JPWO2010082640A1 - 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
PCRを行える優れた方法だが、その出願時には、プライマーや増幅産物のTm値を簡単に実測する技術が無かったためか、未だ実用化されていない。この方法はリアルタイムPCR技術のある現在では実用化可能である。その他、ハイブリプローブを用いる方法やTaqMan PCR法などが一般に用いられているが、誰でも簡単にプローブを作成できる訳ではなく、費用も高価となる等、迅速性・簡便性・経済性の全てを満たす方法は未だ存在しないのが現状である。
(I)耐熱性DNAポリメラーゼを含む酵素調製物であって、
(1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(2)前記酵素調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
ことを特徴とする耐熱性DNAポリメラーゼ調製物。
(1)耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を真核細胞に形質転換し、耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子発現形質転換体細胞を得る工程、
(2)前記形質転換体細胞を培養する工程、
(3)培養された形質転換体細胞より耐熱性DNAポリメラーゼを含む抽出物を取得し、該抽出物を熱処理する工程、または培養された形質転換体細胞を熱処理した後、熱処理された形質転換体細胞より耐熱性DNAポリメラーゼを含む抽出物を取得する工程、
を有することを特徴とする耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の製造方法。
以下の工程:
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
(2)前記増幅工程における増幅産物中の前記目的遺伝子の増幅産物を検出する検出工程と、
を有し、
前記耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
のいずれかであることを特徴とする検体中の検出対象生物の検出方法。
以下の工程:
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)及び(M)と、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
(3)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(F)と、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
(4)前記第二の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程と前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー(B)、(F)及び(M)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(F)全ての真菌の18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(M)メチリシン耐性を示すmecA遺伝子など、その時々の流行を反映した抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一の増幅工程における耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
のいずれかである
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
以下の工程:
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)と、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
(3)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(F)と、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
(4)前記第二の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程と前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
(5)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(M)と、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第三の増幅工程と、
(6)前記第三の増幅工程における増幅産物の融解温度(Tm値)を前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)に基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第三の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー(B)、(F)及び(M)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(F)全ての真菌の18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(M)メチリシン耐性を示すmecA遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一及び第三の増幅工程における耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物である
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
検体から調製した核酸を増幅するための耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有し、
前記耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
であることを特徴とする定量または同定用のセット。
検体から調製した核酸を増幅するための、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
のいずれかの耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
検体から調製した核酸を増幅するための細菌細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有することを特徴とする定量及び/または同定用のセット。
検体中に含まれる検出対象生物の定量及び/または同定を行うためのシステムにおいて、
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼと、を用いて核酸増幅反応を行うための増幅装置と、
(2)前記増幅工程における増幅産物の定量を行うための定量装置と、
(3)前記前記増幅産物の定量結果により前記検体中の検出対象生物の量を算出する算出装置と、
(4)前記目的遺伝子の増幅産物の定量結果から前記検体中の検出対象生物の量を算出するためのデータベースと、
を有し、
上記の検出方法または定量同定方法を行うためのものであることを特徴とする定量及び/または同定システム。
本発明者らは、市販の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と同様に、バクテリアを宿主として用いた遺伝子組み換えを利用して耐熱性DNAポリメラーゼを生産し、生産された耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の、検体に含まれる検出対象微生物の検出のためのPCRへの適用性について検討した。ところが、PCRを利用した検出対象微生物の検出において、検体中に含まれる微生物の量が少なく、それから採取されるDNAも微量である場合でも、PCRのサイクル数を増加させ検出対象微生物の検出のためのDNAの選択的増幅を可能とし、かつ製造コストの低減が可能な耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の提供を行うことができなかった。
R. Woese, "Bacterial Evolution, "Micro. Biol. Reviews, 51:221-271(1987)および図1参照)を参考に、各生物の遠縁関係を検証し、宿主として利用できる真核細胞に着目した。真核細胞を宿主として用いて耐熱性DNAポリメラーゼの生産を検討した結果、得られた培養抽出沈殿物中に耐熱性DNAポリメラーゼの大部分が不溶性として生産され、沈殿物および上清に対し加熱処理する事により不可逆的に可溶化し、またこの工程により活性を有し、且つ、高純度に精製された耐熱性DNAポリメラーゼを容易に回収できることを見出した。種々の検討を行う中で、この耐熱性DNAポリメラーゼ調製物は、バクテリア16S rRNA遺伝幅において鋳型を添加しないものに対してはDNA増幅が起こらないという特徴を少なくとも有することが見出された。
(1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下である。
(2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない。
(1)耐熱性DNAポリメラーゼを生産させた真核細胞をザイモリアーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-1、3-グルカナーゼ、リゾチームなどの細胞壁を溶解する酵素により処理する方法。
(2)超音波、フレンチプレス、ガラスビーズなどの物理的な方法、熱を加えることにより細胞壁、細胞膜を破壊する方法等を用いて、細胞または菌体に含まれる成分を水や緩衝液等の溶媒を用いて抽出し抽出物を取得する方法。
(3)分泌シグナルペプチド等を耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子上流に付加することにより該耐熱性DNAポリメラーゼを細胞外に分泌生産させる方法等を用いて生産された耐熱性DNAポリメラーゼを菌体外に抽出して抽出物を得る方法。
(A)前記抽出物由来の耐熱性DNAポリメラーゼが緩衝作用を有する成分としてリン酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸、酢酸、トリス、トリシン、ビスートリシン、ベルナール、ヘペス、ピペス、キャプス、タプス、テス、モプス、メスなどを含む緩衝液に溶解している状態のもの。
(B)MgCl2やdNTPsなどと共に溶液中に存在している状態のもの。
(C)これらの(A)及び(B)の溶液を凍結乾燥等の方法により乾燥させた乾燥状態のもの。
(I)耐熱性DNAポリメラーゼを含む培地等の抽出物を、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法。
(II)アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法。
(III)ゲルろ過など分子量の差を利用する方法等を用いるカラムクロマトグラフィー法。(IV)硫安沈殿、アセトン沈殿、PEG沈殿、pH沈殿等を用いて分画する方法。
(V)ポリエチレンイミン等を用いた核酸除去法。
Aquifex pyrophilus、Geothermobacterium ferrireducens、Thermotoga maritime、Thermotoga neopolitana、Thermotoga petrophila、Thermotoga naphthophila、Acidianus infernus、Aeropyrum pernix、Archaeoglobus fulgidus、Archaeoglobus
profundus、Caldivirga maquilingensis、Desulfurococcus amylolyticus、Desulfurococcus
mobilis、Desulfurococcus mucosus、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、Hyperthermus butylicus、Ignicoccus islandicus、 Ignicoccus pacificus、Methanococcus
jannaschii、Methanococcus fervens、Methanococcus igneus、Methanococcus infernus、Methanopyrus kandleri、 Methanothermus
fervidus、Methanothermus sociabilis、Palaeococcus ferrophilus、Pyrobaculum
aerophilum、Pyrobaculum calidifontis、Pyrobaculum islandicum、Pyrobaculum oguniense、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus abyssi Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus woesei、Pyrodictium abyssi、Pyrodictium brockii、Pyrodictium occultum、Pyrolobus fumarii、Staphylothermus marinus、Stetteria
hydrogenophila、Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus shibatae、Sulfolobus tokodaii、Sulfophobococcus zilligii、Sulfurisphaera
ohwakuensis、Thermococcus kodakaraensis、Thermococcus celer、Thermococcus litoralis、Thermodiscus maritimus、Thermofilum pendens、Thermoproteus tenax、Thermoproteus
neutrophilus、Thermosphaera aggregans、Vulcanisaeta distributa、Vulcanisaeta
sounianaなどが挙げられる。
菌類としては酵母やカビなどの子嚢菌、糸状菌、担子菌、接合菌などが挙げられ、中でも酵母または糸状菌が好ましく、具体例として、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス属(Schizosaccharomyces)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidi)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、フザリウム(Fusarium) 属、トリコデルマ(Trichoderma)属などが挙げられる。
cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・ウチリス(Candida utilis)、カンジダ・ボイディニ(Candida boidini)、ピキア・メタノリカ(Pichia metanolica)、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・パストリス(Pichiapastoris)、ピキア・アノマラ(Pichia anomala)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces
lactis)、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)、ヤロウイア・リポリティカ (Yarrowia lipolytica )、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon
pullulans)、ロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、及びトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma
reesei)などを挙げることができる。
BY-2培養細胞、Arabidopsis thaliana培養細胞、Ipomoea batatas培養細胞、Daucus carota培養細胞、Oryza sativa培養細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、昆虫より誘導した細胞であればよく、望ましくは株化された培養細胞であり、ハスモンヨトウ近似種Spodoptera frugiperdaの 卵巣細胞由来培養細胞sf9株、sf21株、カイコ(Bombix mori)培養細胞Bm-N株などが挙げられる。宿主細胞として好ましくは、酵母などの増殖が早い微生物あるいは真核生物であり、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母、Nicotiana tabacumなどのタバコ(Nicotiana)属植物の培養細胞をはじめとする植物細胞、アスペルギルス・オリザなどのアスペルギルス(Aspergillus)属を始めとする糸状菌が挙げられる。
thermophilus)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)、サーモコッカス・コダカラエンシス
KOD1(Thermococcus kodakaraensis KOD1)、パイロコッカス・ウォエセイ(Pyrococcus woesei)パイロコッカス・フリオシス(Pyrococcus
furiosus)、エアロパイラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)、アクイフェックス・アエオリカス(Aquifex aeolicus)、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus
tokodaii)パイロロバス・フマリ(Pyrolobus fumarii)、またはメタノパイラス・カンドレリ(Methanopyrus kandleri)由来の耐熱性DNAポリメラーゼを挙げることができる。
植物のPCR実験プロトコール、1997、秀潤社、p95−100)を採用することもできる。
配列番号1
aagcttacgt atacaacatg agaggtatgc ttccattgtt
cgaacctaaa ggtagagtat 60
tgttggttga tggtcatcat ctagcttaca gaactttcca
cgctctaaaa ggtttaacaa 120
catcaagagg tgaacctgtt caagctgtat acggttttgc
taagtcttta ctaaaagcat 180
tgaaggaaga cggtgacgcc gttattgttg ttttcgatgc
taaggcacca agttttagac 240
atgaagcata cggtggttat aaggctggaa gagcaccaac
tcctgaagac ttccctagac 300
aattggcact aatcaaggaa ctagtcgact tactaggtct
tgcaagatta gaagtcccag 360
gttatgaggc agatgatgta ctagcctctt tagcaaagaa
ggcagaaaag gagggttatg 420
aagttagaat tttaaccgct gataaggact tatatcaatt
gctatctgat aggattcatg 480
tgttacaccc tgaaggttat ttgataactc cagcttggtt
atgggagaag tacggtttga 540
ggccagacca atgggccgat tatagagctt taaccggcga
cgagtcagac aatcttccag 600
gtgttaaagg aattggcgaa aagactgcta ggaagttgtt
ggaagagtgg ggctccttgg 660
aggccttact taaaaatttg gacaggctaa aaccagcaat
cagggaaaag atactagctc 720
acatggatga tcttaaattg tcttgggact tagccaaggt
cagaactgat ttgcctttag 780
aggtcgactt cgctaagaga agggaacctg atagggaaag
gttaagagcc ttcttggaaa 840
gacttgagtt tggatcatta ttgcatgaat ttggtttatt
agaatcccct aaggccttgg 900
aagaagcacc atggccacct ccagaaggtg cctttgtagg
cttcgtctta agcaggaaag 960
aaccaatgtg ggcagactta ttggctctag ctgctgccag
aggaggaaga gtgcatagag 1020
ccccagaacc atataaagcc ttgagagact tgaaggaagc
