基中，每7天以1/200的量传代。另外，添加以1/50量传代、且传代培养后经2天预培养的细胞，使雌激素的终浓度为0.01mM，再培养2天。将其在5000rpm下离心分离10分钟，回收转化细胞，用液氮冷冻后，使用乳钵破碎细胞。在其中加入等量的缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl)悬浊，在70℃下进行60分钟的热处理，在12000rpm下离心分离30分钟，得到含有来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的上清液。
(21)使用宿主A.oryzae的来自T.aqaticus的耐热性DNA聚合酶的表达
(21-1)DNA的合成
由GenScript公司合成了来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶的全DNA序列。(序列号41)此时，密码子序列与A.oryzae最适化。编码耐热性DNA聚合酶的基因以5’末端序列存在Pme Ⅰ限制酶位点、3’末端序列存在Xmal限制酶位点的方式进行设计。
序列号41
ATGAGAGGCATGCTGCCACTGTTCGAGCCAAAGGGAAGGGTGCTGCTGGTGGACGGACACCATCTGGCC
TACAGAACTTTTCACGCTCTGAAGGGACTGACCACATCACGGGGGGAGCCAGTGCAGGCTGTGTATGGA
TTCGCTAAAAGCCTGCTGAAGGCCCTGAAAGAGGACGGAGATGCTGTGATCGTGGTGTTCGATGCTAAG
GCCCCTAGCTTTAGACATGAGGCCTACGGCGGATATAAAGCCGGACGCGCTCCAACCCCCGAGGACTTT
CCAAGGCAGCTGGCCCTGATTAAGGAACTGGTGGATCTGCTGGGACTGGCTAGGCTGGAGGTGCCCGGC
TACGAAGCTGACGATGTGCTGGCCTCCCTGGCTAAGAAAGCCGAGAAGGAAGGCTACGAGGTGCGCATC
CTGACAGCCGACAAAGATCTGTATCAGCTGCTGTCTGACAGGATCCACGTGCTGCATCCCGAGGGGTAT
CTGATTACTCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGCCTGAGACCAGACCAGTGGGCTGATTATCGGGCC
CTGACTGGCGACGAGTCAGATAACCTGCCCGGAGTGAAAGGCATCGGAGAAAAAACCGCCAGGAAGCTG
CTGGAGGAATGGGGCAGCCTGGAGGCTCTGCTGAAAAATCTGGATAGACTGAAGCCCGCCATCCGGGAG
AAAATTCTGGCTCACATGGACGATCTGAAGCTGTCTTGGGACCTGGCCAAAGTGAGAACCGACCTGCCT
CTGGAGGTGGATTTCGCCAAGAGGAGAGAGCCAGATCGGGAACGCCTGAGGGCTTTCCTGGAGCGGCTG
GAATTTGGGTCACTGCTGCATGAGTTTGGCCTGCTGGAAAGCCCAAAGGCTCTGGAGGAAGCTCCATGG
CCACCTCCAGAGGGAGCCTTCGTGGGATTTGTGCTGTCCAGGAAAGAACCAATGTGGGCTGACCTGCTG
GCTCTGGCTGCTGCCAGAGGGGGACGGGTGCACCGCGCCCCTGAGCCATACAAGGCTCTGCGCGACCTG
AAAGAAGCCAGGGGGCTGCTGGCTAAGGATCTGTCAGTGCTGGCTCTGAGGGAGGGACTGGGACTGCCC
CCTGGCGACGATCCAATGCTGCTGGCCTACCTGCTGGATCCAAGCAACACTACCCCAGAGGGAGTGGCT
AGGAGATATGGAGGGGAATGGACCGAGGAAGCTGGGGAGAGAGCTGCCCTGTCCGAACGGCTGTTCGCT
AATCTGTGGGGAAGGCTGGAGGGAGAGGAAAGGCTGCTGTGGCTGTACCGGGAGGTGGAACGCCCTCTG
TCCGCTGTGCTGGCTCACATGGAGGCTACAGGCGTGCGCCTGGACGTGGCTTATCTGAGGGCCCTGTCT
CTGGAGGTGGCTGAGGAAATCGCCAGACTGGAGGCTGAAGTGTTCCGGCTGGCCGGACATCCCTTTAAC
CTGAATAGCAGGGACCAGCTGGAGAGAGTGCTGTTCGATGAACTGGGGCTGCCTGCCATTGGCAAGACC
GAGAAAACAGGGAAGCGCTCAACAAGCGCTGCTGTGCTGGAGGCTCTGAGGGAAGCTCACCCCATCGTG
GAGAAGATTCTGCAGTACAGAGAACTGACTAAGCTGAAATCCACCTATATCGACCCCCTGCCTGATCTG
ATTCACCCTAGGACAGGCAGACTGCATACTCGCTTCAACCAGACAGCTACTGCCACCGGAAGGCTGAGC
TCCTCTGACCCAAACCTGCAGAATATCCCTGTGAGAACCCCACTGGGACAGCGGATCAGGAGAGCTTTT
ATTGCTGAGGAAGGATGGCTGCTGGTGGCTCTGGATTACTCCCAGATTGAGCTGAGGGTGCTGGCTCAC
CTGTCTGGGGACGAAAACCTGATCCGCGTGTTCCAGGAGGGCAGGGATATTCATACAGAAACTGCCAGC
TGGATGTTTGGAGTGCCTCGCGAGGCTGTGGACCCACTGATGAGGAGGGCTGCCAAGACAATCAATTTC
GGAGTGCTGTATGGGATGTCCGCCCACAGGCTGTCTCAGGAGCTGGCTATCCCCTACGAGGAAGCTCAG
GCCTTCATCGAAAGATACTTCCAGTCTTTCCCTAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAAACCCTGGAGGAA
GGCAGGAGACGGGGATACGTGGAAACACTGTTCGGCCGCAGGAGATATGTGCCTGACCTGGAGGCCAGG
GTGAAGTCAGTGCGCGAGGCTGCCGAAAGGATGGCTTTCAATATGCCTGTGCAGGGAACCGCTGCCGAC
CTGATGAAACTGGCCATGGTGAAGCTGTTTCCACGCCTGGAGGAAATGGGGGCTAGGATGCTGCTGCAG
GTGCATGATGAGCTGGTGCTGGAAGCCCCAAAGGAGAGAGCTGAAGCCGTGGCTCGGCTGGCCAAAGAA
GTGATGGAAGGCGTGTACCCCCTGGCTGTGCCTCTGGAGGTGGAAGTGGGAATCGGGGAGGACTGGCTG
TCCGCCAAGGAATGA
(21-2)来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶表达用载体的构筑
在自主复制型穿梭载体(pPTR Ⅱ：TaKaRa Bio)的HindⅢ、Kpn Ⅰ限制酶位点插入TEF启动子(序列号66)和SD终止子(序列号67)，得到载体pPTR-TEF-SDt。
序列号66
GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAAGGATGGTTCAGATACAAATTAGCAACAGGCCAGGCTAGACG
CGC
GACTATCCACTGCGGCAAATGGTGAGCTGCAAGCAACGGTAAGATGTGACAGGACGAGCGGTGTGCCGG
GAA
AAAAATTGGAGGAGCGCAAAGCGGCGGCTGTCCCTCAGTGGTGCCCAAACGTTATCGATAGTACACCAA
GCA
TGGGCAGTGAGCGGCTATACAGAGGGAATAATAGGCATATCGGCACGACTAGATTCGGTAGAAAGCATC
GAA
GAGCAATTCATTGAGCATATTATCACGTGGAATGCGATAGCTGTGGCCAGGTTGAGACACCGCAAGTGA
AAG
ATACACACATAGATTCTCGATTCGAGCGGTTTGCCTCCGCCACCGCAGTGCATAGCAAGCAAAGAAACG
ACA
GTTGGCTCATCATCCGTTACATCATTTTTTCTACTGGCTCCGCTCGGTGGGCTCCCAACGAAGCAGCAA
AAA
AGTGAGAGAAAAAAACTAGCTTGGCGGGGCAACAGAAGCTAGACCCTTTGGCTCGCTTAGTCAGTGCGC
CCA
CTCACTCACACTCAAAAAGGCCACCCCTCCCGCACCCTCTTCTCATCACCGTCTTCATACCACGGTTCG
TCA
AGCAATCGTATCTGGTAAGCTTTGACCTCCTCGAGCGGGCTCCACTTTGCTATTTCTTGGATCTGCTCT
TTC
TTTTCTCTCTACCTCTTTTTCTAACCTCTCTTCAGAAAGTTCAACCGTACTTCACTCCATCTTCCTACG
TCA
CTCTAGA
序列号67
TAAAGCGGCGTGCTCTGCACATAACACGTGTCGTGTTTGGGTTCGGTATGGGTAATGGCGAATGGGGAC
ATGCATTTATGGGATAGGGGGCTGGGTTGGTGTAATCAAATGTGCATACAGACCAGCTGATACGAATAC
TACAACTTACCCCGACACACGCATTCATGTGACGCCCAACACCTCGTCTAACTCATCGGGGCAACTCAC
CTCAATCCGATTCAGCCTCCCGG
TEF启动子来自Aureobasidium pulluans，SD终止子来自Colletotrichum orbiculare，以共同提取的基因组DNA作为模板利用PCR进行扩增。以(序列号68、69、70、71)TEF启动子和SD终止子之间存在Pme Ⅰ、Xma Ⅰ限制酶位点的方式进行设计。
序列号68 GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAA
序列号69 ATATCTAGAGTGACGTAGGAAGATGGAG
序列号70 GTTAAACAGATCTCCCGGGTAAAGCGGCGTGCTCTGCAC
序列号71 TATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT
然后，在pPTR-TEF-SDt的Pme Ⅰ、Xma Ⅰ限制酶位点插入编码来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的基因，得到载体pPTR-TEF-Taq。另外，为了添加FLAG标记，以载体pPTR-TEF-Taq为模板，使用以5’末端序列中存在Pme Ⅰ限制酶位点、3’末端序列中存在Xma Ⅰ限制酶位点的方式设计的引物(序列号72、73)进行扩增，插入到pPTR-TEF-SDt的Pme Ⅰ、Xma Ⅰ限制酶位点，得到载体pPTR-TEF-FLTaq。
序列号72
ATAGTTTAAACATGGATTATAAGGATGAC GATGACAAGATGAGAGGCATGCTGCCAC
序列号73
ATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT
(21-3)A.oryzae的转化
将载体pPTR-TEF-FLTaq导入到丝状菌(Aspergillus oryzae)中。使用原生质体-PEG法进行转化。利用CD固体培养基(每1L：NaNO3 6.0g、KCl 0.52g、KH2PO4 1.52g、1M MgSO4·7H2O 2ml、葡萄糖10.0g、FeSO4·7H2O 1.0mg、ZnSO4·7H2O 8.8mg、CuSO4·5H2O 0.4mg、Na2B4O7·10H2O 0.1mg、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.05mg、Agar 20.0g，用1N KOH调至pH6.5)在30℃下培养A.oryzae，将其悬浊在10ml的0.1％Tween80、0.8％NaCl中，用玻璃过滤器(3G2)过滤，收集滤液。在3,000rpm下离心5分钟，使分生孢子沉淀，除去上清液。用10ml的0.1％Tween80清洗分生孢子2次后，使其悬浊在适量的灭菌水中，得到孢子悬浊液。
在100ml的CD液体培养基中植入A.oryzae的孢子悬浊液，在30℃下振荡培养20小时。
用玻璃过滤器(3G 1)过滤，收集菌丝，用灭菌水清洗后，用刮勺等按压，从菌丝中充分挤出水分。将适当量的菌丝加入到50ml聚丙烯制离心管中的原生质体化溶液中进行悬浊，在30℃下平稳地振荡2小时，进行了原生质体化。用玻璃过滤器(3G2)对其过滤，将滤液在2,000rpm下离心5分钟，收集原生质体，用0.8M NaCl清洗2次。在溶液1(0.8M NaCl、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH8.0))中悬浊，使原生质体为2×108/ml，加入0.2容量的溶液2(40％(w/v)PEG4000、50mM CaCl2、50mM Trls-HCl(pH8.0))平稳地悬浊。在0.2ml的原生质体悬浊液中加入20μg的pPTR-TEF-FLTaq，在冰中静置30分钟。加入1ml的溶液2，平稳地悬浊，在室温下静置15分钟。加入8.5ml的溶液1，平稳地悬浊。然后，离心，收集原生质体，除去上清液，将原生质体悬浊在0.2ml的溶液1中。将原生质体悬浊液悬浊在5ml的CD软琼脂选择培养基(使CD培养基的琼脂为0.5％，添加0.8M NaCl、0.1μg/ml吡啶硫胺(TaKaRa Bio)，在50℃下保温所得的培养基)中，以原生质体均匀分散的形式接种到CD选择培养基中，在30℃下培养7天。
(21-4)A.oryzae的培养、来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶的生产
将转化体接种到600ml CD培养基中，在30℃下培养4天。将它们在5000rpm下离心分离10分钟，收集菌体，悬浊在破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl)中，使用0.5mm玻璃珠破碎菌体后，在70℃下进行60分钟的热处理，在12000rpm下离心分离30分钟，得到含有耐热性DNA聚合酶的上清液。使用FLAG标记蛋白质沉淀试剂盒(Sigma)对其进行纯化，得到来自T.aquatics的耐热性DNA聚合酶制品。
(21-5)利用PCR检查非特异性核酸的混入
图7为琼脂糖电泳的照片，表示使用上述得到的耐热性DNA聚合酶调查是否混入非特异性核酸的实例。泳道1为标记、泳道2为未添加模板、泳道3为以大肠杆菌DNA作为模板进行PCR。引物使用序列号85、86，PCR温度条件、PCR溶液组成与(6-3)同样地进行，通过45循环进行PCR。由此，以大肠杆菌作为模板的情况检测到来自细菌16SrRNA的基因的扩增产物，不加模板的情况未检测到来自细菌16SrRNA的基因的扩增产物。
(22)使用不显示法(掩蔽引物二聚体法)利用各种耐热性DNA聚合酶的实时PCR
使用上述得到的耐热性DNA聚合酶制品，使用不显示法进行实时PCR。实时PCR中分别使用：以S.cerevisiae作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品(图8、A、图9、A)、来自突变P.furiosus的耐热性DNA聚合酶制品(图8、B、图9、B)、来自突变T.gorgonarius的耐热性DNA聚合酶制品(图8、C、图9、C)、以P.pastoris作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品(图8、D、图9、D)、以Tobacco BY-2作为宿主生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶制品(图8、E、图9、E)。另外图8、A、B、C、D及E为表示扩增曲线的图，图9、A、B、C、D及E为表示熔解曲线的图。实线为添加模板的情况，虚线为未添加模板的情况。实时PCR试剂与(17)相同。实时PCR的程序为94℃1分钟、50℃30秒、72℃1分钟、84℃2秒后，检测荧光值，将其重复60次。根据实时PCR结果，进行解析，即，通过使用不显示法，未检测到妨碍实时PCR中的定量性的非特异性扩增产物和细菌DNA的扩增曲线的信号。
(实施例2：利用不显示法的定量鉴定A)
以下，将利用宿主S.cerevisiae生产的来自T.aquaticus的耐热性DNA聚合酶记作e-DNAP。
使用上述得到的e-DNAP利用不显示法尝试进行样品的定量鉴定。实时PCR仪为LightCycler 1.5(Roche Diagnostics公司)及RotorGene6000(QIAGEN公司)，实时PCR用试剂为下述构成，使用以下记载的细菌检测用通用引物，以总量20μL的系统进行。
正向引物：CTCCTACGGGAGGCAG(序列号43)
反向引物：ACTACCAGGGTATCTAATCCTG(序列号44)
e-DNAP(5units/μL)1μL
E.Coli基因组DNA
模板或水PCR级2μL，
SYBR Green Ⅰ(TAKARA)300倍稀释液2μL，
PCR引物(10μM)0.8μL each，
10×Buffer(500mM KCl，
100mM Tris-HCl)2μL
25mM MgCl2 1μL，
2mM dNTP mix 2μL，
水PCR级8.4μL
另外，实时PCR的程序按照表1记载的条件进行。
[表1]
Figure BPA00001405947300881
图13及图14为按照表1程序条件实施解析得到的扩增曲线及熔解曲线图。