aagaggtttg ttagctaaag 1080
atttgagcgt attagccttg agggaaggtt taggactacc
accaggtgac gacccaatgt 1140
tgcttgctta tttgcttgat ccatcaaaca caacacctga
aggagtagct agaaggtatg 1200
gtggagaatg gactgaagag gctggagaga gagccgctct
atctgagaga ttgtttgcta 1260
atttgtgggg tagacttgaa ggtgaggaaa gattgttgtg
gctatacagg gaagtagaaa 1320
ggccattatc tgcagtattg gctcatatgg aggccacagg
cgttagatta gatgttgctt 1380
acttaagagc tttgtcattg gaagtcgccg aagaaattgc
aagacttgaa gctgaggtgt 1440
tcagacttgc cggtcatcca ttcaatctta atagtagaga
ccagctagaa agagtgttat 1500
tcgacgagct tggattacca gcaatcggaa agacagaaaa
gactggtaaa aggtctacaa 1560
gtgccgccgt tttggaagca ttgagggagg cccatccaat
tgttgaaaag atattgcagt 1620
atagagaatt gacaaaatta aaatcaactt atatcgatcc
acttccagac ttaatccatc 1680
caaggacagg cagattacac accaggttta accagaccgc
aactgctaca ggcagattat 1740
catcttcaga tcctaactta caaaacattc ctgtaaggac
tccactaggt cagagaatta 1800
gaagagcttt tatcgctgag gaaggctggt tgcttgtggc
tttagattat agtcaaattg 1860
agttaagggt cttggctcac ttgtctggtg acgaaaatct
tatcagagtt tttcaggaag 1920
gtagggatat acatacagag accgcctcat ggatgtttgg
tgttccaagg gaggccgtcg 1980
atccactaat gaggagagca gccaaaacta ttaactttgg
agtattgtat ggtatgagtg 2040
ctcacagatt atcccaagag ttggccatcc cttacgagga
agcacaggct tttatagaaa 2100
ggtatttcca gtcttttcct aaggttagag catggattga
aaagacacta gaggaaggta 2160
ggaggagggg ttacgtggag accttattcg gaagaaggag
atacgttcca gacttagagg 2220
ctagagtgaa atcagttaga gaagccgcag agagaatggc
attcaatatg ccagtacaag 2280
gcactgccgc agatttgatg aaactagcca tggttaagct
atttccaaga ttggaagaaa 2340
tgggagctag aatgctatta caagttcatg atgaacttgt
tttagaggct cctaaagaaa 2400
gggctgaagc agtggccagg ttagctaaag aagtaatgga
gggcgtttac ccattggcag 2460
ttcctttaga ggtcgaagtg ggtataggtg aagactggct
atctgcaaag gaataagaat 2520
tc
2522
配列番号81
atgattttag atgtggatta cataactgaa gaaggaaaac
ctgttattag gctattcaaa 60
aaagagaacg gaaaatttaa gatagagcat gatagaactt
ttagaccata catttacgct 120
cttctcaggg atgattcaaa gattgaagaa gttaagaaaa
taacggggga aaggcatgga 180
aagattgtga gaattgttga tgtagagaag gttgagaaaa
agtttctcgg caagcctatt 240
accgtgtgga aactttattt ggaacatccc caagatgttc
ccactattag agaaaaagtt 300
agagaacatc cagcagttgt ggacatcttc gaatacgata
ttccatttgc aaagagatac 360
ctcatcgaca aaggcctaat accaatggag ggggaagaag
agctaaagat tcttgccttc 420
gatatagaaa ccctctatca cgaaggagaa gagtttggaa
aaggcccaat tataatgatt 480
agttatgcag atgaaaatga agcaaaggtg attacttgga
aaaacataga tcttccatac 540
gttgaggttg tatcaagcga gagagagatg ataaagagat
ttctcaggat tatcagggag 600
aaggatcctg acattatagt tacttataat ggagactcat
tcgacttccc atatttagcg 660
aaaagggcag aaaaacttgg gattaaatta accattggaa
gagatggaag cgagcccaag 720
atgcagagaa taggcgatat gacggctgta gaagtcaagg
gaagaataca tttcgacttg 780
tatcatgtaa taacaaggac aataaatctc ccaacataca
cactagaggc tgtatatgaa 840
gcaatttttg gaaagccaaa ggagaaggta tacgccgacg
agatagcaaa agcctgggaa 900
agtggagaga accttgagag agttgccaaa tactcgatgg
aagatgcaaa ggcaacttat 960
gaactcggga aagaattcct tccaatggaa attcagcttt
caagattagt tggacaacct 1020
ttatgggatg tttcaaggtc aagcacaggg aaccttgtag
agtggttctt acttaggaaa 1080
gcctacgaaa gaaacgaagt agctccaaac aagccaagtg
aagaggagta tcaaagaagg 1140
ctcagggaga gctacacagg tggattcgtt aaagagccag
aaaaggggtt gtgggaaaac 1200
atagtatacc tagattttag agccctatat ccctcgatta
taattaccca caatgtttct 1260
cccgatactc taaatcttga gggatgcaag aactatgata
tcgctcctca agtaggccac 1320
aagttctgca aggacatccc tggttttata ccaagtctct
tgggacattt gttagaggaa 1380
agacaaaaga ttaagacaaa aatgaaggaa actcaagatc
ctatagaaaa aatactcctt 1440
gactatagac aaaaagcgat aaaactctta gcaaattctt
tctacggata ttatggctat 1500
gcaaaagcaa gatggtactg taaggagtgt gctgagagcg
ttactgcctg gggaagaaag 1560
tacatcgagt tagtatggaa ggagctcgaa gaaaagtttg
gatttaaagt cctctacatt 1620
gacactgatg gtctctatgc aactatccca ggaggagaaa
gtgaggaaat aaagaaaaag 1680
gctctagaat ttgtaaaata cataaattca aagctccctg
gactgctaga gcttgaatat 1740
gaagggtttt ataagagggg attcttcgtt acgaagaaga
ggtatgcagt aatagatgaa 1800
gaaggaaaag tcattactcg tggtttagag atagttagga
gagattggag tgaaattgca 1860
aaagaaactc aagctagagt tttggagaca atactaaaac
acggagatgt tgaagaagct 1920
gtgagaatag taaaagaagt aatacaaaag cttgccaatt
atgaaattcc accagagaag 1980
ctcgcaatat atgagcagat aacaagacca ttacatgagt
ataaggcgat aggtcctcac 2040
gtagctgttg caaagaaact agctgctaaa ggagttaaaa
taaagccagg aatggtaatt 2100
ggatacatag tacttagagg cgatggtcca attagcaata
gggcaattct agctgaggaa 2160
tacgatccca aaaagcacaa gtatgacgca gaatattaca
ttgagaacca ggttcttcca 2220
gcggtactta ggatattgga gggatttgga tacagaaagg
aagacctcag ataccaaaag 2280
acaagacaag tcggcctaac ttcctggctt aacattaaaa
aatcctag
2328
配列番号82
atgatcctcg atacagacta cataactgag gatggaaagc
ccgtcatcag gatcttcaag 60
aaggagaacg gcgagttcaa aatagactac gacagaaact
ttgagccata catctacgcg 120
ctcttgaagg acgactctgc gattgaggac gtcaagaaga
taactgccga gaggcacggc 180
actaccgtta gggttgtcag ggccgagaaa gtgaagaaga
agttcctagg caggccgata 240
gaggtctgga agctctactt cactcacccc caggacnnnc
ccgcaatcag ggacaagata 300
aaggagcatc ctgccgttgt ggacatctac gagtacgaca
tccccttcgc gaagcgctac 360
ctcatagaca aaggcttaat cccgatggag ggcgacgagg
aacttaagat gctcgccttc 420
gacatcgaga cgctctatca cgagggcgag gagttcgccg
aagggcctat cctgatgata 480
agctacgccg acgaggaagg ggcgcgcgtt attacctgga
agaatatcga ccttccctat 540
gtcgacgtcg tttccaccga gaaggagatg ataaagcgct
tcctcaaggt cgtcaaggaa 600
aaggatcccg acgtcctcat aacctacaac ggcgacaact
tcgacttcgc ctacctcaag 660
aagcgctccg agaagctcgg agtcaagttc atcctcggaa
gggaagggag cgagccgaaa 720
atccagcgca tgggcgatcg ctttgcggtg gaggtcaagg
gaaggattca cttcgacctc 780
taccccgtca ttaggagaac gattaacctc cccacttaca
cccttgaggc agtatatgaa 840
gccatctttg gacagccgaa ggagaaggtc tacgctgagg
agatagcgca ggcctgggaa 900
acgggcgagg gattagaaag ggtggcccgc tactcgatgg
aggacgcaaa ggtaacctat 960
gaactcggaa aagagttctt ccctatggaa gcccagctct
cgcgcctcgt aggccagagc 1020
ctctgggatg tatctcgctc gagtaccgga aacctcgtcg
agtggttttt gctgaggaag 1080
gcctacgaga ggaatgaact tgcaccaaac aagccggacg
agagggagct ggcaagaaga 1140
agggagagct acgcgggtgg atacgtcaag gagcccgaaa
ggggactgtg ggagaacatc 1200
gtgtatctgg acttccgctc cctgtatcct tcgataataa
tcacccataa cgtctcccct 1260
gatacactca acagggaggg ttgtgaggag tacgacgtgg
ctcctcaggt aggccataag 1320
ttctgcaagg acttccccgg cttcatccca agcctcctcg
gagacctctt ggaggagaga 1380
cagaaggtaa agaagaagat gaaggccact atagacccaa
tcgagaagaa actcctcgat 1440
tacaggcaac gagcaatcaa aatccttgct aatagcttct
acggttacta cggctatgca 1500
aaggcccgct ggtactgcaa ggagtgcgcc gagagcgtta
ccgcttgggg caggcagtac 1560
atcgagacca cgataaggga aatagaggag aaatttggct
ttaaagtcct ctacgcggac 1620
acagatggat ttttcgcaac aatacctgga gcggacgccg
aaaccgtcaa aaagaaggca 1680
aaggagttcc tggactacat caacgccaaa ctgcccggcc
tgctcgaact cgaatacgag 1740
ggcttctaca agcgcggctt cttcgtgacg aagaagaagt
acgcggttat agacgaggag 1800
gacaagataa cgacgcgcgg gcttgaaata gttaggcgtg
actggagcga gatagcgaag 1860
gagacgcagg cgagggttct tgaggcgata ctaaagcacg
gtgacgttga agaagcggta 1920
aggattgtca aagaggttac ggagaagctg agcaagtacg
aggttccacc ggagaagctg 1980
gtcatctacg agcagataac ccgcgacctg aaggactaca
aggccaccgg gccgcatgtg 2040
gctgttgcaa aacgcctcgc cgcaaggggg ataaaaatcc
ggcccggaac ggtcataagc 2100
tacatcgtgc tcaaaggctc gggaaggatt ggggacaggg
ctataccctt tgacgaattt 2160
gacccggcaa agcacaagta cgatgcagaa tactacatcg
agaaccaggt tcttccagct 2220
gtggagagga ttctgagggc ctttggttac cgtaaagaag
atttaaggta tcagaaaacg 2280
cggcaggttg gcttgggggc gtggctaaaa cctaagacat
ga
2322
・配列番号1の塩基配列からなる遺伝子に対応するアミノ酸配列
MRGMLPLFEP KGRVLLVDGH HLAYRTFHAL KGLTTSRGEP
VQAVYGFAKS LLKALKEDGD 60
AVIVVFDAKA PSFRHEAYGG YKAGRAPTPE DFPRQLALIK
ELVDLLGLAR LEVPGYEADD 120
VLASLAKKAE KEGYEVRILT ADKDLYQLLS DRIHVLHPEG
YLITPAWLWE KYGLRPDQWA 180
DYRALTGDES DNLPGVKGIG EKTARKLLEE WGSLEALLKN
LDRLKPAIRE KILAHMDDLK 240
LSWDLAKVRT DLPLEVDFAK RREPDRERLR AFLERLEFGS
LLHEFGLLES PKALEEAPWP 300
PPEGAFVGFV LSRKEPMWAD LLALAAARGG RVHRAPEPYK
ALRDLKEARG LLAKDLSVLA 360
LREGLGLPPG DDPMLLAYLL DPSNTTPEGV ARRYGGEWTE
EAGERAALSE RLFANLWGRL 420
EGEERLLWLY REVERPLSAV LAHMEATGVR LDVAYLRALS
LEVAEEIARL EAEVFRLAGH 480
PFNLNSRDQL ERVLFDELGL PAIGKTEKTG KRSTSAAVLE
ALREAHPIVE KILQYRELTK 540
LKSTYIDPLP DLIHPRTGRL HTRFNQTATA TGRLSSSDPN
LQNIPVRTPL GQRIRRAFIA 600
EEGWLLVALD YSQIELRVLA HLSGDENLIR VFQEGRDIHT
ETASWMFGVP REAVDPLMRR 660
AAKTINFGVL YGMSAHRLSQ ELAIPYEEAQ AFIERYFQSF
PKVRAWIEKT LEEGRRRGYV 720
ETLFGRRRYV PDLEARVKSV REAAERMAFN MPVQGTAADL
MKLAMVKLFP RLEEMGARML 780
LQVHDELVLE APKERAEAVA RLAKEVMEGV YPLAVPLEVE
VGIGEDWLSA
KE 832
・配列番号81の塩基配列からなる遺伝子に対応するアミノ酸配列
MILDVDYITE EGKPVIRLFK KENGKFKIEH DRTFRPYIYA
LLRDDSKIEE VKKITGERHG 60
KIVRIVDVEK VEKKFLGKPI TVWKLYLEHP QDVPTIREKV
REHPAVVDIF EYDIPFAKRY 120
LIDKGLIPME GEEELKILAF DIETLYHEGE EFGKGPIIMI
SYADENEAKV ITWKNIDLPY 180
VEVVSSEREM IKRFLRIIRE KDPDIIVTYN GDSFDFPYLA
KRAEKLGIKL TIGRDGSEPK 240
MQRIGDMTAV EVKGRIHFDL YHVITRTINL PTYTLEAVYE
AIFGKPKEKV YADEIAKAWE 300
SGENLERVAK YSMEDAKATY ELGKEFLPME IQLSRLVGQP
LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK 360
AYERNEVAPN KPSEEEYQRR LRESYTGGFV KEPEKGLWEN
IVYLDFRALY PSIIITHNVS 420
PDTLNLEGCK NYDIAPQVGH KFCKDIPGFI PSLLGHLLEE
RQKIKTKMKE TQDPIEKILL 480
DYRQKAIKLL ANSFYGYYGY AKARWYCKEC AESVTAWGRK
YIELVWKELE EKFGFKVLYI 540
DTDGLYATIP GGESEEIKKK ALEFVKYINS KLPGLLELEY
EGFYKRGFFV TKKRYAVIDE 600
EGKVITRGLE IVRRDWSEIA KETQARVLET ILKHGDVEEA
VRIVKEVIQK LANYEIPPEK 660
LAIYEQITRP LHEYKAIGPH VAVAKKLAAK GVKIKPGMVI
GYIVLRGDGP ISNRAILAEE 720
YDPKKHKYDA EYYIENQVLP AVLRILEGFG YRKEDLRYQK
TRQVGLTSWL NIKKS 775
・配列番号82の塩基配列からなる遺伝子に対応するアミノ酸配列
MILDTDYITE DGKPVIRIFK KENGEFKIDY DRNFEPYIYA
LLKDDSAIED VKKITAERHG 60
TTVRVVRAEK VKKKFLGRPI EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI
KEHPAVVDIY EYDIPFAKRY 120
LIDKGLIPME GDEELKMLAF DIETLYHEGE EFAEGPILMI
SYADEEGARV ITWKNIDLPY 180
VDVVSTEKEM IKRFLKVVKE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK
KRSEKLGVKF ILGREGSEPK 240
IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE
AIFGQPKEKV YAEEIAQAWE 300
TGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS
LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK 360
AYERNELAPN KPDERELARR RESYAGGYVK EPERGLWENI
VYLDFRSLYP SIIITHNVSP 420
DTLNREGCEE YDVAPQVGHK FCKDFPGFIP SLLGDLLEER
QKVKKKMKAT IDPIEKKLLD 480
YRQRAIKILA NSFYGYYGYA KARWYCKECA ESVTAWGRQY
IETTIREIEE KFGFKVLYAD 540
TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLDYINAK LPGLLELEYE
GFYKRGFFVT KKKYAVIDEE 600
DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV
RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL 660
VIYEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS
YIVLKGSGRI GDRAIPFDEF 720
DPAKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT
RQVGLGAWLK
PKT 773
宿主に対して上述した耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を導入するためのDNA構築物について説明する。本発明の耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を用いて宿主細胞に形質転換して、このDNAによってコードされるタンパク質を発現させることにより、そのDNAポリメラーゼ活性により宿主細胞においてDNAポリメラーゼを産生させることができる。
所望のプロモーター下に上述した耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子が導入されたか否かの確認は、PCR法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、導入部位特異的プライマーによりPCRを行い、PCR産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでPCRを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
(2)PCR法
本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用いるPCR法としては、検出対象生物を検出するための目的遺伝子の増幅のためのPCR法であれば種々のPCR法を利用できる。
a.インターカレーターを用いたリアルタイムPCR法であって、以下の手順を含むPCR法。
(a1)ターゲットとなるPCR増幅産物のTm値がプライマーダイマー自体の値より高くなるようにプライマーを設計する。
(a2)リアルタイムPCRの蛍光検出時の温度をそれらの中間に設定する。
b.試料中の標的核酸内における配列のsemi−nested増幅のための方法であって、以下の段階を含んで成るPCR法。
(b1)外側のPCR用プライマーペア、およびsemi−nestedプライマーを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合する。
(b2)外側の増幅配列を提供するため、段階b1の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつsemi−nestedプライマーが働かない温度での増幅反応において処理する。
(b3)semi−nestedされた増幅産物を提供するため、段階b2の混合物を、外側のPCR用プライマーの片方とsemi−nestedプライマーのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
c.試料中の標的核酸内における配列のnested増幅のための方法であって、以下の段階を含んで成るPCR法。
(c1)外側のPCR用プライマーペア、およびnestedプライマーペアを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合。
(c2)外側の増幅配列を提供するため、段階(c1)の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつnestedプライマーペアが働かない温度での増幅反応において処理する。
(c3)nestedされた増幅産物を提供するため、段階(c2)の混合物を、nestedプライマーペアのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
(a1)ターゲットとなるPCR増幅産物のTm値がプライマーダイマー自体の値より高くなるようにプライマーを設計する。
(a2)リアルタイムPCRの蛍光検出時の温度をそれらの中間に設定する。
(2−3)本発明の検出法および定量法にかかるPCR変法は、試料中の標的核酸内における配列のsemi−nested増幅のための方法で、以下の段階を含んで成るPCR法である。
(b1)外側のPCR用プライマーペア、およびsemi−nestedプライマーを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合し、
(b2)外側の増幅配列を提供するため、段階b1の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつsemi−nestedプライマーが働かない温度での増幅反応において処理する。
(b3)semi−nestedされた増幅産物を提供するため、段階b2の混合物を、外側のPCR用プライマーの片方とsemi−nestedプライマーのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
(C)検出法および定量法としてのPCR変法としての、試料中の標的核酸内における配列のnested増幅のための方法で、以下の段階を含んで成るPCR法。
(c1)外側のPCR用プライマーペア、およびnestedプライマーペアを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合する。
(c2)外側の増幅配列を提供するため、段階c1の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつ干渉プライマーペアの阻害作用でnestedプライマーペアが働かない温度での増幅反応において処理する。
(c3)nestedされた増幅産物を提供するため、段階c2の混合物を、nestedプライマーペアのみがアニールする温度か、或いは伸長させる伸長時間での増幅反応において処理する。
Dimer法は、従来のプライマーダイマーの形成抑制方法とは異なり、プライマーダイマーのみを非表示とする手法である。その手法とは、「プライマーダイマーは増幅産物として小さいが故に、そのTm値が低い傾向にある」ことを考慮し、
(a1)ターゲットとなるPCR増幅産物のTm値が、プライマーダイマーのTm値より高値になるようにプライマーを設計する。
(a2)リアルタイムPCRの蛍光検出時の温度をそれらの中間値に設定する。
との手順でインターカレーターを用いたリアルタイムPCRを行う方法である。
)などの蛍光色素を利用したリアルタイムPCRが挙げられる。
Step nested PCR)。このOne Step nested PCR法では、簡単な設計による“nestedプライマー”を加えれば直ぐに施行できるため、誰でも簡単に実施できる。
B法:試料中の標的核酸内における配列のsemi-nested増幅のための方法で、以下の段階を含んで成るPCR変法。
(b1)外側のPCR用プライマーペア、およびsemi-nestedプライマーを含む増幅反応混合物中に試料を混合し、
(b2)外側の増幅配列を提供するため、段階b1の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつsemi-nestedプライマーがアニールしない温度での増幅反応において処理する。
(b3)semi-nestedされた増幅産物を提供するため、段階b2の混合物を、外側のPCR用プライマーの両方とsemi-nestedプライマーとがアニールするが、nestedされた内側のPCR増幅産物のみがdenatureする温度での増幅反応において処理する。或いはnestedされた内側のPCR増幅産物のみが伸長できる伸長時間の増幅反応において処理する。
B法において、増幅反応混合物は、3種類のプライマーから成る。すなわち、第1のプライマーは外側のPCR用プライマーペアの一方で、第2のプライマーはsemi-nestedプライマーであり、第3のプライマーは外側のPCR用プライマーペアのもう一方で、かつsemi-nestedプライマーともペアとなるものである。
B法の段階a1において、プライマーが一定の温度で増幅反応混合物中に存在していることが好ましい。
(c1)外側のPCR用プライマーペア、およびnestedプライマーペアを含む増幅反応混合物中に試料を混合する。
(c2)外側の増幅配列を提供するため、段階c1の増幅反応混合物を、テンプレートとなるDNA上において、外側のPCR用プライマーペアをアニールおよび伸長させ、かつnestedプライマーペアがアニールしない温度での増幅反応において処理する。
(c3)nestedされた増幅産物を提供するため、段階c2の混合物を、nested された内側のPCR増幅産物のみがdenatureする温度での増幅反応において処理する。或いはnestedされた内側のPCR増幅産物のみが伸長できる伸長時間での増幅反応において処理する。
以下に示す通常のPCR条件設定では、蛍光検出ポイントは伸長反応(extension)後の72℃に設定されている。
・Target Temperature:94℃、55℃、72℃
・Incubation Time: 10秒
・Temperature Transition Rate: 20.00 [℃/s]
・Cycle Number: 60
すると、図13に示す増幅曲線のように、蒸留水(distilled water:D.W.)でプライマーダイマー(pd)が検出されてしまう。この時、例えばE.Coli検出時の融解曲線(melting curve)を見ると、プライマーダイマーのTm値は76℃前後、目的(E. coli)のPCR増幅産物のTm値は91℃前後である(図14)。
・Target Temperature:94℃、55℃、72℃、86℃
・Incubation Time:10秒(94℃、55℃、72℃);1秒(86℃)
・Temperature Transition Rate: 20.00 [℃/s]
・Cycle Number: 60
すると、プライマーダイマーが全く検出されない。つまり、プライマーダイマーは非表示となるため、本発明の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と組み合わせると、図15(A)のように蒸留水(D.W.)で全く増幅しない増幅曲線を得ることが出来る。
以下の様なプライマーを設計する(図11(A)参照)。
(a)外側のPCR産物(増幅産物I)の、ForwardおよびReverseプライマーのそれぞれのTm値は同じ、或いは近いものとする。
(b)外側のPCR産物のどちらか片方のプライマーとsemi-nestedとなるようなプライマー(プライマーII)を内側に設定する。
(c)semi-nestedプライマーは、外側のPCR産物のプライマーのTm値より5〜20℃低いTm値となるように設計する。
(d)外側のPCR産物(増幅産物I)のTm値が89℃以上となるように、増幅産物Iが400bp程度以上となるプライマーを設計する。
(e)semi-nested PCR産物(増幅産物II)のTm値が86℃〜87℃となるように、増幅産物IIが100bp程度となるプライマーを設計する。
(a)外側のPCR産物(増幅産物I)の、ForwardおよびReverseプライマーのそれぞれのTm 値は同じ、或いは近いものとする。
(b)増幅産物IのプライマーのTm値と比較し、nestedとなる2つのプライマー(プライマーII)のTm値は十分(5〜20℃)低く設定する。
(c)増幅産物IのTm値が89℃以上となるように、増幅産物Iが500bp程度以上となるプライマーを設計する。
(d)増幅産物IIのTm値が86℃〜87℃となるように、増幅産物IIが100bp程度となるプライマーを設計する。
(e)増幅産物III、IVそれぞれのTm値が89℃以上となるように、増幅産物III、IVそれぞれが300bp程度以上となるプライマーを設計する。
(検出方法)
本発明にかかる検体中の検出対象生物を検出する方法は、
以下の工程:
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
(2)前記増幅工程における増幅産物中の前記目的遺伝子の増幅産物を検出する検出工程と、
を有することを特徴とする。
(1)目的遺伝子増幅産物の融解温度(TmA)が、目的外遺伝子の増幅産物の融解温度(TmB)よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
(2)増幅産物の検出を、TmAとTmBとの間の温度で行う
ことにより設定し、目的遺伝子の増幅産物のみを検出する方法が好ましい。
本発明にかかる検体中の検出対象生物を定量する方法は以下の工程:
(1)検体から調製したDNAと、検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
(2)前記増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物を定量する定量工程と、
を有する。
更に、増幅産物の定量を非表示法により行うことにより、簡便かつ高感度での定量が可能となる。この非表示法は、目的遺伝子の増幅産物を検出可能状態とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出状態とする条件下で、増幅産物の検出を行う方法である。
(1)前記目的遺伝子増幅産物の融解温度(TmA)が、前記目的外遺伝子の増幅産物の融解温度(TmB)よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
(2)前記増幅産物の定量を、TmAとTmBとの間の温度で行う
ことにより設定する。
dimer)の形成を完全に阻害することは非常に難しく、各種プライマーダイマー形成抑制方法を用いてもPCRサイクル数の増加に応じてプライマーダイマーが検出されてしまう場合がある。その結果、リアルタイムPCRによる定量測定の感度低下の要因となっている。また、定性検査においても測定毎にTm値(融解温度:melting temperature)をチェックしてプライマーダイマーによる「偽陽性」を除外する手法をとることが必要となる場合がある。
(1)ターゲットとなるPCR増幅産物のTm値が、プライマーダイマーのTm値より高値になるようにプライマーを設計する。
(2)リアルタイムPCRの増幅産物検出時の温度をそれらの中間値に設定する。
具体的には、
(1)既存の設計方法でプライマーダイマーが生じ難いプライマーを設計する。
(2)プライマー自体のTm値を60℃以下になるように設計する。
(3)最近接塩基法で計算することにより、ターゲットとなるPCR増幅産物のTm値が87℃程度かそれ以上になるように設計する。
増幅産物の量から検出対象生物の量(存在しない場合も含む)の判定には、増幅を行った際の条件(プロトコール)での既知の検出対象生物量から求めた検量線に基づいて行う方法が好適に利用できる。例えば、ある特定のプロトコールで描いた検量線で、検出限界(感度)が0.1 CFU/mlで35サイクルであれば、35サイクルのPCR反応を行って、検量線で示される基準に基づいて検出対象生物の量を算出することができる。なお、プロトコール中に検体の濃縮ステップを加えたり、エタノール沈殿処理を加えたりすれば、検出限界(感度)を更にあげることができる(例えば60サイクル位まで)。そうすると、感度も例えば0.000001CFU/mlと非常に高く設定可能となる。また、設定できる検出感度は予め算出しておくことが可能である。例えば、「検出対象の高感度定量方法」による生活用水の定量では、細菌のユニバーサルプライマーのPCR検出感度が10 fg/μl, 真菌のユニバーサルプライマーのPCR検出感度が10 pg/μlであるので、CFU/mlとの換算式を用い、更に最初に検体50mlをペレット化してDNA抽出することを加味すると、
細菌:3.0×10‐1 CFU/ml
真菌:2.8 CFU/ml
となる。なお、プロトコールを変えることで、検出感度を変えることも可能である。
増幅産物(ホットスタート法を用いる場合も含む)をアガロースゲルなどで展開して、その量を蛍光検出における蛍光強度などによって、検出対象生物の定量を簡便に行うことも可能である。
本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼは、以下の方法にも好適に用いることができる。
(I)検体中の細菌の存在の有無を判定する方法において、
以下の工程:
(1)前記細菌に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)と、真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼを含む調製物と、を用いて核酸増殖反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における増幅産物を可視化する工程と、
を有し、
前記プライマー(B)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー
であることを特徴とする検体中の細菌の存在有無を判定する方法。
以下の工程:
(1)前記細菌に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)と、真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼを含む調製物と、を用いて核酸増殖反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における増幅産物を数値化する工程と、
を有し、
前記プライマー(B)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー
であることを特徴とする検体中の細菌の存在量を把握する方法。
上記の検体中の検出対象生物の定量方法は、以下の検出対象生物の定量かつ同定を行う方法に好適に適用できる。
(A)以下の工程:
(1)前記検体から調製したDNAと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)および(M)と、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
(3)前記検体から調製したDNAと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(F)と、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
(4)前記第二の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー(B)、(F)及び(M)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(F)全ての真菌の18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(M)メチリシン耐性を示すmecA遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であることを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
(1)前記検体から調製したDNAと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)と、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
(3)前記検体から調製したDNAと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(F)と、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
(4)前記第二の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程および前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
(5)前記検体から調製したDNAと、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(M)と、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第三の増幅工程と、