由图13确认到即使在不含模板的状态下也出现扩增曲线，由图14确认到在约76℃附近有引物二聚体的熔解曲线。
[表2]
表2
Figure BPA00001405947300882
参考图14的熔解曲线结果，将荧光检测时的温度设定在引物二聚体和E.Coli的中间，即84℃，在表2记载的条件下进行实时PCR。
图15(A)为利用表2程序条件的实时PCR结果的扩增曲线图。利用该方法使用水作为模板时不显示引物二聚体，加入E.coli作为模板时确认到目的扩增产物的正常的扩增曲线。
(实施例3：利用不显示法的定量鉴定B)
使用本发明中的e-DNAP及不显示法，尝试进行各种样品中存在的感染菌的定量鉴定。细菌检测用实时PCR用试剂及引物构成与(实施例2)相同。真菌检测用实时PCR用试剂及引物构成，除了使用rTaq DNA polymerase(ToYoBo)作为以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶、使用以下记载的真菌检测用通用引物之外，与(实施例2)相同。
正向引物：GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG(序列号9)
反向引物：GCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCA(序列号45)
由于感染菌的浓度单位通常使用CFU/ml，所以为了与以DNA浓度计算的PCR定量法的单位一致，尝试着利用McFarland比浊法计算。具体而言，将E.Coli，C.Albicans分别悬浊在生理盐水中后，制备与0.5McFarland的中央值一致的菌浮游液，分别在培养基中展开，在计算CFU/ml的同时，提取DNA计算DNA/ml，使用该DNA溶液绘制实时PCR的标准曲线。
CFU/ml和DNA/ml的换算值如下所示。
·E.Coli：
0.5McFarland＝1.3×108CFU/ml＝8.6μg/ml(8.6ng/μl)
·C.Albicans
0.5McFarland＝2.5×106CFU/ml＝18.0μg/ml(18.0ng/μl)
另外，绘制标准曲线，结果得到以下结果。
·E.Coli：相关系数-1.00，计算式：循环数＝-4.1×浓度+14.6
·C.Albicans：相关系数-1.00，计算式：循环数＝-4.4×浓度+14.5
作为阳性和定量对照，每次测定定量以下2个。
·E.Coli：
1.3×105CFU/μl＝8.6
ng/μl、2μl(20μl的测定系统)
·C.Albicans
2.5×103CFU/μl＝
18.0ng/μl、2μl(20μl的测定系统)
综上所述，本系统中细菌、真菌显示阳性时，用以下的概算式进行定量。
·细菌(E.Coli换算值)：有效数字2位
1.3×108×[10的{1-(循环数-对照循环数+4.1)÷4.1}次方]CFU/ml
·真菌(Candida Albicans换算值)：有效数字2位
2.5×106÷18×[10的{3-(循环数-对照循环数+7.7)÷4.4}次方]CFU/ml
(1)使用检测对象的高灵敏度定量方法的生活用水检查
接下来，为了评价构筑的“检测对象的高灵敏度定量方法”的实用性，对以下的4种生活用水进行检查。
(A)自来水：富山大学附属医院内的自来水。
(B)泉水：为选自昭和60年、由环境厅选出的“全国名水100选”之一的富山的名水。
(C)温泉水：加热循环的温泉水。无添加物。
(D)空调循环水：富山大学附属医院内的空调循环水。
将自来水、泉水、温泉水各25ml、空调循环水1ml在8000rpm下离心20分钟，使用InstaGene Matrix(Bio-Rad)从颗粒中提取DNA。
将上述DNA提取液作为模板进行感染菌检查，结果从4种生活用水的任一种中均未检测到真菌(图15(B)的B)。但是，关于细菌，自来水和泉水(名水)中不存在细菌，但温泉水和空调循环水显示阳性(图15(C)的B、C)。对它们进行定量计算，结果得到以下的测定值。
·温泉水：1.2CFU/ml(E.Coli换算值)
·空调循环水：78CFU/ml(E.Coli换算值)
结果判明温泉水中存在少量的细菌，另外，空调循环水中以高浓度存在细菌。
(2)使用检测对象的高灵敏度定量方法的食品检查
由于食品的细菌污染和真菌污染为食物中毒症的直接原因，所以从社会性考虑也为重要的检查。此次，使用由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的风险高的奶油泡芙作为样品。需要说明的是，作为“不新鲜的奶油泡芙”，使用室温下放置数天的奶油泡芙，使用冷藏(5℃以下)保存的品尝期限内的奶油泡芙作为对照(新鲜奶油泡芙)。提取DNA时，首先只从各奶油泡芙的奶油部分取27.4g，加入到灭菌生理盐水20ml中，进行离心分离，除去上清液，通过重复3次该操作除去油成分。之后，使用InstaGene Matrix从离心分离得到的颗粒中提取DNA，以它们作为模板进行感染菌检查。
结果，在不新鲜的奶油泡芙、对照中均检测到基本相同程度的非常微量的真菌(图16)。如果考虑奶油泡芙的皮通过酵母而使其膨大的情况，则一般认为没有因真菌引起的新的污染。
关于细菌污染，新鲜的奶油泡芙中完全未检测到细菌，但为不新鲜的奶油泡芙时确认到相当数量的细菌的增殖(图17)。定量计算其增殖量，结果得到以下的测定值。
不新鲜的奶油泡芙：1.5×107
CFU/(奶油)g(E.Coli换算值)
(3)使用检测对象的高灵敏度定量方法的败血症检查
接下来，使用检测对象的高灵敏度定量方法尝试进行败血症的检查。此次，作为败血症患者样品，分别使用真菌血症的患者A(由Candida Albicans引起的败血症)、细菌血症的患者B(由Bacillusspecies引起的败血症)的血液样品。提取DNA时，取患者A、B各自的血液样品2μl，并且从患者B的血液培养瓶中取得2μl，分别使用InstaGene Matrix提取DNA，以它们作为模板进行感染菌检查。
结果患者A中未见细菌感染，仅确认到真菌感染(图18)。定量计算该真菌感染，结果得到以下的测定值。
·患者A：9.7×104
CFU/(血液)ml(Candida Albicans换算值)
另外，患者B中未见真菌感染，仅确认到微量的细菌感染(图19)。另外，对血液培养瓶也进行了确认，结果确认到大量的细菌增殖。定量计算该细菌感染，结果得到以下的测定值。
·患者B：2.0×105
CFU/(血液)ml(E.Coli换算值)
另外，图20为实时PCR的结果，以MRSA DNA为模板，使用MRSA特异性的以下的Spa、mecA引物进行。
Spa正向引物：
GCGATTGATGGTGATACGGTT(序列号46)
Spa反向引物：
AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC(序列号47)
mecA正向引物：
AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC(序列号48)
mecA反向引物：
AGTTCTGCACTACCGGATTTGC(序列号49)
通过在上述实施例中使用的通用引物的基础上同时使用MRSA特异性引物，能够构筑锁定特定的感染菌的检查。
(实施例4：应用检测对象的高灵敏度定量方法的药敏试验)
应用本发明的使用了e-DNAP及不显示法的高灵敏度定量方法，尝试进行迅速的液相药敏试验。利用现行的药敏试验，至得到结果为止一般需要数天，但如果应用本发明的高灵敏度定量方法，则仅仅4～6小时就可以得到结果。需要说明的是，关于液相的药敏试验，已经记载于现有专利(WO2002/052034)中，但由于并不是高灵敏度检测法，所以一旦培养后必须重新开始敏感性试验，至得到结果为止最早需要1天左右。
(1)培养
分别将各等量的样品(败血症的血液等)注入到液体培养基(BHI：脑心浸液)中，在添加或不添加抗生素的条件下，在培养前、培养2小时后、培养4小时后回收培养基，离心沉淀菌体，进行颗粒化，分别提取DNA。另外，DNA的提取优选使用自动核酸提取装置。
(2)利用实时PCR的菌的定量
细菌检测用实时PCR用试剂·条件及引物构成与(实施例2)相同。
(3)判定方法
以培养前的定量结果作为0，以不添加抗生素培养2小时后、4小时后各自的定量结果作为100(以不添加抗生素时的增菌率作为100％)计算时，根据添加抗生素时培养2小时后、4小时后的定量结果，求出增菌率。
例如，如果以培养前的菌量作为N0h，不添加抗生素培养2小时后的菌量作为N2h、添加抗生素培养2小时后的菌量作为K2h，则可以如下计算：
添加抗生素2小时后的增菌率＝(K2h-N0h)/(N2h-N0h)×100(％)
或者，也可以不比较增菌率，直接比较菌量自身。
(4)结果1：对菌量自身的值进行比较的情况
对于被检测的表皮葡萄球菌，在培养2小时后、4小时后，分别评价庆大霉素(GM)10μg/ml、红霉素(EM)10μg/mL各自的药物敏感性。结果判明在2小时后、4小时后对EM均有敏感性，对GM没有敏感性(图21(A))。但是由于表皮葡萄球菌通过2小时的培养增菌少，所以为了更准确地评价，4小时后较好。
(5)结果2：以未添加抗生素时的增菌率为100％计算的情况
对于被检测的蜡状芽孢杆菌，在培养2、3、4小时后，分别评价头孢唑林(CZ)10μg/mL、氨苄西林(AP)10μg/mL、红霉素(EM)10μg/mL的药物敏感性。从该结果可知如果评价增菌多的4小时后，则对AP具有强敏感性(增菌率0％)、对CZ也具有一定程度的敏感性(增菌率16％)，但对EM几乎没有敏感性(增菌率76％)(图21(B))。如上所述由于敏感性的“程度”由菌的增殖速度决定，所以寻求统一时间设定，但对抗生素显示出强敏感性、或者完全不显示敏感性等评价，即使在培养2小时后等早期阶段也能够判定。
(实施例5：使用检测对象的高灵敏度检测方法的子宫内感染症的羊水检查)
使用本发明的使用e-DNAP及不显示法的高灵敏度检测法，进行迅速且简便的子宫内感染症的羊水检查。由于早产的最大原因为子宫内感染症，具有使胎儿死亡的危险，所以寻求迅速地判定是否感染的检查法。作为子宫内感染症的感染微生物，除细菌、真菌之外，支原体和尿素原体的感染率也非常高。支原体属·尿素原体属的碱基序列与细菌显著不同，利用细菌的通用引物不能检测，因此需要另外使用各自的引物。
(1)引物组及PCR用试剂
细菌及真菌检测用PCR用试剂及引物构成与(实施例3)相同。
以下给出支原体属·尿素原体属的检测用引物构成。支原体属·尿素原体属的检测中使用嵌套式PCR法。
支原体属·尿素原体属检测中使用e-DNAP，并使用与(实施例2)相同的PCR用试剂。PCR程序与(实施例2)相同。
支原体正向引物：GATGATCATTAGTCGGTGG(序列号50)
支原体反向引物：CTACCTTAGGCGGTCGTG(序列号51)
支原体正向嵌套式引物：GACATCCTTCGCAAAGCTAT(序列号52)
支原体反向嵌套式引物：CAGTTACCCAGGCAGTATCTC(序列号53)
尿素原体正向引物：GAACGAAGCCTTTTAGGC(序列号54)
尿素原体反向引物：GATACAGCTAGACGTTAAGCATCTA(序列号55)
尿素原体正向嵌套式引物：TAACATCAATATCGCATGAGAAG(序列号56)
尿素原体反向嵌套式引物：CAGTACAGCTACGCGTCATT(序列号57)
(2)PCR检测法
利用上述的引物组，能够迅速且简便地判定羊水中是否存在细菌、真菌、支原体属、尿素原体属中的任一种。检测法可以使用实时PCR法，也可以在琼脂糖凝胶中电泳PCR产物进行确认。通过使用了e-DNAP(实施例3)的方法，能够以高灵敏度检测细菌及真菌，另外，利用嵌套式PCR法能够以高特异度检测支原体属及尿素原体属。
(3)结果
从可能为子宫内感染症的羊水样品1中确认到细菌的感染(图22(A))。另外，从先兆早产的羊水样品2中确认到尿素原体属的感染(图22(B))。上述检查可以以2小时左右迅速且简便地进行。另外，本实施例的引物组也可以用于例如培养细胞的培养液中的污染(细菌·真菌·支原体)等、生物实验环境中的污染的检查。
关于被检测的尿素原体属，之后进一步解析扩增产物的碱基序列，结果确认为细小尿原体。如上所述，对检测的细菌、真菌、支原体属及尿素原体属的PCR扩增产物进行测序，能够鉴定至种属水平。另外，通过解析多个扩增产物的Tm值的组合(WO2007/097323)，或者在利用通用引物得到的扩增产物的更内侧使用菌种特异性的嵌套式引物(利用多个引物也能够进行multlplex PCR)，也能够鉴定种属。
(实施例6：同时使用检测对象的高灵敏度检测方法和一步嵌套式PCR法的检测法)
在本发明的使用e-DNAP及不显示法的高灵敏度检测方法的基础上，如果通过应用“套匣扩增法”或对延伸时间进行研究以1次试行进行嵌套式PCR，则能够边保持高灵敏度和迅速性边高特异度地检测。
(1)引物组及PCR用试剂
大多数以细菌作为宿主制造的市售耐热性DNA聚合酶均以E.Coli作为其宿主。因此，如果为了以高灵敏度检测E.Coli和与其属相近的菌种而进行PCR，则自然假阳性的风险变高。为了解决上述问题，并以高灵敏度·高特异度检测E.Coli，可以在采用使用e-DNAP的高灵敏度检测方法的同时，通过应用“套匣扩增法”或对延伸时间进行研究，利用E.Coli特异性的引物进行一步半嵌套式PCR。需要说明的是，PCR用试剂与(实施例3)相同。以下给出E.Coli特异性的半嵌套式引物组。
E.Coli特异性正向引物：TAACGGCTCACCTAGGCGA(序列号58)
E.Coli特异性反向引物：GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTG(序列号59)
E.Coli特异性半嵌套式引物：GCAATATTCCCCACTG(序列号60)
以序列号58、59的引物的Tm值均为65℃、序列号60的半嵌套式引物的Tm值为55℃的方式进行设计。
(2-1)通过应用“套匣扩增法”进行的一步嵌套式PCR法
利用了序列号58、59的引物得到的扩增产物Ⅰ的长度为548bp，半嵌套式PCR扩增产物Ⅱ的长度为110bp。由此设计引物的位置，使扩增产物的长度存在明显的差，使各自的扩增产物的Tm值的差变大。其结果，扩增产物Ⅰ的Tm值变为87℃，扩增产物Ⅱ的Tm值变为83℃。但是，由于扩增产物的GC％也影响Tm值，所以在引物设计中关于扩增产物的GC％也必须充分研究。另外，由于Tm值受PCR缓冲液的盐浓度的影响，所以盐浓度通常应该固定为定值。
然后按照表3记载的条件进行实时PCR程序。该条件设定中，在进行使用了e-DNAP及不显示法的高灵敏度检测方法的基础上，也可以通过应用“套匣扩增法”以1次试行进行嵌套式PCR。需要说明的是，程序中加入转变的设定，用于嵌套式引物结合。
[表3]
Figure BPA00001405947300971
(2-2)通过研究延伸时间进行的一步嵌套式PCR法
利用序列号58、59的引物得到的扩增产物Ⅰ的长度为548bp，半嵌套式PCR扩增产物Ⅱ的长度为110bp。由此，设计引物的位置，以使扩增产物的长度存在明显的差。
然后按照表4记载的条件进行实时PCR的程序。该条件设定中，在进行使用了e-DNAP及不显示法的高灵敏度检测方法的基础上，还可以通过研究延伸时间，以1次试行进行嵌套式PCR。
[表4]
Figure BPA00001405947300972
(3)结果
混合包括半嵌套式引物的3个引物，关于“套匣扩增法”的应用及延伸时间的研究，按照以下的程序进行实时PCR，根据扩增产物的Tm值或其大小，确认是否利用嵌套式PCR只有上述扩增产物Ⅰ或者扩增产物Ⅱ被扩增。
(3-1)只有外侧的扩增产物Ⅰ被扩增的确认
只在表3及表4的扩增1的程序部分分别试行50循环。点为退火温度的70℃。由于外侧的引物的Tm值为65℃、内侧的半嵌套式引物的Tm值为55℃，所以在70℃的退火中只有外侧的引物结合。其结果，只有外侧的扩增产物Ⅰ被扩增。实验结果中确实扩增产物Ⅰ的Tm值为87℃，且只有548bp的扩增产物被扩增(图23(B)、图25)。
(3-2)只有内侧的扩增产物Ⅱ被扩增的确认
只有表3及表4的扩增2的程序部分试行50循环。
表3的“套匣扩增法”的应用中的点为退火的60℃和变性的85℃。在60℃的退火下，包括半嵌套式引物在内的全部引物结合，但如果变性温度为85℃，则即使内侧的扩增产物Ⅱ(Tm值83℃)变性，外侧的扩增产物Ⅰ(Tm值87℃)也不变性。其结果，只有内侧的扩增产物Ⅱ被扩增。实验结果中确实扩增产物Ⅱ的Tm值为83℃且只有110bp的扩增产物(其他为引物二聚体)被扩增(图23(A)、图25)。
表4的延伸时间的研究中的点为2秒的延伸时间。在60℃的退火下，包括半嵌套式引物在内的所有的引物均结合，但延伸时间如果为2秒，则即使内侧的扩增产物Ⅱ(110bp)延伸，外侧的扩增产物Ⅰ(548bp)也不能延伸。其结果，只有内侧的扩增产物Ⅱ被扩增。实验结果中确实扩增产物Ⅱ的Tm值为83℃且只有110bp的扩增产物(其他为引物二聚体)被扩增(图23(A)、图25)。
(3-3)使用e-DNAP及不显示法的高灵敏度定量方法的确认
按照表3及表4的程序设定，进行实时PCR，结果只有在E.Coli的存在下确认到扩增，蒸馏水(D.W.)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、人DNA中完全未确认到增殖(图24(A)：只有表3及表4的扩增2的扩增显示)。即，即使共计60循环次，除E.Coli之外完全未确认到扩增，确认使用e-DNAP及不显示法可以进行高灵敏度定量。
(3-4)一步嵌套式PCR的确认
以E.Coli的DNA作为模板，利用表3及表4的程序整体被扩增的产物只有1个，其扩增产物的Tm值为83℃且为110bp，即只为内侧的扩增产物Ⅱ(图24(B)、图25)。其结果，确认到通过“套匣扩增法”的应用及延伸时间的研究，能够以一次的试行(One Step)进行嵌套式PCR。
(3-5)结果总结
以上的结果确认到，在使用e-DNAP及不显示法进行高灵敏度定量方法的同时，如果组合通过应用“套匣扩增法”及研究延伸时间进行的一步嵌套式PCR法，则可以只研究PCR程序，边保持高灵敏度和迅速性，边更高特异度的检测。需要说明的是，本实施例的嵌套式PCR中组合E.Coli的特异性的引物，但例如也可以采用在内·外均组合细菌的通用引物的方法，或者采用使外侧为细菌的通用引物、使内侧为菌种特异性的引物(也可以进行使用了多个特异性引物的multiplex PCR)的组合。另外，通过将套匣扩增法和延伸时间的研究的两者一起组入PCR程序中，能够更确实地进行一步嵌套式PCR法。