(6)前記第三の増幅工程における増幅産物の融解温度(Tm値)を前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)に基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第三の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー(B)、(F)及び(M)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、各プライマーごとに、は塩基配列の全部またはその1/3以上を含むプライマーから選択でき、
(F)全ての真菌の18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、各プライマーごとに、塩基配列の全部またはその1/3以上を含むプライマーから選択でき、
(M)メチリシン耐性を示すmecA遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であることを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。
従って、以下の計算式:
(1)細菌の16SrRNAは、ほぼ全ての細菌に共通の塩基配列領域(20〜40塩基)を7〜10ヶ所もつことが知られている。
(2)遺伝子増幅領域は、約150〜200塩基であり、プライマーを設定した共通保存領域以外は、それぞれの細菌に固有の塩基配列を持つ。
(4)非特異的な遺伝子産物が生じ、目的のTm値に近い値を示す場合、偽陽性のリスクが生じる。
<組み合わせグループ1>
(1−1)全ての細菌の16SrRNA遺伝子に共通な配列部位から5カ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する(増幅産物は4つ)。
(B1)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の809番目から905番目に相当する97塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 1:Bac.1)。
・配列番号80.GATTAGATACCCTGGTAGTCCACG (24mer)フォワード
・配列番号2.CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT (21mer) リバース
(B2)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の927番目から1092番目に相当する166塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 2:Bac.2)。
・配列番号3.AAACTCAAAGGAATTGACGGG (21mer)フォワード
・配列番号4.CGCTCGTTGCGGGAC (15mer) リバース
(B3)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の1108番目から1218番目に相当する111塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 3:Bac.3)。
・配列番号5.GTCCCGCAACGAGCG (15mer)フォワード
・配列番号6.ATTGTAGCACGTGTGTAGCCC (21mer) リバース
(B4)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の1240番目から1369番目に相当する130塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 4:Bac.4)。
・配列番号7.GGGCTACACACGTGCTACAAT (21mer)フォワード
・配列番号8.CCGGGAACGTATTCACC (17mer) リバース。
(F1)真菌の18SrRNA遺伝子のプライマーセット(fungi primer:Fungi)
・配列番号9.GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG (28mer) フォワード
・配列番号10.TAACTGCAACAACTTTAATATACGC (25mer) リバース。
(M1)メチシリン耐性を示すmecA遺伝子のプライマーセット(mecA primer:mecA)
・配列番号13.ATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTA (30mer) フォワード
・配列番号14.CCAATAACTGCATCATCTTTATAGCC (26mer) リバース。
(2−1)全ての細菌の16SrRNA遺伝子に共通な配列部位から10カ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
(B5)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の8番目から345番目に相当する338塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 5:Bac.5)。
・配列番号15.AGAGTTTGATCATGGCTCAG (20mer)フォワード
・配列番号16.CGTAGGAGTCTGGACCGT (18mer) リバース
(B6)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の336番目から534番目に相当する199塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 6:Bac.6)。
・配列番号17.GACTCCTACGGGAGGCA (17mer)フォワード
・配列番号18.TATTACCGCGGCTGCTG (17mer) リバース
(B7)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の519番目から805番目に相当する287塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 7:Bac.7)。
・配列番号19.AGCAGCCGCGGTAATA (16mer)フォワード
・配列番号20.GGACTACCAGGGTATCTAATCCT (23mer) リバース
(B8)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の780番目から960番目に相当する181塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 8:Bac.8)。
・配列番号21.AACAGGATTAGATACCCTGGTAG (23mer)フォワード
・配列番号22.AATTAAACCACATGCTCCACC (21mer) リバース
(B9)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の951番目から1070番目に相当する120塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 9:Bac.9)。
・配列番号23.TGGTTTAATTCGATGCAACGC (21mer)フォワード
・配列番号24.GAGCTGACGACAGCCAT (17mer) リバース
(B10)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の1084番目から1192番目に相当する109塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 10:Bac.10)。
・配列番号25.TTGGGTTAAGTCCCGC (16mer)フォワード
・配列番号26.CGTCATCCCCACCTTC (16mer) リバース
(B11)大腸菌(E. coli)の16SrRNA遺伝子の1220番目から1385番目に相当する166塩基のDNAを増幅するプライマーセット(bacteria primer 11:Bac.11)。
・配列番号27.GGCTACACACGTGCTACAAT (20mer)フォワード
・配列番号28.CCGGGAACGTATTCACC (17mer) リバース。
・配列番号29.GTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGC (26mer) フォワード
・配列番号30.GGTAGCCGTTTCTCAGG (17mer) リバース
(F3)カンジダ菌(C. Albicans)の18SrRNA遺伝子の390番目から551番目に相当する162塩基のDNAを増幅するプライマーセット(fungi primer 3:Fungi 3)
・配列番号31.GCCTGAGAAACGGCTACCA (19mer) フォワード
・配列番号32.CCTCCAATTGTTCCTCGTTAAG (22mer) リバース
(F4)カンジダ菌(C. Albicans)の18SrRNA遺伝子の531番目から762番目に相当する232塩基のDNAを増幅するプライマーセット(fungi primer 4:Fungi 4)
・配列番号33.TTAACGAGGAACAATTGGAGGG (22mer) フォワード
・配列番号34.GCCTGCTTTGAACACTCTAATTT (23mer) リバース
(F5)カンジダ菌(C. Albicans)の18SrRNA遺伝子の989番目から1134番目に相当する146塩基のDNAを増幅するプライマーセット(fungi primer 5:Fungi 5)
・配列番号35.ATACCGTCGTAGTCTTAACCA (21mer) フォワード
・配列番号36.GTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCT (24mer) リバース
(F6)カンジダ菌(C. Albicans)の18SrRNA遺伝子の1260番目から1428番目に相当する169塩基のDNAを増幅するプライマーセット(fungi primer 6:Fungi 6)
・配列番号37.CATGGCCGTTCTTAGTTGG (19mer) フォワード
・配列番号38.GGGCATCACAGACCTGTT (18mer) リバース
(F7)カンジダ菌(C. Albicans)の18SrRNA遺伝子の1414番目から1630番目に相当する217塩基のDNAを増幅するプライマーセット(fungi primer 7:Fungi 7)
・配列番号39.AGGTCTGTGATGCCCTTAG (19mer) フォワード
・配列番号40.CGGGCGGTGTGTACAAA (17mer) リバース
(2−3) メチシリン耐性を示すmecA遺伝子のプライマーは、LightCycler Probe Design 2 ソフトウェアを用い、最もスコアが高いプライマーデザインを選定する。
(M2)メチシリン耐性を示すmecA遺伝子のプライマーセット(mecA primer 2:mecA2)
・配列番号43.CAAACTACGGTAACATTGATCGC (23mer) フォワード
・配列番号44.ATGTATGCTTTGGTCTTTCTGC (22mer) リバース
本発明において、Tm値とは、PCR産物の50%がその相補鎖と解離する時の温度である。また、最近接塩基法によるTm値計算式の「Tm値は塩基配列で決まる」という理論的根拠を元に、菌種ごとの塩基配列の違いをTm値の組合せの違いとして起因菌同定に応用することができる。従って、「Tm値から測定誤差の影響を排除する」ことが正確に同定する上で最も重要となる。このため、以下の方法で測定誤差の影響を排除する。
(i)検体からDNAを調製する。
(ii)得られたDNAに対し、先に挙げた細菌、抗生剤耐性遺伝子、および真菌のプライマーセットを用いて遺伝子増幅後、それぞれのTm値を一時に測定し、細菌、抗生剤耐性遺伝子、および真菌のTm値の組合せを得る。
(iii)真菌であるか否かを判定する。
[上記(ii)のTm値の組合せの中で、全ての真菌の18SrRNA遺伝子の一領域〜複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た真菌に特異的なTm値を先ず解析することで、真菌であるか否か、或いは真菌の種類を判定する。]
(iv)抗生剤耐性遺伝子の有無を判定する。
[上記(ii)のTm値の組合せの中で、メチシリン耐性を示すmecA遺伝子など、その時の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いて得た抗生剤耐性菌に固有の遺伝子増幅を解析することで、抗生剤耐性遺伝子の有無を判定する。]
(v)どの細菌であるか絞り込む。
[上記(ii)のTm値の組合せの中で、全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た細菌に特異的なTm値の組合せを解析することで、細菌の種属を同定する。]
細菌の絞り込みは、具体的には、細菌のTm値の一つに注目して(場合によっては、標準Tm値で先ず補正する)、そのTm値に値の近い菌種に範囲を狭め、順次Tm値の差を取って絞り込む、または、直接、標準Tm値を含む、各Tm値間の差をとって、その差の組み合わせをフィンガープリントとして同定する。或いは、「“平均値との相対値”の組合せの近似したものが検出対象生物である」とする同定アルゴリズムを利用する。
[1]真菌の18SrRNA遺伝子の全ての真菌に共通、且つ真菌特異的に検出するプライマー1つと、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
[2]メチシリン耐性を示すmecA遺伝子など、その時の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に検出するプライマー各々1つずつと、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物または細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
[3]細菌の16SrRNA遺伝子の全ての細菌に共通、且つ細菌特異的に検出するプライマー1つと、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
を用いてPCRを行い、アガロース・ゲルに電気泳動して目的サイズのバンドを確認する方法がある。
(1)4〜18個、好ましくは4〜16個のプライマーセットを元にリアルタイムPCRなどの遺伝子増幅を実施し、得られるTm値をデータベースと照合することにより、抗菌薬選択に必要な起因菌の菌種同定、および抗生剤耐性遺伝子の有無が確認出来る。
(2)血液検体の場合、DNA抽出からTm値の解析、そして同定までに要する時間は約2時間であり、迅速診断が可能となる。
(3)DNAを抽出する血液検体の量を一定とした場合、菌量の相対量を定量でき、抗菌薬投与後の治療効果のモニタリングが可能となる。
(4)細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を使い分けることで、非特異的増幅などの偽陽性のリスクをほぼ完全に無くすことが出来る。
セットであって、
検体から調製したDNAを増幅するための本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、を少なくとも用いて検体中に含まれる検出対象生物の定量及び/または同定を行うためのセットを提供することができる。
検体から調製したDNAを増幅するための本発明にかかる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
検体から調製したDNAを増幅するための細菌細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を少なくとも用いて構成することができる。
以下の各装置を用いて、上述した方法による検体中に含まれる検出対象生物の定量または同定を行うためのシステムを構成することができる。
(1)検体から調製したDNAと、検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行うための増幅装置。
(2)増幅工程における増幅産物の定量を行うための定量装置。
(3)増幅産物の定量結果により検体中の検出対象生物の量を算出する算出装置。
(4)目的遺伝子の増幅産物の定量結果から検体中の検出対象生物の量を算出するためのデータベース。
(1)PCR反応装置
(2)データ処理及びデータ処理後の結果を出力するためのコンピュータシステム
(3)データ処理に必要なプログラムを書き込んだデータ処理用ソフト
(4)データ処理に必要なデータベース
(5)PCR反応装置を制御するプログラムを有する制御機構
(6)データ処理の結果を表示する表示装置
これらの装置の関係の一例を図12に示す。このシステムは、PCR反応装置1、コンピュータシステム2、データ処理部3、データ処理用プログラム(ソフト)6、データ処理に必要なデータベース4、PCR反応装置を制御する制御機構5a及び5b及び表示装置7を有している。なお、これらはその2以上を一体化して設けることができる。また、各ユニット間の情報の受け渡しは、信号S1〜S7によって行われる。定量装置は、少なくともコンピュータシステム2により構成することができる。
A)増幅反応スタート時の条件設定
B)増幅のためのサイクル数や温度制御のための条件設定
C)Tm値の測定のための条件設定
D)反応終了のための条件設定
E)目的外遺伝子の増幅を表示装置で非表示とするための条件設定
これらの条件設定から目的に応じて制御項目を選択して設定することができる。条件設定とその実行は、予め設定されたプログラムによって行うことができる。このプログラムは、制御機構5aまたは5b中の媒体に記録しておくことができる。あるいは、このプログラムは、別途用意した移動(携帯)可能な媒体に記憶させておくか、あるいはインターネットにより配布可能となるように媒体に収容しておき、使用時に制御機構5aまたは5bに接続して利用できるようにしてもよい。コンピュータシステム2中に設けられた、あるいは別途用意されたデータ処理部3でのデータ処理結果を利用してPCR反応装置の制御を行う場合は、コンピュータシステム2にデータ処理部3からのデータ処理の結果を送り、その結果に基づいて制御機構5bからPCR反応装置の制御のための信号をPCR反応装置内の制御機構5aに送信して制御を実行する。PCR反応の目的に応じて、PCR反応装置側のみでの制御で十分である場合には、制御機構5aのみを利用してPCR反応の制御を行う。
i)PCR反応装置において得られたPCRの増幅反応結果(例えば蛍光強度に関する信号)の処理
ii)PCR増幅反応結果用いた検出対象生物の定量及び/または同定を行うための演算処理
iii)PCR反応装置におけるPCR反応の条件を制御するための信号の出力処理
iv)PCR増幅反応の結果(経時的モニタリングを含む)、検出対象生物の定量及び/または同定の結果の表示装置での表示を指令する処理
これらの処理は、目的とするデータ処理に応じて設定されたデータ処理用のプログラム6に従って実行される。更に、データ処理にデータベースが必要である場合には、データベース4中に格納された情報を利用する。例えば、PCRでの増幅反応により得られる信号を処理して検出対象生物の定量及び/または同定を行う場合の基準となる既知の生物を用いて得られるデータや、先に説明したTm値を利用した測定対象生物の定量及び/または同定を行う場合は、既知の生物から得られたTm値(複数のTm値からの定量同定を行い場合のTm値の組合せを含む)などをデータベース化して格納しておくことができる。
また、特別な記載がない限り、操作手順は製品キットに付属の説明書に基づいて行った。
(1)DNAの合成
T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼはGenScript社にて全DNA配列を合成した。この際、コドン配列を酵母宿主、S.cerevisiaeに最適化した。合成したDNAは、プラスミドpUC57に組み込まれGenScript社より提供され、ベクターpUC-TA01を得た。耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、5’末端配列にHindIII、3’末端配列にEcoRI制限酵素サイトが入るように設計した。
(2)T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼ発現用ベクターの構築
合成したT.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES2(invitrogen社)に挿入し、ベクターpYES-TA01を構築した。耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、pUC-TA01を制限酵素HindIII、EcoRI(TaKaRa
Bio)にて消化し、1%アガロースゲル(Wako)にて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)にて耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を回収した。プラスミドpYES2はEcoRI、NotI(TaKaRa Bio)にて消化し、DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa Bio)にて耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子とpYES2を連結した。