(实施例7：使用e-DNAP的检测对象微生物的高灵敏度定量鉴定方法)
对于未知的感染微生物，利用多个通用引物进行PCR，通过解析多个扩增产物的Tm值的组合，迅速·简便地鉴定感染微生物(WO2007/097323)。感染微生物为细菌时，本鉴定法使用细菌的通用引物，因此如果不使用e-DNAP，则产生假阳性的风险，另外不能高灵敏度的检测。即，优选在通过本实施例进行的细菌的鉴定中使用e-DNAP。另外，测定仪优选使用RotorGene6000(QIAGEN公司)。
(1)引物组和PCR用试剂
作为细菌的通用引物，使用序列号15～28。由此，能够得到7个PCR扩增产物。PCR用试剂和PCR条件与(实施例2)相同。
(2)解析方法
从败血症患者的血液样品中提取DNA后，试行上述实时PCR，得到7个PCR扩增产物的各Tm值。将所述7个Tm值的组合与以下的数据库核对。此时，通过实时PCR的试行也能够得到定量结果。
(3)数据库
对于从富山大学附属医院过去1年的败血症的阳性样品中提取的45种细菌，均输入7个Tm值的组合。需要说明的是，所谓7个Tm值，是使用序列号15～28的引物、利用与(实施例2)完全相同的PCR用试剂·PCR条件获得的。
(4)鉴定方法
算出从患者样品中得到的7个Tm值的平均值，计算与该平均值的相对值(由于不是绝对值，所以产生±)。将上述7个相对值记为D1ref～D7ref。同样地对数据库中的各细菌也进行计算，将所述7个相对值记作D1db～D7db。并且，对于数据库中的全部细菌，实施以下的计算。
Figure BPA00001405947301001
从数据库中导出上述Dist.最接近0的细菌，将其作为样品中的起因菌进行鉴定。以上的方法作为算法装入计算机的鉴定软件中，只要输入从患者样品得到的7个Tm值便可以瞬时得到鉴定结果。如果使用本实施例的算法，则完全可以校正每次试行的Tm值的测定误差。即，即使在每次测定中产生几℃的误差，也不影响鉴定。通过该方法不能校正的误差，为在相同的试行次数中样品间产生的测定误差。但是，例如如果使用作为实时PCR仪之一的RotorGene6000(QIAGEN公司)，则由于样品间的测定误差为±0.01℃，所以误差基本不产生影响，可以准确地鉴定。
(5)结果
从患者样品中得到的未知细菌中的7个Tm值分别为
84.98，84.45，84.84，84.31，
81.20，81.83，81.12，
利用鉴定软件算出的结果，能够瞬时地将Dist.＝0.05的肺炎克雷伯氏菌鉴定为最接近Dist.＝0的起因菌(表5：利用鉴定软件的算出结果)。另外，也可以定量。
[表5]
Figure BPA00001405947301011
另外，通过通常的细菌检查，从该患者样品中检测到肺炎克雷伯氏菌，确认到鉴定结果与通常法相同。
需要说明的是，肺炎克雷伯氏菌的数据库上的7个Tm值分别为
85.02，84.48，84.45，84.29，
81.20，81.84，81.14。
本实施例的鉴定方法不限于细菌，也可以用于真菌或其他生物种的鉴定中。另外，同时调查mecA等耐抗生素基因的有无在临床上有用。
产业上的利用领域
本发明的检测对象生物的定量及/或鉴定方法可以实际应用在生活用水检查、食品检查、败血症检查、药物敏感性试验等中。基本上，本来应该无菌的样品，如果与感染症有关，则也可以应用于其他样品。例如，一般认为脑脊髓液检查或羊水检查(子宫内感染症)等社会贡献度高、特别是本系统的迅速性(2小时以内判明结果)也有用。
另外，不只是与人相关的领域，而且也包括家畜感染症等兽医领域的检查、或细胞培养液的污染等生物实验环境的检查，可以在广泛范围内实用化。

Claims (38)

1.一种耐热性DNA聚合酶制品，是耐热性DNA聚合酶的制品，其特征在于：
(1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码所述耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对所述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
2.一种耐热性DNA聚合酶制品的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将编码耐热性DNA聚合酶的基因转化到真核细胞中，得到耐热性DNA聚合酶基因表达转化体细胞的步骤，
(2)培养所述转化体细胞的步骤，
(3)从经培养的转化体细胞中取得含有耐热性DNA聚合酶的提取物，将所述提取物进行热处理的步骤；或者将经培养的转化体细胞进行热处理后，从经热处理的转化体细胞中取得含有耐热性DNA聚合酶的提取物的步骤。
3.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于，所述热处理的温度为50℃以上。
4.如权利要求2或3所述的制造方法，其特征在于，转化中使用的编码耐热性DNA聚合酶的基因来自嗜热菌或超嗜热菌。
5.如权利要求2～4中任一项所述的制造方法，其中，编码耐热性DNA聚合酶的基因是由序列号1的碱基序列构成的DNA。
6.如权利要求2～5中任一项所述的制造方法，其特征在于，真核细胞为菌类、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞中的任一种。
7.如权利要求2～6中任一项所述的制造方法，其中，所述制品为：
(1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码所述耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对所述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
8.一种耐热性DNA聚合酶制品，其特征在于，含有利用权利要求2～7中任一项所述的制造方法得到的提取物或其纯化制品。
9.样品中的检测对象生物的检测方法，其特征在于，在对样品中的检测对象生物进行检测的方法中，
包括以下步骤：
(1)扩增步骤，使用由所述样品制备的核酸、用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因的引物、和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，和
(2)检测步骤，检测所述扩增步骤中的扩增产物中的所述靶基因的扩增产物，
其中，所述耐热性DNA聚合酶制品为下述(A)及(B)耐热性DNA聚合酶制品中的任一种，
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码所述耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对所述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
10.如权利要求9所述的检测方法，其中，所述扩增步骤是在抑制除所述靶基因之外的靶外基因的扩增的条件下进行的。
11.如权利要求10所述的检测方法，其中，利用热启动法抑制所述靶外基因的扩增。
12.如权利要求11所述的检测方法，其中，相对于1单位所述耐热性DNA聚合酶，使用过量的抗DNA聚合酶抗体。
13.如权利要求9～12中任一项所述的检测方法，其中，以能够检测到所述靶基因的扩增产物、不能检测到其之外的靶外基因的扩增产物的方式进行所述检测步骤。
14.如权利要求13所述的检测方法，其中，通过下述方式设定能够检测到所述靶基因的扩增产物、不能检测到除其之外的靶外基因的扩增产物的条件，并使用只检测所述靶基因的扩增产物的方法进行检测，所述方式为：
(1)设计所述引物，使所述靶基因扩增产物的熔解温度(TmA)高于所述靶外基因的扩增产物的熔解温度(TmB)，
(2)在TmA和TmB之间的温度下进行所述扩增产物的检测。
15.如权利要求14所述的检测方法，其中，利用实时PCR进行所述扩增步骤和所述检测步骤，所述实时PCR使用显示扩增产物的量的显示装置，所述靶外基因的扩增产物在所述显示装置中无显示。
16.如权利要求9～15中任一项所述的检测方法，其中，利用具有检测用标记的嵌入剂进行所述扩增产物的检测。
17.如权利要求9～12中任一项所述的检测方法，其中，所述检测步骤通过在凝胶上展开扩增产物来进行。
18.如权利要求9～17中任一项所述的检测方法，其中，所述耐热性DNA聚合酶制品为以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，所述真核细胞为菌类、植物细胞、昆虫细胞及动物细胞中的任一种。
19.如权利要求9～18中任一项所述的检测方法，其中，所述检测对象生物为选自细菌、真菌、病毒中的1种或2种以上。
20.如权利要求19所述的检测方法，其中，所述检测对象生物为细菌，所述引物为能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组。
21.如权利要求9～20中任一项所述的检测方法，其中，所述检测对象生物为感染症病原菌。
22.如权利要求9～21中任一项所述的检测方法，其中，所述样品为应为无菌环境的样品。
23.如权利要求22所述的检测方法，其中，所述应为无菌环境的样品选自血液、脑脊髓液、羊水、尿、食品、饮料、化妆品、供水质检查的样品。
24.如权利要求9～23中任一项所述的检测方法，其中，在所述检测步骤中，定量所述扩增步骤中的扩增产物，根据所得的定量结果定量所述样品中的检测对象生物。
25.如权利要求24所述的检测方法，其中，在所述检测步骤中，将所述靶基因的扩增产物进行定量或数值化，根据其结果求出所述样品中含有的检测对象生物的个体数。
26.如权利要求25所述的检测方法，其中，作为将所述扩增产物数值化的方法，使用吸光度测定法或光密度测定法。
27.如权利要求24所述的检测方法，其中，所述靶基因为所述检测对象生物的鉴定用基因，根据所述靶基因的扩增产物的分析结果，对所述样品中含有的检测对象生物进行定量鉴定。
28.样品中的检测对象生物的定量鉴定方法，是对样品中的检测对象生物进行定量鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用由所述样品制备的核酸、引物(B)及(M)和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，所述引物(B)及(M)用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因，
(2)第一定量鉴定步骤，基于对所述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析所述第一扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，进行所述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
(3)第二扩增步骤，使用由所述样品制备的核酸、引物(F)、和以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，所述引物(F)用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因，和
(4)第二定量鉴定步骤，基于对所述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析所述第二扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对定量鉴定所述检测对象生物的第一定量鉴定步骤和所述第二扩增步骤中的扩增产物进行定量，根据所得的定量结果进行所述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
其中，所述引物(B)、(F)及(M)如下：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(F)能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(M)对呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因进行特异性地扩增的引物组，
第一扩增步骤中的耐热性DNA聚合酶制品为下述(A)及(B)中的任一种，
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码所述耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对所述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
29.样品中的检测对象生物的定量鉴定方法，是对样品中的检测对象生物进行定量鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)第一扩增步骤，使用由所述样品制备的核酸、引物(B)、和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，所述引物(B)用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因，
(2)第一定量鉴定步骤，基于对所述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析所述第一扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，进行所述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
(3)第二扩增步骤，使用由所述样品制备的核酸、引物(F)、和以细菌作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，所述引物(F)用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因，
(4)第二定量鉴定步骤，基于对所述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)的组合，解析所述第二扩增步骤中的多个(3～10)扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对定量鉴定所述检测对象生物的第一定量鉴定步骤及所述第二扩增步骤中的扩增产物进行定量，根据所得的定量结果进行所述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
(5)第三扩增步骤，使用由所述样品制备的核酸、引物(M)、和耐热性DNA聚合酶制品进行核酸扩增反应，所述引物(M)用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因，和
(6)第三定量鉴定步骤，基于对所述靶基因的扩增产物为特异性的熔解温度(Tm值)，解析所述第三扩增步骤中的扩增产物的熔解温度(Tm值)，进行所述样品中的检测对象生物的定量鉴定，
其中，所述引物(B)、(F)及(M)如下所述：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(F)能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(M)对呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因进行特异性地扩增的引物组，
第一及第三扩增步骤中的耐热性DNA聚合酶制品为：
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，及
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码所述耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对所述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
30.如权利要求28或29所述的定量鉴定方法，其中，所述细菌的16SrRNA基因的扩增区域为3～10处。
31.如权利要求28或29所述的定量鉴定方法，其中，所述真菌的18SrRNA基因的扩增区域为3～10处。
32.如权利要求28～31中任一项所述的定量鉴定方法，其中，增加下述步骤：
作为标准对照，将一定浓度的大肠杆菌标准株DNA作为模板，
使用能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组及含有全部或一部分各引物碱基序列的引物组中的任一种，通过每次测定标准Tm值，来校正所述扩增产物的Tm值的测定误差。
33.如权利要求28～32中任一项所述的定量鉴定方法，其中，基于对所述检测对象生物为特异性的熔解温度的组合(TmS1～TmSn：n为3～10)，解析基于各扩增区域的扩增产物的溶解温度的组合(TmM1～TmMN：N为3～10)，对所述检测对象生物进行定量鉴定。
34.如权利要求33所述的定量鉴定方法，其中，增加下述步骤：作为用于鉴定所述检测对象生物的算法，不仅利用Tm值自身的组合，而且利用各Tm值间的差的组合进行鉴定，由此使测定误差的影响为最小限度。
35.一种定量或鉴定用组合，用于对样品中所含的检测对象生物进行定量及/或鉴定，其特征在于，
具有用于扩增由样品制备的核酸的耐热性DNA聚合酶制品和用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因的引物，
其中，所述耐热性DNA聚合酶制品为：
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，及
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码所述耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对所述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