(3)S.cerevisiaeの形質転換
この得られたベクターpYES-TA01を酵母(Saccharomyces cerevisiae X2180株)へ導入した。宿主はウラシル要求株であれば他の酵母を用いることも可能である。形質転換はFastTrackTM-Yeast Transformation Kit(Geno Technology社)を用いた。
(4)S.cerevisiaeによるT.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼの生産
得られた形質転換体は、SD培地(0.67% Bacto yeast nitrogen base、2% Galactose、)100mlにて、28℃、72時間振とう培養を行った。これらを5000rpm、10分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM
KCl)に懸濁し、0.5mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後12000rpm、30分間遠心分離を行い、酵母破砕液上清および沈殿物を得て細胞抽出物とした。
(5)熱処理による耐熱性DNAポリメラーゼ可溶化条件の検討
細胞抽出物について、耐熱性DNAポリメラーゼ熱処理による可溶化条件の検討を行った。図2は酵母破砕沈殿物を等量の破砕用緩衝液に懸濁したものに対して、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃にて熱処理を行い、12000rpm、30分間、4℃にて遠心分離した後上清に対しSDS-PAGEを行った図である。50℃以上での熱処理において目的タンパク質である耐熱性DNAポリメラーゼのバンドが検出され、65℃から70℃での熱処理では宿主由来の夾雑タンパク質混入量が減少した。50℃以上の熱処理を行うことにより耐熱性DNAポリメラーゼは可溶化され、かつ耐熱性DNAポリメラーゼ活性を有していた。
(6−1)ラムダDNA内領域の増幅
ラムダDNA(NIPPON GENE)をテンプレートとして、活性検出を行った。反応液組成は、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、200μM dNTPsとなるように調製し、プライマーは、配列番号83、84をそれぞれ0.4μMになるよう添加した。
配列番号83 gatgagttcg tgtccgtaca act
配列番号84 ggttatcgaa atcagccaca gcgcc
ラムダDNAは0.2μg、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物は上記遠心分離上清を1/4、1/8、1/16、1/32、1/64となるように希釈列を調製後1μl添加し、これらを超純水にて全量50μlになるように調製した。PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。:94℃ 1分間、50℃ 30秒間、72℃ 1分間を30回繰返した。各PCR反応溶液は1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、増幅産物を可視化した。
(6−2)耐熱性DNAポリメラーゼ活性の定義
得られた耐熱性DNAポリメラーゼのユニットをProcedures in
nucleic acid research(Richardson, C. C. (1966) DNA polymerase from Escherichia coli, pp. 263-276 In G. L. Cantoni and D.R. Davies (ed.) )の方法に従い決定した。活性化サケ精子DNAをテンプレート/プライマーとして用い、活性測定用反応液(25mM TAPS(pH9.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM β-メルカプトエタノール、各200μM のdATP, dGTP, dTTP、100μM [α-32P]・dCTP(0.05-0.1 Ci/mmol)、0.25mg/ml 活性化サケ精子DNAを含む全量50μl)中にて74℃において、30分間に10 nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を1Uとした。
(6−3)PCRの検出限界
図3は大腸菌DNAをテンプレートとし、PCRでの検出の限界を求めた図である。100ngから10fgまではPCR増幅バンドが検出され、10fgから1fgの間で増幅バンドが未検出であった。大腸菌DNAは、大腸菌JM109(ToYoBo社製)よりDNA抽出キットFastPure DNA Kit(TaKaRa社製)にて抽出、精製した。反応液組成は、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、200μM dNTPsとなるように調製し、プライマーは、配列番号85、86をそれぞれ0.4μMになるよう添加した。
配列番号85 agcagccgcg gtaat
配列番号86 ggactaccag ggtatctaat cct
テンプレートは100ngから1fgまでを10-1ずつ作成した大腸菌DNA希釈列を作成し添加した。耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を1U添加しこれらを超純水にて全量20μlになるように調製した。PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。:94℃ 1分間、50℃ 30秒間、72℃ 30分間を60回繰返した。各PCR反応溶液は1%アガロースゲルにて電気泳動を行い、増幅産物を可視化した。
(7)T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼ発現用ベクターの構築、
T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpPIC ZA(invitrogen社)に挿入し、ベクターpPIC -TA01を構築した。pYES-TA01をテンプレートとして用い、KOD Plus(ToYoBo)を用いてPCRにて耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子の増幅を行った。PCRに用いるプライマー(配列番号87、88)は、5’末端配列にEcoRI、3’末端配列にNotI制限酵素サイトが入るように設計した。
配列番号87 cccgaattca tgagggggat gttgccattg
配列番号88 aaagcggccg ctcattcctt tgcggataac
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。:94℃ 2分間加熱した後、94℃
15秒間、56℃ 30秒間、68℃ 2分30秒間を30回繰返した。PCR生成物は次に1%アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)にてPCR断片を回収した。PCR増幅物、pPICZ
Aは共にEcoRI、NotI(TaKaRa Bio)にて消化し、DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa Bio)にてPCR増幅断片とプラスミドpPICZ Aを連結した。
(8)E.coliの形質転換、ベクター抽出
連結したベクターをE.coliコンピテントセル DH5α(ToYoBo)へ導入した。大腸菌形質転換体はZeocinを選択マーカーに持つ為、SOC(ToYoBo)培地にて1時間回復させた後、25μl/mlのZeocin(Invitrogen)を含むLenox(Difco)寒天培地に播種し、37℃、16時間静置培養した。寒天プレートから大腸菌コロニーを接種し、ダイレクトコロニーPCR、そして塩基配列を解読し、正しく耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子が組み込まれていることを確認した後、ベクターpPIC -TA01を得た。
(9)P.pastorisの形質転換
ベクターpYES-TA01を酵母(Pichia
pastoris GS115株)へ導入した。形質転換はFastTrackTM-Yeast
Transformation Kit(Geno Technology社)を用いた。酵母形質転換体はZeocinを選択マーカーに持つ為、YPD培地(Difco)で3時間培養し回復させた後、100μg/mlのZeocinを含むYPDS(Difco)寒天プレートに播種した。そして、寒天プレートは28℃、3日間静置培養した。
(10)形質転換体の選抜
耐熱性DNAポリメラーゼ高生産株を取得する為、形質転換した寒天プレートよりコロニーを接種し、Zeocin含有濃度を500μg/ml〜2000μg/mlと順に上げたYPDS(Difco)寒天プレートで培養し、挿入遺伝子の多コピー形質転換体を選抜した。寒天プレートはZeocin濃度500μg/ml、1000μg/ml 、2000μg/mlと3段階で培養し、各々28℃、3日間静置培養した。Zeocin濃度2000μg/mlのYPDS(Difco)寒天プレートで生育した形質転換体を下記の耐熱性DNAポリメラーゼ生産実験に用いた。
BMGY培地100mlに形質転換体を接種し、28℃にて1日振盪培養し菌体量を増やした。次にタンパク質の生産を誘導する為に0.5%メタノールを添加し28℃にて3日間培養した。これらを5000rpm、10分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl)に懸濁し、0.5mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した。次に70℃、60分間の熱処理を行い、12000rpm、30分間遠心分離しT.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼを含む上清を得た。
(12)P.furiosus由来耐熱性DNAポリメラーゼ発現用ベクターの構築
P.furiosus由来の耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES2に挿入し、ベクターpYES -PF01を構築した。耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子はP.furiosusゲノムDNA(ATCC 43587D-5)をテンプレートとしてPCRにて合成した。PCRに用いるプライマー(配列番号89、90)は、5’末端配列にKpnI、3’末端配列にNotI制限酵素サイトが入るように設計し、KOD Plusを用いてPCRを行った。
配列番号89 gggggtacca tgattttaga tgtggattac
配列番号90 cccgcggccg cctaggattt tttaatg
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。:94℃ 2分間加熱した後、94℃
15秒間、56℃ 30秒間、68℃ 2分30秒間を30回繰返した。PCR生成物は次に1%アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キットにてPCR断片を回収した。PCR増幅物、pYES2は共にKpnI、NotIにて消化し、DNA Ligation Kit Ver.2.1にてPCR増幅断片とpYES2を連結した。
(13)T.gorgonarius由来耐熱性DNAポリメラーゼ発現用ベクターの構築
T.gorgonarius由来の耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES2に挿入し、ベクターpYES -TG01を構築した。耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子はT.gorgonariusのゲノムDNA(ATCC 700654D)をテンプレートとしてPCRにて合成した。PCRに用いるプライマー(配列番号91、92)は、5’末端配列にKpnI、3’末端配列にNotI制限酵素サイトが入るように設計し、KOD Plusを用いてPCRを行った。
配列番号91 gggggtacca tgatcctcga tacagac
配列番号92 cccgcggccg ctcatgtctt aggttttag
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。:94℃ 2分間加熱した後、94℃
15秒間、60℃ 30秒間、68℃ 2分30秒間を30回繰返した。PCR生成物は次に1%アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キットにてPCR断片を回収した。PCR増幅物、pYES2プラスミドは共にKpnI、NotIにて消化し、DNA Ligation Kit Ver.2.1にてPCR増幅断片とプラスミドpYES2を連結した。
この得られたベクターpYES-PF01、pYES-TG01を酵母(Saccharomyces cerevisiae X2180株)へ導入した。形質転換はFastTrackTM-Yeast Transformation Kitを用いた。
(15)P.furiosus、T.gorgonarius由来耐熱性DNAポリメラーゼの生産
得られた形質転換体は、SD培地(0.67% Bacto yeast nitrogen base、2% Galactose、)100mlにて、28℃、72時間振とう培養を行った。これらを5000rpm、10分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM
KCl)に懸濁し、0.5mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後遠心分離を行い、酵母破砕液沈殿を得た。この沈殿に対し、沈殿湿重量の2倍量の破砕用緩衝液を添加、懸濁し70℃、60分間の熱処理を行い、12000rpm、30分間遠心分離し耐熱性DNAポリメラーゼを含む上清を得た。
図4は上記の得られた各耐熱性DNAポリメラーゼ調製物とTaKaRa Taq(TaKaRa)、AmpliTaq Gold LD(ABI)を用い、非特異的核酸混入が認められるかを調査した実例を示す1%アガロース電気泳動の写真である。レーン1、4、7、10、13、16は40サイクル、レーン2、5、8、11、14、17は60サイクルにてテンプレートを添加せずPCRを行ったものである。また、レーン3、6、9、12、15、18は大腸菌1μgをテンプレートとしてPCRを30サイクルにて試行したものである。プライマーは259bpの大腸菌16S rRNA遺伝子を増幅させ得る配列番号85、86を用いて、温度条件、PCR溶液組成は(6−3)と同様の操作にて行った。これより、テンプレートを添加していないにも関わらず、TaKaRa
Taqでは40サイクル、AmpliTaq Gold LDは60サイクルにてバクテリア16S rRNA由来遺伝子の増幅産物が検出された。また、本特許の製造方法により生産された耐熱性DNAポリメラーゼでは40、60サイクルのPCRでも増幅産物は検出されず、煩雑な精製工程を行わなくとも非特異的核酸混入は認められず、PCRが実施可能であった。
(17)リアルタイムPCRによる増幅曲線、融解曲線の解析(非特異的核酸混入の調査)
上記の得られた耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の非特異的核酸混入を調査する為、リアルタイムPCRを用いて増幅曲線、融解曲線の解析を行った。図5(A)及び図5(B)は増幅曲線、図6(A)及び図6(B)は融解曲線の解析を示す図である。また、図5(A)及び図6(A)はAmpliTaq
Gold LD、図5(B)及び図6(B)はS.cerevisiaeを宿主に生産した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用い解析を実施した図である。実線はテンプレートとして大腸菌を添加したもの、点線はテンプレート未添加のものである。リアルタイムPCR試薬として、LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenI(Roche社)の1bチューブに対し、10μlの超純水を加えx10 Bufferとした。このチューブ内にはTaq DNAポリメラーゼに最適化された緩衝試薬の他、dNTPsとSYBR GreenIが含まれる。その他に1.5mM MgCl2、それぞれ0.4μMプライマー(配列番号85、86)、テンプレートとして大腸菌1μg、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を1ユニット添加し、超純水にて全量20μlになるよう調製して、ホットスタート法でリアルタイムPCR(60サイクル)を行った。AmpliTaq
Gold LDでは32サイクル程度で増幅曲線が立ち上がり始め、融解曲線ではテンプレート添加、未添加共に同程度の位置にピークがあり、非特異的核酸混入が認められた。これに対し、本特許の製造方法により製造した耐熱性DNAポリメラーゼは、テンプレート未添加では増幅曲線、融解曲線共に見られなかった。真核細胞を宿主として用いて生産した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物では非特異的核酸混入に由来する増幅産物が認められず、細菌を宿主として用いて生産し、バクテリアDNAのコンタミネーションが最小に抑えられるように精製された耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用いた場合では非特異的核酸混入に由来する増幅産物が認められた結果から、大気や水環境中に存在するバクテリアの混入など様々な非特異的核酸混入の可能性がある中で、その主たる要因は耐熱性DNAポリメラーゼの生産過程における宿主由来DNAの耐熱性DNAポリメラーゼ調製物への混入にあるものと考えられた。
(18)ベクターpYES-PF01の変異の導入
P.furiosus由来耐熱性DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼをコードする遺伝子に変異を導入した。すなわち、DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ改変を行い活性を調整した(Kongら(1993)、journal
of biological chemistry、vol.268、1965-1975)。具体的には、変異導入に用いるプライマー(配列番号61、62)、テンプレートとしてベクターpYES2-PF01、KOD Plusを用いてPCRを行った。
配列番号61 GATTCTTGCCTTCGCGATCGCAACCCTCTATCACGAAGG
配列番号62 CCTTCGTGATAGAGGGTTGCGATCGCGAAGGCAAGAATC
PCRプログラムを下記のプログラムで実施した。:94℃ 2分間加熱した後、94℃
15秒間、56℃ 30秒間、68℃ 7分秒間を15回繰返した。反応後、制限酵素DpnIにてPCR溶液中のテンプレートを消化し、E.coliコンピテントセル JM109へ導入した。大腸菌形質転換体は50μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に播種し、37℃、16時間静置培養した。寒天プレートから大腸菌コロニーを接種し、塩基配列を解読し目的位置に変異が導入されていることを確認し、ベクターpYES-PF-M01を得た。また、実施例(14)、(15)と同様に形質転換、生産を行い、P.furiosus由来変異耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を得た。
(19)ベクターpYES-TG01の変異の導入
T.gorgonarius由来耐熱性DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼをコードする遺伝子に変異を導入した。変異導入に用いるプライマー(配列番号63、64)、テンプレートとしてベクターpYES2-TG01を用い(18)と同様の方法で変異を導入した。
配列番号63 GATGCTCGCCTTCGCGATCGCAACGCTCTATCACGAGGGCG
配列番号64 CGCCCTCGTGATAGAGCGTTGCGATCGCGAAGGCGAGCATC
塩基配列を解読し目的位置に変異が導入されていることを確認し、ベクターpYES-TG-M01を得た。また、実施例(14)、(15)と同様に形質転換、生産を行い、T.gorgonarius由来変異耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を得た。
(20−1)転写因子発現用DNA断片導入用ベクターの構築
転写因子発現用DNA断片を宿主細胞(タバコBY2細胞)に導入するためのベクター(以下転写因子発現用DNA断片導入用ベクターと称する)として、TiプラスミドpER8(−Stu)
(Dohi, K., Nishikiori, M., Tamai, A., Ishikawa, M., Meshi, T.,
Mori, T. (2006) Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in