36.一种定量及/或鉴定用组合，用于对样品中所含的检测对象生物进行定量及/或鉴定，其特征在于，具有
用于扩增由样品制备的核酸的、为下述(A)及(B)中的任一种的耐热性DNA聚合酶制品，
用于扩增由样品制备的核酸的、以细菌细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，和
用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因的引物，
其中，所述(A)及(B)为：
(A)以真核细胞作为宿主制造的耐热性DNA聚合酶制品，
(B)具有下述特征的耐热性DNA聚合酶制品，
(B-1)1单位的耐热性DNA聚合酶中，除编码所述耐热性DNA聚合酶的基因之外，来自细菌的核酸的混入量为10fg以下，
(B-2)使用仅能够使除编码耐热性DNA聚合酶的基因之外的来自细菌的核酸扩增的引物，在不加入模板的条件下，即使对所述制品进行32个循环以上的基因扩增反应，也未检测到来自细菌的核酸的扩增产物。
37.如权利要求36所述的组合，其中，所述引物为下述引物(B)、(F)及(M)：
(B)能够扩增所有细菌的16SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部1/3以上各引物碱基序列的引物，
(F)能够扩增所有真菌的18SrRNA基因的多个区域的引物组，及含有全部或1/3以上各引物碱基序列的引物，
(M)对呈现甲氧西林耐性的mecA基因等随着各时期的流行而产生的抗生素耐性基因进行特异性地扩增的引物组。
38.一种定量及/或鉴定系统，用于对样品中所含的检测对象生物进行定量及/或鉴定，其特征在于，具有：
(1)扩增装置，用于使用由所述样品制备的核酸、用于扩增对所述检测对象生物为特异性的靶基因的引物、耐热性DNA聚合酶进行核酸扩增反应，
(2)定量装置，用于对所述扩增步骤中的扩增产物进行定量，
(3)计算装置，根据所述扩增产物的定量结果计算所述样品中检测对象生物的量，和
(4)数据库，用于由所述靶基因的扩增产物的定量结果计算所述样品中检测对象生物的量，
所述系统用于进行权利要求9～34中任一项所述的检测方法或定量鉴定方法。
CN201080004647.1A 2009-01-15 2010-01-15 含有耐热性dna聚合酶的酶制品及其制造方法、以及检测对象生物的检测方法 Active CN102282257B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-006556 2009-01-15
JP2009006556 2009-01-15
JP2009023707 2009-02-04
JP2009-023707 2009-02-04
JP2009040052 2009-02-23
JP2009-040052 2009-02-23
JP2009181755 2009-08-04
JP2009-181755 2009-08-04
PCT/JP2010/050443 WO2010082640A1 (ja) 2009-01-15 2010-01-15 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102282257A true CN102282257A (zh) 2011-12-14
CN102282257B CN102282257B (zh) 2015-04-01

Family

ID=42339893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080004647.1A Active CN102282257B (zh) 2009-01-15 2010-01-15 含有耐热性dna聚合酶的酶制品及其制造方法、以及检测对象生物的检测方法

Country Status (12)

Country Link
US (3) US9243272B2 (zh)
EP (1) EP2388322B1 (zh)
JP (1) JP5583602B2 (zh)
KR (2) KR20110102467A (zh)
CN (1) CN102282257B (zh)
AU (1) AU2010205133B2 (zh)
BR (1) BRPI1007382A2 (zh)
CA (1) CA2749693C (zh)
MX (1) MX340406B (zh)
MY (1) MY188333A (zh)
SG (1) SG196823A1 (zh)
WO (1) WO2010082640A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105612254A (zh) * 2013-10-07 2016-05-25 三井化学株式会社 用于扩增细菌dna的pcr中使用的引物组、用于检出及/或鉴定细菌菌种的试剂盒及检出及/或鉴定细菌菌种的方法
CN113957127A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 中国科学院微生物研究所 通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测的方法
CN114686599A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 北京五加和基因科技有限公司 宿主昆虫细胞dna残留含量定量检测方法及试剂盒

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2749693C (en) 2009-01-15 2018-11-06 Hokkaido Mitsui Chemicals Inc. Enzyme preparation containing thermostable dna polymerase, method for producing same, and method for detecting subject organism to be detected
JP5678471B2 (ja) * 2010-05-11 2015-03-04 コニカミノルタ株式会社 体液遊離核酸検査における品質保証方法
WO2012146260A1 (de) * 2011-04-23 2012-11-01 Biolytix Ag Herstellung und verwendung von proteinen in der molekularbiologie
JP2014223026A (ja) * 2013-05-15 2014-12-04 東洋紡株式会社 核酸配列の欠失または導入を判定する方法
PL228161B1 (pl) 2013-05-21 2018-02-28 Univ Jagielloński Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR
CN104250641B (zh) * 2013-06-28 2017-09-01 北京福安华生物科技有限公司 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用
EP3201355B1 (en) 2014-09-30 2019-07-31 Illumina, Inc. Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
JP6860771B2 (ja) * 2016-05-26 2021-04-21 学校法人福岡大学 絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセット、アッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法
KR102593021B1 (ko) * 2017-10-12 2023-10-31 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법
KR102494612B1 (ko) 2017-12-20 2023-01-31 국립대학법인 도야마 다이가쿠 개량 Tm 매핑법
CN111684067A (zh) 2017-12-22 2020-09-18 三井化学株式会社 被检样品中的细菌数的定量方法
KR102490275B1 (ko) 2018-03-26 2023-01-20 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 시료 세균의 rna를 이용한 세균 동정 방법 및 그를 위한 키트
CN110878124B (zh) * 2018-09-05 2021-10-08 深圳华大生命科学研究院 Dna聚合酶的抗体片段、抗体及其应用
MX2020013347A (es) 2018-10-31 2021-04-28 Illumina Inc Polimerasas, composiciones y metodos de uso.