suspension-cultured cells. Archives of Virology 151, 1075-1084)を用いた。pER8(−Stu)は、恒常的プロモーターPG10-90の下流にエストロジェンレセプターを含む融合転写因子LexA−VP16−hERをコードする遺伝子、ターミネーターTE9を連結し、さらに薬剤耐性マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子(Hygr)を組み込んで構築した。
(20−2)タンパク質発現用DNA断片導入用ベクターの構築
ToMVの外被タンパク質をコードする遺伝子を、T.aquaticus由来DNAポリメラーゼをコードする遺伝子(配列番号65)で置換したToMV変異体を用いた。
配列番号65
ATGAGGGGGATGTTGCCATTGTTTGAACCTAAAGGGAGGGTTTTACTCGTGGATGGCCATCACCTTGCTTATCGTACTTTCCACGCTCTCAAAGGTTTAACAACCTCTAGGGGAGAGCCAGTTCAAGCTGTGTACGGGTTTGCAAAGTCACTCCTTAAAGCCTTGAAGGAGGACGGTGATGCCGTTATCGTGGTATTCGATGCTAAAGCACCAAGTTTTAGACACGAGGCTTACGGAGGCTATAAGGCTGGACGTGCACCAACTCCCGAGGATTTCCCAAGACAACTCGCCCTGATAAAGGAGTTGGTTGACCTACTTGGATTGGCTAGGTTAGAAGTTCCCGGTTACGAAGCTGACGACGTTTTGGCCTCACTTGCTAAGAAAGCAGAAAAGGAGGGCTACGAAGTTCGTATACTCACAGCCGATAAAGACTTGTATCAACTGTTATCTGATAGGATTCATGTGCTTCACCCCGAAGGGTACCTTATCACCCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGGCTCAGACCTGACCAGTGGGCTGATTACCGTGCACTCACCGGTGACGAGAGTGACAATCTTCCTGGCGTGAAAGGAATAGGTGAAAAGACAGCTAGAAAATTGCTAGAAGAGTGGGGGTCCCTCGAGGCACTTTTGAAGAACCTTGATAGGTTAAAACCAGCTATTAGAGAAAAGATACTGGCCCATATGGATGACTTGAAACTATCATGGGACTTAGCTAAAGTCAGAACCGATTTACCTTTGGAAGTGGATTTTGCTAAGAGAAGGGAACCAGATAGAGAGAGGCTTAGAGCATTCTTGGAGCGTCTGGAATTTGGATCTTTACTCCACGAGTTCGGTTTGCTTGAGTCTCCCAAGGCACTGGAAGAGGCACCATGGCCTCCACCTGAAGGCGCTTTTGTTGGGTTCGTTCTCAGTAGGAAGGAACCTATGTGGGCAGACTTGCTCGCCCTAGCAGCTGCAAGAGGGGGAAGAGTGCATAGGGCTCCCGAACCTTATAAGGCACTCAGAGATCTTAAGGAGGCTAGGGGCCTCTTGGCAAAGGACCTATCCGTGCTTGCACTCAGGGAAGGATTGGGACTCCCACCCGGTGATGACCCTATGTTATTGGCTTACTTGCTTGACCCATCCAATACCACACCCGAGGGAGTTGCCCGTAGGTATGGGGGCGAGTGGACTGAGGAAGCTGGTGAGAGGGCCGCATTGAGTGAGAGGCTATTTGCCAACTTATGGGGGAGGTTGGAGGGGGAGGAACGTCTGCTATGGCTTTACAGAGAGGTGGAGCGTCCCTTGAGTGCTGTATTAGCTCACATGGAAGCTACAGGCGTCCGTCTAGATGTTGCTTACTTAAGGGCTCTAAGTTTGGAAGTTGCAGAAGAGATCGCCAGATTAGAAGCTGAAGTTTTCAGGTTAGCAGGACACCCTTTTAATCTCAATAGTAGGGACCAACTCGAACGTGTGTTATTTGATGAACTGGGCCTCCCCGCTATAGGGAAAACCGAGAAAACAGGGAAAAGGTCCACATCTGCAGCTGTATTGGAAGCCCTTAGAGAAGCACATCCTATTGTGGAGAAAATACTACAGTACAGGGAGCTAACCAAATTAAAGAGTACCTACATAGATCCATTGCCTGATCTTATTCACCCAAGGACCGGAAGGCTTCACACCCGTTTCAATCAAACCGCAACAGCTACTGGGAGGTTATCATCTTCCGACCCTAACTTGCAAAATATACCTGTTCGTACCCCACTCGGACAGAGAATACGTAGAGCTTTCATTGCCGAAGAGGGATGGCTCTTGGTTGCTTTGGATTATAGTCAGATTGAACTTAGAGTTCTAGCACACCTTAGTGGCGACGAAAACCTCATCAGGGTGTTTCAGGAGGGGAGAGATATACACACCGAAACTGCTTCATGGATGTTTGGGGTGCCCAGGGAAGCCGTAGACCCCCTCATGAGAAGGGCTGCTAAAACAATTAATTTCGGCGTGTTGTACGGAATGTCCGCTCACAGGCTATCACAAGAGTTGGCAATCCCCTATGAAGAGGCTCAAGCCTTCATTGAGAGGTATTTTCAGTCCTTTCCAAAGGTGCGTGCTTGGATAGAGAAAACTTTAGAGGAAGGTAGAAGGAGAGGGTATGTGGAAACTCTATTTGGCAGACGTAGGTACGTTCCTGACCTCGAAGCTAGAGTTAAGTCCGTCAGAGAGGCAGCTGAACGTATGGCATTCAATATGCCTGTTCAAGGAACAGCTGCAGACTTAATGAAATTAGCTATGGTGAAGTTGTTCCCAAGGTTAGAGGAAATGGGTGCAAGAATGCTCCTACAGGTCCATGATGAGCTAGTGTTGGAAGCACCTAAAGAGAGGGCAGAGGCAGTAGCCAGGTTGGCAAAGGAGGTTATGGAAGGGGTGTATCCACTTGCTGTCCCCTTGGAGGTGGAAGTCGGGATCGGTGAGGACTGGTTATCCGCAAAGGAATGAGCTCACTAGT
T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼはGenScript社にて全遺伝子配列を合成した。この際、コドン配列をタバコBY2細胞に最適化した。形質転換用ベクターとしてエストロジェンで転写誘導可能なプロモーターOLexA−46を有するTiプラスミドを用い、OLexA−46の下流にToMV変異体のcDNAを連結し、さらにその3’末端にサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列S-Rz、35Sターミネーター(35ST)を組み込んだタンパク質発現用DNA断片を宿主細胞(タバコBY2細胞)に導入するためのベクターpBICER8-ToMV/Taq-SRzを構築した。
(20−3)第一形質転工程: 転写因子発現用DNA断片の宿主細胞への導入
転写因子発現用DNA断片導入用ベクターpER8(-Stu)を、タバコBY2細胞にアグロバクテリウム法により導入した。まずpER8(-Stu)をエレクトロポレーション法によってAgrobacterium tumefacince LBA4404系統に導入した。これをスペクチノマイシン(50mg/l)を含むAB sucrose培地で前培養した。次にタバコBY2細胞と混合してシャーレに移し、26℃、暗所で42〜48時間静置してタバコBY2細胞を形質転換した。タバコBY2細胞用培地にて洗浄した後、カルベニシリン(100mg/l)およびハイグロマイシン(20mg/l)を含むタバコBY2細胞用固形培地に広げ、形質転換タバコBY2細胞を増殖させた。
(20−4)選抜工程: 転写因子高発現形質転換体の選抜
形質転換タバコBY2細胞のうち、ノーザンブロット法の結果、転写因子の発現量の高い細胞ラインを選抜した。ここで「細胞ライン」とは、形質転換細胞を増殖させることにより形成された個々のコロニーのことを意味する。
上記で得られた転写因子高発現タバコBY2細胞ラインに、ウイルスベクター(pBICER8-ToMV/Taq-SRz)をアグロバクテリウム法により導入し形質転換細胞を得た。
上記で得られた形質転換細胞を15mlの液体培養にて維持し、7日ごとに1/200量になるように継代した。また、1/50量になるよう継代し、継代培養後2日間前培養した細胞を、エストロジェンの終濃度が0.01mMとなるように添加し、さらに2日間培養した。これを5000rpm、10分間遠心分離し形質転換細胞を回収し、液体窒素で凍結した後、乳鉢を用いて細胞を破砕した。これに等量の緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM
KCl)を加え懸濁し、70℃、60分間の熱処理を行い、12000rpm、30分間遠心分離しT.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼを含む上清を得た。
(21−1)DNAの合成
T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼはGenScript社にて全DNA配列を合成した。(配列番号41)この際、コドン配列をA.oryzaeに最適化した。耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、5’末端配列にPmeI、3’末端配列にXmaI制限酵素サイトが入るように設計した。
配列番号41
ATGAGAGGCATGCTGCCACTGTTCGAGCCAAAGGGAAGGGTGCTGCTGGTGGACGGACACCATCTGGCCTACAGAACTTTTCACGCTCTGAAGGGACTGACCACATCACGGGGGGAGCCAGTGCAGGCTGTGTATGGATTCGCTAAAAGCCTGCTGAAGGCCCTGAAAGAGGACGGAGATGCTGTGATCGTGGTGTTCGATGCTAAGGCCCCTAGCTTTAGACATGAGGCCTACGGCGGATATAAAGCCGGACGCGCTCCAACCCCCGAGGACTTTCCAAGGCAGCTGGCCCTGATTAAGGAACTGGTGGATCTGCTGGGACTGGCTAGGCTGGAGGTGCCCGGCTACGAAGCTGACGATGTGCTGGCCTCCCTGGCTAAGAAAGCCGAGAAGGAAGGCTACGAGGTGCGCATCCTGACAGCCGACAAAGATCTGTATCAGCTGCTGTCTGACAGGATCCACGTGCTGCATCCCGAGGGGTATCTGATTACTCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGCCTGAGACCAGACCAGTGGGCTGATTATCGGGCCCTGACTGGCGACGAGTCAGATAACCTGCCCGGAGTGAAAGGCATCGGAGAAAAAACCGCCAGGAAGCTGCTGGAGGAATGGGGCAGCCTGGAGGCTCTGCTGAAAAATCTGGATAGACTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAAATTCTGGCTCACATGGACGATCTGAAGCTGTCTTGGGACCTGGCCAAAGTGAGAACCGACCTGCCTCTGGAGGTGGATTTCGCCAAGAGGAGAGAGCCAGATCGGGAACGCCTGAGGGCTTTCCTGGAGCGGCTGGAATTTGGGTCACTGCTGCATGAGTTTGGCCTGCTGGAAAGCCCAAAGGCTCTGGAGGAAGCTCCATGGCCACCTCCAGAGGGAGCCTTCGTGGGATTTGTGCTGTCCAGGAAAGAACCAATGTGGGCTGACCTGCTGGCTCTGGCTGCTGCCAGAGGGGGACGGGTGCACCGCGCCCCTGAGCCATACAAGGCTCTGCGCGACCTGAAAGAAGCCAGGGGGCTGCTGGCTAAGGATCTGTCAGTGCTGGCTCTGAGGGAGGGACTGGGACTGCCCCCTGGCGACGATCCAATGCTGCTGGCCTACCTGCTGGATCCAAGCAACACTACCCCAGAGGGAGTGGCTAGGAGATATGGAGGGGAATGGACCGAGGAAGCTGGGGAGAGAGCTGCCCTGTCCGAACGGCTGTTCGCTAATCTGTGGGGAAGGCTGGAGGGAGAGGAAAGGCTGCTGTGGCTGTACCGGGAGGTGGAACGCCCTCTGTCCGCTGTGCTGGCTCACATGGAGGCTACAGGCGTGCGCCTGGACGTGGCTTATCTGAGGGCCCTGTCTCTGGAGGTGGCTGAGGAAATCGCCAGACTGGAGGCTGAAGTGTTCCGGCTGGCCGGACATCCCTTTAACCTGAATAGCAGGGACCAGCTGGAGAGAGTGCTGTTCGATGAACTGGGGCTGCCTGCCATTGGCAAGACCGAGAAAACAGGGAAGCGCTCAACAAGCGCTGCTGTGCTGGAGGCTCTGAGGGAAGCTCACCCCATCGTGGAGAAGATTCTGCAGTACAGAGAACTGACTAAGCTGAAATCCACCTATATCGACCCCCTGCCTGATCTGATTCACCCTAGGACAGGCAGACTGCATACTCGCTTCAACCAGACAGCTACTGCCACCGGAAGGCTGAGCTCCTCTGACCCAAACCTGCAGAATATCCCTGTGAGAACCCCACTGGGACAGCGGATCAGGAGAGCTTTTATTGCTGAGGAAGGATGGCTGCTGGTGGCTCTGGATTACTCCCAGATTGAGCTGAGGGTGCTGGCTCACCTGTCTGGGGACGAAAACCTGATCCGCGTGTTCCAGGAGGGCAGGGATATTCATACAGAAACTGCCAGCTGGATGTTTGGAGTGCCTCGCGAGGCTGTGGACCCACTGATGAGGAGGGCTGCCAAGACAATCAATTTCGGAGTGCTGTATGGGATGTCCGCCCACAGGCTGTCTCAGGAGCTGGCTATCCCCTACGAGGAAGCTCAGGCCTTCATCGAAAGATACTTCCAGTCTTTCCCTAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAAACCCTGGAGGAAGGCAGGAGACGGGGATACGTGGAAACACTGTTCGGCCGCAGGAGATATGTGCCTGACCTGGAGGCCAGGGTGAAGTCAGTGCGCGAGGCTGCCGAAAGGATGGCTTTCAATATGCCTGTGCAGGGAACCGCTGCCGACCTGATGAAACTGGCCATGGTGAAGCTGTTTCCACGCCTGGAGGAAATGGGGGCTAGGATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAGCTGGTGCTGGAAGCCCCAAAGGAGAGAGCTGAAGCCGTGGCTCGGCTGGCCAAAGAAGTGATGGAAGGCGTGTACCCCCTGGCTGTGCCTCTGGAGGTGGAAGTGGGAATCGGGGAGGACTGGCTGTCCGCCAAGGAATGA
(21−2)T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼ発現用ベクターの構築
自立複製型シャトルベクター(pPTRII:TaKaRa Bio)のHindIII、KpnI制限酵素サイトにTEFプロモーター(配列番号66)とSDターミネーター(配列番号67)を挿入しベクターpPTR-TEF-SDtを得た。
配列番号66
GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAAGGATGGTTCAGATACAAATTAGCAACAGGCCAGGCTAGACGCGC
GACTATCCACTGCGGCAAATGGTGAGCTGCAAGCAACGGTAAGATGTGACAGGACGAGCGGTGTGCCGGGAA
AAAAATTGGAGGAGCGCAAAGCGGCGGCTGTCCCTCAGTGGTGCCCAAACGTTATCGATAGTACACCAAGCA
TGGGCAGTGAGCGGCTATACAGAGGGAATAATAGGCATATCGGCACGACTAGATTCGGTAGAAAGCATCGAA
GAGCAATTCATTGAGCATATTATCACGTGGAATGCGATAGCTGTGGCCAGGTTGAGACACCGCAAGTGAAAG
ATACACACATAGATTCTCGATTCGAGCGGTTTGCCTCCGCCACCGCAGTGCATAGCAAGCAAAGAAACGACA
GTTGGCTCATCATCCGTTACATCATTTTTTCTACTGGCTCCGCTCGGTGGGCTCCCAACGAAGCAGCAAAAA
AGTGAGAGAAAAAAACTAGCTTGGCGGGGCAACAGAAGCTAGACCCTTTGGCTCGCTTAGTCAGTGCGCCCA
CTCACTCACACTCAAAAAGGCCACCCCTCCCGCACCCTCTTCTCATCACCGTCTTCATACCACGGTTCGTCA
AGCAATCGTATCTGGTAAGCTTTGACCTCCTCGAGCGGGCTCCACTTTGCTATTTCTTGGATCTGCTCTTTC
TTTTCTCTCTACCTCTTTTTCTAACCTCTCTTCAGAAAGTTCAACCGTACTTCACTCCATCTTCCTACGTCA
CTCTAGA
配列番号67
TAAAGCGGCGTGCTCTGCACATAACACGTGTCGTGTTTGGGTTCGGTATGGGTAATGGCGAATGGGGACATGCATTTATGGGATAGGGGGCTGGGTTGGTGTAATCAAATGTGCATACAGACCAGCTGATACGAATACTACAACTTACCCCGACACACGCATTCATGTGACGCCCAACACCTCGTCTAACTCATCGGGGCAACTCACCTCAATCCGATTCAGCCTCCCGG
TEFプロモーターはAureobasidium
pulluans由来、SDターミネーターはColletotrichum
orbiculare由来であり、共に抽出したゲノムDNAをテンプレートとしPCRにて増幅を行った。(配列番号68、69、70、71)TEFプロモーターとSDターミネーターの間にはPmeI、XmaI制限酵素サイトが入るように設計した。
配列番号68 GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAA
配列番号69 ATATCTAGAGTGACGTAGGAAGATGGAG
配列番号70 GTTTAAACAGATCTCCCGGGTAAAGCGGCGTGCTCTGCAC
配列番号71 TATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT
次にpPTR-TEF-SDtのPmeI、XmaI制限酵素サイトに T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を挿入しベクターpPTR-TEF-Taqを得た。また、FLAGタグを付加するため、ベクターpPTR-TEF-Taqをテンプレートにし、5’末端配列にPmeI、3’末端配列にXmaI制限酵素サイトが入るように設計したプライマー(配列番号72、73)を用いて増幅、pPTR-TEF-SDtのPmeI、XmaI制限酵素サイトに挿入しベクターpPTR-TEF-FLTaqを得た。
配列番号72
ATAGTTTAAACATGGATTATAAGGATGACGATGACAAGATGAGAGGCATGCTGCCAC
配列番号73
ATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT
(21−3)A.oryzaeの形質転換
ベクターpPTR-TEF-FLTaqを糸状菌(Aspergillus oryzae)へ導入した。形質転換はプロトプラスト-PEG法を用いた。CD固形培地(1 L 当たり:NaNO3
6.0g、KCl 0.52g、KH2PO4 1.52 g、1M MgSO4・7H2O 2 ml、Glucose
10.0g、FeSO4・7H2O 1.0mg、ZnSO4・7H2O 8.8mg、CuSO4・5H2O 0.4mg、Na2B4O7・10H2O
0.1mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.05mg、Agar 20.0g、1N KOH でpH6.5
に調整)にてA.oryzaeを30℃培養し、これを10 mlの0.1% Tween 80、0.8% NaCl に懸濁し、ガラスろ過器(3G2)でろ過し、ろ液を集めた。3,000rpm、5分間遠心して分生子を沈澱させ、上清を除去した。10ml の0.1% Tween80 で分生子を2回洗浄した後、適量の滅菌水に懸濁し、胞子懸濁液とした。
100mlのCD液体培地にA.oryzaeの胞子懸濁液を植菌し、30℃で20 時間振盪培養した。
ガラスろ過器(3G1)でろ過して菌糸を集め滅菌水で洗浄後、スパーテル等で押さえて菌糸から水分を十分にいた。適当量の菌糸を、50ml ポリプロピレン製遠心管中のプロトプラスト化溶液に加えて懸濁し、30℃、2 時間穏やかに振盪、プロトプラスト化した。これをガラスろ過器(3G2)でろ過し、ろ液を2,000rpmで5分間遠心してプロトプラストを集め、0.8M NaClで2回洗浄した。プロトプラストを2×108/mlとなるようにSolution 1(0.8 M NaCl、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl (pH8.0))に懸濁し、0.2容量のSolution 2(40% (w/v) PEG4000、50mM CaCl2、50mM Tris-HCl (pH8.0))を加えて穏やかに懸濁した。0.2 mlのプロトプラスト懸濁液に20μgのpPTR-TEF-FLTaqを加え氷中で30分間静置した。1 mlのSolution
2を加え、穏やかに懸濁し室温で15分間静置した。8.5mlのSolution 1を加え、穏やかに懸濁した。次に、遠心してプロトプラストを集め上清を除き、プロトプラストを0.2mlのSolution 1に懸濁した。プロトプラスト懸濁液を5mlのCD軟寒天選択培地(CD培地のagarを0.5%にし、0.8M
NaCl、0.1μg/ml Pyrithiamine(TaKaRa Bio)を添加し50℃で保温したもの)。に懸濁し、CD 選択培地にプロトプラストが均一に分散するように播種し30℃、7 日間培養した。
(21−4)A.oryzaeの培養、T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼの生産
CD培地600mlに形質転換体を接種し、30℃にて4日間培養を行った。これらを5000rpm、10分間遠心分離し集菌し、破砕用緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5、50mM KCl)に懸濁し、0.5mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後70℃、60分間の熱処理を行い、12000rpm、30分間遠心分離し耐熱性DNAポリメラーゼを含む上清を得た。これにFLAG Tagged protein
Immunoprecipitation Kit (Sigma)を用いて精製を行い、T.aquatics由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を得た。
(21−5)PCRによる非特異的核酸混入の検査
図7は上記の得られた耐熱性DNAポリメラーゼを用い、非特異的核酸混入が認められるかを調査した実例を示すアガロース電気泳動の写真である。レーン1はマーカー、レーン2はテンプレートを添加せず、レーン3は大腸菌DNAをテンプレートとしてPCRを行った。プライマーは配列番号85、86を用いて、PCR温度条件、PCR溶液組成は(6−3)と同様に行い、45サイクルにてPCRを行った。これより、大腸菌をテンプレートとしたものはバクテリア16S rRNA由来遺伝子の増幅産物が検出され、テンプレートを加えなかったものはバクテリア16S rRNA由来遺伝子の増幅産物が検出されなかった。
(22)非表示法(masked Primer Dimer法)を用いた各種耐熱性DNAポリメラーゼによるリアルタイムPCR
上記の得られた耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用い、非表示法を用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRでは各々、S.cerevisiaeを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物(図8、A、図9、A)、変異P.furiosus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物(図8、B、図9、B)、変異T.gorgonarius由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物(図8、C、図9、C)、P.pastorisを宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物(図8、D、図9、D)、Tobacco BY-2を宿主として生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼ調製物(図8、E、図9、E)を使用した。また図8、A、B、C、D及びEは増幅曲線、図9、A、B、C、D及びEは融解曲線を示す図である。実線はテンプレートを添加したもの、点線はテンプレート未添加のものである。リアルタイムPCR試薬は(17)と同様である。リアルタイムPCRのプログラムは94℃ 1分間、50℃
30秒間、72℃ 1分間、84℃ 2秒後蛍光値を検出、を60回繰返した。リアルタイムPCR結果より、非表示法を用いた事でリアルタイムPCRでの定量性を害する非特異的増幅産物やバクテリアDNAの増幅曲線のシグナルを検出することなく解析可能であった。
以下、宿主S.cerevisiaeにより生産したT.aquaticus由来耐熱性DNAポリメラーゼをe-DNAPと記す。
Forward Primer: CTCCTACGGGAGGCAG (配列番号43)
Reverse
Primer: ACTACCAGGGTATCTAATCCTG (配列番号44)
e-DNAP(5 units/μL ) 1μL,
E.coli genomic DNA
templateまたは Water PCR grade 2μL,
SYBR Green I (TAKARA) 300倍希釈液2μL,
PCR primers(10μΜ)0.8μL each,
10×Buffer (500mM KCl,
100mM Tris-HCl)2μL,
25mM MgCl2 1μL,
2mM dNTP mix 2μL,
Water PCR grade 8.4μL
また、リアルタイムPCRのプログラムは表1記載の条件にて行った。
図13より、テンプレートを含まない状態でも増幅曲線が現れ、図14より、約76℃付近にプライマーダイマーの融解曲線が認められた。
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いて、各種検体中に存在する感染菌の定量同定を試みた。細菌検出用のリアルタイムPCR用試薬およびプライマー構成は(実施例2)と同じである。真菌検出用のリアルタイムPCR用試薬およびプライマー構成は、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼとしてrTaq DNA polymerase (ToYoBo)を用い、以下に記載の真菌検出用のユニバーサルプライマーを用いる以外は、(実施例2)と同じである。
Forward Primer: GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG (配列番号9)
Reverse Primer: GCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCA (配列番号45)
感染菌の濃度単位は一般的にCFU/mlが用いられるため、DNA濃度で計算されるPCR定量法との単位を合わせるために、McFarland比濁法を介して計算を試みた。具体的には、E. Coli, C.Albicansそれぞれを生理食塩水に懸濁した後、0.5
McFarlandの中央値に合わせた菌浮遊液を作り、それぞれを培地に展開してCFU/mlを計算すると同時に、DNAを抽出してDNA/mlを計算し、そのDNA溶液でリアルタイムPCRの検量線を描いた。
CFU/mlとDNA/mlの換算値を以下に示す。
・E.Coli :
0.5 McFarland = 1.3×108 CFU/ml = 8.6μg/ml (8.6 ng/μl)
・C.Albicans
: 0.5 McFarland = 2.5×106 CFU/ml = 18.0μg/ml (18.0 ng/μl)
また、検量線を描いた結果、以下の結果が得られた。
・E.Coli : 相関係数 -1.00で、計算式:cycle数=-
4.1×concentration + 14.6
・C.Albicans
: 相関係数 -1.00で、計算式:cycle数=- 4.4×concentration + 14.5
陽性 and 定量コントロールとして、以下の2つを測定毎に定量する。
・E.Coli :
1.3×105 CFU/μl = 8.6
ng/μl を、2μl (20μlの測定系)
・C.Albicans
: 2.5×103 CFU/μl =
18.0 ng/μl を、2μl (20μlの測定系)
以上より、本システムにて細菌、真菌が陽性に出た場合、以下の概算式で定量を行う。
・細菌(E. Coli 換算値):有効数字 2ケタ
1.3×108×[10の{1-(cycle数-control cycle数+4.1)÷4.1}乗] CFU/ml
・真菌(Candida Albicans 換算値):有効数字 2ケタ
2.5×106÷18×[10の{3-(cycle数-control cycle数+7.7)÷4.4}乗] CFU/ml
(1)検出対象の高感度定量方法を用いた生活用水の検査
次に、構築した「検出対象の高感度定量方法」の実用性を評価する目的で、以下の4種の生活用水について検査を行った。
(A)水道水:富山大学附属病院内の上水道水。
(B)湧水:昭和60年、環境庁から「全国名水100選」の1つに選ばれた富山の名水。
(C)温泉水:加温循環の温泉水。添加物は無し。
(D)空調循環水:富山大学附属病院内の空調循環水。
・温泉水:1.2 CFU/ml(E.Coli換算値)
・空調循環水:78 CFU/ml(E.Coli換算値)
この結果、温泉水には量的には少ないが細菌が存在し、また、空調循環水には高濃度で細菌が存在することが判明した。
食品の細菌汚染や真菌汚染は食中毒症の直接の原因となるため、社会的にも重要な検査である。今回、黄色ブドウ球菌による食中毒のリスクの高いシュークリームを検体として用いた。尚、「古いシュークリーム」とは室温にて数日放置したものを使用し、コントロール(新しいシュークリーム)として冷蔵(5℃以下)保存してある賞味期限内のシュークリームを使用した。DNA抽出に際しては、先ず各シュークリームのクリーム部分のみ27.4g採取し、減菌生理食塩水水20mlに添加し遠心分離して上清を除去し、この操作を3回繰り返すことで油成分を除去した。その後、遠心分離したペレットからInstaGene
Matrixを用いてDNAを抽出し、それらをテンプレートとして感染菌検査を行った。
CFU/(クリーム)g (E.Coli換算値)
(3)検出対象の高感度定量方法を用いた敗血症の検査
次に、検出対象の高感度定量方法を用いた敗血症の検査を試みた。今回、敗血症患者検体として、真菌血症の患者A(Candida Albicansによる敗血症)、細菌血症の患者B(Bacillus
speciesによる敗血症)それぞれの血液検体を使用した。DNA抽出に際しては、患者A,Bそれぞれの血液検体2μlと、更に患者Bの血液培養ボトルから2μlを採取し、それぞれInstaGene
Matrixを用いてDNAを抽出し、それらをテンプレートとして感染菌検査を行った。
・患者A:9.7×104
CFU/(血液)ml (Candida Albicans 換算値)
また、患者Bでは真菌感染はみられず、微量の細菌感染のみ認められた(図19)。また、血液培養ボトルでも確認したところ、多量の細菌増殖を確認した。この細菌感染を定量計算した結果、以下の測定値を得た。
・患者B:2.0×105
CFU/(血液)ml (E.Coli 換算値)
また、図20はMRSA DNAを鋳型としMRSAに特異的な以下のSpa, mecA primerを用いて行ったリアルタイムPCR結果である。
Spa Forward Primer:
GCGATTGATGGTGATACGGTT (配列番号46)
Spa Reverse Primer:
AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC (配列番号47)
mecA Forward Primer:
AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC (配列番号48)
mecA Reverse Primer:
AGTTCTGCACTACCGGATTTGC (配列番号49)
上記実施例に使用したユニバーサルプライマーに加えてMRSA特異的なプライマーを併用することにより、特定の感染菌に的を絞った検査の構築が可能であった。
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いた高感度定量方法を応用して、迅速な液相の薬剤感受性試験を試みた。現行の薬剤感受性試験では結果を得るまでに一般的に数日を要するが、本発明にかかる高感度定量方法を応用すると僅か4〜6時間で結果を得ることが出来る。尚、液相の薬剤感受性試験については既に先行特許に記載されている(WO2002/052034)が、高感度検出法ではない為、一旦培養した後に改めて感受性試験をスタートしなければならず、結果を得るまでに早くても1日程度はかかることになる。
液体培地(BHI:Brain Heart Infusion)にそれぞれ等量ずつの検体(敗血症の血液など)を注入し、抗生剤添加あるいは無添加の条件の下、培養前、培養2時間後、培養4時間後に培地を回収し、菌体を遠沈・ペレット化して、それぞれDNAを抽出する。また、DNAの抽出は自動核酸抽出装置を使用するのが望ましい。
細菌検出用のリアルタイムPCR用試薬・条件及びプライマー構成は(実施例2)と同じである。
培養前の定量結果を0とし、抗生剤無添加にて培養2時間後、4時間後のそれぞれの定量結果を100として(抗生剤無添加時の増菌率を100%として)計算した場合、抗生剤添加での培養2時間後、4時間後の定量結果より増菌率を求めた。
例えば、培養前の菌量をN0h、抗生剤無添加培養2時間後の菌量をN2h、抗生剤添加培養2時間後の菌量をK2hとすると、
抗生剤添加2時間後の増菌率=(K2h−N0h)/(N2h−N0h)×100 (%)
と計算できる。或いは、増菌率の比較ではなく、菌量そのものを直接比較しても良い。
検出されたStaphylococcus epidermidisに対し、ゲンタマイシン(GM)10 μg/mL、エリスロマイシン(EM)10 μg/mLそれぞれの薬剤感受性を培養2時間後、4時間後にてそれぞれ評価した。その結果、2時間後、4時間後共にEMには感受性があるが、GMには感受性の無いことが判明した(図21(A))。但しStaphylococcus epidermidisは2時間の培養では増菌が少ない為、より正確に評価するには4時間後の方がよい。
検出されたBacillus cereusに対し、セファゾリン(CZ)10 μg/mL、アンピシリン(AP)10 μg/mL、エリスロマイシン(EM)10 μg/mLそれぞれの薬剤感受性を培養2、3、4時間後にてそれぞれ評価した。その結果、増菌の多い4時間後を評価すると、APには強い感受性があり(増菌率0%)、CZにもある程度の感受性が認められる(増菌率16%)が、EMには殆ど感受性が無い(増菌率76%)ことが分る(図21(B))。このように感受性の“程度”については菌の増殖の速さに左右されるため統一した時間設定が求められるが、抗生剤に対し強い感受性を示す、或いは全く感受性を示さないなどの評価は、培養2時間後などの早い段階でも判定可能であった。
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いた高感度検出法を用いて、迅速且つ簡便な子宮内感染症の羊水検査を行った。早産の最大の原因は子宮内感染症であり、胎児が死に至る危険を有するため、感染の有無を迅速に判定する検査法が求められている。子宮内感染症の感染微生物とは、細菌、真菌に加え、マイコプラズマやウレアプラズマの感染率が非常に高い。マイコプラズマ属・ウレアプラズマ属の塩基配列は細菌とは非常に異なり、細菌のユニバーサルプライマーでは検出できないため、それぞれのプライマーを別途用いる必要がある。
細菌および真菌検出用のPCR用試薬およびプライマー構成は、(実施例3)と同じである。
以下にマイコプラズマ属・ウレアプラズマ属の検出用のプライマー構成を示す。マイコプラズマ属・ウレアプラズマ属の検出にはnested PCR法を用いた。
マイコプラズマ属・ウレアプラズマ属検出にはe-DNAPを使用し、(実施例2)と同じPCR用試薬を用いた。PCRプログラムは(実施例2)と同じである。
Mycoplasma
Forward Primer: GATGATCATTAGTCGGTGG (配列番号50)
Mycoplasma Reverse
Primer: CTACCTTAGGCGGTCGTC (配列番号51)
Mycoplasma Forward
nested Primer: GACATCCTTCGCAAAGCTAT (配列番号52)
Mycoplasma Reverse
nested Primer: CAGTTACCCAGGCAGTATCTC (配列番号53)
Ureaplasma Forward
Primer: GAACGAAGCCTTTTAGGC (配列番号54)
Ureaplasma Reverse
Primer: GATACAGCTAGACGTTAAGCATCTA (配列番号55)
Ureaplasma Forward
nested Primer: TAACATCAATATCGCATGAGAAG (配列番号56)
Ureaplasma
Reverse nested Primer: CAGTACAGCTACGCGTCATT (配列番号57)
(2)PCR検出法
上記のプライマーセットにより、羊水中に細菌、真菌、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属のいずれかが存在するか否かを迅速且つ簡便に判定できる。検出法は、リアルタイムPCR法を用いても良いし、PCR産物をアガロースゲルに電気泳動して確認しても良い。e-DNAPを用いる(実施例3)の方法により、高感度に細菌および真菌を検出でき、また、nested
PCR法により高特異度にマイコプラズマ属およびウレアプラズマ属を検出できる。
子宮内感染症疑いの羊水検体1より、細菌の感染が確認された(図22(A))。また、切迫早産の羊水検体2からは、ウレアプラズマ属の感染が確認された(図22(B))。これらの検査は2時間程度で迅速且つ簡便に行うことが出来る。また、本実施例のプライマーセットは例えば培養細胞の培養液中のコンタミネーション(細菌・真菌・マイコプラズマ)など、生物実験環境におけるコンタミネーションの検査に用いることも可能である。
本発明にかかるe-DNAPおよび非表示法を用いた高感度検出方法に加え、“入れ子増幅法”の応用または伸長時間の工夫により1回の試行でnested PCRを行えば、高感度と迅速性を保ちながら更に高特異度な検出が可能となる。
(1)プライマーセットおよびPCR用試薬
細菌を宿主として製造した市販の耐熱性DNAポリメラーゼの多くは、E.Coliをその宿主とする。従って、E.Coliやその属に近い菌種を高感度に検出しようとしてPCRを行えば、自ずと偽陽性のリスクが高くなる。そのような問題を解決し、E.Coli を高感度・高特異度で検出するために、e-DNAPを用いた高感度検出方法と共に、“入れ子増幅法”の応用または伸長時間の工夫によりE.Coli特異的プライマーでOne Step semi-nested PCRを行った。尚、PCR用試薬は(実施例3)と同じである。以下にE.Coliに特異的なsemi-nestedプライマーセットを示す。
E. Coli specific
Forward Primer: TAACGGCTCACCTAGGCGA (配列番号58)
E. Coli specific Reverse
Primer: GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTG (配列番号59)
E. Coli specific
semi-nested Primer: GCAATATTCCCCACTG (配列番号60)
配列番号58、59のプライマーのTm値はそれぞれ65℃、配列番号60のsemi-nestedプライマーのTm値は55℃となるように設計した。
(2−1)“入れ子増幅法”の応用によるOne Step nested PCR法
配列番号58、59のプライマーによる増幅産物Iの長さは548bpであり、semi-nested PCR増幅産物IIの長さは110bpである。この様に、増幅産物の長さに明らかな差をつけて、それぞれの増幅産物のTm値の差が大きくなるようにプライマーの位置を設計した。その結果、増幅産物IのTm値は87℃、増幅産物IIのTm値は83℃となった。但し、増幅産物のGC%もTm値に影響するため、プライマー設計においては増幅産物のGC%についても十分に検討しなければならない。また、Tm値はPCR Bufferの塩濃度に影響されるため、塩濃度は常に一定に固定すべきである。
配列番号58、59のプライマーによる増幅産物Iの長さは548bpであり、semi-nested PCR増幅産物IIの長さは110bpである。この様に、増幅産物の長さに明らかな差をつけるようにプライマーの位置を設計した。
semi-nestedプライマーを含む3つのプライマーを混合し、“入れ子増幅法”の応用および伸長時間の工夫について、以下のプログラムにてリアルタイムPCRを行い、nested PCRにて上記増幅産物I、または増幅産物IIのみが増幅されるか増幅産物のTm値やその大きさにより確認した。
(3−1)外側の増幅産物Iのみが増幅されることの確認
表3および表4のAmplification 1のプログラム部分のみをそれぞれ50 cycle試行する。ポイントはアニーリング温度の70℃である。外側のプライマーのTm値は65℃、内側のsemi-nestedプライマーのTm値は55℃なので、70℃のアニーリングでは外側のプライマーしか結合しない。その結果、外側の増幅産物Iのみが増幅される。実験結果では確かに増幅産物IのTm値である87℃かつ548bpの増幅産物のみが増幅されている(図23(B)、図25)。
(3−2)内側の増幅産物IIのみが増幅されることの確認
表3および表4のAmplification 2のプログラム部分のみを50 cycle試行する。
表3の“入れ子増幅法”の応用におけるポイントはアニーリングの60℃と、Denaturationの85℃である。60℃のアニーリングではsemi-nestedプライマーを含めた全てのプライマーが結合するが、Denaturation温度が85℃だと内側の増幅産物II(Tm値83℃)はdenatureしても、外側の増幅産物I(Tm値87℃)はdenatureしない。その結果、内側の増幅産物IIのみが増幅される。実験結果では確かに増幅産物IIのTm値である83℃かつ110bpの増幅産物のみ(他はプライマーダイマー)が増幅される(図23(A)、図25)。
(3−3)e-DNAPおよび非表示法を用いた高感度定量方法であることの確認
表3および表4のプログラム設定でリアルタイムPCRを行った結果、E.Coliの存在下のみで増幅を認め、distilled water (D.W.)、Staphylococcus
aureus(S.aureus)、Human
DNAでは全く増殖を認めなかった(図24(A):表3および表4のAmplification 2の増幅のみ表示)。つまり、計60 cycle回してもE. Coli以外は全く増幅を認めず、e-DNAPおよび非表示法を用いて高感度定量が可能であることを確認した。
E. ColiのDNAをテンプレートとし、表3および表4のプログラム全体を通して増幅された産物はただ1つであり、その増幅産物のTm値は83℃かつ110bp、すなわち内側の増幅産物IIのみであった(図24(B)、図25)。この結果、“入れ子増幅法”の応用および伸長時間の工夫により、一回の試行(One Step)でnested PCRが可能であることを確認した。
以上の結果、e-DNAPおよび非表示法を用いて高感度定量方法を行うと同時に、“入れ子増幅法”の応用および伸長時間の工夫によるOne Step nested PCR法を組み合わせれば、PCRプログラムの工夫のみで、高感度と迅速性を保ちながら更に高特異度な検出が可能となることを確認した。尚、本実施例のnested PCRではE.Coliの特異的プライマーを組み合わせたが、例えば内・外共にバクテリアのユニバーサルプライマーを組み合わせる方法や、外側をバクテリアのユニバーサルプライマーにし、内側を菌種特異的プライマー(複数の特異的プライマーを用いたmultiplex PCRも行える)にする組合せも可能である。また、入れ子増幅法と伸長時間の工夫の両方を一緒にPCRプログラムに組み込むことで、より確実にOne Step nested PCR法を行うことが出来る。
未知の感染微生物に対し、複数のユニバーサルプライマーでPCRを行い、複数の増幅産物のTm値の組合せを解析することで感染微生物を迅速・簡便に同定する(WO2007/097323)。感染微生物がバクテリアの場合、本同定法ではバクテリアのユニバーサルプライマーを用いるため、e-DNAPを使用しなければ偽陽性のリスクが生じ、また高感度の検出が出来ない。すなわち、本実施例によるバクテリアの同定にはe-DNAPを使うことが望ましい。また、測定機器はRotorGene6000(キアゲン社)を使用することが望ましい。
(1)プライマーセットとPCR用試薬
バクテリアのユニバーサルプライマーとして、配列番号15〜28を使用する。これにより、7つのPCR増幅産物が出来る。PCR用試薬やPCR条件は(実施例2)に同じ。
(2)解析方法
敗血症患者の血液検体からDNAを抽出した後、上記リアルタイムPCRを試行して、7つのPCR増幅産物のそれぞれのTm値を得る。その7つのTm値の組合せを、以下のデータベースと照合する。この時、リアルタイムPCRの試行による定量結果も得られる。
(3)データベース
富山大学附属病院にて過去1年間に敗血症の陽性検体から抽出された45種のバクテリアそれぞれについて、7つのTm値の組合せが入力されている。尚、7つのTm値とは、配列番号15〜28のプライマーを用い、(実施例2)と全く同じPCR用試薬・PCR条件にて取得したものである。
(4)同定方法
患者検体から得られた7つのTm値の平均値を算出し、その平均値からの相対値(絶対値ではない為、±が生じる)を算出する。それら7つの相対値をD1ref〜D7refと記載する。同様に、データベース中のそれぞれのバクテリアについても算出し、それら7つの相対値をD1db〜D7dbと記載する。そして、データベース中の全てのバクテリアに対し、以下の計算を実施する。
(5)結果
患者検体から得られた未知のバクテリアにおける7つのTm値はそれぞれ、
84.98, 84.45, 84.84, 84.31,
81.20, 81.83, 81.12
であり、同定ソフトウェアによる算出の結果、Dist.=0.05であるKlebsiella pneumoniaeをDist.=0に最も近い起因菌として瞬時に同定することが出来た(表5:同定ソフトウェアによる算出結果)。また、定量も可能であった。
尚、Klebsiella pneumoniaeのデータベース上の7つのTm値はそれぞれ、
85.02, 84.48, 84.45, 84.29,
81.20, 81.84, 81.14, であった。
Claims (38)
- 耐熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
ことを特徴とする耐熱性DNAポリメラーゼ調製物。 - 以下の工程:
(1)耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を真核細胞に形質転換し、耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子発現形質転換体細胞を得る工程、
(2)前記形質転換体細胞を培養する工程、
(3)培養された形質転換体細胞より耐熱性DNAポリメラーゼを含む抽出物を取得し、該抽出物を熱処理する工程、または培養された形質転換体細胞を熱処理した後、熱処理された形質転換体細胞より耐熱性DNAポリメラーゼを含む抽出物を取得する工程、
を有することを特徴とする耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の製造方法。 - 前記熱処理の温度が50℃以上であることを特徴とする請求項2記載の製造方法。
- 形質転換に用いる耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子が好熱菌または超好熱菌由来で有る事を特徴とする請求項2または3に記載の製造方法。
- 耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子が、配列番号1の塩基配列からなるDNAである請求項2〜4のいずれかに記載の製造方法。
- 真核細胞が、菌類、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞のいずれかであることを特徴とする請求項2〜5のいずれかに記載の製造方法。
- 前記調製物が、
(1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない
ものである請求項2〜6のいずれかに記載の製造方法。 - 請求項2〜7のいずれかに記載の製造方法により得られた抽出物またはその精製調製物を含むことを特徴とする耐熱性DNAポリメラーゼ調製物。
- 検体中の検出対象生物を検出する方法において、
以下の工程:
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う増幅工程と、
(2)前記増幅工程における増幅産物中の前記目的遺伝子の増幅産物を検出する検出工程と、
を有し、
前記耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)耐熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
のいずれかであることを特徴とする検体中の検出対象生物の検出方法。 - 前記増幅工程が、前記目的遺伝子以外の目的外遺伝子の増幅抑制下で行われる請求項9に記載の検出方法。
- 前記目的外遺伝子の増幅抑制をホットスタート法により行う請求項10に記載の検出方法。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニットに対して、過剰量の抗DNAポリメラーゼ抗体を用いる請求項11記載の検出方法。
- 前記検出工程を、前記目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出として行う請求項9〜12のいずれかに記載の検出方法。
- 前記目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物を非検出とする条件を、
(1)前記目的遺伝子増幅産物の融解温度(TmA)が、前記目的外遺伝子の増幅産物の融解温度(TmB)よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
(2)前記増幅産物の検出を、TmAとTmBとの間の温度で行う
ことにより設定し、前記目的遺伝子の増幅産物のみを検出する方法を用いて行う
請求項13に記載の検出方法。 - 前記増幅工程と前記検出工程を、増幅産物の量を表示する表示装置を用いるリアルタイムPCRにより行い、前記目的外遺伝子の増幅産物が前記表示装置において非表示となる請求項14に記載の検出方法。
- 前記増幅産物の検出を、検出用の標識を有するインターカレーターにより行う請求項9〜15のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検出工程が、増幅産物をゲル上で展開することにより行われる請求項9〜12のいずれかに記載の検出方法。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物であり、該真核細胞が、菌類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のいずれかである請求項9〜17のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検出対象生物が細菌、真菌、ウイルスから選ばれる1種または2種以上である請求項9〜18に記載の検出方法。
- 前記検出対象生物が細菌であり、前記プライマーが、全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセットである請求項19に記載の検出方法。
- 前記検出対象生物が、感染症原因菌である請求項9〜20のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検体が、無菌環境であるべき検体である請求項9〜21のいずれかに記載の検出方法。
- 前記無菌環境であるべき検体が、血液、髄液、羊水、尿、食品、飲料、化粧品、水質検査に供される検体から選択される請求項22記載の検出方法。
- 前記検出工程において前記増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物を定量する請求項9〜23のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検出工程において前記目的遺伝子の増幅産物を定量または数値化し、その結果から前記検体中に含まれる検出対象生物の個体数を求める請求項24に記載の検出方法。
- 前記増幅産物を数値化する方法として吸光度測定法またはデンシドメトリー法を用いる請求項25記載の検出方法。
- 前記目的遺伝子が前記検出対象生物の同定用遺伝子であり、前記目的遺伝子の増幅産物の分析結果から前記検体中に含まれる検出対象生物を定量同定する請求項24に記載の検出方法。
- 検体中の検出対象生物を定量同定する方法において、
以下の工程:
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)及び(M)と、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
(3)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(F)と、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
(4)前記第二の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程および前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー(B)、(F)及び(M)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(F)全ての真菌の18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(M)メチリシン耐性を示すmecA遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一の増幅工程における耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)耐熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
のいずれかである
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。 - 検体中の検出対象生物を定量同定する方法において、
以下の工程:
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(B)と、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第一の増幅工程と、
(2)前記第一の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第一の定量同定工程と、
(3)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(F)と、細菌を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第二の増幅工程と、
(4)前記第二の増幅工程における複数(3〜10)の増幅産物の融解温度(Tm値)の組合せを前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)の組合せに基づいて解析し、前記検出対象生物を定量同定する第一の定量同定工程および前記第二の増幅工程における増幅産物を定量し、得られた定量結果から前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第二の定量同定工程と、
(5)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマー(M)と、耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、を用いて核酸増幅反応を行う第三の増幅工程と、
(6)前記第三の増幅工程における増幅産物の融解温度(Tm値)を前記目的遺伝子の増幅産物に特異的な融解温度(Tm値)に基づいて解析し、前記検体中の検出対象生物の定量同定を行う第三の定量同定工程と、
を有し、
前記プライマー(B)、(F)及び(M)が、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(F)全ての真菌の18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(M)メチリシン耐性を示すmecA遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
であり、
第一及び第三の増幅工程における耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物である
ことを特徴とする検体中の検出対象生物の定量同定方法。 - 前記細菌の16SrRNA遺伝子の増幅領域が3〜10箇所である請求項28または29記載の定量同定方法。
- 前記真菌の18SrRNA遺伝子の増幅領域が3〜10箇所である請求項28〜29のいずれかに記載の定量同定方法。
- 標準コントロールとして、一定濃度の大腸菌標準株DNAをテンプレートとし、
全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または一部を含むプライマーセットのいずれか1つを用いて標準Tm値を毎回測定することにより、前記増幅産物のTm値の測定誤差を補正する工程が付加された請求項28〜31のいずれかに記載の定量同定方法。 - 各増幅領域に基づく増幅産物の融解温度の組合せ(TmM1〜TmMN:Nは3〜10)を、前記検出対象生物に特異的な融解温度の組合せ(TmS1〜Tmsn:nは3〜10)に基づいて解析して、前記検出対象生物を定量同定する請求項28〜32のいずれかに記載の定量同定方法。
- 前記検出対象生物を同定するためのアルゴリズムとしてTm値そのものの組合せだけでなく、各Tm値間の差の組合せを利用して同定することで、測定誤差の影響を最小限とする工程が付加された請求項33に記載の定量同定方法。
- 検体中に含まれる検出対象生物の定量及び/または同定を行うためのセットであって、
検体から調製した核酸を増幅するための耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有し、
前記耐熱性DNAポリメラーゼ調製物が、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)耐熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
であることを特徴とする定量または同定用のセット。 - 検体中に含まれる検出対象生物の定量及び/または同定を行うためのセットであって、
検体から調製した核酸を増幅するための、
(A)真核細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物、及び
(B)耐熱性DNAポリメラーゼ調製物であって、
(B−1)耐熱性DNAポリメラーゼ1ユニット中に該耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を除くバクテリア由来核酸の混入が10fg以下であり、
(B−2)前記調製物に対して耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外のバクテリア由来の核酸のみを増幅させうるプライマーを用いて、鋳型を加えない条件下32サイクル以上の遺伝子増幅反応を行ってもバクテリア由来の核酸の増幅産物を検出しない耐熱性DNAポリメラーゼ調製物
のいずれかの耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
検体から調製した核酸を増幅するための細菌細胞を宿主として製造した耐熱性DNAポリメラーゼ調製物と、
前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、
を有することを特徴とする定量及び/または同定用のセット。 - 前記プライマーが、以下のプライマー(B)、(F)及び(M)、
(B)全ての細菌の16SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(F)全ての真菌の18SrRNA遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセット、および各プライマー塩基配列の全部または1/3以上を含むプライマー、
(M)メチリシン耐性を示すmecA遺伝子など、その時々の流行に応じた抗生剤耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、
である請求項36に記載のセット。 - 検体中に含まれる検出対象生物の定量及び/または同定を行うためのシステムにおいて、
(1)前記検体から調製した核酸と、前記検出対象生物に特異的な目的遺伝子を増幅するためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼと、を用いて核酸増幅反応を行うための増幅装置と、
(2)前記増幅工程における増幅産物の定量を行うための定量装置と、
(3)前記前記増幅産物の定量結果により前記検体中の検出対象生物の量を算出する算出装置と、
(4)前記目的遺伝子の増幅産物の定量結果から前記検体中の検出対象生物の量を算出するためのデータベースと、
を有し、
請求項9〜34のいずれかに記載の検出方法または定量同定方法を行うためのものであることを特徴とする定量及び/または同定システム。
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