JP2022511206A (ja) 2018-12-05 2022-01-31 イラミーナ インコーポレーテッド ポリメラーゼ、組成物、および使用方法
EP3935188A1 (en) * 2019-03-08 2022-01-12 Ontera Inc. Relative quantification of genetic variants in a sample
CA3165380A1 (en) * 2020-01-22 2021-07-29 Microbio Pty Ltd Bacterial quantification method
CN114592036B (zh) * 2022-04-02 2023-03-31 予果生物科技（北京）有限公司 放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用
CN115844771B (zh) * 2022-12-21 2024-01-30 广州市巧美化妆品有限公司 一种温泉水发酵产物、修复抗衰组合物及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0745675A2 (en) * 1995-05-31 1996-12-04 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha A method of amplifying nucleic acid and a reagent therefor
WO2007097323A1 (ja) * 2006-02-21 2007-08-30 National University Corporation University Of Toyama 感染症起因菌の迅速同定方法
CN101191146A (zh) * 2006-11-28 2008-06-04 佳能株式会社 用于细菌基因组扩增反应的引物

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0479117B1 (en) 1990-10-05 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for identifying gram negative bacteria
US5489523A (en) * 1990-12-03 1996-02-06 Stratagene Exonuclease-deficient thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
DE69233253T2 (de) * 1991-06-03 2004-08-26 Takara Bio Inc., Otsu Verfahren zum Klonieren eines Pol-I-Typ DNS-Polymerase-Gens
DK0519338T3 (da) 1991-06-20 1996-10-28 Hoffmann La Roche Forbedrede fremgangsmåder til nukleinsyreamplifikation
US5436149A (en) * 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
US5912155A (en) * 1994-09-30 1999-06-15 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
US6107071A (en) * 1996-09-24 2000-08-22 Smithkline Beecham Corporation Histidinol dehydrogenase
FR2755145B1 (fr) * 1996-10-28 1999-01-15 Gervais Danone Co Procede de mise en evidence de contaminants microbiologiques vivants dans un echantillon de produit a usage alimentaire
GB9716664D0 (en) * 1997-08-06 1997-10-15 Norwegian Inst Of Fisheries & A method of removing nucleic acid contamination reactions
US6596492B2 (en) * 2000-07-11 2003-07-22 Colorado State University Research Foundation PCR materials and methods useful to detect canine and feline lymphoid malignancies
ES2254306T3 (es) 2000-10-25 2006-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Amplificacion usando cebadores modificados.
WO2002052034A1 (fr) 2000-12-26 2002-07-04 Joji Oshima Methodes de bioscopie et d'amplification d'acides nucleiques
CA2413669A1 (en) 2001-12-19 2003-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Reagent for improved pcr
US7148049B2 (en) * 2002-04-02 2006-12-12 Roche Molecular Systems, Inc. Thermostable or thermoactive DNA polymerase molecules with attenuated 3′-5′ exonuclease activity
JP2006254784A (ja) 2005-03-17 2006-09-28 Institute Of Physical & Chemical Research プライマーダイマーからの非特異的増幅を減少させる方法
JP2006180886A (ja) 2006-02-24 2006-07-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology Ｄｎａポリメラーゼの製造方法
CA2749693C (en) 2009-01-15 2018-11-06 Hokkaido Mitsui Chemicals Inc. Enzyme preparation containing thermostable dna polymerase, method for producing same, and method for detecting subject organism to be detected

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0745675A2 (en) * 1995-05-31 1996-12-04 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha A method of amplifying nucleic acid and a reagent therefor
US6054301A (en) * 1995-05-31 2000-04-25 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Methods of amplification using a thermostable DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon strain KOD1 and reagent kit therefor
WO2007097323A1 (ja) * 2006-02-21 2007-08-30 National University Corporation University Of Toyama 感染症起因菌の迅速同定方法
CN101191146A (zh) * 2006-11-28 2008-06-04 佳能株式会社 用于细菌基因组扩增反应的引物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBARA S. MROCZKOWSKI等: "Secretion of Thermostable DNA Polymerase Using a Novel Baculovirus Vector", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
张鹍等: "FD耐热逆转录酶的同源模建及结构同源性分析", 《复旦学报（自然科学版）》 *
杜汉森等: "Taq DNA 耐热聚合酶在大肠杆菌中的克隆和高表达", 《生物工程学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105612254A (zh) * 2013-10-07 2016-05-25 三井化学株式会社 用于扩增细菌dna的pcr中使用的引物组、用于检出及/或鉴定细菌菌种的试剂盒及检出及/或鉴定细菌菌种的方法
CN105612254B (zh) * 2013-10-07 2020-06-23 三井化学株式会社 用于扩增细菌dna的pcr中使用的引物组及其试剂盒和方法
CN111534623A (zh) * 2013-10-07 2020-08-14 三井化学株式会社 用于扩增细菌dna的pcr中使用的引物组及其试剂盒和方法
CN111534623B (zh) * 2013-10-07 2024-05-07 三井化学株式会社 用于扩增细菌dna的pcr中使用的引物组及其试剂盒和方法
CN113957127A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 中国科学院微生物研究所 通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测的方法
CN114686599A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 北京五加和基因科技有限公司 宿主昆虫细胞dna残留含量定量检测方法及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
EP2388322B1 (en) 2017-10-25
MY188333A (en) 2021-11-30
EP2388322A4 (en) 2012-12-26
US20120094296A1 (en) 2012-04-19
WO2010082640A1 (ja) 2010-07-22
MX2011007548A (es) 2011-10-28
KR20140022962A (ko) 2014-02-25
EP2388322A1 (en) 2011-11-23
CN102282257B (zh) 2015-04-01
SG196823A1 (en) 2014-02-13
JP5583602B2 (ja) 2014-09-03
JPWO2010082640A1 (ja) 2012-07-05
US9243272B2 (en) 2016-01-26
BRPI1007382A2 (pt) 2015-08-25
MX340406B (es) 2016-07-07
CA2749693A1 (en) 2010-07-22
AU2010205133B2 (en) 2015-01-22
KR101718594B1 (ko) 2017-03-21
US10501813B2 (en) 2019-12-10
KR20110102467A (ko) 2011-09-16
AU2010205133A1 (en) 2011-09-08
US20160257999A1 (en) 2016-09-08
US20180057860A1 (en) 2018-03-01
CA2749693C (en) 2018-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102282257B (zh) 含有耐热性dna聚合酶的酶制品及其制造方法、以及检测对象生物的检测方法
US7045328B2 (en) Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5545552A (en) Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5455170A (en) Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05
US20050282171A1 (en) Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
NO305488B1 (no) Termostabil DNA-polymerase, DNA-sekvens som koder for denne, vektor omfattende DNA-sekvensen, mikroorganisme transformert med DNA-sekvensen samt preparat inneholdende den termostabile DNA-polymerase
CN101107356B (zh) 3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸的酶合成法
US5192674A (en) Thermostable dna polymerase thermus thermophilus and a method of producing the same
US5866395A (en) Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
JP5394928B2 (ja) サーマス・エガートソニイ（ｔｈｅｒｍｕｓｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）ｄｎａポリメラーゼ
US5242818A (en) Method of producing a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus
EP2215222B1 (en) Mutant dna polymerases with improved pyrophosphorolysis activated polymerization (pap) ability
JPS63102677A (ja) 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ
WO2009072811A1 (en) Method for marking bio-information into genome of organism and organism marked with the bio-information
JP3624960B2 (ja) 耐熱性リボヌクレアーゼｈおよびその用途
CN115975975A (zh) 一种室温条件下具有扩增活性的dna聚合酶及其应用
JP2008148584A (ja) アセチル化アミノ糖及びアセチル化アミノ糖ヌクレオチド合成活性を有する耐熱性酵素

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant