MX2011007548A - Preparacion enzimatica que contiene polimerasa de adn termoestable, metodo para su produccion, y metodo para detectar un organismo objeto. - Google Patents

Abstract

Se describe una preparación de polimerasa de ADN termoestable que puede reducir ilimitablemente el riesgo de positividad falsa en la detección de un microorganismo objeto utilizando una reacción de amplificación de gen y, por lo tanto, que permite la amplificación selectiva del ADN para detectar el microorganismo objeto incluso cuando la cantidad del microorganismo objeto es pequeña y, por lo tanto, la cantidad de ADN recolectado del mismo es extremadamente pequeña, y se puede producir a un coste reducido. También se describe un método para cuantificar o cuantificar/identificar un organismo objeto que se detectará de manera rápida y adecuada con alta sensibilidad utilizando la preparación de la presente invención.

Description

PREPARACION ENZIMATICA QUE CONTIENE POL1MERASA DE ADN TER OESTABLE, METODO PARA SU PRODUCCION, Y METODO PARA DETECTAR UN ORGANISMO OBJETO Campo de la Invención La presente invención se refiere a una preparación enzimática que contiene una polimerasa de ADN termoestable, un método para su producción, y un método para detectar un organismo objeto.

Antecedentes de la Invención En los últimos años, una reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) deseada para detectar hongos, bacterias, virus, u otros organismos específicos ha mejorado su popularidad en la medicina, veterinaria, alimento, y otros campos debido a que los resultados de análisis pueden conocerse en un corto período de tiempo tal como aproximadamente 2 horas. Sin embargo, una tecnología para detectar hongos, bacterias, virus u otros organismos no especificados en un corto período de tiempo aún no se ha establecido.

Se esperan méritos muy grandes cuando un rastro de un organismo no específico puede detectarse, identificarse, y cuantificarse de un lugar que debe estar en un ambiente estéril en la naturaleza. Por ejemplo, pueden utilizarse sangre, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, urea, o similares como una muestra para que el análisis detecte e identifique la infección de humanos o animales domésticos, llevando a la administración de un antibiótico efectivo en una etapa temprana. Además, el estado de recuperación puede supervisarse usando el valor cuantitativo de bacterias infectantes. Grandes méritos en el campo del control de calidad de agua de la vida diaria, alimentos, cosméticos, y similares pueden también esperarse. Por ejemplo, la presencia de bacterias indeseadas, hongos, virus u otros organismos no especificados puede detectarse e identificarse rápidamente en el agua de la vida diaria que las personas tienen una posibilidad de inhalar (consumir) en la vida. Tal agua incluye, agua del grifo, agua de un tanque de agua, agua circulante del aire acondicionado, agua de un humidificador, agua de manantial caliente, y agua de la piscina, alimentos, y cosméticos. Además, el nivel de presencia puede supervisarse con alta sensibilidad. Así, se asume que el establecimiento de un método para cuantificar o identificar de manera simple y rápida un microorganismo objeto que se detectará en una muestra con alta sensibilidad rinde el campo de ondulación de la tecnología muy amplia; así, por lo tanto existe una fuerte necesidad de tal método.

La sepsia es una infección sistémica seria y en cuyo diagnóstico definitivo la detección/identificación de un microorganismo causante en la sangre es obligatoria. El número de pacientes que tienen sepsia ha aumentado recientemente con la sofisticación del tratamiento médico tal como tratamiento del cáncer o trasplante de órganos. En vista de infecciones en hospitales, las bacterias resistentes a múltiples fármacos incluyendo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA por sus siglas en inglés) constituyen a menudo una bacteria causante de la sepsia; así, para seleccionar un antibiótico adecuado para salvar la vida de pacientes, es clínicamente importante detectar e identificar un microorganismo causante en la sangre lo más rápido posible.

La infección intrauterina, que es la causa más común del nacimiento prematuro, es una infección seria fatal para los fetos; así, será importante para salvar la vida de los fetos detectar e identificar un microorganismo causante de la misma en el fluido amniótico lo más rápido posible, y administrar el antibiótico más adecuado en una etapa temprana de ocurrencia de la misma. Similarmente, en el campo veterinario, la mamitis bovina es una enfermedad muy seria para vacas lecheras, por ejemplo; cuando se retrasa el tratamiento de la misma, frecuentemente no existen otros medios distintos a la extracción, que también conduce a problemas industriales.

Sin embargo, los métodos de cultivo utilizan botellas de cultivo y los medios selectivos se utilizan normalmente en métodos de detección presentes para infectar microorganismos. Tardan por lo menos varios días para obtener los resultados de los mismos. Por lo tanto, clínicamente, en la actualidad, se está obligado a realizarse la terapia empírica hasta que se revelen los resultados. A consecuencia, un antibiótico se ve obligado a seleccionarse ciegamente, lo que representa una gran desventaja, mientras que se requiere que sea rápida la detección. Algunos microorganismos pueden tener genes resistentes a antibióticos. Por lo tanto, una prueba de susceptibilidad a fármaco se realiza a menudo paralelamente; sin embargo, toma varios días producir los resultados como con el método de detección para identificación. A consecuencia, el aspecto de las bacterias resistentes a múltiples fármacos debido al uso de antibióticos de amplio espectro y la elección inadecuada de antibióticos causan una situación, por ejemplo, que los pacientes con sepsia y fetos con infección intrauterina no pueden salvarse; y se está obligado a que las vacas lecheras con mastitis sean sacrificadas. Además, la detección de bacterias heterotrópicas tiene un riesgo elevado de producir resultados falso-negativos debido a que necesita condiciones especiales de cultivo.

Contra tal antecedente, la detección de bacterias no identificadas se ha estudiado utilizando PCR: se ha hecho un intento por detectar e identificar un microorganismo causante de la sepsia amplificando un rastro de ADN del microorganismo causante por PCR; e hibridando el ADN del microorganismo causante amplificado por una sonda de nucleótido específico a cepa dirigida en un microorganismo empíricamente asumido (J P06-90799A). Además, el desarrollo de una técnica de detección para la sepsia utilizando PCR en tiempo real que utiliza pruebas de hibridación como un principio de base se ha estudiado para una detección/identificación más rápida de un microorganismo causante (Journal of Analytical Bio-Science, Vol. 28, No. 5 (2005) 400-404). Un método de detección/identificación rápido para un microorganismo causante ha sido estudiado realizando la amplificación del gen por una PCR utilizando el ADN del microorganismo con un molde y un sistema de cebador específico, y después analizando la combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de los productos resultantes, específicos para los microorganismos o la diférencia entre los valores Tm (WO2007/097323). Sin embargo, la exactitud debe también asegurarse en los resultados obtenidos en un corto período de tiempo utilizando una PCR. Así, por una PCR, también puede decirse que es importante hacer a la sensibilidad compatible con la especificidad. Estas técnicas anteriores aplican técnicas de amplificación de gen utilizando una PCR, pero son métodos limitados para microorganismos objeto asumidos. Así, no pueden detectarse microorganismos cuando está fuera del alcance de la suposición. Incluso cuando se utilizan como métodos de detección/identificación para los microorganismos no identificados, una técnica para cuantificarlos no se ha establecido y ha sido imposible.

La PCR en tiempo real es un único método con el cual una curva de amplificación con el transcurso del tiempo puede exhibirse. Por lo tanto, en la actualidad, se proporciona una técnica crucial de detección para la determinación cuantitativa de la expresión de gen. Particularmente, los métodos de detección utilizando intercaladores tal como SYBR Green son amplia y frecuentemente utilizado en todo el mundo, debido a que tienen bajo costo y son simples y adecuados. Sin embargo, la PCR en tiempo real utiliza un intercalador que detecta no sólo un objetivo sino también productos de amplificación no específicos, planteando un problema en donde la sensibilidad de detección del mismo es disminuida. Un producto de amplificación no específico problemático particularmente así formado es un dímero de cebador. Para suprimir la formación de un dímero de cebador, varios medios son propuestos ideando el diseño de cebadores, utilizando el método de Hot Start, un método de amplificación que utiliza cebadores modificados (JP2002-291490A), una PCR de Hot Start utiliza un reactivo mejorado para una PCR (JP2003-259882A), y un método que involucra agregar una sustancia que une al dímero de cebador a una muestra (JP2006-254784A). Sin embargo, es extremadamente difícil inhibir completamente la formación de productos de amplificación no específicos incluyendo un dímero de cebador. Incluso cuando varios métodos para suprimir la formación del dímero de cebador se utilizan, los productos de amplificación no específicos se detectan dependiendo del número creciente de ciclos de PCR, que es el factor principal para la sensibilidad disminuida en la medición cuantitativa utilizando la PCR en tiempo real. Incluso en la detección cualitativa, el valor Tm (temperatura de fusión) debe comprobarse en cada medición para excluir el "falso-positivo" debido al dímero de cebador, por ejemplo, que se ha convertido en un problema grave para el sistema de medición de PCR en tiempo real.

Para proporcionar una polimerasa de ADN usada para PCR, se ha estudiado un método para producir una preparación de polimerasa de ADN que utiliza una tecnología de recombinación genética (JP2006-180886A). Entre las preparaciones de polimerasa de ADN termoestables comerciales comúnmente usadas para la reacción PCR, las preparaciones de alta pureza están también comercialmente disponibles; sin embargo, incluso en la reacción PCR que utiliza cada una de estas preparaciones de alta pureza, se detectan productos de amplificación no específicos de origen desconocido, por ejemplo, cuando la reacción de amplificación de gen necesita realizarse en ciclos convencionales (aproximadamente 30) o más, que ha limitado el uso de la misma.

Se han desarrollado varias técnicas para asegurar alta especificidad en el método de PCR. El método más simple es un método de PCR interna, que, sin embargo, necesita el esfuerzo y tiempo de realizar la PCR dos veces. Por consiguiente, se propone un "método de amplificación interna" que involucre realizar la PCR interna por un solo proceso de PCR (JP05-292968A). Este método es un método excelente en el cual la PCR interna puede realizarse utilizando solamente un solo perfil de ciclo térmico; sin embargo, aún no ha sido puesto en práctica posiblemente debido a la ausencia de técnica por la cual los valores Tm de cebadores y un producto de amplificación podrían medirse fácilmente al momento de aplicación. Este método puede ponerse en práctica en la actualidad debido a que está disponible una técnica de PCR en tiempo real. Otros métodos tales como un método utilizando Hybri-Probe y un método de PCR de TaqMan se utilizan generalmente; sin embargo, la preparación de pruebas usadas para estos métodos no es fácil para cada uno y el costo para la preparación de las mismas es también costoso. Por lo tanto, en la actualidad, todavía no existe tal método que satisfaga la rapidez, simplicidad, y eficacia económica.

Como se describe anteriormente, cuando simplemente se amplifica el ADN de un residuo de un microorganismo de muestra y analiza, en particular, realizando el análisis de cuantificación o identificación del ADN en un tiempo corto puede llevarse a cabo, puede realizarse el análisis incluso de un nivel de residuo de un gen previamente incapaz de analizarse. Además, puede realizarse la determinación rápida y exacta en los campos de la medicina, veterinaria, y análisis de varias muestras tal como agua y alimentos de la vida diaria. Mientras tanto, sin embargo, en la PCR para la amplificación de un residuo de ADN de microorganismo de muestra, el control de la sensibilidad y especificidad a altos grados todavía no se ha alcanzado y la cuantificación o cuantificación/identificación rápida para ios microorganismos no identificados tampoco se ha alcanzado aún.

Breve Descripción de la Invención Problema Técnico Un objeto de la presente invención es proporcionar una mejor preparación de la polimerasa de ADN termoestable adecuada para la amplificación de un residuo de ADN de microorganismo de muestra utilizando un método de PCR y proporcionar un método de análisis adecuado para el análisis inicial de un residuo de un microorganismo de muestra utilizando la preparación de la polimerasa de ADN.

Solución del Problema La presente especificación incluye las siguientes invenciones.

(I) Una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, en donde: (1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable.

(II) Un método de producción para una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, que comprende: (1) células eucariotas de transformación con un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable para proporcionar células transformadas que expresan el gen de la polimerasa de ADN termoestable; (2) cultivar las células transformadas; y (3) obtener un extracto que contiene la polimerasa de ADN termoestable de las células transformadas cultivadas, seguido por someter el extracto al tratamiento por calentamiento; o someter las células transformadas cultivadas a tratamiento por calentamiento, seguido de obtener un extracto que contiene la polimerasa de ADN termoestable de las células transformadas tratadas por calentamiento.

(III) Un método de detección para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una etapa de amplificación pare realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y la preparación de la polimerasa de ADN termoestable; y (2) una etapa de detección para detectar un producto de amplificación del gen deseado en productos de amplificación en la II etapa de amplificación, en donde la preparación de la polimerasa de ADN termoestable es cualquiera de: (A) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable.

(IV) Un método de cuantificación/identificación para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores (B) y (M), para amplificar un gen específico deseado para el organismo objeto que se detectará, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, (2) una primera etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en la primera etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para productos de amplificación del gen deseado para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra, (3) una segunda etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores (F), para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una bacteria como un anfitrión, y (4) una segunda etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en el segunda etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para un producto de amplificación del gen deseado para cuantificar los productos de amplificación en la primera etapa de cuantificación/identificación para poder cuantificar/identificar el organismo objeto que se detectará y la segunda etapa de amplificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación obtenidos, en donde los cebadores (B), (F), y (M) son: (B) un conjunto de cebador capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todo o 1/3 o más cada uno de las secuencias base de los cebadores anteriores, (F) un conjunto de cebador capaz de amplificar una pluralidad de regiones del gen de ARNr 18S de todos los hongos, en donde cada cebador comprende toda, o 1/3 o más de cada una de las secuencias base del mismo, y (M) un conjunto de cebadores específicamente amplifica un gen resistente a antibiótico que refleja una propagación epidémica del tiempo actual tal como un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina en donde la preparación de la polimerasa de ADN termoestable en la primera etapa de amplificación es cualquiera de: (A) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando se realizan 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable.

(V) Un método de cuantificación/identificación para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores (B) para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, (2) una primera etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en la primera etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para los productos de amplificación del gen deseado para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra, (3) una segunda etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores (F), para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una bacteria como un anfitrión, (4) una segunda etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en el segunda etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para los productos de amplificación del gen deseado para cuantificar los productos de amplificación en la primera etapa de cuantificación/identificación para poder cuantificar/identificar el organismo objeto que se detectará y la segunda etapa de amplificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación obtenidos, (5) una tercera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores (M) para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, y (6) una tercera etapa de cuantificación/identificación para analizar temperaturas de fusión (valores Tm) de los productos de amplificación en la tercera etapa de amplificación basada en las temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para productos de amplificación del gen deseado para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra, en donde los cebadores (B), (F) y (M) son: (B) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias en donde el cada cebador comprende toda, o 1/3 o más de cada una de las secuencias base del mismo, (F) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones del gen ARNr 18S de todos los hongos, en donde cada cebador comprende toda, o 1/3 o más de cada una de las secuencias base del mismo, y (M) un conjunto de cebadores específicamente amplifica un gen resiste a antibiótico que refleja una propagación epidémica en tiempo presente tal como un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina, en donde son las preparaciones de la polimerasa de ADN termoestable en las primera y tercera etapas de amplificación: (A) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable.

(VI) Un sistema para cuantificar e identificar un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra, que comprende una preparación de la polimerasa de ADN termoestable para amplificar el ácido nucleico preparado de la muestra y cebadores para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objeto sea detectado, en donde las preparaciones de la polimerasa de ADN termoestable son: (A) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable.

(VII) Un sistema para cuantificar e identificar un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra, que comprende: cualquiera de (A) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de la polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable para amplificar el ácido nucleico preparado de la muestra, una preparación de la polimerasa de ADN termoestable para amplificar el ácido nucleico preparado de la muestra, producida utilizando células bacterianas como un anfitrión, y cebadores para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objeto sea detectado.

(VIII) Un sistema para cuantificar e identificar un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra, que comprende: (1) un amplificador para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objeto sea detectado, y una polimerasa de ADN termoestable, (2) un dispositivo de cuantificación para cuantificar el producto amplificado en la etapa de amplificación, (3) una computadora para calcular la cantidad del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación del producto de amplificación del gen deseado, y (4) una base de datos para calcular la cantidad del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación del producto de amplificación del gen deseado, en donde el sistema está para realizar el método de detección o el método de cuantificación/identificación.

Efectos Ventajosos de la Invención Con respecto a la detección del microorganismo de muestra utilizando una reacción de amplificación de gen, una preparación de la polimerasa de ADN termoestable puede proporcionarse de acuerdo con la presente invención. La preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención no sólo permite la amplificación selectiva del ADN para detectar un microorganismo de muestra incluso cuando la cantidad del microorganismo de muestra es limitada y la cantidad de ADN recolectada de la misma es extremadamente pequeña, pero también permite la reducción del costo de producción.

Además de la preparación de la polimerasa de ADN termoestable, el uso de un método de Dímero de Cebador enmascarado permite la detección cuantitativa sin reducir la sensibilidad y elimina el riesgo de positividad falsa debido a un dímero de cebador en la detección cualitativa, debido a que la formación del dímero de cebador no se convierte en un obstáculo para el método de PCR en tiempo real utilizando un intercalador. Así, haciendo posible la cuantificación. exacta al límite de sensibilidad de detección (procedimiento de cuantificación sensible). Además, este método es simple y económico comparado con los métodos convencionales tal como un método de Hot Start utilizando un anticuerpo anti-Taq.

Además, la PCR interna altamente específica que requiere normalmente dos redondos de PCR puede realizarse rápidamente en solamente un redondo (una etapa), aplicando un "método de amplificación interna" (J P05-292968A) o planeando el tiempo de propagación para PCR. El diseño de cebadores es simple y económico comparado en comparación con el del método de Hybri-Probe, el método de TaqMan, o similares.

Además de la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención, el método de Dimero de Cebador enmascarado y el método de PCR interna de una sola etapa pueden utilizarse en combinación para realizar la PCR altamente sensible, altamente específica rápido y simplemente.

De acuerdo con la presente invención, puede proporcionarse rápidamente un método para simplemente cuantificar o identificar un organismo objeto que se detectará con alta sensibilidad mediante examen genético. Este método también permite la^ rápida, simple y alta cuantificación sensible de un organismo objeto que se detectará para cualquier muestra que deba estar en un ambiente estéril o en donde la contaminación con un residuo del organismo objeto que se detectará es un problema. Además, este método de cuantificación o cuantificación/identifícación permite el control de un estado en cual el número de bacterias es controlado o cambiado en el cuerpo de un paciente, para el mantenimiento de una condición estéril o el número de bacterias, la confirmación de un efecto terapéutico sobre un cambio en la cantidad de bacterias infectantes, o similares. La combinación del cultivo de una muestra y el método de cuantificación altamente sensible de la presente invención permite la prueba de susceptibilidad del fármaco a realizarse rápidamente.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un diagrama relacionado con un análisis del árbol genealógico realizado basado en las secuencias de gen ARNr 16s bacteriano y ARNr 18s de célula eucariótica.

La Figura 2 es una fotografía de SDS-PAGE después del tratamiento por calentamiento.

La Figura 3 muestra un límite de detección de PCR utilizando una preparación de la polimerasa de ADN termoestable que utiliza el ADN de Escherichia Coli como molde.

La Figura 4 muestra los resultados de verificación de la contaminación del ácido nucleico no específico que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable.

La Figura 5(A) es una gráfica que muestra un análisis de la curva de amplificación de PCR en tiempo real que utiliza AmpliTaq Gold LD; y la Figura 5(B) es una gráfica que muestra un análisis de la curva de amplificación de PCR en tiempo real que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión.

La Figura 6(A) es una gráfica que muestra un análisis de la curva de fusión de PCR en tiempo real que utiliza AmpliTaq Gold LD; y la Figura 6(B) es una gráfica que muestra un análisis de la curva de fusión de PCR en tiempo real que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión.

La Figura 7 muestra los resultados de la verificación de contaminación del ácido nucleico no específico que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando A. oryzae como un anfitrión.

La Figura 8 es una gráfica que muestra un análisis de la curva de amplificación de PCR en tiempo real que utiliza un método de Dímero de Cebador enmascarado. La Figura 8(A) muestra un análisis que utiliza una preparación termoestable de la polimerasa de ADN derivada de T. aquaticus producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión, la Figura 8(B) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de P. furiosus producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión, la Figura 8(C) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. gorgonarius muíante producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión. La Figura 8(D) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquaticus producida utilizando P. pastoris como un anfitrión, y la Figura 8(E) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquaticus producida utilizando Tobacco BY-2 como un anfitrión.

La Figura 9 es una gráfica que muestra un análisis de la curva de fusión de PCR en tiempo real. La Figura 9(A) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquaticus producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión, la Figura 9(B) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de P. furiosus mutante producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión, la Figura 9(C) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. gorgonarius mutante producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión, la Figura 9(D) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquaticus producida utilizando P. pastoris como un anfitrión, y la Figura 9(E) muestra un análisis que utiliza una preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquaticus producida utilizando Tobacco BY-2 como un anfitrión.

La Figura 10(A) es una gráfica que muestra un ajuste de condición de PCR convencional y un punto de detección de fluorescencia, y la Figura 10(B) es una gráfica que muestra un punto de detección de fluorescencia en un método de Dímero de Cebador enmascarado.

La Figura 11(A) muestra el arreglo de cebadores y productos de amplificación en un método de PCR semi-interna de una etapa. La Figura 11(B) muestra el arreglo de los cebadores y productos de amplificación en un PCR interna de una etapa. La Figura 11(C) muestra una pluralidad de valores Tm (Bad a Bac5) obtenidos de bacterias y valores relativos (d1 a d5) del promedio de los valores Tm.

La Figura 12 es un diagrama de bloque que muestra un ejemplo de un sistema para realizar la cuantificación y/o identificación de un organismo objeto que se detectará de acuerdo con la presente invención.

La Figura 13 es una gráfica que muestra un análisis de la curva de amplificación realizado en las condiciones del programa descritas en la Tabla 1. En este dibujo, "A" muestra una curva de amplificación de E. coli, y "B" muestra una curva de amplificación del agua destilada (D.W.).

La Figura 14 es una gráfica que muestra un análisis de la curva de fusión realizado en las condiciones del programa descritas en la Figura 1. En este dibujo, "A" muestra una curva de fusión de E. coli, y "B" muestra una curva de fusión de un dímero de cebador.

La Figura 15(A) es una gráfica que muestra una curva de amplificación de resultados de PCR en tiempo real en las condiciones del programa descritas en la Figura 2. En este dibujo, "A" muestra una curva de amplificación de E. coli, y "B" muestra una curva de amplificación del agua destilada (D.W.). La Figura 15(B) es una gráfica que muestra el resultado de un examen de bacterias/hongos infecciosos que utiliza una solución de extracción del ADN de cada muestra de prueba como un molde. En este dibujo, "A" es una curva de amplificación de C. albicans como un control positivo, "B" es una curva de amplificación del agua destilada (D.W.), agua de la llave, agua de manantial, agua de manantial caliente, y agua del aire acondicionado. La Figura 15(C) es una gráfica que muestra el resultado de la medida de bacterias infecciosas utilizando una solución de extracción del ADN de cada muestra de prueba como un molde. En este dibujo, "A" es una curva de amplificación de E. coli (número de ciclos: 14.47) como un control positivo, "B" es una curva de amplificación del agua de manantial caliente (número de ciclos: 30.54), "C" es una curva de amplificación del agua del aire acondicionado (número de ciclos: 28.96), y D es una curva de amplificación de la curva de amplificación del agua destilada (D.W.), agua de la llave, y agua de manantial, respectivamente.

La Figura 16 es una gráfica que muestra un resultado del examen de hongos infecciosos cuando un petisú se utiliza como muestra. La Figura 16(A) es una curva de proliferación cuando se utiliza un petisú reciente. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de C. albicans como un control positivo (número de ciclos: 23.78), y "B" es una curva de proliferación del agua destilada (D.W.) y un petisú (crema) (número de ciclos: 45.71). La Figura 16(B) es una curva de proliferación cuando se utiliza un petisú viejo. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de C. albicans como un control positivo (número de ciclos: 23.78), y "B" es una curva de proliferación del agua destilada (D.W.) y un petisú (crema) (número de ciclos: 44.37).

La Figura 17 es una gráfica que muestra un resultado del examen de bacterias infecciosas cuando se utiliza un petisú como una muestra. La Figura 17(A) es una curva de proliferación cuando se utiliza un petisú reciente. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de E. coli como un control positivo (número de ciclos: 26.55), y "B" es una curva de proliferación del agua destilada (D.W.) y un petisú (crema). La Figura 17(B) es una curva de proliferación cuando se utiliza un petisú viejo. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de E. coli como un control positivo (número de ciclos: 23.78), "B" es una curva de proliferación de un petisú (crema) (número de ciclos: 24.48), y "C" es una curva de proliferación del agua destilada (D.W.).

La Figura 18 es una gráfica que muestra un resultado de examen que utiliza una muestra de sangre del paciente A con septicemia por C. albicans. La Figura 18(A) es una curva de proliferación de un cebador universal fungicida. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de C. albicans como un control positivo (número de ciclos: 27.51), "B" es una curva de proliferación de una muestra de sangre (paciente A: número de ciclos: 33.70), y "C" es una curva de proliferación del agua destilada (D.W.). La Figura 18(B) es una curva de proliferación de un cebador bacteriano universal. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de E. coli como un control positivo (número de ciclos: 33.70), y "B" es una curva de proliferación de una muestra del análisis de sangre (paciente A) y agua destilada (D.W.).

La Figura 19 es una gráfica que muestra un resultado de examen que utiliza una muestra de sangre del paciente B con septicemia por especies Bacillus. La Figura 19(A) es una curva de proliferación de un cebador universal fungicida. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de C. albicans como un control positivo, y "B" es una curva de proliferación de una muestra de sangre (paciente B) y agua destilada (D.W.). La Figura 19(B) es una curva de proliferación de un cebador universal bacteriano con respecto a una muestra de sangre. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de E. coü como un control positivo (número de ciclos: 22.53), "B" es una curva de proliferación de una muestra de sangre (paciente B: número de ciclos: 34.07), y "C" es una curva de proliferación de agua destilada (D.W.). La Figura 19(C) muestra una curva de proliferación de un cebador universal bacteriano con respecto a una muestra dé prueba de cultivo de sangre. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de una muestra de prueba de cultivo de sangre (paciente B: número de ciclos: 14.47), "B" es una curva de proliferación de E. coli como un control positivo (número de ciclos: 25.64), y "C" es una curva de proliferación de agua destilada (D.W.).

La Figura 20 muestra un resultado de PCR en tiempo real utilizando ADN de MRSA como un molde, y utilizando un cebador específico a MRSA. "A" es una curva de proliferación con un cebador de Spa, "B" es una curva de proliferación con una cebador de mecA, "C" es una curva de proliferación con una cebador universal bacteriano, y "D" es una curva de proliferación con una cebador universal fungicida.

La Figura 21(A) es una gráfica que muestra la medida de sensibilidad de fármaco del Staphylococcus epidermidis detectada con respecto a la gentamicina (GM) y eritromicina (EM) de la cantidad de enriquecimiento durante el transcurso del tiempo. La Figura 21(B) es una gráfica que muestra la medida de sensibilidad del fármaco de Bacillus cereus con respecto a cefazolina (CZ), ampicilina (AP), y eritromicina (EM) del índice de enriquecimiento durante el transcurso del tiempo.

La Figura 22(A) muestra el resultado de la medida de bacterias/hongos infecciosos en una muestra de fluido amniótico No.1 con infección intrauterina, y la Figura 22(B) muestra el resultado de la medida de bacterias/hongos infecciosos en una muestra de fluido amniótico No. 2 con riesgo de suministro prematuro. "A" a "C" son los resultados de detección frustrados que utilizan cebadores universales bacterianos, y "A": agua destilada, "B": E. coll como control positivo, y "C": se muestra la muestra de fluido amniótico. "D" a "F" son los resultados de detección frustrados utilizando cebadores universales fungicidas, y se muestran "D": agua destilada, "E": C. albicans como un control positivo, y "F": muestra de fluido amniótico. "G" a "H" son los resultados de detección frustrados utilizando un cebador específico al género Mycoplasma, y se muestran "G": agua destilada, "H": control positivo de micoplasma, "I": muestra de fluido amniótico. "J" a "L" son los resultados de detección frustrados utilizando un cebador específico del género Ureaplasma, y se muestran "J": agua destilada, "K": Control positivo de Ureaplasma, y "L": muestra de fluido amniótico.

La Figura 23 muestra una confirmación de sí o no la PCR interna es realizada bien usando un valor Tm de un producto de amplificación mezclando tres cebadores que incluyen un cebador semi-interna. La Figura 23 (A) muestra que solamente un producto de amplificación externo I (valor Tm: 87°C) se amplifica cuando solamente se realiza la amplificación 1 en las Tablas 3 y 4. La Figura 23 (B) muestra que solamente se amplifica un producto de amplificación interna interno II (valor Tm: 83°C) (otros son dímeros de cebador) cuando solamente se realiza la amplificación 2 en las Tablas 3 y 4.

La Figura 24 muestra la confirmación que es bien realizada la PCR altamente sensible y altamente específica mezclando un método de detección altamente sensible utilizando e-DNAP, un método de no exhibición y un método de PCR interna de una etapa utilizando una muestra actual. La Figura 24 (A) es una curva de proliferación cuando se realiza un programa de la Tabla 3 o Tabla 4 con un cebador específico de E. coli. En este dibujo, "A" es una curva de proliferación de E. coli, y "B" es una curva de proliferación de agua destilada (D.W.) y S. aureus, ADN humano. La Figura 24(B) es una curva de fusión cuando se realiza un programa de la Tabla 3 o Tabla 4 con un cebador específico a E. coli. "A" es una curva de fusión de E. coli, y "B" es una curva de fusión de agua destilada (D.W.) y S. aureus, ADN humano. El producto de amplificación en este dibujo es solamente el producto de amplificación interna interno II (valora de Tm: 83°C), y no se observan otros productos de amplificación tal como productos de amplificación de agua destilada (D.W.), S. aureus, y ADN humano.

La Figura 25 muestra la confirmación de sí o no es realiza bien la PCR interna del tamaño de un producto de amplificación mezclando tres cebadores que incluyen un cebador semi-interna. Cuando solamente se realiza la amplificación 1, solamente se amplifica el producto de amplificación externo I (548 bp). Cuando solamente se realiza la amplificación 2, solamente se amplifica el producto de amplificación interna interno II (110 bp). Cuando se realizan las amplificaciones 1 + 2, solamente se amplifica el producto de amplificación interna interno II (110 bp).

Descripción de las Modalidades (1) Preparación de la polimerasa de ADN termoestable Los presentes inventores produjeron una polimerasa de ADN termoestable que utiliza la recombinación genética utilizando una bacteria como un anfitrión de la misma manera que para la preparación de la polimerasa de ADN termoestable comercial, y estudiaron la aplicación de la preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida para PCR para detectar un organismo objeto que se detectará contenida en una muestra. Sin embargo, con respecto a la detección del microorganismo objeto que se detectará utilizando PCR incluso cuando la cantidad del microorganismo en una muestra es pequeña y la cantidad de ADN recolectado de la misma es extremadamente pequeña, ninguna preparación de la polimerasa de ADN termoestable podrá proporcionarse por el proceso convencional, el cual podría incrementar el número de ciclos de PCR y ADN selectivamente amplificado para detectar un microorganismo objeto que se detectará, y permitió la reducción del costo de producción.

Por consiguiente, en vista de la aplicabilidad de un anfitrión, la eficacia de purificación para una polimerasa de ADN termoestable, y similares, los presentes inventores ha verificado la relación distante entre los organismos, con referencia a un árbol filogenético (ver Cari R. Woese, "Bacterial Evolution", Micro. Biol. Reviews, 51:221-271(1987) y Figura 1), y se han centrado la atención en células eucariotas capaces de utilizarse como un anfitrión. Como un resultado de estudiar la producción de una polimerasa de ADN termoestable utilizando células eucariotas como un anfitrión, se ha encontrado que producen la mayoría de la polimerasa de ADN termoestable como una materia insoluble en el precipitado del extracto de cultivo así obtenido e irreversiblemente solubilizado sometiendo el precipitado y el sobrenadante a tratamiento por calentamiento. Esta etapa de calentamiento puede recuperar fácilmente una polimerasa de ADN termoestable la cual es activa y altamente purificada. En varios estudios, se ha encontrado que la preparación de la polimerasa de ADN termoestable por lo menos tiene la característica de no casar ninguna amplificación del ADN cuando un molde no se agrega en la anchura genética del ARNr 16S bacteriano.

La presente invención será descrita más adelante detalladamente.

La preparación de la polimerasa de ADN termoestable usada en la presente invención es una preparación que contiene una polimerasa de ADN termoestable y tiene por lo menos una característica de los siguientes requerimientos (A) y (B).

(A) Una preparación de la polimerasa de ADN termoestable que satisface los siguientes requerimientos (1) y (2): (1) La polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN. (2) No se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan bajo condiciones que no contienen ningún molde, pero utilizando cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable para la preparación.

(B) Una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión.

La contaminación con "10 fg o menos" del ácido nucleico derivado bacterialmente se refiere al caso en el cual el nivel de contaminación es determinado para ser "10 fg o menos" por un método de detección en "Límite de Detección (6-3) de PCR" en el Ejemplo 2-1 a describirse más adelante.

Para los propósitos de la presente invención, el "extracto" puede ser una composición que contiene la polimerasa de ADN termoestable tomada de células o células fungicidas. El solvente y método de extracción usados para obtener el extracto no son particularmente limitados. Los ejemplos del método para obtener el extracto pueden incluir los siguientes métodos: (1) Un método que comprende tratando células eucariotas que producen la polimerasa de ADN termoestable con paredes celulares lizantes de la enzima tal como Zimoliasa, celulasa, quitinasa, quitobiasa, quitosanasa, ß-1 ,3-glucanasa, o lisozima; (2) Un método que comprende utilizar un método físico que utiliza una onda ultrasónica, prensa francesa, o gránulos de vidrio, un método que comprende romper la pared celular o membrana celular mediante calentamiento, o similares para extraer una composición contenida en células o células fungicidas utilizando un solvente tal como agua o una solución amortiguadora para proporcionar un extracto; y (3) Un método que comprende extraer, fuera de las células fungicidas, una polimerasa de ADN termoestable producida utilizando un método que comprende causar la producción secretora extracelular de la polimerasa de ADN termoestable agregando un péptido de señal secretor y similares, corriente arriba del gen de la polimerasa de ADN termoestable para proporcionar un extracto.

Para los propósitos de la presente invención, la "preparación de la polimerasa de ADN termoestable" es una preparación que contiene una polimerasa de ADN termoestable, y puede obtenerse como el extracto por sí mismo o a través de varios tratamientos tal como purificación, dilución, y mezcla con una diferente sustancia o compuesto. Los ejemplos de la preparación pueden también incluir lo siguiente: (A) la polimerasa de ADN termoestable derivada del extracto como se disuelve en una solución amortiguadora que contiene ácido fosfórico, ácido bórico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido acético, tris, tricina, bis-tricina, veronal, Hepes, Pipes, Caps, Taps, Tes, Mops, Mes, o similares como un ingrediente que tiene una acción amortiguadora.

(B) la polimerasa ya que está presente junto con MgCI2, dNTPs, o similares en una solución. (c) las soluciones (A) y (B) como se secan por un método tal como liofilización.

Los métodos para obtener la "preparación de la polimerasa de ADN termoestable" del "extracto" pueden incluir además purificación, dilución, y la mezcla con una diferente sustancia o compuesto.

Los ejemplos del método de purificación incluyen los siguientes métodos: (I) Un método que utiliza cargas eléctricas en la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, o similares, para un extracto de un medio de cultivo o similares que contienen una polimerasa de ADN termoestable.

(II) Un método que utiliza afinidad específica tal como cromatografía de afinidad y un método que utiliza diferencia en hidrofobicidad tal como cromatografía de fase inversa.

(III) Un método de cromatografía en columna utilizando un método que utiliza diferencia en peso molecular tal como filtración de gel, o similares.

(IV) Un método que comprende la división utilizando precipitación del sulfato de amonio, precipitación de acetona, precipitación de PEG, precipitación de pH, o similares.

(V) Un método para eliminar el ácido nucleico utilizando polietilenimina o similares.

Pueden utilizarse estos métodos en una combinación de dos o más de los mismos. Estos métodos pueden concentrar la polimerasa de ADN termoestable contenida en el extracto o reducir o eliminar la contaminación de la proteína, ácido nucleico y similares derivado del huésped.

Los ejemplos del método de dilución incluyen un método que comprende agregar, al extracto, un solvente para la mezcla con el extracto, tal como agua o solución amortiguadora.

Para el método de mezcla con una diferente sustancia o compuesto, la sustancia o compuesto mezclado no está particularmente limitado; sin embargo, los ejemplos del mismo incluyen uno o dos o más seleccionados del grupo que consiste de cloruro de potasio, acetato de potasio, sulfato de potasio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, cloruro de magnesio, acetato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de manganeso, acetato de manganeso, sulfato de manganeso, cloruro sódico, acetato sódico, cloruro de litio, acetato de litio, cloruro de calcio, ß-mercaptoetanol, ditiotreitol, DMSO, glicerol, formamida, cloruro de tetrametilamonio, PEG, tween 20, tween 80, Tritón X 100, NP40, ADN, ARN, proteínas (enzimas, anticuerpos, BSA, etc.), dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP, dNTPs, SYBR Verde, planta de hoja perenne, SYT09, y cera.

Las "bacterias termófilas" se refieren eubacteria o bacterias antiguas (archaebacteria) que tienen una temperatura óptima de crecimiento de 45°C o más o viable a 55°C o más. Las bacterias termofílicas que pueden aplicarse a la presente invención no son particularmente limitadas a condición de que caen dentro de la definición anterior.

Las "bacterias hipertermofílicas" se refieren a eubacteria o bacterias antiguas (archaebacteria) que tienen una temperatura óptima de crecimiento de 80°C o más o viable a 90°C o más. Las bacterias hipertermofílicas que pueden aplicarse a la presente invención no son particularmente limitadas a condición de que caen dentro de la definición anterior. Actualmente, se aislan e identifican 100 tipos o más de bacterias termofílicas e hipertermofílicas, y éstos pueden cada uno aplicarse a la presente invención. Los ejemplos de tales bacterias termofílicas o hipertermofílicas pueden incluir bacterias termofílicas o hipertermofílicas que pertenecen a los géneros Thermus, Bacillus, Thermococcus, Pyrococcus, Aeropyrum, Aquifex, Sulfolobus, Pyrolobus, o Methanopyrus.

Ejemplos más específicos de los mismos incluyen Thermus aquatics, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Aquifex pyrophilus, Geothermobacterium ferrireducens, Thermotoga maritime, Thermotoga neopolitana, Thermotoga petrophila, Thermotoga naphthophila, Acidianus infernus, Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Archaeoglobus profundus, Caldivirga maquilingensis, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Desulfurococcus mucosus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Hyperthermus butylicus, Ignicoccus islandicus, Ignicoccus pacificus, Methanococcus jannaschii, Methanococcus fervens, Methanococcus igneus, Methanococcus infernus, Methanopyrus kandleri, Methanothermus fervidus, Methanothermus sociabilis, Palaeococcus ferrophilus, Pyrobaculum aerophilum, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum oguniense, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus woesei, Pyrodictium abyssi, Pyrodictium brockii, Pyrodictium occultum, Pyrolobus fumarii, Staphylothermus marinus, Stetteria hydrogenophila , Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus shibatae, Sulfolobus tokodaii, Sulfophobococcus zilligii, Sulfurisphaera ohwakuensis, Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus celer, Thermococcus litoralis, Thermodiscus maritimus , Thermofilum pendens, Thermoproteus tenax, Thermoproteus neutrophilus, Thermosphaera aggregans, Vulcanisaeta distributa , y Vulcanisaeta souniana.

El método de producción para una preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención comprende producir una polimerasa de ADN termoestable utilizando células hospedadoras, en donde se utilizan células eucariotas como células hospedadoras.

Las células eucariotas incluyen hongos, células animales, células de planta, y células de insecto. Las células hospedadoras pueden ser cualquier célula derivada de células eucariotas y no son particularmente limitadas. Los hongos incluyen ascomicetos tal como levadura y moho, hongos filamentosos, basidiomicetos, y zigomicetos; entre otros, levadura y hongos filamentosos son preferibles; y ejemplos de los mismos incluyen los géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidi , Aspergillus, Fusarium, y Trichoderma.

Ejemplos más específicos de los mismos pueden incluir Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Candida boidini, Pichia metanolica , Pichia angusta, Pichia pastoris, Pichia anómala, Hansenula polymorpha , Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii, Yarrowia lipolytica, Trichosporon pullulans, Rhodosporidium toruloides, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, y Trichoderma reesei.

Las células animales incluyen células cultivadas derivadas de humano y células cultivadas derivadas de ratón; ejemplos específicos de las mismas incluyen células CHO y células Hela. Las células de planta pueden ser cualquiera de las células derivadas de plantas; preferidas son células cultivadas establecidas, incluyendo células del género Nicociana, células del género Arabidopsis , células del género Ipomoea, células del género Daucus, y células del género Oryza; y ejemplos específicos de las mismas incluyen células Nicociana tabacum BY-2 cultivadas, células Arabidopsis thaliana cultivadas, células ipomoea batatas cultivadas, células Daucus carota cultivadas, y células Oryza sativa cultivadas. Las células de insecto pueden ser cualquiera de las células derivadas de insectos; preferidas son células cultivadas establecidas, incluyendo las líneas celulares, sf9 y sf21, derivadas de células ováricas de Spodoptera Mura aff. var. Spodoptera frugiperda y la línea celular Bombix mori, Bm-n. Las células hospedadoras son preferiblemente las derivadas de un microorganismo rápidamente proliferante u organismo eucariótico tal como levadura; ejemplos de las mismas incluyen levaduras incluyendo el género Saccharomyces tal como Saccharomyces cerevisae , células de planta incluyendo una planta del género Nicociana tal como Nicociana tabacum, y hongos filamentosos incluyendo el género Aspergillus tal como Aspergillus Oryzae.

Para la producción de una polimerasa de ADN termoestable utilizando las células eucariotas, hay, por ejemplo, un método que comprende introducir un gen que contiene por lo menos un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable en células eucariotas para que la expresión produzca la polimerasa de ADN termoestable.

El gen que codifica una polimerasa de ADN termoestable en la presente puede ser cualquiera de los genes tal como ADNc, ADN genómico o ADN sintético que codifica una polimerasa de ADN termoestable, puede ser una sola hebra, o una hebra doble que tiene una hebra complementaria de los mismos, y puede contener un derivado del nucleótido que ocurre natural o artificialmente. Además, cuando la polimerasa de ADN termoestable se deriva de un organismo, el origen de la polimerasa de ADN termoestable también no se limita particularmente.

La polimerasa de ADN tiene varios congéneres dependiendo de los tipos de organismos.

Los ejemplos específicos de la polimerasa de ADN termoestable usados para la presente invención pueden incluir una polimerasa de ADN termoestable derivada de Thermus aquatics, Thermus thermophilus , Bacilius stearothermophilus, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus kodakaraensis KOD1, Pyrococcus woesei, Pyrococcus furiosus, Aeropyrum pernix, Aquifex aeolicus, Sulfolobus tokodaii, Pyrolobus fumarii, o Methanopyrus kandleri.

La polimerasa de ADN termoestable comprende una polimerasa de ADN termoestable sintetizada artificialmente por ingeniería genética.

La polimerasa de ADN termoestable también se deriva preferiblemente de un organismo que tiene resistencia térmica, y más preferiblemente se deriva de un organismo procariótico tal como una bacteria de metano, una bacteria termoacidofílica, una bacteria termofílica, o una bacteria hipertermofílica.

El gen de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención tiene preferiblemente una secuencia base que utiliza el codón de uso frecuentemente usado en un organismo hospedador a transformarse.

Por ejemplo, el codón usado en la introducción de un gen de la polimerasa de ADN termoestable en Saccharomyces Cerevisiae se da en lo siguiente.

Cuando se modifica el gen de la polimerasa de ADN termoestable original basado en el uso del codón de un organismo heterogéneo tal como el género Saccharomyces, el codón de uso se aplica preferiblemente a 70% o más, más preferiblemente 80% o más, aún más preferiblemente 90% o más de la secuencia base del gen de la polimerasa de ADN termoestable de origen natural; el codón de uso más preferiblemente se aplica a todos los codones.

Las formas preferidas del gen de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención incluyen un gen de la polimerasa de ADN termoestable diseñado aplicando el codón de uso de Saccharomyces cerevisiae a la secuencia base de un gen de la polimerasa de ADN termoestable derivado de Thermus aquatics. Entre otros, un gen de la polimerasa de ADN termoestable que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 11 o consiste de cualquiera de estas secuencias base es un aspecto preferido.

El gen de la polimerasa de ADN termoestable es preferiblemente tal que no contiene una secuencia que desestabiliza el ARNm; ejemplos de la secuencia que desestabiliza el ARNm incluyen una secuencia marcadamente repetida y una secuencia del gen con un alto contenido de GC, de un gen de la polimerasa de ADN termoestable. Las medidas específicas para eliminar la secuencia que desestabiliza el ARNm incluyen la supresión del aspecto de tal secuencia del gen de aproximadamente 10 bp a 2% o menos del gen que codifica una poiimerasa de ADN termoestable, y el diseño del gen de la poiimerasa de ADN termoestable tal que el gen entero tiene un contenido de GC de aproximadamente 20% a aproximadamente 45% (ambos inclusivos), y similares.

El gen de la poiimerasa de ADN termoestable de la presente invención tiene preferiblemente por lo menos una de las siguientes características: - la aplicación del codón de uso de un organismo hospedador para introducción, - el diseño de la misma tal que no se contiene ninguna secuencia desestabilizante de ARNm, y - el contenido de GC preferido del mismo.

El gen, preferiblemente, tiene 2 o más, más preferiblemente 3 de las características anteriores. El codón de uso de un anfitrión se aplica preferiblemente al gen de la poiimerasa de ADN termoestable. Particularmente, cuando la levadura del género Saccharomyces , especialmente Saccharomyces cerevisiae, se utiliza como un anfitrión para transformación, el codón de uso de Saccharomyces Cerevisiae es aplicado.

Además, el gen de la poiimerasa de ADN termoestable, particularmente la región de codificación, se diseña preferiblemente de modo que no tenga ningún sitio de enzima de restricción inadecuado para los propósitos de realizar una etapa de clonación de genes. Específicamente, es preferible que los sitios tal como EcoRI, Hindlll, Notl, y SnaBI no estén contenidos en el gen. Sin embargo, en vista de la operación de clonación de genes, es operacionalmente preferible que un sitio de enzima de restricción útil se proporcione fuera de la región de codificación. Por ejemplo, los sitios de enzima de restricción tal como EcoRI, Hindlll, Notl y SnaBI pueden proporcionarse corriente arriba o corriente abajo de la región de codificación.

Los homólogos del gen de la polimerasa de ADN termoestable incluyen, por ejemplo, un homólogo del gen de la polimerasa de ADN capaz de hibridación con cualquiera de estos ADN bajo condiciones rigurosas. Es decir, es un homólogo del gen de la polimerasa de ADN capaz de hibridación con el completo o parte de cualquiera de estos ADN o una hebra complementaria de los mismos bajo condiciones rigurosas. Tales homólogos codifican simultáneamente proteínas que tienen una actividad de la polimerasa de ADN.

El homólogo termoestable del gen de la polimerasa de ADN capaz de hibridación bajo condiciones rigurosas comprende el ADN capaz de hibridación utilizando, como ADN(s) de prueba, ADN(s) en el cuál uno o más de 20 o más bases arbitrarias, preferiblemente 25 base, más preferiblemente 30 o más secuencias base continuas de la secuencia base original se seleccionan, por una técnica de hibridación (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel y colaboradores, (1987) Publish. John Wily & Sons Secciones 6.3-6.4) o similares bien conocida por los expertos en la técnica.

Aquí, las condiciones rigurosas están a una temperatura de hibridación de 37°C y la presencia de 50% de formamida; las condiciones más rigurosas incluyen una temperatura de aproximadamente 42°C. Las condiciones aún más rigurosas pueden ser de aproximadamente 65°C y la presencia de 50% de formamida.

El porcentaje de mutaciones en la secuencia de aminoácido no está limitado a condición de que la función de la proteína original se mantiene; sin embargo, está preferiblemente dentro del 70%, más preferiblemente dentro de 30%, aún más preferiblemente dentro de 20% basado en el total de los aminoácidos.

El homólogo del gen de la polimerasa de ADN termoestable es preferiblemente ADN que contiene o consiste de una secuencia base que tiene por lo menos 80%, preferiblemente 90% o más homologías a la región de codificación de la secuencia base del ADN original. La homología de la secuencia base de ADN puede ser resuelta utilizando la RÁFAGA del programa del análisis del gen o los similares.

El gen de la polimerasa de ADN termoestable puede sintetizarse químicamente o adoptando un método de Fujimoto y colaboradores, conocido como un método para sintetizar el ADN de cadena larga (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel y colaboradores, (1987) Publish. John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5) o similares.

Puede realizarse la secuencia de aminoácido modificada correctamente introduciendo mutaciones de sustitución, eliminación, inserción y/o adición en una secuencia de aminoácido a modificarse utilizando un método de introducción de mutación de sitio dirigido (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5) o similares. La secuencia de aminoácido modificada no se limita a la obtenida por introducción artificial de mutación o síntesis, y también comprende que la generada no solamente basada en el tratamiento de mutación artificial sino también por la mutación del aminoácido en la naturaleza.

Los ejemplos del gen de la polimerasa de ADN termoestable capaz de usarse adecuadamente para la presente invención pueden incluir los genes que consisten de las secuencias base representadas por las SEC ID NOS: 1, 81 y 82 (las secuencias de aminoácido correspondientes se muestran a continuación).

SEC ID NO: 1 aagcttacgt atacaacatg agaggtatgc ttccattgtt cgaacctaaa ggtagagtat 60 tgttggttga tggtcatcat ctagcttaca gaactttcca cgctctaaaa ggtttaacaa 120 catcaagagg tgaacctgtt caagctgtat acggttttgc taagtcttta ctaaaagcat 180 tgaaggaaga cggtgacgcc gttattgttg ttttcgatgc taaggcacca agttttagac 240 atgaagcata cggtggttat aaggctggaa gagcaccaac tcctgaagac ttccctagac 300 aattggcact aatcaaggaa ctagtcgact tactaggtct tgcaagatta gaagtcccag 360 gttatgaggc agatgatgta ctagcctctt tagcaaagaa ggcagaaaag gagggttatg 420 aagttagaat tttaaccgct gataaggact tatatcaatt gctatctgat aggattcatg 480 tgttacaccc tgaaggttat ttgataactc cagcttggtt atgggagaag tacggtttga 540 ggccagacca atgggccgat tatagagctt taaccggcga cgagtcagac aatcttccag 600 gtgttaaagg aattggcgaa aagactgcta ggaagttgtt ggaagagtgg ggctccttgg 660 aggccttact taaaaatttg gacaggctaa aaccagcaat cagggaaaag atactagctc 720 acatggatga tcttaaattg tcttgggact tagccaaggt cagaactgat ttgcctttag 780 aggtcgactt cgctaagaga agggaacctg atagggaaag gttaagagcc ttcttggaaa 840 gacttgagtt tggatcatta ttgcatgaat ttggtttatt agaatcccct aaggccttgg 900 aagaagcacc atggccacct ccagaaggtg cctttgtagg cttcgtctta agcaggaaag 960 aaccaatgtg ggcagactta ttggctctag ctgctgccag aggaggaaga gtgcatagag 1020 ccccagaacc atataaagcc ttgagagact tgaaggaagc aagaggtttg ttagctaaag 1080 atttgagcgt attagccttg agggaaggtt taggactacc accaggtgac gacccaatgt 1140 tgcttgctta tttgcttgat ccatcaaaca caacacctga aggagtagct agaaggtatg 1200 gtggagaatg gactgaagag gctggagaga gagccgctct atctgagaga ttgtttgcta 1260 atttgtgggg tagacttgaa ggtgaggaaa gattgttgtg gctatacagg gaagtagaaa 1320 ggccattatc tgcagtattg gctcatatgg aggccacagg cgttagatta gatgttgctt 1380 acttaagagc tttgtcattg gaagtcgccg aagaaattgc aagacttgaa gctgaggtgt 1440 tcagacttgc cggtcatcca ttcaatctta atagtagaga ccagctagaa agagtgttat 1500 tcgacgagct tggattacca gcaatcggaa agacagaaaa gactggtaaa aggtctacaa 1560 gtgccgccgt tttggaagca ttgagggagg cccatccaat tgttgaaaag atattgcagt 1620 atagagaatt gacaaaatta aaatcaactt atatcgatcc acttccagac ttaatccatc 1680 caaggacagg cagattacac accaggttta accagaccgc aactgctaca ggcagattat 1740 catcttcaga tcctaactta caaaacattc ctgtaaggac tccactaggt cagagaatta 1800 gaagagcttt tatcgctgag gaaggctggt tgcttgtggc tttagattat agtcaaattg 1860 agttaagggt cttggctcac ttgtctggtg acgaaaatct tatcagagtt tttcaggaag 1920 gtagggatat acatacagag accgcctcat ggatgtttgg tgttccaagg gaggccgtcg 1980 atccactaat gaggagagca gccaaaacta ttaactttgg agtattgtat ggtatgagtg 2040 ctcacagatt atcccaagag ttggccatcc cttacgagga agcacaggct tttatagaaa 2100 ggtatttcca gtcttttcct aaggttagag catggattga aaagacacta gaggaaggta 2160 ggaggagggg ttacgtggag accttattcg gaagaaggag atacgttcca gacttagagg 2220 ctagagtgaa atcagttaga gaagccgcag agagaatggc attcaatatg ccagtacaag 2280 gcactgccgc agatttgatg aaactagcca tggttaagct atttccaaga ttggaagaaa 2340 tgggagctag aatgctatta caagttcatg atgaacttgt tttagaggct cctaaagaaa 2400 gggctgaagc agtggccagg ttagctaaag aagtaatgga gggcgtttac ccattggcag 2460 ttcctttaga ggtcgaagtg ggtataggtg aagactggct atctgcaaag gaataagaat 2520 te 2522 SEC ID NO: 81 atgattttag atgtggatta cataactgaa gaaggaaaac ctgttattag gctattcaaa 60 aaagagaacg gaaaatttaa gatagageat gatagaactt ttagaccata catttaeget 120 cttctcaggg atgattcaaa gattgaagaa gttaagaaaa taacggggga aaggcatgga 180 aagattgtga gaattgttga tgtagagaag gttgagaaaa agtttctcgg caagectatt 240 accgtgtgga aactttattt ggaacatccc caagatgttc ccactattag agaaaaagtt 300 agagaacatc cagcagttgt ggacatette gaataegata ttccatttgc aaagagatac 360 ctcatcgaca aaggcctaat accaatggag ggggaagaag agctaaagat tcttgccttc 420 gatatagaaa ccctctatca cgaaggagaa gagtttggaa aaggcccaat tataatgatt 480 agttatgcag atgaaaatga agcaaaggtg attacttgga aaaacataga tcttccatac 540 gttgaggttg tatcaagega gagagagatg ataaagagat ttctcaggat tatcagggag 600 aaggatcctg acattatagt tacttataat ggagaetcat tcgacttccc atatttagcg 660 aaaagggcag aaaaacttgg gattaaatta accattggaa gagatggaag cgagcccaag 720 atgcagagaa taggcgatat gacggctgta gaagtcaagg gaagaataca tttcgacttg 780 tatcatgtaa taacaaggac aataaatctc ccaacataca cactagaggc tgtatatgaa 840 gcaatttttg gaaagccaaa ggagaaggta tacgccgacg agatagcaaa agcctgggaa 900 agtggagaga accttgagag agttgccaaa tactcgatgg aagatgcaaa ggcaacttat 960 gaactcggga aagaattcct tccaatggaa attcagcttt caagattagt tggacaacct 1020 ttatgggatg tttcaaggtc aagcacaggg aaccttgtag agtggttctt acttaggaaa 1080 gcctacgaaa gaaacgaagt agctccaaac aagccaagtg aagaggagta tcaaagaagg 1140 ctcagggaga gctacacagg tggattcgtt aaagagccag aaaaggggtt gtgggaaaac 1200 atagtatacc tagattttag agccctatat ccctcgatta taattaccca caatgtttct 1260 cccgatactc taaatcttga gggatgcaag aactatgata tcgctcctca agtaggccac 1320 aagttctgca aggacatccc tggttttata ccaagtctct tgggacattt gttagaggaa 1380 agacaaaaga ttaagacaaa aatgaaggaa actcaagatc ctatagaaaa aatactcctt 440 gactatagac aaaaagcgat aaaactctta gcaaattctt tctacggata ttatggctat 1500 gcaaaagcaa gatggtactg taaggagtgt gctgagagcg ttactgcctg gggaagaaag 1560 tacatcgagt tagtatggaa ggagctcgaa gaaaagtttg gatttaaagt cctctacatt 1620 gacactgatg gtctctatgc aactatccca ggaggagaaa gtgaggaaat aaagaaaaag 680 gctctagaat ttgtaaaata cataaattca aagctccctg gactgctaga gcttgaatat 1740 gaagggtttt ataagagggg attcttcgtt acgaagaaga ggtatgcagt aatagatgaa 1800 gaaggaaaag tcattactcg tggtttagag atagttagga gagattggag tgaaattgca 1860 aaagaaactc aagctagagt tttggagaca atactaaaac acggagatgt tgaagaagct 1920 gtgagaatag taaaagaagt aatacaaaag cttgccaatt atgaaattcc accagagaag 1980 ctcgcaatat atgagcagat aacaagacca ttacatgagt ataaggcgat aggtcctcac 2040 gtagctgttg caaagaaact agctgctaaa ggagttaaaa taaagccagg aatggtaatt 2100 ggatacatag tacttagagg cgatggtcca attagcaata gggcaattct agctgaggaa 2160 tacgatccca aaaagcacaa gtatgacgca gaatattaca ttgagaacca ggttcttcca 2220 gcggtactta ggatattgga gggatttgga tacagaaagg aagacctcag ataccaaaag 2280 acaagacaag tcggcctaac ttcctggctt aacattaaaa aatcctag 2328 SEC ID NO: 82 atgatcctcg atacagacta cataactgag gatggaaagc ccgtcatcag gatcttcaag 60 aaggagaacg gcgagttcaa aatagactac gacagaaact ttgagccata catctacgcg 120 ctcttgaagg acgactctgc gattgaggac gtcaagaaga taactgccga gaggcacggc 180 actaccgtta gggttgtcag ggccgagaaa gtgaagaaga agttcctagg caggccgata 240 gaggtctgga agctctactt cactcacccc caggacnnnc ccgcaatcag ggacaagata 300 aaggagcatc ctgccgttgt ggacatctac gagtacgaca tccccttcgc gaagcgctac 360 ctcatagaca aaggcttaat cccgatggag ggcgacgagg aacttaagat gctcgccttc 420 gacatcgaga cgctctatca cgagggcgag gagttcgccg aagggcctat cctgatgata 480 agctacgccg acgaggaagg ggcgcgcgtt attacctgga agaatatcga ccttccctat 540 gtcgacgtcg tttccaccga gaaggagatg ataaagcgct tcctcaaggt cgtcaaggaa 600 aaggatcccg acgtcctcat aacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctcaag 660 aagcgctccg agaagctcgg agtcaagttc atcctcggaa gggaagggag cgagccgaaa 720 atccagcgca tgggcgatcg ctttgcggtg gaggtcaagg gaaggattca cttcgacctc 780 taccccgtca ttaggagaac gattaacctc cccacttaca cccttgaggc agtatatgaa 840 gccatctttg gacagccgaa ggagaaggtc tacgctgagg agatagcgca ggcctgggaa 900 acgggcgagg gattagaaag ggtggcccgc tactcgatgg aggacgcaaa ggtaacctat 960 gaactcggaa aagagttctt ccctatggaa gcccagctct cgcgcctcgt aggccagagc 1020 ctctgggatg tatctcgctc gagtaccgga aacctcgtcg agtggttttt gctgaggaag 1080 gcctacgaga ggaatgaact tgcaccaaac aagccggacg agagggagct ggcaagaaga 140 agggagagct acgcgggtgg atacgtcaag gagcccgaaa ggggactgtg ggagaacatc 1200 gtgtatctgg acttccgctc cctgtatcct tcgataataa tcacccataa cgtctcccct 1260 gatacactca acagggaggg ttgtgaggag tacgacgtgg ctcctcaggt aggccataag 1320 ttctgcaagg acttccccgg cttcatccca agcctcctcg gagacctctt ggaggagaga 1380 cagaaggtaa agaagaagat gaaggccact atagacccaa tcgagaagaa actcctcgat 1440 tacaggcaac gagcaatcaa aatccttgct aatagcttct acggttacta cggctatgca 1500 aaggcccgct ggtactgcaa ggagtgcgcc gagagcgtta ccgcttgggg caggcagtac 1560 atcgagacca cgataaggga aatagaggag aaatttggct ttaaagtcct ctacgcggac 1620 acagatggat ttttcgcaac aatacctgga gcggacgccg aaaccgtcaa aaagaaggca 680 aaggagttcc tggactacat caacgccaaa ctgcccggcc tgctcgaact cgaatacgag 1740 ggcttctaca agcgcggctt cttcgtgacg aagaagaagt acgcggttat agacgaggag 1800 gacaagataa cgacgcgcgg gcttgaaata gttaggcgtg actggagcga gatagcgaag 860 gagacgcagg cgagggttct tgaggcgata ctaaagcacg gtgacgttga agaagcggta 1920 aggattgtca aagaggttac ggagaagctg agcaagtacg aggttccacc ggagaagctg 980 gtcatctacg agcagataac ccgcgacctg aaggactaca aggccaccgg gccgcatgtg 2040 gctgttgcaa aacgcctcgc cgcaaggggg ataaaaatcc ggcccggaac ggtcataagc 2100 tacatcgtgc tcaaaggctc gggaaggatt ggggacaggg ctataccctt tgacgaattt 2160 gacccggcaa agcacaagta cgatgcagaa tactacatcg agaaccaggt tcttccagct 2220 gtggagagga ttctgagggc ctttggttac cgtaaagaag atttaaggta tcagaaaacg 2280 cggcaggttg gcttgggggc gtggctaaaa cctaagacat ga 2322 La secuencia de aminoácidos correspondiente al gen que consiste de una secuencia base de la SEC ID NO: 1 MRG LPLFEP KGRVLLVDGH HLAYRTFHAL KGLTTSRGEP VQAVYGFAKS LLKALKEDGD 60 AVIWFDAKA PSFRHEAYGG YKAGRAPTPE DFPRQLALIK ELVDLLGLAR LEVPGYEADD 120 VLASLA KAE KEGYEVRILT ADKDLYQLLS DRIHVLHPEG YLITPAWLWE KYGLRPDQWA 180 DYRALTGDES DNLPGVKGIG EKTARKLLEE WGSLEALLKN LDRL PAIRE KILAHMDDLK 240 LSWDLA VRT DLPLEVDFAK RREPDRERLR AFLERLEFGS LLHEFGLLES PKALEEAPWP 300 PPEGAFVGFV LSRKEPMWAD LLALAAARGG RVHRAPEPYK ALRDLKEARG LLAKDLSVLA 360 LREGLGLPPG DDPMLLAYLL DPSNTTPEGV ARRYGGEWTE EAGERAALSE RLFANLWGRL 420 EGEERLLWLY REVERPLSAV LAHMEATGVR LDVAYLRALS LEVAEEIARL EAEVFRLAGH 480 PFNLNSRDQL ERVLFDELGL PAIGKTEKTG KRSTSAAVLE ALREAHPIVE KILQYRELTK 540 LKSTYIDPLP DLIHPRTGRL HTRFNQTATA TGRLSSSDPN LQNIPVRTPL GQRIRRAFIA 600 EEGWLLVALD YSQIELRVLA HLSGDENLIR VFQEGRDIHT ETASWMFGVP REAVDPLMRR 660 AAKTINFGVL YGMSAHRLSQ ELAIPYEEAQ AFIERYFQSF PKVRAWIEKT LEEGRRRGYV 720 ETLFGRRRYV PDLEARVKSV REAAERMAFN MPVQGTAADL MKLAMVKLFP RLEEMGARML 780 LQVHDELVLE APKERAEAVA RLAKEVMEGV YPLAVPLEVE VGIGEDWLSA KE 832 La secuencia de aminoácidos correspondiente al gen que consiste de una secuencia base de la SEC ID NO: 81 MILDVDYITE EGKPVIRLFK KENGKFKIEH DRTFRPYIYA LLRDDSKIEE VKKITGERHG 60 KIVRIVDVEK VEKKFLGKPI TVWKLYLEHP QDVPTIREKV REHPAWDIF EYDIPFAKRY 120 LIDKGLIPME GEEELKILAF DIETLYHEGE EFGKGPIIMI SYADENEAKV ITWKNIDLPY 180 VEWSSEREM IKRFLRIIRE KDPDIIVTYN GDSFDFPYLA KRAEKLGIKL TIGRDGSEPK 240 MQRIGDMTAV EVKGRIHFDL YHVITRTINL PTYTLEAVYE AIFGKPKEKV YADEIAKAWE 300 SGENLERVAK YSMEDAKATY ELGKEFLPME IQLSRLVGQP LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK 360 AYERNEVAPN KPSEEEYQRR LRESYTGGFV KEPEKGLWEN IVYLDFRALY PSIIITHNVS 420 PDTLNLEGCK NYDIAPQVGH KFCKDIPGFI PSLLGHLLEE RQKIKTKMKE TQDPIEKILL 480 DYRQKAIKLL ANSFYGYYGY AKARWYCKEC AESVTAWGRK YIELVWKELE EKFGFKVLYI 540 DTDGLYATIP GGESEEIKKK ALEFVKYINS KLPGLLELEY EGFYKRGFFV TKKRYAVIDE 600 EGKVITRGLE IVRRDWSEIA KETQARVLET ILKHGDVEEA VRIVKEVIQK LANYEIPPEK 660 LAIYEQITRP LHEYKAIGPH VAVAKKLAAK GVKIKPGMVI GYIVLRGDGP ISNRAILAEE 720 YDPKKHKYDA EYYIENQVLP AVLRILEGFG YRKEDLRYQK TRQVGLTSWL NIKKS 775 La secuencia de aminoácidos correspondiente al gen que consiste de una secuencia base de la SEC ID NO: 82 MILDTDYITE DGKPVIRIFK KENGEFKIDY DRNFEPYIYA LLKDDSAIED VKKITAERHG 60 TTVRWRAEK VKKKFLGRPI EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI KEHPAWDIY EYDIPFAKRY 120 LIDKGLIPME GDEELK LAF DIETLYHEGE EFAEGPILMI SYADEEGARV ITWKNIDLPY 180 VDWSTEKEM IKRFLKWKE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK KRSEKLGVKF ILGREGSEPK 240 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE AIFGQPKEKV YAEEIAQAWE 300 TGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK 360 AYERNELAPN KPDERELARR RESYAGGYVK EPERGLWENI VYLDFRSLYP SIIITHNVSP 420 DTLNREGCEE YDVAPQVGHK FCKDFPGFIP SLLGDLLEER QKVKKKMKAT IDPIEKKLLD 480 YRQRAIKILA NSFYGYYGYA KARWYCKECA ESVTAWGRQY IETTIREIEE KFGFKVLYAD 540 TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLDYINAK LPGLLELEYE GFYKRGFFVT KKKYAVIDEE 600 DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL 660 VIYEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS YIVLKGSGRI GDRAIPFDEF 720 DPAKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT RQVGLGAWLK PKT 773 Se describirá un constructo de ADN para introducir el gen de la polimerasa de ADN termoestable anterior en un anfitrión. Las células hospedadoras pueden transformarse con el gen de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención para expresar la proteína codificada por esta ADN para producir la polimerasa de ADN en las células hospedadoras por la actividad de la polimerasa de ADN de la misma.

En la transformación, se utiliza un constructo de ADN que permite la expresión del segmento de ADN que consiste del gen de la polimerasa de ADN termoestable en células hospedadoras. El aspecto del constructo de ADN para la transformación no es particularmente limitado; un plásmido (ADN), un bacteriófago (ADN), un retrotransposón (ADN), o un cromosoma artificial (YAC, PAC, CCB, MAC, etc.) pueden seleccionarse y adoptarse dependiendo de la forma de introducción (extracromosomal o i ntracromosomal) del gen extranjero y el tipo de células hospedadoras. Así, el constructo de ADN puede proporcionarse con segmentos de constituyente de cualquiera de uno o más de estos aspectos de vectores además del gen de la polimerasa de ADN termoestable.

Los vectores procarióticos preferidos, vectores eucarióticos, vectores de célula animal y vectores de célula de planta son bien conocidos en la técnica.

Los ejemplos del ADN de plásmido pueden incluir vectores transbordadores de levadura de E. coli tipo YCp tal como pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 o pAUR123, vectores transbordadores de levadura de E. coli tipo YEp-tipo tal como pYES32 o YEp13, y vectores transbordadores de levadura de £. coli tipo Ylp tal como pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pAUR101 o pAUR135. Los ejemplos del ADN de fago pueden incluir fagos ? (Charon 4A, Charon 21A, EMBL3, EMBL4, gt 100, gt11, zap),<(> X174, M13mp18, o M13mp19.

Los ejemplos del retrotransposón pueden incluir un factor de Ty. Los ejemplos de YAC pueden incluir pYACC2.

Para preparar el constructo de ADN, un fragmento o similares que contienen el gen de la polimerasa de ADN termoestable se divide con una enzima de restricción adecuada y, por ejemplo, se inserta en el sitio de enzima de restricción o sitio de multi-clonación del ADN de vector usado.

Un primer aspecto del presente constructo de ADN comprende un segmento promotor operablemente ligado al segmento del ADN que consiste del gen de la polimerasa de ADN termoestable descrito antes. Asi, el segmento termoestable del gen de la polimerasa de ADN es controlado por un promotor y ligado rio abajo del promotor: Para la expresión del gen de la polimerasa de ADN termoestable, cuando utiliza un promotor que permite la expresión del mismo en levadura, es preferible para uso, por ejemplo, un promotor ga! 1 , promotor ga O, promotor del gen de descarboxilasa de piruvato, promotor de proteína de choque de calor, promotor MFa1, promotor PH05, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH, o promotor AOX1.

Un segundo constructo de ADN como otro aspecto del presente constructo de ADN incluye un segmento de ADN para recombinación homologa en un cromosoma hospedador además del presente ADN. El segmento de ADN para recombinación homologa es una secuencia de ADN homologa a una secuencia de ADN cerca de un sitio objetivo en el cual el gen de la polimerasa de ADN termoestable debe introducirse en el cromosoma hospedador. El constructo incluye por lo menos uno, preferiblemente dos segmentos de ADN para recombinación homologa. Por ejemplo, se utilizan dos segmentos de ADN para recombinación homologa preferiblemente como homólogo de la secuencia de ADN corriente arriba y corriente abajo del ADN del sitio objetivo en el cromosoma para ligar el gen de la polimerasa de ADN termoestable entre estos segmentos de ADN.

Cuando es introducido el gen de la polimerasa de ADN termoestable en un cromosoma hospedador mediante recombinación homologa, puede introducirse el presente ADN en el cromosoma hospedador para que pueda controlarse por un promotor en el cromosoma hospedador. En este caso, la introducción del gen deseado interrumpe simultáneamente un gen endógeno a controlarse por el promotor en la naturaleza, y el gen de la polimerasa de ADN termoestable extranjero puede expresarse en lugar del gen endógeno. El promotor es particularmente útil cuando es un promotor de alto expresión en células hospedadoras.

La transformación de un anfitrión con el constructo de ADN anterior se describe más adelante. Una vez que se ha construido el constructo de ADN, puede introducirse en las células hospedadoras adecuadas por cualquiera de varios medios adecuados tal como un método de transformación, método de transfección , método de conjugación, fusión de protoplasto, método de electroporación, método de lipofección, método de acetato de litio, método de pistola de partículas, método de precipitación de fosfato de calcio, método de agrobacteria, método de PEG, y método de microinyección directa. Después de introducir el constructo de ADN, las células que reciben el constructo se cultivan en un medio de selección.

En un transformadas obtenido por transformación con el constructo de ADN, los componentes del constructo de ADN estarán presentes en un cromosoma o un elemento extracromosomal (incluyendo un cromosoma artificial). Puede confirmarse por un método de PCR o un método de hibridación meridional si el gen de la polimerasa de ADN termoestable se ha introducido debajo de un promotor deseado o no. Por ejemplo, puede realizarse la confirmación preparando el ADN del transformante, realizando una PCR utilizando un cebador de sitio-específico de introducción, y detectando una venda deseada en la electroforesis de los productos de la PCR. Alternativamente, puede también realizarse la confirmación realizando la PCR utilizando un cebador etiquetado con un colorante fluorescente o similares. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Cuando la levadura es una célula hospedadora, puede utilizarse una cepa en la cual se interrumpe un gen de levadura. Por ejemplo, en la introducción del gen, la presencia de un gen de sintasa de uracilo en un plásmido permite la selección de la levadura en la cual el plásmido se introduce utilizando un auxótrofo de uracilo. Puede utilizarse una cepa de levadura deficiente de proteasa para suprimir la descomposición de una proteína expresada excesivamente en células de levadura. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

La producción de una preparación de la polimerasa de ADN termoestable utilizando el transformante anterior será descrita más adelante. Un transformante obtenido mediante introducción del constructo de ADN se cultiva para producir la polimerasa de ADN termoestable como un producto de expresión de un gen extranjero en un cultivo. Una etapa para separar la polimerasa de ADN termoestable del cultivo puede realizarse para proporcionar una preparación de la polimerasa de ADN termoestable. Para los propósitos de la presente invención, el cultivo comprende células cultivadas o células fungicidas y células trituradas o células fúngicas.

En el cultivo transformante de la presente invención, las condiciones de cultivo pueden seleccionarse dependiendo del tipo del transformante. Tales condiciones de cultivo son bien conocidas por los expertos en la técnica.

El medio para cultivar el transformadas obtenido utilizando la levadura como un anfitrión no está particularmente limitado a condición de que sea un medio que contiene una fuente de carbono, fuente de nitrógeno y sales inorgánicas utilizables por microorganismos y permita al transformante ser cultivado eficientemente; pueden utilizarse un medio natural y un medio sintético. Sin embargo, para producir una preparación de la polimerasa de ADN termoestable aplicable cuando un microorganismo de muestra está en cantidades residuales, es preferible utilizar un medio sintético. Para la fuente de carbono, pueden utilizarse un carbohidrato tal como glucosa, fructosa, sucrosa, o almidón, un ácido orgánico tal como ácido acético o ácido propiónico, o un alcohol tal como etanol o propanol. Para la fuente de nitrógeno, pueden utilizarse amoníaco, un ácido inorgánico o sal de amonio del ácido orgánico tal como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio, o fosfato de amonio u otro compuesto que contiene nitrógeno, peptona, extracto de carne, licor escarpado del maíz, o similares.

Para la materia inorgánica, pueden utilizarse fosfato primario de potasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, carbonato de calcio o similares. Se realiza el cultivo normalmente a 30°C durante 24 a 72 horas bajo condiciones aeróbicas tal como cultivo sacudido y cultivo con aireación y agitado. Se mantiene el pH preferiblemente de 5.0 a 7.0 durante el período de cultivo. Se ajusta el pH utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una solución alcalina, o similares.

El medio para cultivar el transformadas obtenido utilizando células de planta como un anfitrión no está particularmente limitado a condición de que sea un medio capaz de cultivar células de planta, que contiene una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales inorgánicas, sales orgánicas, o similares; ejemplos del mismo incluyen el medio del MS, medio de LS, medio de Gamborg B5, medio de WP y medio blanco que se utilizan comúnmente. Ejemplos de la fuente de carbono incluyen carbohidratos tal como glucosa, fructosa, sucrosa, y almidón, ácidos orgánicos tal como ácido acético y ácido propiónico, y alcoholes tal como etanol y propanol; entre otros, son preferibles la sucrosa y glucosa. Ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen nitratos tal como nitrato de potasio, nitrato de sodio, y nitrato de calcio, sales de amonio tal como fosfato de amonio, nitrato de amonio, y sulfato de amonio o sales de amonio del ácido orgánico u otros compuestos que contienen nitrógeno así como peptona, extracto de carne, licor escarpado del maíz, y aminoácidos tal como glicina, alanina, histidina, glutamina, ácido glutámico, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina , tirosina, triptófano, lisina, asparagina, ácido aspártico, treonina, cisteína, cistina, metionina, serina, y ornitina. Ejemplos de sales inorgánicas incluyen fosfato primario de potasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, y carbonato de calcio. Ejemplos de la materia orgánica incluyen vitaminas tal como clorhidrato de tiamina, ácido nicotínico, clorhidrato de piridoxina, biotina, ácido fólico, y ácido paraaminobenzoico, así como ¡nositol, leche de coco, e hidrolizado de caseína. Las hormonas de planta incluyen auxinas tal como ácido indoleacético, ácido indolebutírico, ácido naftalenoacético, y ácido 2,4- diclorofenoxiacético, citocininas tal como zeatína, 6- benciladenina , y cinetina, ácido abscísico, y ácido giberélico; sin embargo, cuando pueden cultivarse células de planta, estas hormonas de planta pueden cada una contenerse o no contenerse. Se realiza el cultivo normalmente a 25C° durante 5 días a 6 semanas bajo condiciones aeróbicas tal como cultivo sacudido y cultivo con aireación y agitado.

Para el medio para cultivar el transformante obtenido utilizando células animales como un anfitrión, puede utilizarse un medio RPMI1640 o DMEM usado generalmente o un medio en el cual se agrega suero vacuno fetal a cada uno de estos medios. Normalmente se realiza el cultivo a 37°C durante 1 a 30 días en presencia de 5% de C02. Durante el cultivo, puede agregarse un antibiótico tal como kanamicina o penicilina al medio, si es necesario.

Después de final del cultivo, puede obtenerse una poiimerasa de ADN termoestable en una forma deseada de un cultivo tal como una solución de cultivo o células fungicidas cultivadas. Por ejemplo, para obtener una preparación que contiene la poiimerasa de ADN termoestable, pueden utilizarse los métodos mencionados en la presente antes. Además, puede separarse la poiimerasa de ADN termoestable y purificarse de los extractos (por ejemplo, fracciones extraídas crudas) obtenidos por los métodos de preparación del extracto mencionados en la presente anteriormente para hacer un producto purificado.

Estos extractos pueden cada uno someterse a varias cromatografías, electroforesis, o similares para proporcionar una preparación enzimática purificada. Por ejemplo, puede obtenerse un producto del gen purificado deseado correctamente seleccionando la filtración de gel utilizando Sephadex, Ultragel, Bio-gel, o similares, un método electroforético que utiliza cromatografía de intercambio iónico, gel de poliacrilamida, o similares, o un método de fraccionamiento que utiliza cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa, o similares, o combinación de estos métodos. La secuencia de aminoácido del producto purificado del gen puede analizarse por un método de análisis conocido del aminoácido. El método de cultivo y método de purificación antes descritos son solamente ilustrativos y no deseados para limitación.

Particularmente, de acuerdo con la presente invención, la mayoría de la polimerasa de ADN termoestable es producida en una forma insoluble en un cultivo, y el resultado puede calentarse para llevar a la exhibición de actividad y mejorar la solubilidad y pureza de la misma. Puede realizar el tratamiento por calentamiento en una etapa adecuada antes de obtener la polimerasa de ADN termoestable en una forma deseada (por ejemplo, un producto de preparación o purificado) para solubilizar y activar la polimerasa de ADN termoestable producida por un hongo hospedador. Por ejemplo, se trituran y después centrifugan los células fungicidas cultivadas, y los materiales resultantes se separan en el sobrenadante y el precipitado; la fracción del precipitado o células fungicidas, en las cuales se produce y acumula la polimerasa de ADN termoestable, pueden someterse a tratamiento por calentamiento para alcanzar la solubilidad y activación de la polimerasa de ADN termoestable. Se realiza el tratamiento por calentamiento preferiblemente de 50°C a 100°C, preferiblemente 70°C a 80°C, aún más preferiblemente 73°C a 75°C por aproximadamente 1 hora. La fracción de sobrenadante del producto de cultivo puede también calentarse para insolubilizar la proteína derivada del huésped y mejorar la pureza de la misma. La fracción de sobrenadante del producto de cultivo es preferiblemente calentada de 50°C a 100°C, preferiblemente 70°C a 80°C, aún más preferiblemente 73°C a 75°C por aproximadamente 1 hora.

En la producción de la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención, se introduce un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable y expresa utilizando células eucariotas como un anfitrión. A consecuencia, la preparación de la polimerasa de ADN termoestable a obtenerse puede tener o no la contaminación extremadamente reducida con el ácido nucleico derivado de ADN bacteriano y similares. Así, cuando se obtiene un producto purificado del mismo, los requerimientos para el proceso de purificación, se deducen varias etapas o grado de purificación con relación a la contaminación mediante ácidos nucleicos, y, así, puede reducirse el costo de producción. (2) Método de PCR El método de PCR que utiliza la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención puede ser de varios métodos de PCR a condición de que sea un método de PCR para amplificar un gen deseado para detectar un organismo objeto que se detectará.

Los métodos de PCR preferidos pueden incluir los siguientes métodos: (A) Un método de PCR normal o un método de PCR modificado en el cual los siguientes a, b, y c se utilizan solos o en combinación de A y B, o A y C. a. Un método de PCR en tiempo real que utiliza un intercalador, que comprende los siguientes procedimientos: (a1) Es diseñado el cebador para que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona que el valor Tm del objetivo sea más alto que el del dímero de cebador por sí mismo; y (a2) La temperatura en la detección de fluorescencia durante la PCR en tiempo real se ajusta intermediariamente entre la misma. b. Un método de PCR para la amplificación semi-interna de una secuencia dentro de un ácido nucleico objetivo en un espécimen, que comprende las siguientes etapas: (b-1) El espécimen se mezcla en una mezcla de reacción de amplificación que contiene un par del cebador de PCR externo y un cebador semi-interna; (b-2) Para proporcionar una secuencia de amplificación externa, la mezcla de reacción de amplificación de la etapa b1 se coloca en la porción del ADN como molde, y somete a reacción de amplificación a una temperatura en la cual se hibridice y extienda el par del cebador de PCR externo, pero el par del cebador semi-interna no funciona; y (b-3) Para proporcionar un producto de amplificación semi-interna, la mezcla de la etapa b2 se somete a reacción de amplificación, cualquiera temperatura en la cual solamente uno de los cebadores de PCR externos y el cebador semi-interna se hibridice, d por un tiempo de extensión durante el cual los dos cebadores son extendidos. c. Un método de PCR para la amplificación semi-interna de una secuencia dentro de un ácido nucleico objetivo en un espécimen, que comprende las siguientes etapas: (d) El espécimen se mezcla en una mezcla de reacción de amplificación que contiene un par del cebador de PCR externo y un par del cebador interna; (c2) Para proporcionar una secuencia de amplificación externa, la mezcla de reacción de amplificación de la etapa (d) se coloca en la porción del ADN como un molde y se somete a reacción de amplificación a una temperatura en la cual se recuece y extiende el par del cebador de PCR externo, pero el par del cebador interna no funciona; y (c3) Para proporcionar un producto de amplificación interna, la mezcla de la etapa (c2) se somete a reacción de amplificación a cualquier temperatura en la cual solamente se recuece el par del cebador interna, o por un tiempo de extensión durante la cual el cebador es extendido.

(B) Un método de PCR que es un método de PCR en tiempo real que utiliza un intercalador como un método de PCR modificado involucrado en un método de cuantificación y los siguientes procedimientos: (a1) Se diseña el cebador de modo que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona un objetivo sea mayor que el valor del dímero de cebador por sí mismo; (a2) La temperatura en la detección de fluorescencia durante la PCR en tiempo real se ajusta intermediariamente entre la misma; y (2-3) Un método de PCR modificado involucrado en el método de detección y método de cuantificación de la presente invención es un método para la amplificación semi-interna de una secuencia dentro de un ácido nucleico objetivo en un espécimen e incluye las siguientes etapas: (b1) El espécimen se mezcla en una mezcla de reacción de amplificación que contiene un par del cebador de PCR externo y un cebador semi-interna; (b2) Para proporcionar una secuencia de amplificación externa, la mezcla de reacción de amplificación de la etapa b1 se coloca en la porción de ADN como un molde y somete a reacción de amplificación a una temperatura en la cual se hibridice y extienda el par del cebador de PCR externo, pero el cebador semi-interna no funciona; y (b3) Para proporcionar un producto de amplificación semi-interna, se somete la mezcla de la etapa b2 a reacción de amplificación a cualquiera temperatura en la cual solamente uno de los cebadores de PCR externos y el cebador semi-interna se hibridice, o por un tiempo de extensión durante la cual los dos cebadores son extendidos.

(C) Un método de PCR para la amplificación interna de una secuencia dentro de un ácido nucleico objetivo en un espécimen como una PCR modificada involucrada en el método de detección y el método de cuantificación, que comprende las siguientes etapas: (c1) El espécimen se mezcla en una mezcla de reacción de amplificación que contiene un par del cebador de PCR externo y un par del cebador interna; (c2) Para proporcionar una secuencia de amplificación externa, la mezcla de reacción de amplificación de la etapa c1 se coloca en la porción del ADN como un molde y somete a reacción de amplificación a una temperatura en la cual se hibridice y extienda el par del cebador de PCR externo, pero el par del cebador interna no funciona debido al efecto inhibidor de un par del cebador de intervención; y (c3) Para proporcionar un producto de amplificación interna, se somete la mezcla de la etapa (c2) a reacción de amplificación a cualquier temperatura en la cual solamente se hibridice el par del cebador interna, o por un tiempo de extensión durante el cual el cebador es extendido.

Uno de los métodos de PCR modificados útiles cuando se combina con la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención es un método de Dímero de Cebador enmascarado (método A). A diferencia de un método convencional para suprimir la formación de un dímero de cebador, el método de Dímero de Cebador enmascarado es una técnica que comprende hacer solamente un dímero de cebador no exhibido. La técnica es un método para realizar la PCR en tiempo real utilizando un intercalador mediante los procedimientos: (a1) Se diseña el cebador de modo que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona un objetivo sea mayor que el valor Tm del dímero de cebador; y (a2) La temperatura en la detección de fluorescencia durante la PCR en tiempo real se ajusta en el valor de la mediana entre la misma, considerando que "el dímero de cebador es pequeño como un producto de amplificación . y por lo tanto tiende a tener un valor Tm bajo".

Al pasar por los procedimientos anteriores, solamente el dímero de cebador es disociado de un hebra doble en hebras sencillas; así, el intercalador no puede unirse al mismo. A consecuencia, el dímero de cebador no emite fluorescencia, que hace solamente el dímero de cebador no-exhibido en un monitor, dando por resultado el producto de amplificación deseado que representa normalmente una curva de amplificación.

El diseño de los cebadores utilizado para el método A no está particularmente limitado a condición que es tal que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona un objetivo llega a ser mayor que el valor del dímero de cebador por sí mismo. Sin embargo, como un ejemplo específico, pueden diseñarse los cebadores de modo que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona un objetivo sea 5°C o más, preferiblemente 10°C o más, mayor del valor Tm del dímero de cebador por sí mismo. Para el método A, la temperatura en la detección de fluorescencia durante PCR en tiempo real puede ajustarse en el valor de la mediana entre el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona una objetivo y el valor Tm del dímero de cebador. Sin embargo, el valor de la mediana puede tener un intervalo en proximidad del valor de la mediana, por ejemplo, en proximidad de 1 a 4°C, es decir, el valor de la mediana ± 1 a ± 4, dependiendo del grado de la diferencia del valor Tm entre el producto de amplificación y el dímero de cebador. Sin embargo, la temperatura de detección de fluorescencia es preferiblemente una temperatura tan baja como sea posible en el intervalo anterior.

La PCR en tiempo real que utiliza un intercalador puede ser una para al cual el dispositivo y método usados se conocen; los ejemplos de la misma incluyen PCR en tiempo real que utiliza un colorante fluorescente tal como verde SYBR I como intercalador.

Otro de los métodos de PCR modificados útiles cuando se combinan con la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención es la aplicación de un método de amplificación interna o del diseño del tiempo de extensión de PCR. Aplicando el método de amplificación interna o diseñando el tiempo de extensión de PCR, una PCR interna puede realizarse utilizando solamente una redonda de PCR sin realizar separadamente dos redondos de PCR (un sola etapa de PCR interna) como en la PCR interna convencional. Esta PCR interna de una sola etapa puede inmediatamente realizarse después de agregar una "cebador interna" simplemente diseñada; así, es un método infalible.

La PCR interna de una sola etapa es una modificación de PCR del método B o método C.

Método B: Un método de PCR modificado para la amplificación semi-interna de una secuencia dentro de un ácido nucleico objetivo en un espécimen, que comprende las siguientes etapas: (b1) El espécimen se mezcla en una mezcla de reacción de amplificación que contiene un par del cebador de PCR externo y un cebador semi-interna; (b2) Para proporcionar una secuencia de amplificación externa, la mezcla de reacción de amplificación de la etapa b1 se coloca en la porción del ADN como un molde y somete a reacción de amplificación a una temperatura en la cual se hibridice y extienda el par del cebador de PCR externo, pero el par del cebador semi-interna no se hibridice; y (b3) Para proporcionar un producto de amplificación semi-interna, la mezcla de la etapa b2 se somete a la reacción de amplificación a una temperatura en la cual ambos de los cebadores de PCR externos y cebador semi-interna se hibridicen, pero solamente es desnaturalizado el producto de amplificación de PCR interna interno. Alternativamente, se somete a la reacción de amplificación por un tiempo de extensión durante la cual solamente puede extenderse el producto interno interna de amplificación de PCR.

Para el método B, la mezcla de reacción de amplificación incluye 3 tipos de cebadores. Es decir, un primer cebador es uno de los cebadores de PCR externos complementados; un segundo cebador es el cebador semi-interna; y un tercer cebador es el otro de los cebadores externos de PCR complementados y también forma un par con el cebador semi-interna.

Para el método B, es necesario en la etapa b2 utilizar una temperatura en la cual solamente se hibridice y extienda el par del cebador de PCR externo, pero no se hibridice el cebador semi-interna. Es también necesario en la etapa b3 proporcionar una temperatura en la cual los productos de amplificación de PCR externos no se desnaturalicen, pero solamente se desnaturaliza y extiende un producto de amplificación de PCR interna interno. Alternativamente, es necesario en la etapa b3 proporcionar una tiempo de extensión durante el cual no puedan extenderse los productos de amplificación de PCR externos, pero solamente puede extenderse el producto de amplificación de PCR interna interno. Para el método B, la temperatura para hibridizar los pares del cebador semi-interna es preferiblemente 5°C a 20°C menor que la temperatura adecuada para hibridizar los pares del cebador de PCR externo.

Para la etapa a1 del método B, los cebadores están preferiblemente presentes a una temperatura constante en la mezcla de reacción de amplificación.

Para el método B, los valores Tm del primer cebador y tercer cebador son preferiblemente iguales. Para el método B, se ajusta el segundo cebador en el lado interno para que sean semi-internos con respecto al primer o tercer cebador, y el valor Tm del segundo cebador es preferiblemente 5 a 20°C menor que el valor Tm de cada uno del primer y tercer cebadores. Para el método B, los productos de amplificación externos son preferiblemente de manera suficiente mayores (aproximadamente 300 bp o más) que el producto de amplificación interno interna.

Método C: Un método de PCR modificado para la amplificación interna de una secuencia dentro de un ácido nucleico objetivo en un espécimen, que comprende las siguientes etapas: (d) El espécimen se mezcla en una mezcla de reacción de amplificación que contiene un par del cebador de PCR externo y un par del cebador interna; (c2) Para proporcionar una secuencia de amplificación externa, la mezcla de reacción de amplificación de la etapa d se coloca en la porción del ADN como un molde y somete a la reacción de amplificación a una temperatura en la cual se hibridice y extienda el par del cebador de PCR externo, pero no se hibridice el par del cebador interna; y (c3) Para proporcionar un producto de amplificación interna, la mezcla de la etapa c2 se somete a la reacción de amplificación a una temperatura en la cual solamente se desnaturalice un producto de amplificación de PCR interno interna. Alternativamente, se somete a la reacción de amplificación por un tiempo de extensión durante el cual solamente puede extenderse el producto de amplificación de PCR interno interna.

Para el método C, la mezcla de reacción de amplificación incluye 4 tipos de cebadores. Es decir, un cuarto cebador y un quinto cebador forman un par del cebador de PCR externo, y un sexto cebador y un séptimo cebador forman un par del cebador interna. Para el método C, es necesario en la etapa c2 utilizar una temperatura en la cual solamente se hibridice y extienda el par del cebador de PCR externo, pero no funciona el par del cebador interna. Es también necesario en la etapa c3 proporcionar una temperatura en la cual no se desnaturalicen los productos de amplificación de PCR externos, sino que solamente se desnaturalizan y extienden los productos de amplificación de PCR internas internos. Alternativamente, es necesario en la etapa c3 proporcionar un tiempo de extensión durante el cual los productos de amplificación de PCR externos no puedan extenderse, sino que solamente puedan extenderse los productos de amplificación de PCR internas internos.

Para el método C, la temperatura para hibridizar el par del cebador interna es preferiblemente 5°C a 20°C menor que la temperatura adecuada para hibridizar los pares del cebador de PCR externos.

Para la etapa d del método C, el cuarto a séptimo cebadores están preferiblemente presentes a una temperatura constante en la mezcla de reacción de amplificación. Para el método C, el valor Tm de cada uno de los sexto a séptimo cebadores es preferiblemente 5°C a 20°C menor que el de cada uno de los cuarto a quinto cebadores. Para el método C, los valores Tm de los cuarto a quinto cebadores son preferiblemente iguales. Para el método C, los valores Tm de los sexto a séptimo cebadores son preferiblemente iguales. Para el método C, los productos de amplificación externos son preferiblemente de manera suficiente mayores (300 bp aproximadamente o más) que los productos de amplificación internos internas.

Método del Dímero de Cebador Enmascarado En la condición de PCR normal el ajuste se da más adelante, el punto de detección de fluorescencia se ajusta a 72°C después de la extensión.

Temperatura del objetivo: 94°C, 55°C, 72°C Tiempo de incubación: 10 segundos Velocidad de transición de temperatura: 20.00 [°C/s] Número de ciclo: 60 Después un dímero de cebador (pd) es detectado utilizando agua destilada (D.W.) como se muestra por una curva de amplificación en la Figura 13. En este momento, por ejemplo, una curva de fusión en la detección de E. coli muestra que el valor Tm del dímero de cebador es de aproximadamente 76°C y el valor Tm de un producto de amplificación de PCR deseado (£. coli) es de aproximadamente 91°C (Figura 14).

Por consiguiente, se diseña un cebador tal que el valor Tm del producto de PCR deseado es 10°C mayor que el valor Tm del dímero de cebador, y se ajusta el punto de detección de fluorescencia (FDP) a aproximadamente el valor de la mediana entre el mismo (por ejemplo, 86°C como en las siguientes condiciones) (Figura 10: la temperatura puede ser en cualquier momento en vez de después de la extensión).

Temperatura del objetivo: 94°C, 55°C, 72°C, 86°C Tiempo de incubación: 10 segundos (94°C, 55°C, 72°C); 1 segundo (86°C) Velocidad de transición de temperatura: 20.00 [°C/s] Número de ciclo: 60 Después no se detecta ningún dímero de cebador. Esto es, no se exhibe el dímero de cebador; así, la combinación del mismo con la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención puede proporcionar una curva de amplificación que no indica ninguna amplificación utilizando agua destilada (D.W.) como se muestra en la Figura 15 (A).

La combinación de "método de no exhibición + polimerasa de ADN termoestable de la presente invención + cebadores universales bacterianos" permite la medida de una bacteria al límite de detección (Figura 14), y se ha mostrado para ser capaz de cuantificación exacta al límite de detección puesto que la curva estándar muestra linealidad al límite de detección. Esto es, se hace posible medir cuantitativamente bacterias con alta sensibilidad y exactamente por el método de PCR en tiempo real utilizando un ¡ntercalador solamente después de agregar el método de Dímero de Cebador enmascarado a la presente invención.

Método de PCR Interna de Una Etapa Se diseñan los siguientes cebadores (ver la Figura 11 (A)). (a) Los valores Tm de los cebadores directos e inversos para un producto de PCR externo (producto de amplificación I) serán iguales o cercanos entre sí. (b) Un cebador (cebador II) es el interno ajustado que es semi-interno con respecto a uno de los cebadores para el producto de PCR externo. (c) Se diseñan los cebadores semi-internos tal que tengan valores Tm de 5 a 20°C menor que los de los cebadores para el producto de PCR externo. (d) Se diseñan los cebadores de modo que el producto de amplificación I tengan una longitud de aproximadamente 400 bp o más para ajustar el valor Tm del producto de PCR externo (producto de amplificación I) a 89°C o más. (e) Se diseña el cebador de modo que el producto de amplificación II tenga una longitud de aproximadamente 100 bp para ajustar el valor Tm de un producto de PCR semi-interna (producto de amplificación II) de 86°C a 87°C.

Cuando se realiza una PCR interna más específica, se diseñan los siguientes nuevos cebadores (ver Figura 11 (B)). (a) Los valores Tm de los cebadores directos e inversos para un producto de PCR externo (producto de amplificación I) serán ¡guales o cercanos entre sí. (b) Los valores Tm de dos cebadores interna (cebador II) se ajustan a suficientemente bajo (por 5 a 20°C) comparados con los valores Tm de los cebadores para el producto de amplificación I. (c) Se diseñan los cebadores de modo que el producto de amplificación I tenga una longitud de aproximadamente 500 bp o más para ajustar el valor Tm del producto de amplificación I a 89°C o más. (d) Se diseñan los cebadores de modo que el producto de amplificación II tenga una longitud de aproximadamente 100 bp para ajustar el valor Tm del producto de amplificación II de 86°C a 87°C. (e) Se diseñan los cebadores de modo que los productos de amplificación III e IV tengan longitudes de aproximadamente 300 bp o más para ajustar los valores Tm de los productos, de amplificación III e IV a 89°C o más. (3) Método para Detectar el Organismo Objetivo a Detectarse (Método de Detección) El método de detección para que un organismo objeto sea detectado en una muestra de acuerdo con la presente invención que comprende: (1) una etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención; y (2) una etapa de detección para detectar un producto de amplificación del gen deseado en productos de amplificación en la etapa de amplificación.

Para este método de detección, la etapa de amplificación se realiza preferiblemente bajo supresión de amplificación de un gen no deseado distinto del gen deseado. Puede utilizarse un método Hot Start utilizando un anticuerpo de la polimerasa anti-ADN preferiblemente para la supresión de amplificación de un gen no deseado. A este respecto, se utiliza el anticuerpo anti-polimerasa ADN preferiblemente en cantidades excesivas basadas en 1 U de la polimerasa de ADN termoestable.

La etapa de detección del método puede detectar el producto de amplificación del gen deseado sin detección de un producto de amplificación de un diferente gen no deseado. Para esta etapa, se utiliza un método preferiblemente en cuyas condiciones permite la detección del producto de amplificación del gen deseado sin la detección de un producto de amplificación de un diferente gen no deseado se ajustan por: (1) diseñar los cebadores de modo que la temperatura de fusión (TmA) del producto de amplificación del gen deseado sea mayor que la temperatura de fusión (TmB) del producto de amplificación del gen no deseado; y (2) realizar la detección del producto de amplificación a una temperatura entre TmA y TmB para detectar solamente el producto de amplificación del gen deseado.

Además, puede utilizarse un método en el cual la etapa de amplificación y la etapa de detección son realizados por PCR en tiempo real utilizando un dispositivo de exhibición para exhibir la cantidad de un producto de amplificación y el producto de amplificación de un gen no deseado no debe exhibirse en el dispositivo de exhibición.

Puede utilizarse un intercalador etiquetado para la detección para detectar el producto de amplificación.

Puede realizarse la etapa de detección desarrollando el producto de amplificación en un gel. Puede desarrollarse el producto de amplificación mediante electroforesis de gel para visualización.

Los ejemplos del organismo objeto que se detectará pueden incluir uno o dos o más seleccionados del grupo que consiste de bacterias, hongos, y virus.

El método de detección de la presente invención puede lograr la detección de un microorganismo causante de una infección en una muestra con alta sensibilidad. Además, el método de detección de la presente invención puede aplicarse adecuadamente a una muestra que debe estar en un ambiente estéril, seleccionada del grupo que consiste de sangre, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, urea, alimentos (incluyendo un ambiente de procesamiento de alimentos que se someterán al análisis de contaminación), bebidas, cosméticos, y muestras proporcionadas para el análisis de calidad de agua y análisis de contaminación de ambientes experimentales biológicos. Los ejemplos de la muestra proporcionada para análisis de calidad de agua pueden incluir agua de la llave, agua de almacenamiento de agua o tanque de suministro de agua, agua circulante de acondicionamiento de aire, agua de humidificador, agua de manantial caliente, o agua de piscina.

En la etapa de detección, se cuantifica el producto de amplificación del gen deseado, y pueden utilizarse los resultados de cuantificación para realizar la cuantificación de un organismo objeto que se detectará en una muestra; la medida del número de individuos de la misma; la supervisión de la presente cantidad de la misma; y cuantificación/identificación de la misma. El método de cuantificación para que un organismo objeto que se detectará en una muestra se describe más adelante.

(Método de Cuantificación) El método para cuantificar un organismo objeto que se detectará en una muestra de acuerdo con la presente invención comprende: (1) una etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ADN preparado de la muestra, cebadores para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención; y (2) una etapa de cuantificación para cuantificar el producto de amplificación en la etapa de amplificación y cuantificar el organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación obtenidos.

El organismo objeto que se detectará puede ser cualquier organismo que tiene un ácido nucleico para información de transferencia; ejemplos del mismo pueden incluir bacterias (eubacteria o bacterias antiguas), hongos, y virus. El método de cuantificación de la presente invención que utiliza la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención es adecuado particularmente para la cuantificación de bacterias. La cuantificación puede realizarse comparando los resultados para detectar el producto de amplificación con los resultados obtenidos utilizando un organismo de referencia. El método de cuantificación de la presente invención puede cuantificar el número de individuos de un organismo objeto que se detectará en la muestra y la masa total del mismo. Además, un gen para la identificación de un organismo objeto que se detectará puede utilizarse como un gen deseado para cuantificar e identificar el organismo objeto que se detectará contenido en una muestra de los resultados para cuantificar un producto de amplificsnción del gen deseado.

Para el ácido nucleico de una muestra, puede utilizarse el ADNc preparado basado en el ADN obtenido de la muestra o además el ARN obtenido de la muestra. Puede también utilizarse el ARN directamente como un objeto a amplificarse, de acuerdo con el objeto particular.

Los ejemplos de la muestra incluyen una muestra que debe estar en un ambiente estéril. Los ejemplos de la muestra que debe estar en un ambiente estéril pueden incluir un espécimen muestreado de humanos o animales domésticos, tal como sangre, fluido cerebroespinal, fluido amniótico o urea. Además, para la muestra, puede utilizarse una muestra proporcionada para análisis de calidad de agua. Los ejemplos de la muestra proporcionada para análisis de calidad de agua pueden incluir agua de la llave, agua de almacenamiento de agua o tanque de suministro de agua, agua circulante de acondicionamiento de aire, agua de humidificador, agua de manantial caliente, o agua de piscina. Además, para la muestra, puede utilizarse una muestra tal como un alimento, bebida, cosmético, o cultivo celular en un ambiente experimental biológico en la cual se contiene las materias orgánicas y la presencia o proliferación de bacterias u hongos resultantes de la deterioración de la calidad de la misma.

Puede prepararse el ADN de una muestra por un método convencional. Cuando se proporciona una preparación del ADN para la etapa de amplificación, puede someterse una preparación del ADN al retiro de componentes con excepción del ADN y ajuste de la concentración, como sea necesario.

La PCR, especialmente PCR en tiempo real, puede aplicarse adecuadamente a la etapa de amplificación. Para la detección de un producto de amplificación, pueden utilizarse varios métodos conocidos. Ejemplos de los mismos incluyen un método que utiliza un ¡ntercalador que tiene una función de etiquetado y un método que utiliza una prueba en la cual una sustancia fluorescente se enlaza a un nucleótido capaz de específicamente hibridizar una secuencia del ADN a amplificarse. Ejemplos del intercalador incluyen bromuro de etidio y SYBR Green I. El intercalador es preferiblemente SYBR Green I. Cuando los cebadores universales, se hacen reaccionar con todas las bacterias del ADN, se utilizan, el SYBR Green I a utilizarse es preferiblemente SYBR Green I de alta pureza en el cual se minimiza la contaminación con el ADN bacteriano derivado de un anfitrión recombinante.

Para este método, se realiza la etapa de amplificación preferiblemente bajo condiciones en las cuales la amplificación de un gen no deseado con excepción de un gen deseado se suprime. Los métodos para la supresión de amplificación de un gen no deseado incluyen, por ejemplo, un método de Hot Start, un método que utiliza cebadores modificados, un método que involucra agregar una sustancia que une a un dímero de cebador a una muestra, y un método que involucra agregar una sustancia química en una solución de amplificación de gen que contiene una polimerasa de ADN termoestable. El método de Hot Start es preferible. Ejemplos del método de Hot Start incluyen un método que utiliza un anticuerpo de la polimerasa anti-ADN y un método de cera que involucra separar la enzima y cebadores hasta que la cera alcance la temperatura de fusión. Cuando se realiza el método que utiliza un anticuerpo de la polimerasa anti-ADN, se utiliza el anticuerpo de la polimerasa anti-ADN preferiblemente en una cantidad excesiva que excede la cantidad en la cual la actividad enzimática de la polimerasa de ADN termoestable se inhibe por 100%.

Método de no exhibición Además, el producto de amplificación es cuantificado por un método de no exhibición para permitir la cuantificación simple con alta sensibilidad. El método de no exhibición es un método que involucra la detección del producto de amplificación bajo condiciones en las cuales el producto de amplificación de un gen deseado se pone en un estado detectable y el producto de amplificación de un diferente gen no deseado se pone en un estado no detectable.

Específicamente, las condiciones de permitir la detección del producto de amplificación del gen deseado sin detectar un producto de amplificación de un diferente gen no deseado se ajustan por: (1) diseñar los cebadores de modo que la temperatura de fusión (TmA) del producto de amplificación del gen deseado sea mayor que la temperatura de fusión (TmB) del producto de amplificación del gen no deseado; y (2) realizar la cuantificación del producto de amplificación a una temperatura entre TmA y TmB.

El método de no exhibición se aplica adecuadamente a un método de PCR en tiempo real utilizando un dispositivo de exhibición para exhibir la cantidad de un producto de amplificación para la amplificación de un gen deseado y la cuantificación de un producto de amplificación. El uso de este método hace el producto de amplificación del gen no deseado no exhibido en el dispositivo de exhibición en cuantitativamente analizar el producto de amplificación, que permite la eliminación de la influencia del producto de amplificación del gen no deseado en sensibilidad.

Para el gen no deseado, el problema particular es un dímero de cebador. Cuando la cantidad de ADN preparado de una muestra es muy pequeña, un cebador está presente en una cantidad excesiva basada en el ADN preparado de la muestra en la etapa inicial de amplificación. Cuando se forma un dímero de cebador, se forma un producto de amplificación basado en el dímero, haciendo imposible la supervisión o cuantificación de un producto de amplificación del ADN esencialmente a detectarse. Para la ocurrencia de un dímero de cebador, se utiliza el método de Hot Start y/o método de no exhibición preferiblemente.

Es extremadamente difícil inhibir totalmente la formación de un amortiguador de cebador. Incluso si se utilizan varios métodos para suprimir la formación de un dímero de cebador, hay casos en que un dímero de cebador es detectado en respuesta a un incremento en el número de ciclos de PCR. Esto es una contribución a una reducción en la sensibilidad de la medida cuantitativa utilizando la PCR en tiempo real. Incluso para el análisis cualitativo, puede ser necesario adoptar una técnica que involucre comprobar un valor Tm (temperatura de fusión) en cada medida para excluir la posibilidad de "falso-positivo" debido al dímero de cebador.

A diferencia de un método convencional para suprimir la formación de un dímero de cebador, el método de no exhibición es un método que involucra hacer solamente un dímero de cebador no exhibido (un método de Dímero de Cebador enmascarado), y se ha terminado, considerando que "el dímero de cebador es un producto de amplificación y por lo tanto tiende a tener un valor Tm bajo".

Para realizar el método de Dímero de Cebador enmascarado utilizando la PCR en tiempo real, se ajustan las siguientes condiciones: (1) Se diseña el cebador de modo que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona un objetivo sea mayor que el valor Tm del dímero de cebador; y (2) La temperatura en la detección del producto de amplificación durante la PCR en tiempo real se ajusta en el valor de la mediana entre la misma.

El ajuste de las condiciones anteriores disocia solamente un dímero de cebador bicatenario en cadenas sencillas en la detección del producto de amplificación. En la detección del producto de amplificación (ADN bicatenario), el uso de un marcador para no detectar el ADN monocatenario sino detectar solamente el ADN bicatenario, por ejemplo, un intercalados hace la unión del ¡ntercalador imposible, debido a que solamente el dímero de cebador bicatenario se disocia en hebras sencillas. A consecuencia, no se proporciona una señal de detección basada en el dímero de cebador. Solamente el dímero de cebador no se exhibe en un dispositivo de exhibición (tal como un monitor) y los resultados del producto de amplificación deseados en el dibujo normal de una curva de amplificación.

Cuando se utiliza el método de no exhibición, el diseño de cebadores no está particularmente limitado a condición de que es tal que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona un objetivo es mayor que el valor del dímero de cebador por sí mismo. Sin embargo, puede realizarse el diseño de cebadores de modo que el valor Tm del producto de amplificación de PCR proporciona un objetivo 5°C mayor, preferiblemente 10°C mayor que el valor Tm del dímero de cebador por sí mismo. El valor Tm del producto de amplificación se ajusta dependiendo del sistema de medida utilizado.

Específicamente, (1) Los cebadores de, desde los cuales un dímero de cebador es difícil de producirse, son diseñadas por un método de diseño convencional; (2) Se realiza el diseño de modo que los valores Tm de cebadores por sí mismos sean 60°C o menores; y (3) Calcular utilizando un método de vecino más próximo, el diseño es realizado de modo que el valor Tm de un producto de amplificación de PCR que proporciona un objetivo es de aproximadamente 87°C o mayor.

El tamaño del producto de amplificación obtenido mediante amplificación que utiliza estos cebadores no está particularmente limitado a condición de que es un tamaño diseñado de modo que el valor Tm del producto es mayor que el del dímero de cebador por sí mismo. Sin embargo, los cebadores son preferiblemente diseñados de modo que el tamaño de los mismos esté en el orden de 50 bp a 1,000 bp, preferiblemente 50 bp a 500 bp, que son adecuados para amplificación utilizando la PCR en tiempo real.

La temperatura de detección de fluorescencia durante la PCR en tiempo real puede ajustarse en el valor de la mediana entre el valor Tm del producto de amplificación de PCR que proporciona una objetivo y el valor Tm del dímero de cebador; el valor de la mediana puede tener un intervalo en proximidad del valor de la mediana, por ejemplo, en el intervalo de ±1 a ±4°C del valor de la mediana, dependiendo del grado de la diferencia del valor Tm entre el producto de amplificación y el dímero de cebador. Sin embargo, la temperatura de detección de fluorescencia se ajusta preferiblemente a una temperatura tan baja como sea posible en el intervalo anterior, en vista de la estabilidad del ADN bicatenario.

La PCR en tiempo real que utiliza un intercalador puede utilizar un dispositivo, técnica, y similares que se conocen generalmente; por ejemplo, se menciona la PCR en tiempo real que utiliza el SYBR Green I como intercalador.

El uso de un método de Dímero de Cebador enmascarado puede realizar un análisis cuantitativo sin reducir la sensibilidad y elimina el riesgo de positividad falsa debido a un dímero de cebador en el examen cualitativo, debido a que la formación del dímero de cebador se convierte en no más un obstáculo para el método de PCR en tiempo real que utiliza un intercalador. Además, el método de la presente invención es simple y económico comparado con métodos convencionales tal como un método de Hot Start que utiliza un anticuerpo de la polimerasa anti-ADN.

El método de no exhibición permite medir al límite de detección; además, puesto que la curva estándar muestra linealidades al límite de detección, es hecho posible hacer la medida cuantitativa exacta con alta sensibilidad por el método de PCR en tiempo real.

Cuantificación del Organismo Objetivo a Detectarse de Producto de Amplificación Utilizando el Método de PCR Para la determinación de la cantidad de un organismo objeto que se detectará (incluyendo la ausencia de la misma) del producto de amplificación, puede preferiblemente no utilizarse en un método para la determinación basada en una curva estándar obtenida de las cantidades conocidas del organismo objeto que se detectará bajo condiciones (protocolo) en las cuales se realiza la amplificación. Por ejemplo, si el límite de detección (sensibilidad) a 35 ciclos es 0.1 CFU/ml en la curva estándar ilustrada que utiliza un protocolo particular, 35 ciclos de reacción de PCR pueden realizarse para calcular la cantidad de un organismo objeto que se detectará en referencia a la curva estándar. La adición de una etapa de concentración de muestra o una etapa de tratamiento de etanol al protocolo puede además incrementar el límite de detección (sensibilidad) (por ejemplo, de aproximadamente 60 ciclos). Después, la sensibilidad puede ajustarse, por ejemplo, en un nivel extremadamente alto de 0.000001 CFU/ml. La sensibilidad de detección capaz de ajustarse puede calcularse por adelantado. Por ejemplo, para la cuantificación para el agua de vida diaria por un "método de alta sensibilidad para cuantificar un objeto a detectarse", debido a que la sensibilidad de detección de PCR de los cebadores universales para bacterias es 10 fg/µ? y la sensibilidad de detección de PCR de cebadores universales para hongos es 10 pg/µ?, los siguientes valores se obtuvieron, utilizando una fórmula de conversión para conversión a la unidad de CFU/ml y además considerando que 50 mi de una muestra primero son granulados y después sometidos a extracción del ADN: bacteria: 3.0 ? 10-1 CFU/ml hongo: 2.8 CFU/ml.

La sensibilidad de detección puede variarse modificando el protocolo.

Cuantificación del Organismo Objeto a Detectarse del Producto de Amplificación Utilizando el Método de Desarrollo de Gel Un producto de amplificación (que incluye obtener utilizar un método de Hot Start) puede desarrollarse en un gel de la agarosa o similares para cuantificar simplemente un organismo objeto que se detectará por intensidad fluorescente en la detección de fluorescencia, o similares.

Método para Determinar la Presencia de Bacteria La polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención puede también utilizarse adecuadamente para los siguientes métodos. (i) Un método para determinar la presencia de una bacteria en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando cebadores para amplificar un gen deseado específico para la bacteria (B) y una preparación que contiene una polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión; y (2) una etapa para visualizar el producto de amplificación en la primera etapa de amplificación, en donde los cebadores (B) son: (B) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todo o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los cebadores anteriores.

La electroforesis de gel puede utilizarse como un método para visualizar el producto de amplificación.

(II) Un método para supervisar la cantidad presente de una bacteria en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando cebadores para amplificar un gen deseado específico para la bacteria (B) y una preparación que contiene una polimerasa de ADN termoestable producida utilizando células eucariotas como un anfitrión; y (2) una etapa para digitalizar el producto de amplificación en la primera etapa de amplificación, en donde los cebadores (B) son: (B) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todo o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los cebadores anteriores.

Un método de medición de absorbencia o un método densitométrico puede utilizarse como un método para digitalizar el producto de amplificación.

Método de cuantificación/identificación Los métodos de cuantificación para que un organismo objeto sea detectado en una muestra pueden aplicarse a los siguientes métodos para cuantificar e identificar un organismo objeto que se detectará.

(A) Un método de cuantificación/identificación para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ADN preparado de la muestra, cebadores (B) y (M), para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención, (2) una primera etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en la primera etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para un producto de amplificación del gen deseado para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra, (3) una segunda etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ADN preparado de la muestra, cebadores (F), para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una bacteria como un anfitrión, y (4) una segunda etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en la segunda etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para un producto de amplificación del gen deseado para cuantificar los productos de amplificación en la primera etapa de cuantificación/identificación de cuantificar e identificar el organismo objeto que se detectará y la segunda etapa de amplificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación obtenidos, en donde los cebadores (B), (F) y (M) son: (B) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todo o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los cebadores anteriores, (F) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones del gen de ARNr 18S de todos los hongos y cebadores que contienen todo o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los cebadores anteriores, y (M) un conjunto de cebadores específicamente amplificado de un gen resistente a antibiótico de acuerdo con una epidemia del momento tal como un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina.

(B) Un método de cuantificación/identificación para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ADN preparado de la muestra, cebadores (B), para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención, (2) una primera etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en la primera etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para un producto de amplificación del gen deseado para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra, (3) una segunda etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ADN preparado de la muestra, cebadores (F), para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una bacteria como un anfitrión, (4) una segunda etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de productos de amplificación (3 a 10 productos) en la segunda etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para un producto de amplificación del gen deseado para cuantificar los productos de amplificación en la primera etapa de cuantificación/identificación para cuantificar/identificar el organismo objeto que se detectará y la segunda etapa de amplificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación obtenidos, (5) una tercera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ADN preparado de la muestra, cebadores (M), para amplificar un gen deseado específico para que el organismo objeto sea detectado, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención, y (6) una tercera etapa de cuantificación/identificación para analizar las temperaturas de fusión (valores Tm) de los productos de amplificación en la tercera etapa de amplificación basadas en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para un producto de amplificación del gen deseado para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra, en donde los cebadores (B), (F) y (M) son: (B) cebadores que pueden seleccionarse del grupo que consiste de un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todo o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los cebadores anteriores, (F) cebadores que pueden seleccionarse del grupo que consiste de un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones del gen de ARNr 18S de todos los hongos y cebadores que contienen todo o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los cebadores anteriores, y (M) un conjunto de cebadores específicamente amplifico de un gen resiste a antibiótico que refleja una epidemia del tiempo tal como un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina.

De acuerdo con la invención de la presente solicitud, los cebadores que contienen una porción de cada uno de los cebadores que constituyen cada conjunto de cebadores sólo necesita no tener pérdida de función como un cebador universal (la función de reconocer una región común particular); ejemplos del mismo pueden incluir cebadores cada uno obtenido suprimiendo o agregando 1 a 3 bases en cada una de las secuencias base diseñadas como cebadores universales.

Es preferible ajustar 3 a 10 regiones de amplificación como regiones de amplificación de los genes de ARNr 16S bacterianos. Es también preferible ajustar 3 a 10 regiones de amplificación como regiones de amplificación del gen de ARNr 18S de hongos.

Además, una referencia del valor Tm puede medirse en cada ciclo utilizando cualquiera de "un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias y un conjunto de cebadores que contienen todos o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los cebadores anteriores" para agregar una etapa para corregir el error de medida del valor Tm del producto de amplificación para medida con una precisión mayor.

Para un algoritmo para identificar el organismo objeto que se detectará, no sólo una combinación de los valores Tm sino también una combinación de diferencias entre los valores Tm pueden utilizarse para identificación agregando una etapa para minimizar la influencia de errores de medida.

El "cálculo del promedio de la combinación de los valores Tm para combinar los valores relativos de los valores Tm al valor promedio" puede utilizarse como un método para corregir un error de medida en cada ciclo de medida de un dispositivo sin requerir la "medir un valor Tm estándar en cada ciclo". Es decir, se trata de un método en el cual el arreglo de las combinaciones de los valores Tm se utiliza como una "forma de identificación". La "forma" bidimensional que muestra el arreglo de las combinaciones de los valores Tm no es afectada por errores de medida. Por ejemplo, la combinación de valores Tm específicos (valores de n) para que el organismo objeto sea detectado consiste de T 1db a T ndb (db = base de datos) y los valores relativos al valor promedio del mismo sean d 1 d b a d ndb, respectivamente (Figura 11(C); el caso de n = 1 a 5). Similarmente, la combinación de los valores Tm (valores de n) para que un organismo desconocido sea detectado obtenidos de una muestra consiste de T 1 ref a T nref (ref = referencia) y los valores relativos al valor promedio de los mismos sean d 1 ref a d nref, respectivamente (Figura 11(C)). Después, se realiza la comparación con la base de datos para utilizar "la aproximación de la combinación de los valores relativos de la misma = la semejanza de la "forma" del arreglo de la combinación de los valores Tm de la misma" como un algoritmo de identificación. Así, el organismo para el cual el resultado de la fórmula de cálculo: Fórmula 1 Dist.= f (D1db-D1ref)2+(D2db-D2ref)2+...+(D7db-D7ref)2} está más cercano a cero puede identificarse como organismo objeto deseado a detectarse. El algoritmo anterior puede utilizarse como un software de identificación tipo base de datos en una computadora.

Los métodos (A) y (B) primero se han logrados aplicando los resultados (WO2007/097323) a la técnica de cuantificación alcanzada utilizando la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención. Se obtuvieron los resultados (WO2007/097323) mediante estudios intensivos de la aplicación de la diferencia de valores Tm entre cepas para la identificación de un' organismo objeto que se detectará, basada en el fundamento teórico que "la temperatura de fusión (valor Tm) depende de la secuencia base" para el método de vecino más próximo.

Estos métodos serán específicamente descritos más adelante. (1) el ARNr 16S bacteriano se conoce por tener 7 a 10 regiones de secuencias base (20 a 40 bases) comunes a casi todas las bacterias.

Los cebadores directos e inversos se ajustan en porciones de toda o parte de la misma para preparar 3 a 10 regiones de amplificación del gen. (2) Las regiones de amplificación del gen cada una consisten de aproximadamente 150 a 200 bases, y cada una de las regiones excepto las regiones conservadas comunes, en las cuales se ajustan los cebadores, tiene una secuencia base específica de cada bacteria.

Así, el valor Tm refleja diferencias en la secuencia base para mostrar un valor característico, y cada bacteria se estima por tener 1 a 10 valores Tm característicos. Por lo tanto, el valor Tm va de 1 a 10 dependiendo de los tipos de bacterias se examina para la compilación de una base de datos. Puede utilizarse la base de datos para identificar una bacteria desconocida. (3) Además, se utilizan 3 a 10 cebadores específicas para hongos en combinación con cebadores para un gen resiste a antibiótico que refleja una extensión epidémica del tiempo presente tal como un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina para identificar la infección bacteriana o su tipo (incluyendo presencia de un gen resiste a antibiótico) o infección fungicida o su tipo con respecto a un agente causante desconocido. (4) Cuando se produce un producto de gen no específico y tiene un valor cerca de un valor Tm deseado, el riesgo de positividad falsa ocurre.

En tal caso, puede activarse los productos de amplificación después de la amplificación del gen a través de un gel de la agarosa para confirmar el tamaño de bandas para comprobar nuevamente los resultados.

Así, un sistema convencional para comprobar nuevamente por un método de detección utiliza la amplificación del gen puede adoptarse para mejorar la precisión del examen.

Alternativamente, el riesgo de positividad falsa debido a un producto de amplificación no específico puede eliminarse casi completamente mediante combinación del "método de solución de un problema del dímero de cebador tal como un método de Dímero de Cebador enmascarado + la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención + cebadores universales para bacterias". (5) Cuando se adopta la PCR en tiempo real como un método de amplificación del gen, cuantitativamente la misma puede utilizarse para realizar la cuantificación relativa de la cantidad bacteriana antes y después del tratamiento para mejorar la supervisión de un efecto terapéutico. (6) Hay dos tipos de dispositivos de PCR en tiempo real: un tipo de bloque de calentamiento en el cual la temperatura se controla con un bloque de calentamiento y un tipo aerobús uno en el cual la temperatura es controlada vía aire. Un valor Tm mide el error de ± 0.1°C + a 0.3°C (que varía dependiendo del fabricante) ocurre cuando el bloque de calentamiento se utiliza (el error entre las muestras es de aproximadamente ± 0.2°C en el mismo ciclo de medida). Es preferible adoptar un método que utiliza un patrón de diferencia entre los valores Tm en el mismo ciclo de medida para determinación de modo que el error de medida no disturbe la identificación de cepa. Por una parte, el gen rotor tipo aerobús 6000 (Qiagen Inc.) tiene una uniformidad de temperatura entre tubos de ± 0.01°C, que es preferible puesto que un error de medición del valor Tm menos ocurre fácilmente. (7) en el caso de infección con una pluralidad de bacterias, si después de ascender de la curva de amplificación por PCR en tiempo real, se detiene el ciclo de amplificación una vez que se alcanza una meseta y los valores Tm se analizan posteriormente, solamente puede identificarse "un microorganismo con una dosis contagiosa mayor (probablemente el microorganismo de infección principal)".

Los cebadores son como sigue.

Grupo 1 de Combinación (1-1) Cinco regiones se seleccionan de las regiones de secuencia comunes a los genes de ARNr 16S de todas las bacterias para ajustar los cebadores directos y cebadores inversos (4 productos de amplificación).

Específicamente, los cebadores son cebadores cada uno que contiene toda o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los siguientes cebadores.

(B1) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 97 bases que corresponde a los nucleótidos 809 a 905 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 1: Ccb. 1).

• SEC ID NO: 80. GATTAGATACCCTGGTAGTCCACG (24mer) directo • SEC ID NO: 2. CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT (21mer) Inverso (B2) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 166 bases que corresponde a los nucleótidos 927 a 1092 del gen ARNr 16S de E. coli (cebador 2 de las bacterias: Bac. 2).

• SEC ID NO: 3. AAACTCAAAGGAATTGACGGG (21mer) directo · SEC ID NO: 4. de CGCTCGTTGCGGGAC (15mer) Inverso (B3) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 111 bases que corresponde a los nucleótidos 1108 a 1218 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 3: Bac. 3).

• SEC ID NO: 5. GTCCCGCAACGAGCG (15mer) directo · SEC ID NO: 6. ATTGTAGCACGTGTGTAGCCC (21mer) Inverso (B4) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 130 bases que corresponde a los nucleótidos 1240 a 1369 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 4: Bac. 4).

· SEC ID NO: 7. GGGCTACACACGTGCTACAAT (21mer) directo • SEC ID NO: 8. CCGGGAACGTATTCACC (17mer) Inverso (1-2) Las regiones de secuencia comunes a los genes de ARNr 18S de todos los hongos se seleccionan y un par de un cebador directo y un cebador inverso derivados de las mismas se ajustan.

Específicamente, los cebadores son cebadores cada uno contiene toda o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los siguientes cebadores.

(F-1) Un conjunto de cebadores para el gen de ARNr 18S de hongos (cebador de hongos: Hongos).

• SEC ID NO: 9. G AATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG (28mer) directo • SEC ID NO: 10. TAACTGCAACAACTTTAATATACGC (25mer) Inverso (1-3) Los cebadores para un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina son ajustados seleccionando un diseño del cebador más altamente calificado utilizando el software Light Cycler Probé Design 2.

Específicamente, los cebadores son como sigue.

(M1) Un conjunto de cebadores para el gen mee A que exhibe la resistencia a meticilina (cebador mee A: mecA) • SEC ID NO: 13. ATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTA (30mer) directo • SEC ID NO: 14. de CCAATAACTGCATCATCTTTATAGCC (26mer) inverso Grupo de Combinación 2 (2-1) Diez regiones se seleccionan de regiones de secuencias comunes a los genes de ARNr 16S de todas las bacterias para ajustar cebadores directos y cebadores inversos.

Específicamente, los cebadores son cebadores cada uno contiene toda o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los siguientes cebadores.

(B5) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 338 bases que corresponde a los nucleotidos 8 a 345 del gen de ARNr 16S de £. coli (cebador bacteriano 5: Bac. 5).

• SEC ID NO: 15. AGAGTTTGATCATGGCTCAG (20mer) directo • SEC ID NO: 16. CGTAGGAGTCTGGACCGT (18mer) inverso (B6) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 199 bases que corresponde a los nucleotidos 336 a 534 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 6: Bac. 6).

• SEC ID NO: 17. GACTCCTACGGGAGGCA (17mer) directo • SEC ID NO: 18. TATTACCGCGGCTGCTG (17mer) inverso (B7) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 287 bases que corresponde a los nucleotidos 519 a 805 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 7: Bac. 7).

• SEC ID NO: 19. AGCAGCCGCGGTAATA (16mer) directo • SEC ID NO: 20. GGACTACCAGGGTATCTAATCCT (23mer) inverso (B8) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 181 bases que corresponde a los nucleótidos 780 a 960 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 8: Bac. 8).

• SEC ID NO: 21. AACAGGATTAGATACCCTGGTAG (23mer) d ¡recto • SEC ID NO: 22. AATTAAACCACATGCTCCACC (21mer) inverso (B9) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 120 bases que corresponde a los nucleótidos 951 a 1,070 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 9: Bac. 9).

• SEC ID NO: 23. TGGTTTAATTCGATGCAACGC (21mer) directo • SEC ID NO: 24. GAGCTGACGACAGCCAT (17mer) inverso (B10) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 109 bases que corresponde a los nucleótidos 1,084 a 1,192 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 10: Bac. 10).

• SEC ID NO: 25. TTGGGTTAAGTCCCGC (16mer) directo • SEC ID NO: 26. CGTCATCCCCACCTTC (16mer) inverso ( B 1 ) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 166 bases que corresponde a los nucleótidos 1,220 a 1,385 del gen de ARNr 16S de E. coli (cebador bacteriano 11: Bac. 11).

• SEC ID NO: 27. GGCTACACACGTGCTACAAT (20mer) directo • SEC ID NO: 28. CCGGGAACGTATTCACC (17mer) inverso (2-2) Siete regiones se seleccionan de las regiones de secuencias comunes al gen ARNr 18S de hongos para ajustar los cebadores directos y cebadores inversos.

Específicamente, los cebadores son cebadores cada uno contiene toda o 1/3 o más cada una de las secuencias base de los siguientes cebadores.

(F2) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 259 bases que corresponde a los nucleótidos 149 a 407 del gen de ARNr 18S (SEC ID NO: 16) de C. Albicans (cebador de hongos 2: Hongos 2).

• SEC ID NO: 29. GTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGC (26mer) directo • SEC ID NO: 30. GGTAGCCGTTTCTCAGG (17mer) inverso (F3) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 162 bases que corresponde a los nucleótidos 390 a 551 del gen de ARNr 18S de C. Albicans (cebador de hongos 3: Hongos 3).

• SEC ID NO: 31. GCCTGAG AAACGGCTACCA (19mer) directo • SEC ID NO: 32. CCTCCAATTGTTCCTCGTTAAG (22mer) inverso (F4) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 232 bases que corresponde a los nucleótidos 531 a 762 del gen de ARNr 18S de C. Albicans (cebador de hongos 4: Hongos 4).

• SEC ID NO: 33. TTAACGAGGAACAATTGGAGGG (22mer) directo • SEC ID NO: 34. GCCTGCTTTGAACACTCTAATTT (23mer) inverso (F5) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 146 bases que corresponde a los nucleótidos 989 a 1,134 del gen de ARNr 18S de C. Albicans (cebador de hongos 5: Hongos 5).

• SEC ID NO: 35. ATACCGTCGTAGTCTTAACCA (21mer) d ¡recto • SEC ID NO: 36. GTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCT (24mer) inverso (F6) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 169 bases que corresponde a los nucleótidos 1,260 a 1,428 del gen de ARNr 18S de C. Albicans (cebador de hongos 6: Hongos 6) .

• SEC ID NO: 37. CATGGCCGTTCTTAGTTGG (19mer) directo • SEC ID NO: 38. GGGCATCACAGACCTGTT (18mer) inverso (F7) Un conjunto de cebadores para amplificar el ADN de 217 bases que corresponde a los nucleótidos 1,414 a 1,630 del gen de ARNr 18S de C. Albicans (cebador de hongos 7: Hongos 7) .

• SEC ID NO: 39. AGGTCTGTGATGCCCTTAG (19mer) directo • SEC ID NO: 40. CGGGCGGTGTGTACAAA (17mer) inverso (2-3) Los cebadores para un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina son ajustados seleccionando un diseño del cebador más altamente calificado utilizando el software Light Cycler Probé Design 2 Específicamente, los cebadores son como sigue.

(M2) Un conjunto de cebadores para el gen del mee A que exhibe resistencia a meticilina (cebador mee A 2: mecA2) • SEC ID NO: 43. CAAACTACGGTAAC ATTGATCGC (23mer) directo • SEC ID NO: 44. ATGTATGCTTTGGTCTTTCTGC (22mer) inverso Para los propósitos de la presente invención, el valor Tm es una temperatura en la cual las hebras complementarias del 50% de un producto de PCR disocian. De acuerdo con el fundamento teórico que "el valor Tm depende de la secuencia base" para la fórmula del cálculo utilizando un método de vecino más próximo, la diferencia en la secuencia base entre cepas puede aplicarse como una diferencia en la combinación de valores Tm a la identificación de un agente causante. Así, es el más importante-para la identificación exacta "eliminar la influencia del error de medida del valor Tm". Por lo tanto, la influencia del error de medida es eliminada por el siguiente método.

Debido a que el valor Tm varía bajo condiciones experimentales en las cuales la composición de una solución amortiguadora o similares es diferente, SYBR Green I, en el cual la concentración del cloruro de magnesio se fija, primero se utiliza como una solución amortiguadora para la reacción de modo que no ocurra el error de medida debido a la composición de una solución de reacción. Después, debido a que un dispositivo de PCR en tiempo real por sí mismo causa error de medida en cada ciclo de medida, una referencia del valor Tm se ajusta como control, y el patrón diferencial entre los valores Tm obtenidos en el mismo ciclo de medida se utiliza para la determinación. Alternativamente, se utiliza el algoritmo de identificación en el cual "el organismo que tiene la aproximación de la combinación de "los valores relativos al valor promedio" es un organismo objeto que se detectará".

De acuerdo con la presente invención, un valor Tm estándar como la referencia puede utilizarse para corregir el error entre los ciclos de medida de un dispositivo de medida. Específicamente, utilizando una concentración constante de ADN de una cepa estándar de E. coli como un molde, un conjunto de cebadores para amplificar una región del gen de ARNr 16S de una bacteria se utiliza para medir el valor Tm en cada ciclo para corregir la desviación de un valor Tm en cada ciclo de medida. Así, si el mismo cebador se combina con el mismo molde, el valor Tm será teóricamente igual en cada ciclo.

Sin embargo, cuando el valor Tm obtenido realmente se desvía, la desviación proporciona un error entre las medidas, y, así, el error puede corregirse por una desviación en tal caso.

Los procedimientos específicos de los métodos (A) y (B) de la presente invención son como sigue: (i) el ADN se prepara de una muestra; (¡i) el ADN resultante es la amplificación del gen sometido utilizando los conjuntos de cebadores anteriormente mencionados para las bacterias, un gen resiste a antibiótico, y hongos para medir el valor Tm respectivo a la vez que proporciona una combinación de los valores Tm para las bacterias, el gen resiste a antibiótico, y los hongos. (iii) se determina si el ADN está derivado de un fungoso [en combinación de los valores Tm en (ii), el valor Tm específico para hongos obtenidos así, utilizando un conjunto de cebadores capaz de amplificar una o más regiones del gen de ARNr 18S de todos los hongos es primero analizado para determinar si el ADN es derivado de un hongo o cuál es el tipo del hongo.]; (iv) la presencia del gen resiste a antibiótico es determinada [en combinación de los valores Tm en (ii), la amplificación del gen específico a una bacteria resistente a antibióticos obtenida así, utilizando un conjunto de cebadores específicamente amplifica de un gen resiste a antibiótico que refleja una propagación epidémica del momento actual tal como un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina se analiza para determinar la presencia del gen resiste a antibiótico]; y (v) el intervalo de la especie bacteriana como los candidatos se enangosta, [en combinación de los valores Tm en (ii), la combinación del valor Tm específico para hongos así obtenidos, utilizando un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes de ARNr 16S de todas las bacterias se analiza para identificar la especie de bacteria].

Específicamente, uno de los valores Tm específicos a bacterias se selecciona (el valor Tm puede corregirse utilizando el valor Tm de referencia). El intervalo de la especie bacteriana como los candidatos se enangosta a la especie bacteriana que tiene un valor cerca del valor Tm. La diferencia en los valores Tm se calcula secuencialmente para enangostar el intervalo, o la diferencia en los valores Tm incluyendo el valor Tm de referencia se calcula directamente, y la especie bacteriana se identifica utilizando la combinación de las diferencias como una huella digital. Alternativamente, se utiliza el algoritmo de identificación en el cual "el organismo que tiene la aproximación de la combinación de "los valores relativos al valor promedio" es un organismo objeto que se detectará".

Como un método para rápido y simplemente identificar si el organismo objeto que se detectará es una bacteria, hongo, o resistente a antibióticos, hay un método que comprende extraer el ADN de una bacteria desconocida sin utilizando el valor Tm y, utilizando el ADN como un molde, realizando la PCR utilizando los siguientes [1] a [3], y los productos de amplificación resultantes se someten a electroforesis en gel de agarosa para determinar la banda con un tamaño deseado: [1] un cebador común a los genes de ARNr 18S de todos los hongos y hongos específicamente detectados y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una bacteria como un anfitrión; [2] cada un cebador que detectaba específicamente un gen resiste a antibiótico refleja una propagación epidémica del tiempo presente tal como un gen mee A que exhibe resistencia a meticilina y la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención o una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una bacteria como un anfitrión; [3] un cebador común a los genes de ARNr 16S de todas las bacterias y bacterias específicamente de detección y la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con el método anterior, puede obtenerse el siguiente efecto. (1) pueden realizarse amplificación del gen tal como la PCR en tiempo real basada en 4 a 18, y preferiblemente 4 a 16 conjuntos de cebador, seguido por comparar los valores Tm resultantes con la base de datos para identificar la cepa de un microorganismo causante necesario para la selección del fármaco antimicrobiano y determinar la presencia del gen resiste a antibiótico. (2) En el caso de una muestra de sangre, ya que el tiempo requerido para la extracción del ADN, análisis de valor de TM, e identificación es de aproximadamente dos horas, llega a ser posible la diagnosis rápida. (3) Cuando la cantidad de muestra de sangre, de la cual se extrae el ADN, es constante, la cantidad bacteriana relativa puede cuantificarse, que permite la supervisión de un efecto terapéutico después de la administración del fármaco antimicrobiano. (4) la preparación de la polimerasa de ADN termoestabie producida utilizando una bacteria como un anfitrión y la preparación de la polimerasa de ADN termoestabie de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse correctamente para eliminar casi totalmente el riesgo de positividad falsa tal como amplificación no específica.

Además, la identificación de un hongo preferiblemente se realiza basada en la combinación de los valores Tm obtenidos utilizando la combinación de cebadores universales para la topoisomerasa II, ADN mitocondrial o ARN ribosomal 26S.

Conjunto para Cuantificación o Identificación) Puede proporcionarse un conjunto para cuantificar y/o identificar un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra por lo menos por la preparación de la polimerasa de ADN termoestabie de acuerdo con la presente invención para amplificar el ADN preparado de una muestra; y cebadores para amplificar un gen deseado específico para que un organismo objeto que se detectará.

Además, el conjunto puede comprende por lo menos la preparación de la polimerasa de ADN termoestable de la presente invención para amplificar el ADN preparado de una muestra una preparación de la polimerasa de ADN termoestable para amplificar el ADN preparado de una muestra, producida utilizando células bacterianas como un anfitrión, y cebadores para amplificar un gen deseado específico para un organismo objeto que se detectará.

Para estos cebadores para el conjunto, pueden utilizarse los cebadores anteriormente mencionados (B), (F) y (M).

Sistema de cuantificación/identificación Los siguientes dispositivos pueden comprende un sistema para cuantificar o identificación un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra por los métodos descritos antes. (1) Un dispositivo de amplificador para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando ADN preparado de una muestra, cebadores para amplificar un gen deseado específico para un organismo objeto que se detectará, y una preparación de la polimerasa de ADN termoestable. (2) Un dispositivo de cuantificación para cuantificar un producto de amplificación en una etapa de amplificación. (3) Una computadora para calcular la cantidad del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación del producto de amplificación. (4) Una base de datos para calcular la cantidad del organismo objeto que se detectará en la muestra de los resultados de cuantificación del producto de amplificación del gen deseado.

Para el amplificador y el dispositivo de cuantificación, pueden utilizarse un dispositivo de PCR, especialmente un dispositivo de PCR en tiempo real, adecuadamente. Para la computadora, puede también utilizarse un sistema informático el cual opera basado en un programa preseleccionado para cuantificar y/o identificar el organismo objeto que se detectará utilizando la base de datos, por ejemplo.

Se describe un ejemplo del sistema para cuantificar e identificar un organismo objeto que se detectará de acuerdo con la presente invención más adelante. Este sistema puede incluir los siguientes elementos (unidades): (1) un dispositivo de reacción de PCR; (2) un sistema de computadora para procesar datos y mostrar los resultados del procesamiento de datos; (3) un software procesador de datos en el cual un programa necesario para procesamiento datos se escribe; (4) una base de datos necesaria para el procesamiento de datos; (5) un sistema de control que tiene un programa para controlar el dispositivo de reacción de PCR; y (6) un dispositivo de exhibición para exhibir los resultados del procesamiento de datos.

Un ejemplo de la relación entre estos dispositivos se muestra en la Figura 12. Este sistema incluye un dispositivo de reacción 1 de PCR, un sistema de computadora 2, una sección de procesamiento de datos 3, un programa de procesamiento de datos (software) 6, una base de datos necesaria para el procesamiento de datos 4, sistemas control para controlar el dispositivo de reacción de PCR 5a y 5b, y un dispositivo de exhibición 7. Éstos pueden proporcionarse integrando dos o más de los mismos. El enviar y recibir la información entre las unidades son realizados usando señales S1 a S7. El dispositivo de cuantificación puede constituirse por lo menos por el sistema de computadora 2.

En el dispositivo de reacción de PCR, la reacción de PCR para cuantificar y/o identificar un organismo objeto que se detectará se lleva a cabo. Puede realizarse el control del mismo utilizando el sistema de control 5. Los siguientes puntos pueden listarse como un ejemplo de los artículos de control en el sistema de control 5: A) condición de ajuste al inicio de una reacción de amplificación; B) condición de ajuste para el número de ciclos para la amplificación y para el control de temperatura; C) condición de ajuste para la medida del valor Tm; D) condición de ajuste para la terminación de la reacción; y E) condición de ajuste para no exhibir la amplificación de un gen no deseado en el dispositivo de exhibición.

De éstos los artículos de ajuste de condición, controlan artículos que pueden seleccionar y ajustar de acuerdo con el objeto particular. El ajuste de condición y trabajo de las condiciones pueden realizarse utilizando un programa preseleccionado. Este programa puede registrarse en un medio en el sistema de control 5a o 5b. Alternativamente, el programa puede almacenarse en un medio (portable) portátil proporcionado o acomodado por separado en un medio para poderlo distribuir utilizando la Internet para permitir el uso del mismo mediante conexión al sistema de control 5a o 5b a tiempo de uso. Cuando el dispositivo de reacción de PCR es controlado utilizando los resultados del procesamiento de datos en la sección de procesamiento de datos 3 localizada en el sistema computadora 2 o proporcionada por separado, los resultados del procesamiento de datos de la sección de procesamiento de datos 3 se envían al sistema computadora 2, y, con base en los resultados, una señal para controlar el dispositivo de reacción de PCR se transmite desde el sistema de control 5b al mecanismo de control 5a en el dispositivo de reacción de PCR para el trabajo del control. Cuando solamente el control del dispositivo lateral de reacción de PCR es suficiente de acuerdo con el objeto de la reacción de PCR, la reacción de PCR es controlada utilizando solamente el sistema de control 5a.

Se programa el sistema computadora 2 para poder procesar una señal de cada unidad de acuerdo con el objeto particular. En la sección de procesamiento de datos 2, se realizan los siguientes procesamientos, por ejemplo: i) el procesamiento de los resultados de la reacción de amplificación de PCR (por ejemplo, una señal con intensidad fluorescente) obtenida en el dispositivo de reacción de PCR; ¡i) procesamiento aritmético para cuantificar y/o identificar un organismo objeto que se detectará utilizando los resultados de la reacción de amplificación de PCR; iii) el procesamiento de una señal de salida para controlar las condiciones de reacción de PCR en el dispositivo de reacción de PCR; y iv) procesamiento para ordenar la exhibición de los resultados de reacción de amplificación de PCR (incluyendo supervisión para un curso de tiempo) y los resultados de cuantificación y/o identificación del organismo objeto que se detectará en un dispositivo de exhibición.

Estos procesamientos se realizan de acuerdo con el programa 6 para procesamiento de datos, que se ajusta de acuerdo con el procesamiento de datos deseado. Además, cuando una base de datos es necesaria para el procesamiento de datos, se utiliza la información almacenada en la base de datos 4. Por ejemplo, los siguientes datos pueden almacenarse como una base de datos: Los datos obtenidos de los organismos conocidos como la referencia, cuando la señal obtenida por la reacción de amplificación utilizando la PCR se procesan para cuantificar y/o identificar un organismo objeto que se detectará.

Varios valores Tm (incluyendo varias combinaciones de valores Tm para cuantificación y/o identificación de valores Tm) obtenidos de organismos conocidos, cuando la cuantificación y/o identificación del organismo objeto a medirse se realiza utilizando el valor Tm previamente descrito.

El programa de procesamiento de datos 6 y la base de datos 4 pueden almacenarse en un medio en el sistema de computadora 2. Alternativamente, por lo menos uno de éstos puede almacenarse en un medio (portable) portátil proporcionado o acomodado por separado en un medio para poderlo distribuir utilizando la Internet para permitir el uso del mismo mediante conexión a la sección de procesamiento de datos 3 al momento de uso.

Ejemplos Más adelante, se describe la presente invención detalladamente con referencia al Ejemplo y Ejemplos de referencia. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos Ejemplos.

Por otra parte, a menos que se indique específicamente, los procedimientos de operación se realizaron basados en las instrucciones adjuntas a los kits del producto.

Ejemplo 1-1 (1 ) Síntesis del ADN La secuencia del ADN completa de polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics se sintetizó en GenScript. En este momento, las secuencias del codón se optimizaron para un anfitrión de levadura, S. cerevisiae. El ADN sintetizado se incorporó en un plásmido pUC57 proporcionado de GenScript, y así se obtuvo un vector pUC-TA01. El gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable se diseñó tal que un sitio de enzima de restricción Hindlll se introdujo en la secuencia 5' terminal y un sitio de enzima de restricción EcoRI se introdujo en la secuencia 3' terminal. (2) El constructo del vector para expresar la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics El gen sintetizado que codifica la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics se insertó en el plásmido pYES2 (Invitrogen) con el fin de construir un vector pYES-TA01. Para el gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable, el pUC-TA01 se digirió con las enzimas de restricción Hindlll y EcoRI (TaKaRa Bio), que se sometieron a electroforesis con 1% de gel de agarosa (Wako) y el gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable se recuperó usando un kit de extracción de gel de QIAquick (Qiagen). El plásmido pYES2 se digirió con EcoRI y Notl (TaKaRa Bio), y ligó al gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable usando el kit de unión de ADN Ver.2.1 (TaKaRa Bio). (3) Transformación de S. cerevisiae Se introdujo el vector pYES-TA01 así obtenido en levadura (cepa Saccharomyces Cerevisiae X2180). Como un anfitrión, otra levadura puede utilizarse siempre y cuando sea una cepa que requiere uracilo. Se realizó la transformación usando el FastTrack™-Yeast Transformation Ki (Geno Technology). (4) Producción de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics por S. cerevisiae Se cultivó el transformante obtenido con agitación en 100 mi de medio de SD (0.67% de base de nitrógeno de levadura de Bacto y 2% de galactosa) a 28°C durante 72 horas. Se centrifugó el cultivo a 5000 rpm mediante 10 minuto para recolectar células que se suspendieron en una solución amortiguadora de interrupción (50 mM de Tris-HCI, pH7.5, 50 mM de KCI), y las células se desestabilizaron usando 0.5 mM de gránuios de vidrio y después sometieron a centrifugación a 12000 rpm mediante 30 minutos para obtener el sobrenadante homogeneizado de levadura y el precipitado para los extractos celulares. (5) Estudio de Condiciones de Solubilidad para la Polimerasa de ADN Termoestable mediante Tratamiento por Calor En cuanto a los extractos celulares, se estudiaron las condiciones de solubilidad de la polimerasa de ADN termoestable mediante tratamiento por calor. La Figura 2 muestra SDS-PAGE de un sobrenadante obtenido después de que los precipitados homogen ados de levadura se suspendieron en una cantidad igual de la solución amortiguadora de interrupción, sometida a tratamiento por calor a 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, y 100°C, y después centrifugó a 12000 rpm durante 30 minutos a 4°C. Cuando se trató por calor a 50°C o mayor, una banda de la polimerasa de ADN termoestable se detectó como una proteína objetivo; cuando se trató por calor a una temperatura de 65°C a 70°C, se redujo la cantidad de proteína no pura derivada del huésped. Después de realizar el tratamiento por calentamiento a 50°C o mayor, la polimerasa de ADN termoestable se encontrada para solubilizarse con una actividad de la polimerasa de ADN termoestable. (6) Actividad de la polimerasa de ADN (6-1) Amplificación de la Región en ADN de Lambda Se realizó la detección de actividad usando ADN de lambda (NIPPON GENE) como un molde. La solución de reacción se preparó para tener una composición que incluye 10 mM de Tris-HCI (pH 8.3), 1.5 mM de MgCI2, 50 mM de KCI, y 200 µ? de dNTPs. Como los cebadores, se agregaron las SEC ID NOS: 83 y 84 de modo que cada uno fuera de 0.4 µ?.

SEC ID NO: 83 gatgagttcg tgtccgtaca act SEC ID NO: 84 ggttatcgaa atcagccaca gcgcc Se agregó el ADN de la lambda en la cantidad de 0.2 µg, y se agregó la preparación de la polimerasa de ADN termoestable en la cantidad de 1 µ? después de que se preparó una serie de dilución de modo que el sobrenadante centrifugado anteriormente mencionado se convirtió en 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, y 1/64, y se preparó con agua del ultra pura de modo que la cantidad total se convirtió en 50 µ?. Se realizó un programa de PCR por el siguiente programa: 94°C durante 1 min, 50°C durante 30 seg, y 72°C durante 1 min en un ciclo, que se repitió 30 veces. Cada solución de reacción de PCR se sometió a electroforesis con 1% de gel de agarosa para visualizar el producto de amplificación. (6-2) Definición de Actividad de la Polimerasa de ADN Termoestable Se determinó la unidad de la polimerasa de ADN termoestable obtenida de acuerdo con el método descrito en los Procedimientos en la búsqueda del ácido nucleico (Richardson, C. C. (1966) DNA polymerase from Escherichia coli, pp. 263-276 In G. L. Cantoni and D.R. Davies (ed.)). El ADN de esperma de salmón activado se utilizó como molde/cebador, una actividad para tomar 10 nmol de nucleótido completo en precipitados insolubles 'en ácido a 74°C durante 30 min en una solución de reacción de medida de actividad (cantidad total 50 µ? que contienen 25 mM de TAPS (pH 9.3), 50 mM de KCI, 2 mM de MgCI2, 1 mM de ß-mercaptoetanol, 200 µ? cada uno de dATP, dGTP, y dTTP, 100 µ? [a-32P]-dCTP (0.050-01 Ci/mmol), y 0.25 mg/ml de ADN de esperma de salmón activado) se definió como 1U. (6-3) Límite de detección de PCR La Figura 3 muestra el límite de detección de PCR utilizando ADN de E. coli como un molde. A partir de 100 ng a 10 fg, se detectó una banda de amplificación de PCR; de 10 fg a 1 fg, ninguna banda de amplificación se detectó. El ADN de Escherichia coli se extrajo y purificó de Escherichia coli JM109 (fabricado por ToYoBo) usando el kit de extracción de ADN FastPure DNA Kit (fabricado por TaKaRa). Se preparó la solución de reacción por tener una composición que incluye 10 mM de Tris-HCI (pH 8.3), 1.5 mM de MgCI2, 50 mM de KCI, y 200 µ? de dNTPs. Como cebadores, se agregaron las SEC ID NOS: 85 y 86 de modo que cada uno fue 0.4 µ?.

SEC ID NO: 85 agcagccgcg gtaat SEC ID NO: 86 ggactaccag ggtatctaat cct Como un molde, se formó y agregó la serie de dilución del ADN de Escherichia coli que incluye cada 10"1 de 100 ng a 1 fg. Se agregó y preparó el 1 U de la preparación de la polimerasa de ADN termoestable con agua ultra pura de modo que la cantidad total fue 20 µ?. Se realizó un programa de PCR por el siguiente programa: 94°C durante 1 min, 50°C durante 30 seg, y 72°C durante 30 seg como un ciclo, que se repitió 60 veces. Cada solución de reacción de PCR se sometió a electroforesis con 1% de gel de agarosa para visualizar el producto de amplificación. (7) Construcción del Vector para Expresar la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics Un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics se insertó en un plásmido pPIC ZA (Invitrogen) para construir un vector pPIC TA01. Se amplificó el gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable por PCR utilizando pYES-TA01 como un molde y utilizó OD Plus (ToYoBo). Los cebadores a utilizarse para PCR (SEC ID NOS: 87 y 88) se diseñaron tal que un sitio de enzima de restricción de EcoRI se introdujo en la secuencia terminal 5' y un sitio de enzima de restricción Notl se introdujo en la secuencia terminal 3'.

SEC ID NO: 87 cccgaattca tgagggggat gttgccattg SEC ID NO: 88 aaagcggccg ctcattcctt tgcggataac Se realizó el programa de PCR por el siguiente programa: calentamiento a 94°C durante 2 min, después 94°C durante 15 seg, 56°C durante 30 seg, y 68°C durante 2 mínimos y 30 sec como un ciclo, que se repitió 30 veces. El producto de PCR después se sometió a electroforesis con 1% de gel de agarosa, y se recolectaron los fragmentos de PCR usando el kit de extracción de gel de QIAquick (Qiagen). El producto de amplificación de PCR y pPICZA se digirieron con EcoRI y Notl (TaKaRa Bio), y se ligó el fragmento de amplificación de PCR para proporcionar el plásmido pPICZ A usando el kit de ligadura de ADN Ver.2.1 (TaKaRa Bio). (8) Transformación de E. coli y Extracción del Vector Se introdujo el vector ligado en la célula competente DH5a de £. coli (ToYoBo). Puesto que el transformante E. coli requiere Zeocina como un marcador de selección, se sembró sobre un medio del agar de Lenox (Difco) que contiene 25 µ?/ml de Zeocina (Invitrogen) después de recuperar en un medio de SOC (ToYoBo) durante una hora e cultivado inmóvil a 37°C durante 16 horas. Una colonia de Escherichia coli Inocularon de la placa de agar se inoculó y uso por PCR de colonia directa, y la secuencia base se leyó para confirmar que el gen de la polimerasa de ADN termoestable se incorporó correctamente. Así se obtuvo el vector pPIC-TAOL (9) Transformación de P. pastoris Se introdujo el vector pYES-TA01 en la levadura (cepa de Pichia pastoris GS115). Se realizó la transformación usando el FastTrack™-Yeast Transformaron Ki (Geno Technology). Puesto que la levadura transformante requiere Zeocina como marcador de selección, fue sembró sobre una placa de agar de YPDS (Difco) que contiene 100 µ?/ml de Zeocina después de recuperar en el medio de YPD (Difco) durante tres horas. Después, se cultivó inmóvil la placa de agar a 28°C durante tres días. (10) Selección de Transformante Para obtener una cepa de alta producción de la polimerasa de ADN termoestable, se inoculó y cultivó una colonia transformada de la placa de agar en una placa de agar de YPDS (Difco) cuya concentración de la Zeocina contenida se lavó secuencialmente de 500 µg/ml a 2000 µg/ml, seguido por selección de transformadas con multicopia del gen insertado. Se cultivaron en placas de agar a concentraciones de Zeocina de tres-fases: 500 µg/ml, 1000 µg/ml, y 2000 µ9/???, y cada una de ellas se cultivaron inmóviles a 28°C durante tres días. El transformante que se había hecho crecer en la placa de agar de YPDS (Difco) cuya concentración de Zeocina fue 2000 µg/ml se utilizó para el siguiente experimento de producción de la polimerasa de ADN termoestable. (11) Producción de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics Se inoculó el transformante en 100 mi de medio de BMGY, y cultivó con agitación a 28°C durante un día para incrementar la cantidad de células. Después, para inducir la producción de proteína, se agregaron 0.5% de metanol y cultivaron a 28°C durante tres días. Se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min para recolectar las células, que se suspendieron en una solución amortiguadora de interrupción (50 mM de Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM de KCI) e desestabilizaron las células usando 0.5 mM de gránulos de vidrio. Después, se sometieron a tratamiento por calor a 70CC durante 60 min, y sometieron a centrifugación a 12000 rpm durante 30 min, y obtuvo una polimerasa de ADN termoestable derivada de 7. aquatics que contiene sobrenadante. (12) Construcción del Vector para Expresar la polimerasa de ADN termoestable derivada de P. furiosus Se insertó un gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable derivada de P. furiosus en el plásmido pYES2 para construir un vector pYES-PF01. Se sintetizó el gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable mediante PCR utilizando el ADN del genoma de P. furiosus (ATCC 43587D-5) como un molde. Se diseñaron cebadores a utilizarse para PCR (SEC ID NOS: 89 y 90) tal que se introdujo un sitio de enzima de restricción de Kpnl en la secuencia terminal 5' y se introdujo un sitio de enzima de restricción de Notl en la secuencia terminal 3'. Se realizó la PCR usando KOD Plus.

SEC ID NO: 89 gggggtacca tgattttaga tgtggattac SEC ID NO: 90 cccgcggccg cctaggattt tttaatg Se realizó un programa de PCR por el siguiente programa: calentamiento a 94°C durante 2 min, después 94°C durante 15 seg, 56°C durante 30 seg, y 68°C durante 2 min y 30 seg como un ciclo, que se repitió 30 veces. Se sometió el producto de PCR a electroforesis con 1% de gel de agarosa, y recuperaron los fragmentos de PCR usando el kit de extracción de gel de QIAquick. Se digirieron el producto de amplificación de PCR y pYES2 con Kpnl y Notl, y ligó el fragmento amplificado por PCR para proporcionar pYES2 usando el DNA Ligation Kit Ver.2.1.

Se introdujo el vector ligado en la célula competente de E. coli JM109 (ToYoBo). Se sembró el transformante de E. coli sobre un medio de agar LB que contienen 50 µ?/ml de ampicilina, y cultivó inmóvil a 37°C durante 16 horas. Se inoculó la colonia de Escherichia coli de la placa de agar y utilizó para la PCR de colonia directa y leyó la secuencia base para confirmar que se incorporó el gen de la polimerasa de ADN termoestabje correctamente. Así, se obtuvo un vector pYES-PF01. (13) Construcción del Vector para Expresar la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. gorgonarius Se insertó un gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. gorgonarius en el plásmido pYES2 para construir un vector pYES-TG01. Se sintetizó el gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable por PCR utilizando el ADN del genoma de T. gorgonarius (ATCC 700654D) como un molde. Se diseñaron cebadores usados para PCR (SEC ID NOS: 91 y 92) tal que se introdujo un sitio de la enzima de restricción de Kpnl en la secuencia terminal 5' y un sitio de enzima de restricción de Notl se introdujo en la secuencia terminal 3'. se realizó la PCR usando KOD PLUS.

SEC ID NO: 91 gggggtacca tgatcctcga tacagac SEC ID NO: 92 cccgcggccg ctcatgtctt aggttttag Se realizó un programa de PCR mediante el siguiente programa: calentamiento a 94°C durante 2 min, después 94°C durante 15 seg, 60°C durante 30 seg, y 68°C durante 2 min y 30 seg como un ciclo, que se repitió 30 veces. Se sometió el producto de PCR a electroforesis con 1% de gel de agarosa, y recolectaron los fragmentos de PCR usando el kit de extracción de gel de QIAquick. Se digirieron el producto de amplificación de PCR y pYES2 con Kpnl y Notl, y ligó el fragmento de amplificación de PCR para proporcionar pYES2 usando DNA ügation Kit Ver.2.1.

Se transformó el vector ligado en la célula competente de E. coli J 109. Se sembró el transformante de E. coli sobre un medio de agar de LB que contiene 50 µ?/ml de ampicilina. Después, se cultivó inmóvil la placa de agar a 37°C durante 16 horas. Se inoculó la colonia de Escherichia coli de la placa de agar y utilizó para PCR de colonia directa y leyó la secuencia base para confirmar que se incorporó el gen de la polimerasa de ADN termoestable correctamente. Así, se obtuvo un vector pYES-TG01. (14) Transformación de Levadura Se introdujeron el vector pYES-PF01 y pYES-TG01 así obtenidos en levadura (cepa de Saccharomyces Cerevisiae X2180). Se realizó la transformación usando el kit de Transformación de Levadura FastTrack™. (15) Producción de la polimerasas de ADN termoestables derivada de P. furiosus-, T. gorgonarius Se cultivó el transformante obtenido con agitación en 100 mi de medio de SD (0.67% de bases de nitrógeno de levadura de Bacto y 2% de galactosas) a 28°C durante 72 horas. Se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min para recolectar las células que se suspendieron en una solución amortiguadora de interrupción (50 mM de Tris-HCI, pH 7.5, 50 de mM KCI) e desestabilizaron las células usando 0.5 mM de granulos de vidrio, y después sometieron a centrifugación para obtener los precipitados homogenados de levadura. A los precipitados, se agregó la solución amortiguadora de interrupción en la cantidad dos veces como el peso de humedad de los precipitados y suspendieron. Se trató por calor la suspensión a 70°C durante 60 min y centrifugó a 12000 rpm durante 30 min para obtener un sobrenadante que contiene la polimerasa de ADN termoestable. (16) Examen de Contaminación del Ácido Nucleico no Específico por PCR La Figura 4 es una fotografía de 1% de electroforesis de agarosa que muestra ejemplos de investigación si la contaminación del ácido nucleico no específico es observada usando cada una de las preparaciones de la polimerasa de ADN obtenida anteriormente, TaKaRa Taq (TaKaRa) y AmpliTaq Gold LD (ABI). Las filas 1, 4, 7, 10, 13, y 16 muestran los resultados de 40 ciclos de PCR sin adición de un molde, así como los carriles 2, 5, 8, 11, 14, y 17 muestran los resultados de 60 ciclos de PCR sin adición de un molde. Además, los carriles 3, 6, 9, 12, 15, y 18 muestran los resultados de 30 ciclos de PCR utilizando 1 µ9 de Escherichia coli como un molde. Se realizó el procedimiento usando las SEC ID NOS: 85 y 86 capaces de amplificar 259 bp el gen de ARNr 16S de Escherichia coli como cebadores a las mismas condiciones de temperatura y composiciones de solución de PCR como en los (6-3). A consecuencia, aunque un molde no se agregó, un producto de amplificación del gen derivado de ARNr 16S bacteriano se detectó en 40 ciclos con TaKaRa Taq y en 60 ciclos con AmpliTaq Gold LD. Además, en la polimerasa de ADN termoestable producida por el método de producción de la presente invención, no se detectó ningún producto de amplificación incluso en 40 ciclos y 60 ciclos de PCR, y no se observó la contaminación del ácido nucleico no específico y fue capaz de realizarse la PCR sin necesidad de realizar el proceso de purificación complicado. (17) Análisis de la Curva de Amplificación y Curva de Fusión por PCR en Tiempo Real (Investigation of Contamination of Non-specific Nucleic Acid) Para investigar la contaminación del ácido nucleico no específico en las preparaciones de la polimerasa de ADN termoestable anteriormente mencionadas, se realizaron los análisis de una curva de amplificación y una curva de fusión usando PCR en tiempo real. La Figuras 5(A) y Figura 5(B) muestran el análisis de las curvas de amplificación. La Figuras 6(A) y Figura 6(B) muestran el análisis de las curvas de fusión. Además, la Figura 5(A) y Figura 6(A) son gráficas que muestran el análisis realizado usando la preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando AmpliTaq Gold LD como un anfitrión. La Figura 5(B) y Figura 6(B) son gráficas que muestran el análisis realizado usando la preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando S. cerevisiae como un anfitrión. Las líneas continuas muestran un caso en el cual se agregó Escherichia coli como un molde, y las líneas discontinuas muestran un caso en el cual no se agregó un molde. Como el reactivo de PCR en tiempo real, se obtuvieron x10 de amortiguador agregando 10 µ? de agua ultra pura en un tubo 1b del LightCycler FastStart DNA aster SYBR Greenl (Roche). En este tubo, dNTPs y SYBR Greenl además de un reactivo de amortiguador optimizado para que se contenga la polimerasa de ADN de Taq. Además, se agregaron 1.5 mM de MgCI2, 0.4 µ? por cada uno de los cebadores (SEC ID NOS: 85 y 86), 1 µg de Escherichia coli como un molde, y 1 unidad de preparación de la polimerasa de ADN termoestable, y se agregó agua ultra pura para que la cantidad total fuera 20 µ?, y así se realizó la PCR en tiempo real (60 ciclos) por un método iniciado por calor. En el caso de utilizar AmpliTaq Gold LD, una curva de amplificación comenzó a subirse aproximadamente 32 ciclos, una curva de fusión tienen picos en las sustancialmente las mismas posiciones en el caso donde se agregó el molde y en el caso donde no se agregó el molde, y se observó la contaminación del ácido nucleico no específico. Por el contrario, en la polimerasa de ADN termoestable producida por el método de producción por la presente invención, cuando no se agregó el molde, no se observó la contaminación en la curva de amplificación y la curva de fusión. Con respecto a la preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una célula eucariótica como un anfitrión, no se observó el producto de amplificación derivado de la contaminación del ácido nucleico no específico. Con respecto a la preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando bacterias como un anfitrión y purificado de modo que la contaminación del ADN bacteriano se minimizó, se observó el producto de amplificación derivado de la contaminación del ácido nucleico no específico. De los resultados, en la probabilidad de contaminación de varios ácidos nucleicos no específicos tal como contaminación de bacterias presentes en el ambiente de aire o agua, el factor principal de la misma fue probablemente contaminación en preparaciones de la polimerasa de ADN termoestable del ADN derivado del huésped durante el proceso de producción de la polimerasa de ADN termoestable. (18) Introducción de Mutación del Vector pYES-PF01 Se introdujo la mutación en un gen que codificaba la exonucleasa 3'-5' de la polimerasa de ADN termoestable derivada de P. furiosus. Así, la actividad se ajustó modificando la exonucleasa 3'-5' de la polimerasa de ADN (Kong y colaboradores (1993), journal of biological chemistry, vol.268, 1965-1975). Específicamente, se realizó la PCR usando los cebadores (SEC ID NOS: 61 y 62) a utilizarse para la introducción de mutación, y vectores pYES2-PF01 como un molde y utilizó KOD PLUS.

SEC ID NO: 61 GATTCTTGCCTTCGCGATCGCAACCCTCTATCACGAAGG SEC ID NO: 62 CCTTCGTGATAGAGGGTTGCGATCGCGAAGGCAAGAATC Se realizó un programa de PCR mediante el siguiente programa: calentamiento a 94°C durante 2 min, después 94°C durante 15 seg, 56°C durante 30 seg, y 68°C durante 7 min como un ciclo, que se repitió 15 veces. Después de la reacción, se digirió el molde en solución de PCR con una enzima de restricción Dpnl, e introdujo en la célula competente de Escherichia coli JM109. Se sembró el transformante de Escherichia coli sobre un medio de agar LB que contiene 50 µ?/ml de ampicilina, e cultivó inmóvil a 37°C durante 16 horas. Se inoculó la colonia de Escherichia coli de la placa de agar, seguido por descodificar la secuencia base para confirmar que se introdujo la mutación en la posición objetivo. Así, se obtuvo un vector pYES-PF-M01. Además, se realizaron la transformación y producción similares a los Ejemplos (14) y (15), y obtuvo la preparación de la polimerasa de ADN termoestable mutante derivada de P. furiosus. (19) Introducción de Mutación del Vector pYES-TG01 Se introdujo la mutación en un gen que codificaba la exonucleasa 3'-5' de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. gorgonarius. Se introdujo la mutación por el mismo método que en (18) usando los cebadores (SEC ID NOS 63 y 64) que se utilizaron para introducir la mutación, y el vector pYES2-TG01 como un molde.

SEC ID NO: 63 GATGCTCGCCTTCGCGATCGCAACGCTCTATCACGAGGGCG SEC ID NO: 64 CGCCCTCGTGATAGAGCGTTGCGATCGCGAAGGCGAGCATC Se leyó la secuencia base para confirmar que se introdujo la mutación en la posición objetivo, y así se obtuvo un vector pYES-TG-M01. Además, se realizaron la transformación y producción similares a los ejemplos (14) y (15), y se obtuvo la preparación de la polimerasa de ADN termoestable transformada derivada de T. gorgonarius. (20) Producción de la Polimerasa de ADN Termoestable Derivada de T. aquaticusa Usando el Huésped Tobacco-BY2 (20-1) Construcción del Vector para Introducir el Fragmento de ADN de Expresión de Factor de Transcripción Como un vector para introducir un fragmento de ADN de expresión del factor de transcripción en una célula hospedadora (célula de Tobacco BY2) (más adelante, designado como un "fragmento de ADN de expresión del factor de transcripción que introduce el vector"), se utilizó un plásmido Ti de pER8 (-Stu) (Dohi, K., Nishikiori, M., Tamai, A., Ishikawa, M., Meshi, T., and Morí, T. (2006), Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured cells. Archives of Virology 151, 1075-1084). Se construyó el pER8 (-Stu) ligando un gen que codifica un factor de transcripción de fusión LexA-VP16-hER que contiene un receptor de estrógeno y un exterminador TE9 corriente abajo de un promotor constitutivo PG10-90 y que incorpora un gen resistente a higromicina (Hygr) como un marcador resistente a fármaco. (20-2) Construcción del Fragmento de ADN de Expresión de Proteína que introduce el Vector Se utilizó una variante de ToMV en la cual un gen que codificaba el desarrollo de ToMV se sustituyó con un gen que codifica la polimerasa de ADN derivada de T. aquaticus (SEC ID NO: 65).

SEC ID NO: 65 ATGAGGGGGATGTTGCCATTGTTTGAACCTAAAGGGAGGGT TTTACTCGTGGATGGCCATCACCTTGCTTATCGTACTTTCCACGCT CTCAAAGGTTTAACAACCTCTAGGGGAGAGCCAGTTCAAGCTGTG TACGGGTTTGCAAAGTCACTCCTTAAAGCCTTGAAGGAGGACGGT GATGCCGTTATCGTGGTATTCGATGCTAAAGCACCAAGTTTTAGA CACGAGGCTTACGGAGGCTATAAGGCTGGACGTGCACCAACTCC CGAGGATTTCCCAAGACAACTCGCCCTGATAAAGGAGTTGGTTGA CCTACTTGGATTGGCTAGGTTAGAAGTTCCCGGTTACGAAGCTGA CGACGTTTTGGCCTCACTTGCTAAGAAAGCAGAAAAGGAGGGCTA CGAAGTTCGTATACTCACAGCCGATAAAGACTTGTATCAACTGTTA TCTGATAGGATTCATGTGCTTCACCCCGAAGGGTACCTTATCACC CCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGGCTCAGACCTGACCAGTG GGCTGATTACCGTGCACTCACCGGTGACGAGAGTGACAATCTTCC TGGCGTGAAAGGAATAGGTGAAAAGACAGCTAGAAAATTGCTAGA AGAGTGGGGGTCCCTCGAGGCACTTTTGAAGAACCTTGATAGGTT AAAACCAGCTATTAGAGAAAAGATACTGGCCCATATGGATGACTT GAAACTATCATGGGACTTAGCTAAAGTCAGAACCGATTTACCTTTG GAAGTGGATTTTGCTAAGAGAAGGGAACCAGATAGAGAGAGGCTT AGAGCATTCTTGGAGCGTCTGGAATTTGGATCTTTACTCCACGAG TTCGGTTTGCTTGAGTCTCCCAAGGCACTGGAAGAGGCACCATGG CCTCC ACCTGAAGGCGCTTTTGTTGGGTTCGTTCTCAGTAGG AAG GAACCTATGTGGGCAGACTTGCTCGCCCTAGCAGCTGCAAGAGG GGGAAGAGTGCATAGGGCTCCCGAACCTTATAAGGCACTCAGAG ATCTTAAGGAGGCTAGGGGCCTCTTGGCAAAGGACCTATCCGTGC TTGCACTCAGGGAAGGATTGGGACTCCCACCCGGTGATGACCCTA TGTTATTGGCTTACTTGCTTGACCCATCCAATACCACACCCGAGG GAGTTGCCCGTAGGTATGGGGGCGAGTGGACTGAGGAAGCTGGT GAGAGGGCCGCATTGAGTGAGAGGCTATTTGCCAACTTATGGGG GAGGTTGGAGGGGGAGGAACGTCTGCTATGGCTTTACAGAGAGG TGGAGCGTCCCTTGAGTGCTGTATTAGCTCACATGGAAGCTACAG GCGTCCGTCTAGATGTTGCTTACTTAAGGGCTCTAAGTTTGGAAG TTGCAGAAGAGATCGCCAGATTAGAAGCTGAAGTTTTCAGGTTAG CAGGACACCCTTTTAATCTCAATAGTAGGGACCAACTCGAACGTG TGTTATTTGATGAACTGGGCCTCCCCGCTATAGGGAAAACCGAGA AAACAGGGAAAAGGTCCACATCTGCAGCTGTATTGG AAGCCCTTA GAGAAGCACATCCTATTGTGGAGAAAATACTACAGTACAGGGAGC TAACCAAATTAAAGAGTACCTACATAGATCCATTGCCTGATCTTAT TCACCCAAGGACCGGAAGGCTTCACACCCGTTTCAATCAAACCGC AACAGCTACTGGGAGGTTATCATCTTCCGACCCTAACTTGCAAAAT ATACCTGTTCGTACCCCACTCGGACAGAGAATACGTAGAGCTTTC ATTGCCGAAGAGGGATGGCTCTTGGTTGCTTTGGATTATAGTCAG ATTGAACTTAGAGTTCTAGCACACCTTAGTGGCGACGAAAACCTC ATCAGGGTGTTTCAGGAGGGGAGAGATATACACACCGAAACTGCT TCATGGATGTTTGGGGTGCCCAGGGAAGCCGTAGACCCCCTCAT GAGAAGGGCTGCTAAAACAATTAATTTCGGCGTGTTGTACGGAAT GTCCGCTCACAGGCTATCACAAGAGTTGGCAATCCCCTATGAAGA GGCTCAAGCCTTCATTGAGAGGTATTTTCAGTCCTTTCCAAAGGT GCGTGCTTGGATAGAGAAAACTTTAGAGGAAGGTAGAAGGAGAG GGTATGTGGAAACTCTATTTGGCAGACGTAGGTACGTTCCTGACC TCGAAGCTAGAGTTAAGTCCGTCAGAGAGGCAGCTGAACGTATGG CATTCAATATGCCTGTTCAAGGAACAGCTGCAGACTTAATGAAATT AGCTATGGTGAAGTTGTTCCCAAGGTTAGAGGAAATGGGTGCAAG AATGCTCCTACAGGTCCATGATGAGCTAGTGTTGGAAGCACCTAA AGAGAGGGCAGAGGCAGTAGCCAGGTTGGCAAAGGAGGTTATGG AAGGGGTGTATCCACTTGCTGTCCCCTTGGAGGTGGAAGTCGGG ATCGGTGAGGACTGGTTATCCGCAAAGGAATGAGCTCACTAGT La secuencia del gen completa de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics se sintetizó en GenScript. En este momento, se optimizaron las secuencias del codón para una célula del tabaco BY2. Como vector para la transformación, se construyó el vector pBICER8-ToMV/Taq-SRz para introducir un fragmento de ADN de expresión de proteína en una célula hospedadora (célula de tabaco BY2) usando un plásmido de Ti que tiene un promotor inducible por estrógeno 0LexA-46, ligando el ADNc de una variante de ToMV a la corriente abajo del 0LexA-46, e incorporando la secuencia de ribozima S-Rz del virus del punto del anillo de tabaco de satélite y exterminador 35S (35ST) en su terminal 3'. (20-3) Primera Etapa de Transformación: Introducción del fragmento de ADN de Expresión del Factor de Transcripción en la Célula Hospedadora Se introdujo un vector pER8 (-Stu) para introducir un fragmento de ADN de expresión del factor de transcripción en la célula del tabaco BY2 por un método de Agrobacteria. En primer lugar, se introdujo pER8 (-Stu) en la linea celular de Agrobacteria tumefacince LBA4404 mediante electroporación. Esta se precultivó en un medio de sucrosa de AB que contiene espectinomicina (50 mg/l). Después, se mezcló con células de tabaco BY2 y transfirió a un plato de petri, y mantuvo en obscuridad a 26°C durante 42 a 48 horas para transformar las células de tabaco BY2. Se lavó el transformante en un medio para las células de tabaco BY2, y después se desarrolló en un medio sólido para células de tabaco BY2 que contienen carbenicilina (100 mg/l) e higromicina (20 mg/l) así como la proliferación de células de tabaco BY2r transformadas. (20-4) Etapa de Selección: Selección del Transformante de Alta Expresión del Factor de Transcripción Entre las células de tabaco BY2 de transformación, se seleccionó una línea celular que tiene una cantidad de alta expresión del factor de transcripción de acuerdo con los resultados de Northern Blottlng. La "línea celular" en la presente significa una colonia individual formada proliferando células transformadas. (20-5) Segunda Etapa de Transformación: Introducción del Fragmento de ADN de Expresión de Proteína Se introdujo a la línea celular de tabaco BY2 de alta expresión del factor de transcripción obtenida antes, un vector del virus (pBICER8-ToMV/Taq-SRz) por el método de Agrobacteria para obtener células de transformación. (20-6) Cultivo de la Célula de Tabaco BY2, y Expresión y Extracción de Proteína Las células transformadas obtenidas antes se mantuvieron en 15 mi de cultivo líquido, y se sub-cultivaron 1/200 cantidades del cultivo cada siete días. Además, se sub-cultivaron 1/50 cantidades del cultivo, y se agregó estrógeno a células pre-cultivadas 2 días en la concentración final de 0.01 mM, la cual después se cultivó por otros dos días. Se centrifugó este cultivo en 5000 rpm durante 10 min, y recolectaron las células transformadas, y congelaron en nitrógeno líquido. Se desestabilizaron las células usando un mortero. A las células desestabilizadas, se agregó una cantidad igual de la solución amortiguadora (50 mM de Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM de KCI) y suspendieron, y trató por calor la suspensión a 70°C durante 60 min, centrifugó a 12000 rpm durante 30 min para obtener un sobrenadante que contiene la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics. (21) Expresión de la polimerasa de ADN termoestable Derivada de T. Aqaticus utilizando A. oryzae como anfitrión. (21-1) Síntesis del ADN Se sintetizó la secuencia de ADN entera de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics en GenScript (SEC ID NO: 41). En este momento, se optimizaron las secuencias del codón por A. oryzae. Se diseñó un gen que codificaba la polimerasa de ADN termoestable tal que se introdujo un sitio de la enzima de restricción de Pmel en la secuencia terminal 5' e introdujo un sitio de la enzima de restricción de Xmal en la secuencia terminal 3'.

SEC ID NO: 41 ATGAGAGGCATGCTGCCACTGTTCG AGCCAAAGGGAAGGGT GCTGCTGGTGGACGGACACCATCTGGCCTACAGAACTTTTCACGC TCTGAAGGGACTGACCACATCACGGGGGGAGCCAGTGCAGGCTG TGTATGGATTCGCTAAAAGCCTGCTGAAGGCCCTGAAAGAGGACG GAGATGCTGTGATCGTGGTGTTCGATGCTAAGGCCCCTAGCTTTA GACATGAGGCCTACGGCGGATATAAAGCCGGACGCGCTCCAACC CCCGAGGACTTTCCAAGGCAGCTGGCCCTGATTAAGGAACTGGT GGATCTGCTGGGACTGGCTAGGCTGGAGGTGCCCGGCTACGAAG CTGACGATGTGCTGGCCTCCCTGGCTAAGAAAGCCGAGAAGGAA GGCTACGAGGTGCGCATCCTGACAGCCGACAAAGATCTGTATCAG CTGCTGTCTGACAGGATCCACGTGCTGCATCCCGAGGGGTATCTG ATTACTCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGCCTGAGACCAGAC CAGTGGGCTG ATTATCGGGCCCTGACTGGCGACG AGTCAGATAA CCTGCCCGGAGTGAAAGGCATCGGAGAAAAAACCGCCAGGAAGC TGCTGGAGGAATGGGGCAGCCTGGAGGCTCTGCTGAAAAATCTG GATAGACTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAAATTCTGGCTCACATG GACGATCTGAAGCTGTCTTGGGACCTGGCCAAAGTGAGAACCGA CCTGCCTCTGG AGGTGGATTTCGCCAAGAGG AGAGAGCCAGATC GGGAACGCCTGAGGGCTTTCCTGGAGCGGCTGGAATTTGGGTCA CTGCTGCATGAGTTTGGCCTGCTGGAAAGCCCAAAGGCTCTGGA GGAAGCTCCATGGCCACCTCCAGAGGGAGCCTTCGTGGGATTTG TGCTGTCCAGGAAAGAACCAATGTGGGCTGACCTGCTGGCTCTG GCTGCTGCCAGAGGGGGACGGGTGCACCGCGCCCCTGAGCCATA CAAGGCTCTGCGCGACCTGAAAGAAGCCAGGGGGCTGCTGGCTA AGGATCTGTCAGTGCTGGCTCTGAGGGAGGGACTGGGACTGCCC CCTGGCGACGATCCAATGCTGCTGGCCTACCTGCTGGATCCAAG CAACACTACCCCAGAGGGAGTGGCTAGGAGATATGGAGGGGAAT GGACCGAGGAAGCTGGGGAGAGAGCTGCCCTGTCCGAACGGCTG TTCGCTAATCTGTGGGGAAGGCTGGAGGGAGAGGAAAGGCTGCT GTGGCTGTACCGGGAGGTGGAACGCCCTCTGTCCGCTGTGCTGG CTCACATGGAGGCTACAGGCGTGCGCCTGGACGTGGCTTATCTG AGGGCCCTGTCTCTGGAGGTGGCTGAGGAAATCGCCAGACTGGA GGCTGAAGTGTTCCGGCTGGCCGGACATCCCTTTAACCTGAATAG CAGGGACCAGCTGGAGAGAGTGCTGTTCGATGAACTGGGGCTGC CTGCCATTGGCAAGACCGAGAAAACAGGGAAGCGCTCAACAAGC GCTGCTGTGCTGGAGGCTCTGAGGGAAGCTCACCCCATCGTGGA GAAGATTCTGCAGTACAGAGAACTGACTAAGCTGAAATCCACCTA TATCGACCCCCTGCCTGATCTGATTCACCCTAGGACAGGC AGACT GCATACTCGCTTCAACCAGACAGCTACTGCCACCGGAAGGCTGAG CTCCTCTGACCCAAACCTGCAGAATATCCCTGTGAGAACCCCACT GGGACAGCGGATCAGGAGAGCTTTTATTGCTGAGGAAGGATGGC TGCTGGTGGCTCTGGATTACTCCCAGATTGAGCTGAGGGTGCTGG CTCACCTGTCTGGGGACG AAAACCTGATCCGCGTGTTCCAGGAG GGCAGGGATATTCATACAGAAACTGCCAGCTGGATGTTTGGAGTG CCTCGCGAGGCTGTGGACCCACTGATGAGGAGGGCTGCCAAGAC AATCAATTTCGGAGTGCTGTATGGGATGTCCGCCCACAGGCTGTC TCAGGAGCTGGCTATCCCCTACGAGGAAGCTCAGGCCTTCATCGA AAGATACTTCCAGTCTTTCCCTAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAA AACCCTGGAGGAAGGCAGGAGACGGGGATACGTGGAAACACTGT TCGGCCGCAGGAGATATGTGCCTGACCTGGAGGCCAGGGTGAAG TCAGTGCGCGAGGCTGCCGAAAGGATGGCTTTCAATATGCCTGTG CAGGGAACCGCTGCCGACCTGATGAAACTGGCCATGGTGAAGCT GTTTCCACGCCTGGAGGAAATGGGGGCTAGGATGCTGCTGCAGG TGCATG ATGAGCTGGTGCTGG AAGCCCCAAAGGAGAGAGCTG AA GCCGTGGCTCGGCTGGCCAAAGAAGTGATGGAAGGCGTGTACCC CCTGGCTGTGCCTCTGGAGGTGGAAGTGGGAATCGGGGAGGACT GGCTGTCCGCCAAGGAATGA (21-2) Construcción del Vector de Expresión de la Polimerasa de ADN termoestable derivado de T. aquatics Se insertaron un promotor de TEF (SEC ID NO: 66) y un terminador de SD (SEC ID NO: 67) en los sitios de enzima de restricción Hindlll y Kpnl de un vector transbordador de replicación autónomo (pPTRII: TaKaRa Bio) para obtener el vector pPTR-TEF-SDt.

SEC ID NO: 66 GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAAGGATGGTTCAGA TACAAATTAGCAACAGGCCAGGCTAGACGCGCGACTATCCACTGC GGCAAATGGTG AGCTGCAAGC AACGGTAAGATGTGACAGGACG A GCGGTGTGCCGGGAAAAAAATTGGAGGAGCGCAAAGCGGCGGCT GTCCCTCAGTGGTGCCCAAACGTTATCGATAGTACACCAAGCATG GGCAGTGAGCGGCTATACAGAGGGAATAATAGGCATATCGGCAC GACTAGATTCGGTAGAAAGCATCGAAGAGCAATTCATTGAGCATA TTATCACGTGGAATGCGATAGCTGTGGCCAGGTTGAGACACCGCA AGTGAAAGATACACACATAGATTCTCGATTCGAGCGGTTTGCCTC CGCCACCGCAGTGCATAGCAAGCAAAGAAACGACAGTTGGCTCAT CATCCGTTACATCATTTTTTCTACTGGCTCCGCTCGGTGGGCTCC CAACGAAGCAGCAAAAAAGTGAGAGAAAAAAACTAGCTTGGCGGG GCAACAGAAGCTAGACCCTTTGGCTCGCTTAGTCAGTGCGCCCAC TCACTCACACTCAAAAAGGCCACCCCTCCCGCACCCTCTTCTCAT CACCGTCTTCATACCACGGTTCGTCAAGCAATCGTATCTGGTAAG CTTTGACCTCCTCGAGCGGGCTCCACTTTGCTATTTCTTGGATCT GCTCTTTCTTTTCTCTCTACCTCTTTTTCTAACCTCTCTTCAGAAAG TTCAACCGTACTTCACTCCATCTTCCTACGTCACTCTAGA SEC ID NO: 67 TAAAGCGGCGTGCTCTGCACATAACACGTGTCGTGTTTGGG TTCGGTATGGGTAATGGCGAATGGGGACATGCATTTATGGGATAG GGGGCTGGGTTGGTGTAATCAAATGTGCATACAGACCAGCTGATA CGAATACTACAACTTACCCCGACACACGCATTCATGTGACGCCCA ACACCTCGTCTAACTCATCGGGGCAACTCACCTCAATCCGATTCA GCCTCCCGG Se derivó el promotor de TEF de Aureobasidium pulluans, y derivó el terminador SD de Colletotrichum orbiculare, y ambos se amplificaron por PCR utilizando el ADN del genoma extraído como un molde (SEC ID NOS: 68, 69, 70 y 71). Se diseñaron tal que se introdujeron los sitios de enzimas de restricción Pmel y Xmal entre el promotor TEF y terminador SD.

SEC ID NO: 68 GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAA SEC ID NO: 69 ATATCTAGAGTGACGTAGGAAGATGGAG SEC ID NO: 70 GTTTAAACAGATCTCCCGGGTAAAGCGGCGTGCTCTGCAC SEC ID NO: 71 TATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT Después, se insertó un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. aquatics en los sitios de la enzima de restricción de Pmel y Xmal de of pPTR-TEF-SDt para obtener un vector pPTR-TEF-Taq. Además, para agregar un FLAG tag, se realizó la amplificación usando el vector pPTR-TEF-Taq como un molde y utilizaron los cebadores diseñados tal que se introdujo un sitio de la enzima de restricción de Pmel en la secuencia terminal 5' y se introdujo un sitio de la enzima de restricción de Xmal en la secuencia terminal 3' (SEC ID NOS: 72 y 73), seguido por insertar en los sitios de la enzima de restricción de Pmel y Xmal del pPTR-TEF-SDt para obtener el vector pPTR-TEF-FLTaq.

SEC ID NO: 72 ATAGTTTAAACATGGATTATAAGGATGACGATGACAAGATGA GAGGCATGCTGCCAC SEC ID NO: 73 ATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT (21-3) Transformación de A. oryzae Se introdujo el vector pPTR-TEF-FLTaq en hongos filamentosos {Aspergillus oryzae). Se realizó la transformación por un método de PEG de protoplastos. Se cultivó el A. oryzae en un medio sólido de CD (que contiene 6.0 g de NaN03, 0.52 g de KCI, 1.52 g de KH2P04, 2 mi de 1 M de MgS04-7H20, 10.0 g de Glucosa, 1.0 mg de FeS04-7H20, 8.8 mg de ZnS04-7H20, 0.4 mg de CuS04-5H20, 0.1 mg de Na2B407-10H2O, 0.05 mg de (NH4)6Mo7024-4H20, y 20.0 g de Agar por 11; y ajustó a pH 6.5 con 1N de KOH) a 30°C, y suspendió este cultivo en 10 mi de 0.1% de Tween 80 y 0.8% de NaCI, se filtró la suspensión a través de un filtro de vidrio (3G2), y recolectó el filtrado. Se centrifugó el filtrado en 3,000 rpm durante 5 min para depositar los conidios, y eliminó el sobrenadante. Se lavaron los conidios con 10 mi de 0.1% de Tween80 dos veces, y después suspendieron en una cantidad apropiada de agua estéril para obtener una suspensión de espora.

Se inoculó la suspensión de espora de A. oryzae en 100 mi de medio líquido de CD, y cultivó con agitación a 30°C durante 20 horas.

Se filtró el cultivo a través de filtro de vidrio (3G1) para recolectar las hifas y lavó con agua estéril, las hifas se mantuvieron mediante una espátula, y después se eliminó suficientemente el agua de las hifas. Se agregó una cantidad apropiada de hifas y suspendió en una solución para hacer los protoplastos en un tubo de centrifugado de 50 mi hecho de polipropileno, y agitó suavemente a 30°C durante dos horas para hacer la solución en protoplastos. Se filtraron a través del filtro de vidrio (3G2), y centrifugó el filtrado a 2000 rpm durante 5 min para recolectar los protoplastos que se lavaron con 0.8M de NaCI dos veces. Se suspendieron los protoplastos en una Solución 1 (0.8 M de NaCI, 10 mM de CaCI2, y 10 m de Tris-HCI (pH 8.0)) a 2x108/ml, y 0.2 volúmenes de una solución 2 (40% (p/v) de PEG4000, 50 mM de CaCI2, y 50 mM de Tris-HCI (pH 8.0)) agregaron y suspendieron suavemente. A 0.2 mi de la suspensión de protoplasto, se agregaron 20 µg de pPTR-TEF-FLTaq, y colocó la mezcla en hielo durante 30 min. A esto, se agregó 1 mi de la solución 2 y suspendió suavemente, y dejó a temperatura ambiente durante 15 min. Después, se agregaron 8.5 mi de la solución 1 y suspendieron suavemente. Después, se centrifugó la suspensión para recolectar los protoplastos y eliminar el sobrenadante, y suspendieron los protoplastos en 0.2 mi de la solución 1. Se agregó la suspensión de protoplasto y suspendió en 5 mi de medio de selección de agar suave de CD (un medio en el cual el agar en el medio de CD se hizo para ser 0.5%, se agregaron 0.8M de NaCI y 0.1 µg/ml de Píritiamina (TaKaRa Bio) a la misma y la temperatura se mantuvo a 50CC). Se sembró la suspensión en medio de selección de CD de modo que se dispersaron los protoplastos uniformemente y cultivaron a 30°C por siete d ías. (21-4) Cultivo de A. oryzae y Producción de la PoMmerasa de ADN Termoestable Derivada de 7. aquatics Se inoculó el transformante en 600 mi de medio de CD y cultivó a 30°C durante cuatro días. Se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min para recolectar las células, se suspendieron las células recolectadas en una solución amortiguadora de interrupción (50 mM de Tris-HCI, pH 7.5, 50 m de KCI), y desestabilizaron las células usando 0.5 mM de gránulos de vidrio, y después sometieron a tratamiento por calentamiento a 70°C durante 60 min y centrifugaron a 12000 rpm durante 30 min para obtener un sobrenadante que contiene la polimerasa de ADN termoestable. Esto se purificó usando el kit Inmunoprecipitación de proteína Etiquetado FLAG (sigma), y se obtuvo la preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de 7. aquatics. (21-5) Examen de Contaminación del ácido nucleico no específico por PCR La Figura 7 es una fotografía de electroforesis de la agarosa que muestra sí o no el ácido nucleico no específico es contaminado usando las polimerasas de ADN termoestables anteriores. El carril 1 muestra un marcador, el carril 2 muestra la PCR sin adición de un molde, y el carril 3 muestra la PCR utilizando el ADN de Escherichia coli como un molde. Se realizó la PCR usando las SEC ID NOS: 85 y 86 como un cebador, y se hicieron las condiciones de temperatura de PCR y la composición de solución de PCR para ser iguales como en (6-3), y se realizaron 45 ciclos. Esto muestra que se detectó un producto de amplificación del gen derivado de ARNr 16S bacteriano cuando se utilizó Escherichia coli como un molde, y el producto de amplificación del gen derivado de ARNr 16S bacteriano no se detectó cuando no se agregó un molde. (22) PCR en tiempo real de Varias Polimerasas de ADN Termoestables Utilizando el Método de no exhibición (Masked Primer Dimer Method) Se realizó la PCR en tiempo real por el método de no exhibición usando la preparación de la polimerasa de ADN termoestable obtenida anteriormente. Se realizó la PCR en tiempo real usando la preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de 7. aquaticus (Figura 8A y Figura 9A), preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de P. furiosus mutada (Figura 8B y Figura 9B), y preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de T. gorgonarius mutada (Figura 8C y Figura 9C), que se produjeron usando S. cerevisiae como un anfitrión, preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de 7. aquaticus (Figura 8D, Figura 9D) producida utilizando P. pastoris como un anfitrión, y preparación de la polimerasa de ADN termoestable derivada de 7. aquaticus (Figura 8E, Figura 9E) producida utilizando tabaco BY-2 como un anfitrión. Además, las Figuras 8A, B, C, D y E muestran una curva de amplificación, y las Figuras 9A, B, C, D y E muestran una curva de fusión, respectivamente. Las líneas continuas muestran un caso en el cual se agregó un molde, y las líneas discontinuas muestran un caso en el cual no se agregó un molde. El reactivo de PCR en tiempo real fue igual como en (17). Se realizó el programa de PCR en tiempo real a 94°C durante 1 min, 50°C durante 30 seg, 72°C durante 1 min, y 84°C durante 2 seg como un ciclo, seguido detectando un valor de fluorescencia, que se repitió 60 veces. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que el uso del método de no exhibición permitió un análisis sin detección de un producto de amplificación no específico o una señal de la curva de amplificación del ADN bacteriano qué daño la cuantificación en PCR en tiempo real.

(Ejemplo 2: Identificación de Cuantificación A por el Método de no Exhibición) Más adelante, la polimerasa de ADN termoestable derivada de 7. aquaticus producida utilizando el S. cerevisiae hospedador se refiere como "e-ADNP".

Usando el e-ADNP obtenido antes, se probó la identificación de cuantificación de una muestra por el método de no exhibición. Se realizó la PCR en tiempo real en un sistema cuya cantidad total fue 20 µ? usando máquinas de PCR en tiempo real LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics K.K.) y RotorGene 6000 (QIAGEN) y un reactivo para PCR en tiempo real por la siguiente constitución usando los cebadores universales anteriormente mencionados para detectar bacterias.

Cebador directo: CTCCTACGGGAGGCAG (SEC ID NO: 43) Cebador Inverso: ACTACCAGGGTATCTAATCCTG (SEC ID NO: 44) e-ADNP (5 unidades/µ?): 1 µ?, Molde de ADN genómico de Escherichia coli o grado de PCR de agua: 2 µ?, SYBR Green I (TAKARA) 300 veces diluido: 2 µ?, Cebadores de PCR (10 µ?): 0.8 µ? por cada uno, 10 x Amortiguador (500 mM de KCI, 100 mM de Tris-HCI): 2 µ?, 25 mM de MgCI2: 1 µ?, 2 mM de dNTP mez: 2 µ?, Grado de PCR de agua: 8.4 µ?.

Además, se realizó el programa de PCR en tiempo real de acuerdo con las condiciones descritas en la Tabla 1.

Tabla 1 Modo Objeto Fluorescencia Programa de Ciclos Segmento Tiempo Modo de Temperatura Análisis Adquisición P re¬ Ninguno 1 1 95°C 2 min Ninguno incubación Desnaturali¬ 95°C 15 seg - Cuanti- zación Amplificación 50 ficación Hibridación 55°C 15 seg - Extensión 72°C 15 seg - Desnaturali¬ 95°C 0 seg - Análisis de la Curvas zación Curva de de 1 Hibridación . 70°C 15 seg - Fusión Fusión 95°C Fusión 0 seg Continuo O.rC/sec.

Enfriamiento Ninguno 1 1 40°C 30 seg - La Figura 13 y Figura 14 son una curva de amplificación y una curva de fusión que muestran el análisis de acuerdo a las condiciones del programa descritas en la Tabla 1.

La Figura 13 muestra que una curva de amplificación aparece, incluso si un molde no está incluido, y la Figura 14 muestra que una curva de fusión del dímero de cebador se observó alrededor de aproximadamente 76°C.

Tabla 2 Objeto Fluorescencia Modo de Programa Ciclos Segmento Tiempo Modo de Análisis Temperatura Adquisición Pre-incubación Ninguno 1 1 95°C 2 min Ninguno Desnaturalización 95°C 15 seg - Cuantific Hibridación 55°C 15 seg - Amplificación 50 ación Extensión 72°C 15 seg - 1 84°C 2 seg sencillo Desnaturalización 95°C 0 seg - Análisis de la Curvas Hibridación 70°C 15 seg - Curva de de 1 95°C Fusión Fusión Fusión 0 seg Continuo 0.1°C/sec.

Enfriamiento Ninguno 1 1 40°C 30 seg - Con referencia a los resultados de la curva de fusión mostrados en la Figura 14, la temperatura en el momento cuando se detectó la fluorescencia se ajustó a 84°C, la temperatura media entre el dímero de cebador y el de E. coli. Se realizó la PCR en tiempo real de acuerdo con las condiciones descritas en la Tabla 2.

La Figura 15(A) es una gráfica que muestra una curva de amplificación de los resultados de PCR en tiempo real de acuerdo con las condiciones del programa descritas en la Tabla 2. De acuerdo con este método, se utilizó cuando agua como un molde, no se exhibió un dímero de cebador; y cuando se agregó E. coli como un molde, se observó una curva de amplificación normal de un producto de amplificación objeto.

(Ejemplo 3: Identificación de Cuantificación B por el Método de no Exhibición) Usando el e-ADNP y el método de no exhibición de acuerdo con la presente invención, la bacteria y hongo infecciosos que estaban presentes en varias muestras se probaron para ser cuantificados e identificados. Un reactivo de PCR en tiempo real para detectar bacterias y constitución del cebador son iguales como en el Ejemplo 2. Se realizó este ejemplo de manera similar como en el Ejemplo 2 salvo que un reactivo de PCR en tiempo real para detectar hongos y la constitución del cebador son como sigue: se utilizó una polimerasa de ADN de rTaq (ToYoBo) como una polimerasa de ADN termoestable producida utilizando bacterias como un anfitrión, y se utilizó el cebador universal mencionado anteriormente para detectar hongos.

Cebador directo: GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG (SEC ID NO: 9) Cebador Inverso: GCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCA (SEC ID NO: 45) Puesto que CFU/ml se utiliza generalmente como la unidad de la concentración de las bacterias/hongos infecciosos, para permitir que la unidad iguale a la del ensayo de cuantificación de PCR calculada en la concentración de ADN, el cálculo se probó vía el método turbidimétrico de McFarland. Específicamente, después de que se suspendieron E. coli y C. albicans en salina fisiológica, respectivamente, se formó una suspensión bacteriana se permitió igualar a un valor medio de 0.5 de McFarland y desarrolló cada suspensión sobre un medio, y calculó el CFU/ml. Al mismo tiempo, se extrajo el ADN y calculó el ADN/ml, y ilustró una curva de calibración de PCR en tiempo real de la solución de ADN.

Los valores convertidos de los CFU/ml y ADN/ml se muestran a continuación.

- E. coli: 0.5 de McFarland = 1.3 ? 108 de CFU/ml = 8.6 µg/ml (8.6 ng/µ?) - C. albicans: 0.5 de McFarland = 2.5 ? 106 se CFU/ml = 18.0 µ9/? ? (18.0 ng/µ?) Además, como un resultado de la curva de calibración, se obtienen los siguientes resultados.

- E. coli: coeficiente de correlación es -1.00, y fórmula de cálculo: número de ciclos = -4.1 ? concentración + 14.6 - C. albicans: coeficiente de correlación es -1.00, y fórmula de cálculo: número de ciclos = - 4.4 ? concentración + 14.5.

Como los controles positivos y cuantitativos, se cuantificaron las siguientes dos bacterias para cada medida.

- E. coli: 1.3 x 105 de CFU/µ? = 8.6 ng/?µ, 2 µ? (20 µ? del sistema de medida) - C. albicans: 2.5 ? 103 de CFU/?µ = 18.0 ng/?µ, 2 µ? (20 µ? del sistema de medida) Como se mencionó antes, en este sistema, cuando las bacterias y hongos son positivos, se realizó la cuantificacion usando la siguiente fórmula de estimación.

- Bacterias (valor convertido de E. coli), número efectivo: 2 dígitos 1 3 X 108 X [10 í1"(n"mer0 de ciclos - número de ciclos de control + 4.1 )/4.1}j de CFU/ml - Hongo (valor convertido de la Candida Albicans), número efectivo: 2 dígitos 2 5 X 106/18 X [10 {3"(n"mero de ciclos - número de ciclos de control + 7 7) 4>] de CFU/ml (1) Examen del Agua de Vida Diaria Usando - el Método de cuantificacion Altamente Sensible del Objeto a Detectarse Después, para los propósitos de evaluar el sentido práctico del "método de cuantificacion altamente sensible de un objeto a detectarse" construido, se examinaron los siguientes cuatro tipos de agua de vida diaria.

(A) Agua de la llave: agua del suministro de agua en el Toyama University Hospital.

(B) Agua de manantial: agua famosa de la Toyama Prefecture seleccionada para una de la "the 100 best waters ¡n Japan" en 1985 by Environment Agency.

(C) Agua de manantial caliente: agua de manantial caliente calentada y circulada. No se contiene ningún aditivo.

(D) Agua de aire acondicionado: agua de aire acondicionado en el Toyama University Hospital.

Se centrifugaron veinte cinco mi cada una del agua de la llave, agua de manantial y agua de manantial caliente y 1 mi de agua del aire acondicionado a 8000 rpm durante 20 min, y extrajeron los ADNs de las pelotillas usando la InstaGene Matrix (Bio-Rad).

Se realizó el examen de bacterias/hongos infecciosos usando la solución de extracción de ADN como un molde. Como un resultado del examen, no se detectó ninguno de los hongos de cualquiera de los cuatro tipos de las aguas de vida diaria (B en la Figura 15(B)). En cuanto a bacterias, sin embargo, ninguna bacteria está presente en el agua de la llave y agua de manantial (famosas), pero el agua de manantial caliente y agua del aire acondicionado probaron positivas (B y C en la Figura 15(C)). Como un resultado de cuantificación de las mismas, se obtuvieron los siguientes valores de medida.

- Agua de manantial caliente: 1.2 de CFU/ml (valor convertido de E. coli) - Agua del aire acondicionado: 78 de CFU/ml (valor convertido de E. coli) A consecuencia, se reveló que el agua de manantial caliente incluyó bacterias aunque la cantidad fue pequeña y el agua del aire acondicionado incluyó bacterias en una alta concentración. (2) Examen de Alimentos Utilizando el Método de Cuantificación Altamente Sensible del Objeto a Detectarse Dado que la contaminación bacteriana o contaminación fúngica en los alimentos puede causar directamente los síntomas de intoxicación por alimentos, el examen de los mismos es socialmente importante. En este momento, se utilizó petisú con alto riesgo de intoxicación alimentaria mediante Staphylococcus aureus como una muestra.

Nótese aquí que como un "petisú antiguo", se utilizó un petisú que se había dejado a temperatura ambiente durante varios días, y como un control (un nuevo petisú), se utilizó un petisú en una mejor fecha previa, el cual se había conservado en un refrigerador (no mayor de 5°C). Para la extracción de ADN, en primer lugar, se recolectaron 27.4 g de solamente parte de crema de cada petisú y agregaron 20 mi de solución salina fisiológica esterilizada, que después se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Esta operación se repitió tres veces para eliminar el componente de aceite. Después de la misma, se extrajo el ADN de la pelotilla centrifugada usando la InstaGene Matrix, se realizó el examen de bacterias/hongos infecciosos usando los ADNs extraídos como un molde.

A consecuencia, se detectó la cantidad de hongos extremadamente pequeña del petisú viejo y el control en substancialmente al mismo nivel (Figura 16). En vista del hecho que la cubierta del petisú es fermentada con levadura, no se piensa que ocurra una nueva contaminación por hongos.

En cuanto a las bacterias infecciosas, no se detectó ninguna bacteria en el petisú reciente, mientras que se observó proliferación del número considerable de bacterias en el petisú viejo (Figura 17). Se cuantificó la cantidad de proliferación, y como un resultado, se obtuvo el siguiente valor de medida.

Petisú antiguo: 1.5 x 107 CFU/(crema) g (valor convertido de E. coli) (3) Examen de septicemia utilizando el método de cuantificación altamente sensible del objeto que será detectado Después, se intentó un examen de septicemia utilizando el método de cuantificación altamente sensible del objeto que será detectado. En este momento, como muestras de pacientes con septicemia, fueron utilizadas las muestras de sangre de cada uno de los pacientes A con fungemia (septicemia causada por Candida Albicans) y de los pacientes B con bacteriemia (septicemia causada por Bacillus species). Para la extracción de ADN, cada 2 µ? de las muestras de sangre de los pacientes A y B fueron recolectados, y 2 µ? de una botella de cultivo de sangre del paciente B fueron recolectados adicionalmente, los ADNs fueron extraído usando InstaGene Matrix, respectivamente, y fueron utilizados como molde para realizar el examen de bacteria/hongo infeccioso.

Por lo tanto, en el paciente A, la infección bacteriana no fue observada, sólo la infección fúngica fue observada (Figura 18). Como resultado de la cuantificación de la infección fúngica, los siguientes valores de medición fueron obtenidos.

Paciente A: 9.7 x 104 CFU/(sangre) mi (valor convertido de Candida Albicans) Además, en el paciente B, no se observó ninguna infección fúngica, y solamente una pequeña cantidad de infección bacteriana fue observada extremadamente (Figura 19). También, cuando una botella de cultivo de sangre fue confirmada, una gran cantidad de proliferación de bacterias fue observada. Como resultado del cálculo de cuantificación de esta infección bacteriana, los siguientes valores de medición fueron obtenidos.

Paciente B: 2.0 x 105 CFU/(sangre) mi (valor convertido de £. coli) Además, la Figura 20 muestra los resultados de la PCR en tiempo real realizada usando el ADN de MRSA como molde y los siguientes cebadores específico Spa y mecA para MRSA.

Cebador directo Spa: GCGATTGATGGTGATACGGTT (SEC ID NO. 46) Cebador Inverso Spa: AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC (SEC ID NO: 47) Cebador directo mecA: AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC (SEC ID NO: 48) Cebador inverso mecA: AGTTCTGCACTACCGGATTTGC (SEC ID NO: 49) El uso de los cebadores específicos a MRSA de los cebadores universales usados en el ejemplo anterior, permitió diseñar un análisis de detección de las bacterias/hongos infecciosos específicos.

Ejemplo 4: Prueba de sensibilidad de fármaco que aplica el método de cuantificación altamente sensible del objeto que será detectado Una prueba rápida de sensibilidad de fármaco en fase líquida fue realizada aplicando el método cuantificación altamente sensible utilizando e-DNAP y el método de no exhibición de acuerdo con la presente invención. En las pruebas de sensibilidad de fármaco actuales, generalmente toma varios días obtener los resultados. Sin embargo, cuando se aplica el método de cuantificación altamente sensible de acuerdo con la presente invención, los resultados pueden obtenerse sobre solamente de cuatro a seis horas. Observar aquí que la prueba de sensibilidad de fármaco en fase líquida ya está descrito en una patente anterior (WO2002/052034), pero no utiliza el el método de cuantificación altamente sensible. Por consiguiente, una prueba sensible debe ser comenzada una vez que el cultivo fue realizado, para que tome por lo menos un día obtener un resultado. (1) Cultivo Una cantidad igual de cada muestra (por ejemplo, sangre de septicemia) fue infundida en un medio líquido (BHI: infusión de cerebro-corazón), cada medio de muestra fue recolectado antes del cultivo, dos horas después del cultivo, y cuatro horas después del cultivo bajo condiciones en las cuales un agente antibiótico fue agregado o no agregado, las células fueron sometidas a la centrifugación y granulación para obtener el ADN, respectivamente. Además, es deseable que la extracción del ADN sea realizada usando un dispositivo automático de extracción de ácido nucleico. (2) Cuantificación de bacterias por PCR en tiempo real Un reactivo de PCR en tiempo real para detectar las bacterias, condiciones y constitución del cebador fueron iguales que en el ejemplo 2. (3) Método de determinación Cuando se realiza el cálculo cuando el resultado de cuantificación antes de que cultivo se defina como 0 y el resultado de cuantificación dos horas después y cuatro horas después de que el cultivo en el cual un agente antibiótico no fue agregado, se define respectivamente como 100 (un índice de enriquecimiento cuando un agente antibiótico no fue agregado se define como 100%), el índice enriquecimiento fue calculado dos horas después y cuatro horas después del cultivo en el cual un agente antibiótico fue agregado.

Por ejemplo, la cantidad de bacterias/hongos antes de que el cultivo sea NOh, la cantidad de bacterias dos horas después del cultivo en el cual un agente antibiótico no se agrega es N2h, y la cantidad dos horas después de cultivo en el cual se agrega un agente antibiótico es K2h, el índice de enriquecimiento dos horas después de que un agente antibiótico se agregue se puede calcular por la siguiente fórmula: índice de enriquecimiento dos hora después de que el agente antibiótico es agregado = (K2h-N0h)/(N2h-N0h) x 100 (%) Alternativamente, en lugar de comparar los índices de enriquecimiento, las cantidades pueden ser comparadas directamente por sí mismas. (4) Resultado 1: Comparación de la cantidad de bacterias por sí mismas Con respecto al Staphylococcus epidermitis detectado, la sensibilidad al fármaco con respecto a cada 10 Mg/ml de gentamicina (GM) y 10 Mg/ml de eritromicina (EM) fue evaluada dos horas y cuatro horas después del cultivo, respectivamente. Por lo tanto, fue revelado que dos horas después y cuatro horas después del cultivo, la sensibilidad a la EM fue observada, pero la sensibilidad a la GM no fue observada (Figura 21(A)). Sin embargo, debido a que el Staphylococcus epidermidis no fue proliferado mucho después de dos horas de cultivo, para evaluar más exactamente, la evaluación se debe realizar después de cuatro horas de cultivo. (5) Resultado 2: Cálculo cuando el índice de enriquecimiento sin adición del agente antibiótico se define como 100% Con respecto al Bacillus cereus detectado, la sensibilidad al fármaco con respecto a cada 10 Mg/ml de cefazolina (CZ), 10 Mg/ml de ampicilina (AM) y 10 Mg/ml de eritromicina (EM) fue evaluada dos, tres, y cuatro horas después del cultivo, respectivamente. Por lo tanto, cuando la evaluación después de cuatro horas cuando el enriquecimiento es grande, se revela que la sensibilidad al AP fue observada (índice de enriquecimiento: 0%) y la sensibilidad a CZ fue observada hasta cierto punto (índice de enriquecimiento: 16%), pero la sensibilidad a EM fue apenas observada (índice de enriquecimiento: 76%) (Figura 21(B)). Así, debido a que el "nivel" de la sensibilidad es afectado por la velocidad de la proliferación de las bacterias, se requiere el ajuste de tiempo uniforme. Sin embargo, la evaluación independientemente de si la sensibilidad fuerte a un agente antibiótico es mostrada o no mostrada se puede determinar incluso en una primera etapa tal como dos horas después del cultivo.

Ejemplo 5: Prueba amniótica de la infección intrauterina utilizando el método de detección altamente sensible del objeto que será detectado Usando un método de detección altamente sensible utilizando e-DNAP y el método de no exhibición de acuerdo con la presente invención, una prueba amniótica rápida y simple de la infección intrauterina fue realizada. Debido a que la causa más grande del nacimiento prematuro es la infección intrauterina, que tiene el riesgo de que un feto pueda morir, se ha exigido un método de análisis para determinar rápidamente la presencia de infección. En la infección intrauterina, el índice de infección de microorganismos infecciosos por ejemplo Mycoplasma y Ureaplasma , además de bacterias y hongos, es extremadamente alta. Debido a que las secuencias base del género Mycoplasma y Ureaplasma son extremadamente diferentes de la secuencia base de las bacterias, no pueden ser detectadas usando los cebadores universales de las bacterias. Por lo tanto, es necesario utilizar un cebador de cada microorganismo. (1) Conjunto de cebadores y reactivo para PCR El reactivo de PCR en tiempo real para detectar las bacterias y hongos y las combinaciones de cebadores son iguales que en para el ejemplo 3.

Más adelante, se muestran las constituciones de los cebadores para detectar el género Mycoplasma y Ureaplasma. Para la detección del género Mycoplasma y Ureaplasma, fue utilizado un método de PCR interna.

Para la detección del género Mycoplasma y Ureaplasma, e-DNAP fue utilizado, y fue utilizado el mimo reactivo de PCR que en el ejemplo 2. El programa de PCR fue igual que en el ejemplo 2.

Cebador directo de Mycoplasma: GATGATCATTAGTCGGTGG (SEC ID NO: 50) Cebador inverso de Mycoplasma: CTACCTTAGGCGGTCGTC (SEC ID NO: 51) Cebador interno directo de Mycopiama: GACATCCTTCGCAAAGCTAT (SEC ID NO: 52) Cebador interno inverso de Mycopiama: CAGTTACCCAGGCAGTATCTC (SEC ID NO: 53) Cebador directo de Ureaplasma: GAACGAAGCCTTTTAGGC (SEC ID NO: 54) Cebador inverso de Ureaplasma: GATACAGCTAGACGTTAAGCATCTA (SEC ID NO Cebador interno directo de U reaplasma: TAACATCAATATCGCATGAGAAG (SEC ID NO Cebador interno inverso de Ureaplasma: CAGTACAGCTACGCGTCATT (SEC ID NO: 57) (2) Método de detección por PCR Con el conjunto de cebadores anterior, es posible determinar de manera rápida y simple si las bacterias, hongos, género Mycoplasma , y genero Ureaplasma están presentes en el fluido amniótico. El método de detección puede utilizar un método de PCR en tiempo real o puede utilizar un método de confirmación al someter un producto de PCR a la electroforésis en un gel de agarosa. El método del ejemplo 3 utilizando e-DNAP permite detectar las bacterias y hongos con alta sensibilidad, y el método de PCR interna permite detectar con alta especificidad el género Mycoplasma y el género Ureaplasma. (3) Resultados De una muestra de fluido amniótico 1 con sospecha de tener infección intrauterina, la infección con una bacteria fue confirmada (Figura 22(A)). Además, de una muestra de fluido amniótico 2 del suministro prematuro amenazante, la infección con el género Ureaplasma fue confirmada (Figura 22 (B)). Estos exámenes se pueden realizar aproximadamente en dos horas rápida y simplemente. Además, el conjunto de cebadores de este ejemplo se puede utilizar para los exámenes de contaminación en, por ejemplo, un ambiente de experimento de organismo tal como una solución de cultivo de las células cultivadas (bacterias, hongo, y Mycoplasma).

En cuanto al género Ureaplasma detectado, la secuencia base del producto de amplificación fue analizada adicionalmente, y por lo tanto, fue confirmado que el género Ureaplasma detectado fue Ureaplasma parvum. De esta manera, el nivel de especies detectadas de bacterias, hongos, género Mycoplasma, y género Ureaplasma puede ser identificado al someter productos de amplificación de PCR a la secuencia. Alternativamente, la especie puede ser identificada analizando la combinación de valores Tm de una pluralidad de los productos de amplificación (WO2007/097323) o usando los cebadores internos específicos a cepa con respecto al lado interno adicional del producto de amplificación por un cebador universal (puede ser posible una PCR múltiple por una pluralidad de cebadores).

Ejemplo 6: Método de detección que combina el método de detección altamente sensible y un método de PCR interna de una etapa del objeto que se detectará Además del método de detección altamente sensible utilizando e-DNAP y el método de no exhibición de acuerdo con la presente invención, aplicando el "método de amplificación interna" o contemplando un periodo de extensión, con un ensayo de PCR interna, una mayor detección altamente sensible se puede realizar mientras se mantiene una altas sensibilidad y rapidez. (1) Conjunto de cebadores y reactivo para PCR La mayoría de la polimerasa de ADN termoestable comercialmente disponible producida utilizando las bacterias como anfitrión, utilizan E. coli como un anfitrión de las mismas. Por lo tanto, cuando la PCR se realiza para detectar las cepas de E. coli o del género cercano a E. coli, aumenta naturalmente el riesgo de ser seudo-positivo. Para solucionar tal problema, y detectar E. coli con alta sensibilidad y alta especificidad, aplicando el "método de amplificación interna" o contemplando un periodo de extensión junto con el método de detección altamente sensible utilizando e-DNAP, fue realizada la PCR semi-interna de una etapa utilizando un cebador específico para E. coli. El reactivo de PCR es igual al del ejemplo 3. En la presente, se muestra el conjunto de cebadores semi-internos específicos para E. coli.

Cebador directo específico para E. coli: TAACGGCTCACCTAGGCGA (SEC ID NO: 58) Cebador inverso específico para E. coli: GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTG (SEC ID NO: 59) Cebador semi-interno específico para E. coli: GCAATATTCCCCACTG (SEC ID NO: 60) Los cebadores fueron diseñados tal que los valores Tm de las SEC ID NOs de los cebadores: 58 y 59 fueran de 65°C, respectivamente, y el valor Tm de SEC ID NO del cebador semi-interno: 60 fuera de 55°C. (2-1) Método de PCR interna de una etapa aplicando el "método de amplificación interna" La longitud del producto de amplificación I usando el cebador de las SEC ID NOs: 58 y 59 es 548 bp, y la longitud del producto de amplificación de PCR semi-interna II es 110 bp. De esta manera, distinguiendo claramente entre las longitudes de los productos de amplificación, las posiciones de los cebadores fueron diseñadas tal que la diferencia de los valores Tm entre los productos de amplificación sea aumentada. Por lo tanto, el valor Tm del producto de amplificación fue de 87°C, y el valor Tm del producto de amplificación II fue de 83°C. Sin embargo, debido a que el GC% del producto de amplificación afecta el valor TM, en el diseño de los cebadores, el GC% del producto de amplificación se debe también considerar suficientemente. Además, puesto que el valor Tm fue afectado por la concentración de sal del amortiguador de PCR, la concentración de sal debe ser siempre constante.

Entonces, el programa de PCR en tiempo real fue realizado a las condiciones descritas en la Figura 3. En este ajuste de condición, además del método de detección altamente sensible utilizando e-DNAP y el método de no exhibición, la PCR interna se puede realizar por un ensayo aplicando el "método de amplificación interno". En el programa, se agrega el ajuste del cambio al cual el cebador interno se une.

Tabla 3 Modo de Modo de Temperatura Programa Ciclos Segmento Tiempo adquisición análisis objeto fluorescente Incubación Ninguno 1 1 95°C 10 min Ninguno previa Desnaturalización 94°C 15 seg - Amplificación Hibridación 70°C 2seg - Cuantificación 10 1 Extensión 72°C 20 seg - 1 81°C 2 seg Simple Desnaturalización 94°C 10 seg - Hibridación 60°C 2 seg - Cambio Cuantificación 2 Extensión 72°C 20 seg - 1 81°C 2 seg Simple Desnaturalización 85°C 10 seg - Amplificación Hibridación 60°C 2 seg - Cuantificación 40 2 Extensión 72°C 20 seg - 1 81°C 2 seg Simple Análisis de Curvas de 95°C curva de 1 Fusión 0 seg Continuo fusión 0.1oC/seg fusión Enfriamiento Ninguno 1 1 40°C 30 seg - (2-2) Método de PCR interna de una etapa mediante la planificación de un periodo de extensión La longitud del producto de amplificación I mediante el uso de los cebadores de las SEC ID NOs: 58 y 59 es 548 pb, y la longitud del producto de amplificación de PCR semi-internade II es de 110 pb. De esta manera, las posiciones de los cebadores se diseñaron para los propósitos de diferenciar claramente la longitud de los productos de amplificación.

A continuación, el programa de PCR en tiempo real se llevó a cabo a las condiciones descritas en la Tabla 4. En este ajuste de condición, además del método de detección de alta sensibilidad con e-DNAP y el método de no exhibición, la PCR interna se puede llevar a cabo por un ensayo mediante la planificación de un periodo de extensión.

Tabla 4 Modo de Modo de Temperatura Programa Ciclos Segmento Tiempo adquisición análisis objeto fluorescente Incubación Ninguno 1 1 95°C 10 min Ninguno previa Desnaturalización 94°C 15 seg - Amplificación Hibridación 70°C 2 seg - Cuantificación 10 1 Extensión 72°C 20 seg - 1 81°C 2 seg Simple Modo de Modo de Temperatura Programa Ciclos Segmento Tiempo adquisición análisis objeto fluorescente Desnaturalización 94°C 10 seg - Hibridación 60°C 2 seg - Cambio Cuantificación 2 Extensión 72°C 2 seg - 1 81°C 2 seg Simple 95°C Desnaturalización 0 seg - 0.1°C/sec.

Amplificación Cuantificación 40 Hibridación 40°C 30 seg - 2 Extensión 95°C 10 min - 1 94°C 15 seg Simple Análisis de Curvas de curva de 1 Fusión 70°C 2 seg Continuo fusión fusión Enfriamiento Ninguno 1 1 72°C 20 seg - (3) Resultados La PCR en tiempo real fue realizada por el siguiente programa mezclando tres cebadores incluyendo el cebador semi-interno para confirmar si solamente el producto de amplificación I anterior o el producto de amplificación II fueron amplificados por PCR interna, de acuerdo con los valores Tm de los productos de amplificación o tamaños de los mismos aplicando el "método de amplificación interna" y planificando un periodo de extensión. (3-1) Confirmación que solamente el producto de amplificación externo I es amplificado Solamente parte del programa de amplificación 1 mostrada en los Figuras 3 y 4 se realiza 50 ciclos, respectivamente. El punto es una temperatura de hibridación de 70°C. Debido a que el valor Tm de el cebador externo es 65°C y el valor Tm del cebador semi-interno interior es 55°C, sólo el cebador externo se une en la hibridación a 70°C. Por lo tanto, solamente se amplifica el producto de amplificación externo I. Los resultados del experimento muestran con seguridad que solamente es amplificado un producto de amplificación que tiene un valor Tm del producto de amplificación I de 87°C y que tiene la longitud de 548 dbp (Figura 23 (B) y Figura 25). (3-2) Confirmación de que solamente el producto de amplificación interno II es amplificado Solamente parte del programa de amplificación 2 mostrado en las Figuras 3 y 4 se realiza 50 ciclos, respectivamente. El punto en la aplicación del "método de amplificación interna" en la Figura 3 es la temperatura de hibridación de 60°C y la temperatura de desnaturalización de 85°C. En la hibridación a 60°C, todos los cebadores incluyendo el cebador semi-interno son unidos, pero cuando la temperatura de desnaturalización es 85°C, el producto de amplificación interna II (valor Tm: 83°C) se desnaturaliza pero el producto de amplificación externa I (valor Tm: 87°C) no se desnaturaliza. Por lo tanto, solamente el producto de amplificación interna II se amplifica. Los resultados de experimento muestran seguramente que solamente un producto de amplificación II (otros son dímeros de cebador) tiene 83°C que es el valor Tm y 110 bp es amplificado (Figura 23(A) y Figura 25).

El punto de planificar el periodo de extensión en la Figura 4 es el tiempo de extensión de dos segundos. En la hibridación a 60°C, todos los cebadores incluyendo el cebador semi-interno son unidos, pero cuando el tiempo de extensión es de dos segundos, aunque el producto de amplificación interno II (110 bp) se extienda, el producto de amplificación externo I (548 bp) no puede extenderse. A consecuencia, solamente se amplifica el producto de amplificación interno II. Los resultados de experimento muestran seguramente que solamente un producto de amplificación II (otros son dímeros de cebador) que tiene 83°C que es el valor Tm y 110 bp, es amplificado (Figura 23(A) y Figura 25). (3-3) Confirmación del método de cuantificación altamente sensible utilizando e-DNAP y el método de no exhibición La PCR en tiempo real fue realizada de acuerdo con el ajuste de programa en las Figuras 3 y 4. Por lo tanto, sólo en presencia de E. coli, la amplificación fue observada, y en presencia de agua destilada (D.W.), Staphylococcus aureus (S. aureus) y ADN humano, la proliferación de ADN no fue observada en absoluto (Figura 24(A): solamente se muestra la amplificación de la amplificación 2 de las Figuras 3 y 4). Es decir, incluso después 60 ciclos en total, la amplificación no fue observada en un caso distinto a aquel en donde E. coli fue utilizado, fue confirmado que la cuantificación altamente sensible puede realizarse usando e-DNAP y el método de no exhibición. (3-4) Confirmación de PCR interna de una etapa Un producto amplificado usando el ADN de E. coli como molde con el programa entero descrito en las tablas 3 y 4 fue solamente uno, y que tiene el valor Tm de 83°C y la longitud de 110 dbp, es decir, sólo el producto de amplificación interno II fue amplificado (Figura 24(B) y Figura 25). Por lo tanto, fue confirmado que la PCR interna se puede realizar por un ensayo (una etapa) aplicando el "método de amplificación interna" u planificando el periodo de extensión. (3-5) Conclusión de los resultados Por lo tanto, según lo descrito anteriormente, fue confirmado que cuando el método de cuantificación altamente sensible es realizado usando e-DNAP y el método de no exhibición, y al mismo tiempo, la PCR interna de una etapa es combinada aplicando el "método de amplificación interna" y planificando el periodo de extensión, una detección altamente específica puede realizarse solamente planificando el programa de PCR mientras que la alta sensibilidad y rapidez pueden ser mantenidas. De acuerdo con la PCR interna de estos ejemplos, los cebadores específicos a E. coli se combinan, pero, por ejemplo, pueden ser combinados un método para combinar los cebadores universales bacterianos para el interior y exterior, y un método para utilizar el cebador universal bacteriano para el cebador exterior y específico para cada especie para el interior (PCR múltiple que utiliza una pluralidad de cebadores específicos puede también ser realizada). Además, incorporando el método de amplificación interna y la planificación del tiempo de extensión en un programa de PCR, el método de PCR interna de una etapa se puede realizar más confiablemente.

Ejemplo 7: Método de identificación por cuantificación altamente sensible para que un microorganismo objete sea detectado utilizando e-DNAP La PCR con respecto a los microorganismos infecciosos desconocidos es realizada usando los cebadores universales, y se analiza la combinación de valores Tm de una pluralidad de productos de amplificación, para identificar los microorganismos infecciosos rápida y simplemente (WO2007/097323). Cuando el microorganismo infeccioso es una bacteria, puesto que el cebador universal de una bacteria se utiliza en este método de identificación, si e-DNAP no se utiliza, se presenta el riesgo de ser seudo-positivo y por lo tanto la detección altamente sensible no puede realizarse. Es decir, es deseable utilizar e-DNAP para la identificación de bacterias en este ejemplo. Además, como equipo de medición, es deseable utilizar RotorGene6000 (Qiagen). (1) Conjunto de cebadores y reactivo para PCR Como los cebadores universales de bacterias, se utilizan las SEC ID NOs: 15 a 28. Así, siete productos de amplificación de PCR pueden ser producidos. El reactivo para las condiciones de PCR y la PCR es igual que para el ejemplo 2. (2) Método de análisis Después de que el ADN se extraiga de una muestra de sangre de un paciente con septicemia, la PCR tiempo real anterior se realiza para obtener un valor Tm de cada uno de los siete productos de amplificación de PCR. La combinación de los siete productos de amplificación de PCR se compagina con la siguiente base de datos. En este tiempo, pueden ser obtenidos los resultados de cuantificación por el ensayo de PCR en tiempo real. (3) Base de datos Las combinaciones de los siete valores Tm en cuanto a cada uno de los 45 tipos de bacterias extraídas de las muestras positivas de septicemia el último un año en Toyama University Hospital se han ingresado. Los siete valores Tm son obtenidos usando los cebadores de las SEC ID NOs: 15 a 28 y usando el reactivo para las condiciones de PCR y PCR que son iguales que en el ejemplo 2. (4) Método de identificación Se calcula el valor promedio de los siete valores Tm obtenidos de las muestras de los pacientes, y un valor relativo se calcula del valor promedio (debido a que este valor no es un valor absoluto, se genera más/menos). Los siete valores relativos son denotados por D1ref a D7re(. Similarmente, los valores se calculan en cuanto a cada una de las bacterias en la base de datos, los siete valores relativos son denotados por D1db a D7d_. Entonces, en cuanto a todas las bacterias en la base de datos, se realiza el siguiente cálculo.

Expresión 2 Dist= (D1db-D1ref)2+(D2db-D2ref)2+...+(D7db-D7ref)2} Una bacteria que tiene el "Dist." que es el más cercano a 0 se deriva de la base de datos, y esta bacteria se identifica como una bacteria causante en la muestra. Puesto que el método anterior se incorpora en un algoritmo del software de identificación de la computadora, sólo ingresando los siete valores Tm obtenidos de las muestras del paciente, los resultados de la identificación se pueden obtener inmediatamente. Usando el algoritmo de este ejemplo, los errores de medición del valor Tm para cada ensayo son corregidos totalmente. Es decir, incluso si un error de temperatura ocurre para cada medición, tal error no afecta a la identificación. Un error que no puede ser corregido con este método es un error en la medición que ocurre entre las muestras en el mismo ensayo. Sin embargo, por ejemplo, cuando RotorGene6000 (Qiagen) se utiliza como un equipo de PCR en tiempo real, puesto que un error de medición entre las muestras es ± 0.01°C, el error apenas afecta la identificación, y por lo tanto la identificación exacta pueden realizarse. (5) Resultados Los siete valores Tm en las bacterias desconocidas obtenidas de las muestras pacientes fueron 84.98, 84.45, 84.84, 84.31, 81.20, 81.83, y 81.12, respectivamente. Como resultado del cálculo por el software de identificación, Klebsiella pneumoniae que tiene Dist. de 0.05 pudo ser identificada inmediatamente como bacteria causante que es la más cercana a Dist. = 0 (Tabla 5. resultados de cálculo por el software de identificación). Además, la cuantificación fue posible.

Tabla 5 Además, del examen general de las bacterias, fue confirmado que Klebsiella pneumoniae fue detectada de la muestra de paciente, y que el resultado de identificación es igual que por el método común.

Observar aquí que siete valores Tm en la base de datos de la Klebsiella pneumoniae fueron 85.02, 84.48, 84.45, 84.29, 81.20, 81.84, y 81.14, respecti amente.

El método de identificación de este ejemplo se puede utilizar no sólo para la identificación de bacterias sino también para la identificación de hongos y otra especie de organismos. Además, es clínicamente útil examinar la presencia o ausencia de un gen resistente al agente antibiótico tal como mecA junto.

Aplicabilidad Industrial Un método de cuantificación y/o identificación de un organismo que se detectará de acuerdo con la presente invención es aplicable a las exámenes de agua de la vida diaria, exámenes de alimento, exámenes de septicemia, pruebas de sensibilidad a fármaco, y similares. Básicamente, el método es aplicable a cualquier otra muestra que deba ser estéril y se relacione con la infección. Por ejemplo, se piensa que los exámenes de fluido cerebroespinal, el fluido amniótico (infección intrauterina), y similares, tienen alta contribución social, y la rapidez de este sistema (los resultados son resueltos en el plazo de dos horas) es particularmente útil.

Además, la amplia gama de uso práctico es posible no sólo en los exámenes en el campo relacionado al humano, sino también en los exámenes en el campo veterinario, por ejemplo, infección de animales domésticos, o exámenes en un ambiente de experimento de organismo, por ejemplo, contaminación en soluciones de cultivo celular.

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES 1. Una preparación de polimerasa de ADN termoestable, en donde: (1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basado en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (2) no se detecta ningún producto de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo las condiciones que no contienen ningún molde utilizando los cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable. 2. Un método de producción para una preparación de polimerasa de ADN termoestable, que comprende los etapas de: (1) transformar las células eucariotas de transformación con un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable para proporcionar las células transformadas que expresan el gen de polimerasa de ADN termoestable; (2) cultivar las células transformadas; y (3) obtener un extracto que contiene la polimerasa de ADN termoestable de las células transformadas cultivadas, seguido por someter el extracto al tratamiento por calentamiento, o someter las células transformadas cultivadas al tratamiento por calentamiento, seguido de obtener un extracto que contiene la polimerasa de ADN termoestable de las células transformadas sometidas a un tratamiento por calentamiento. 3. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el tratamiento por calentamiento se realiza a una temperatura de 50°C o más. 4. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable usada para la transformación se deriva de una bacteria termofílica o hipertermofílica. 5. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable es ADN que consiste de la secuencia base de la SEC ID NO: 1. 6. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde las células eucariotas son cualquiera de hongos, células vegetales, células de insecto, y células animales. 7. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la preparación es aquella en donde: (1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de polimerasa de ADN, y (2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación de ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando los cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable. 8. Una preparación de polimerasa de ADN termoestable que comprende el extracto obtenido por el método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, o una preparación purificada de la misma. 9. Un método de detección para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores para amplificar un gen específico deseado para que el organismo objete sea detectado, y una preparación de polimerasa de ADN termoestable; y (2) una etapa de detección para detectar un producto de amplificación del gen deseado en los productos de amplificación en la etapa de amplificación, en donde la preparación de polimerasa de ADN termoestable es cualquiera de: (A) una preparación de polimerasa de ADN termoestable producida utilizando las células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando los cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable. 10. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la etapa de amplificación se realiza bajo supresión de amplificación de los genes no previstos distintos del gen deseado. 1?. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la supresión de amplificación de genes no previstos es realizada por un método Hot Start. 12. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 11, en donde un exceso de un anticuerpo anti-polimerasa de DNA se utiliza basado en 1 unidad de polimerasa de ADN termoestable. 13. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la etapa de detección se realiza bajo condiciones que permiten la detección del producto de amplificación del gen deseado mientras que no detecte los productos de amplificación de los genes no previstos distintos del gen deseado. 14. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las condiciones que permiten la detección del producto de amplificación del gen deseado mientras que no detectan los productos de amplificación de los genes no previstos distintos del gen deseado, son: (1) los cebadores se diseñan para que la temperatura de fusión (TmA) del producto de amplificación de gen previsto sea más alta que las temperaturas de fusión de los productos de amplificación de gen previsto; y (2) la detección del producto de amplificación es ajustada realizando la detección a una temperatura entre TmA y TmB y realizada utilizando un método que involucra detectar solamente el producto de amplificación del gen previsto. 15. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la etapa de amplificación y la etapa de detección son realizadas por PCR en tiempo real utilizando un dispositivo de exhibición para exhibir la cantidad del producto de amplificación y de los productos de amplificación de los genes no previstos, no se exhiben en el dispositivo de exhibición. 16. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en donde la detección del producto de amplificación se realiza utilizando un intercalador que tiene un marcador para la detección. 17. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la etapa de detección es realizada desarrollando productos de amplificación en un gel. 18. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en donde la preparación de la polimerasa de ADN termoestable es una preparación de la polimerasa de ADN termoestable producida utilizando las células eucariotas como anfitrión, las células eucariotas son cualquiera de hongos, células vegetales, células de insecto, y células animales. 19. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en donde el organismo objeto que se detectará es uno o dos o más seleccionados del grupo que consiste de una bacteria, hongo, y virus. 20. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el organismo objeto que se detectará es una bacteria y los cebadores son un conjunto de cebadores capaces de amplificar una pluralidad de regiones del gen ARNr 16S de todas las bacterias. 21. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, en donde el organismo objete que se detectará es una bacteria causante de la infección. 22. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 21, en donde la muestra es una muestra que debe estar en un ambiente estéril. 23. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 22, la muestra que debe estar en un ambiente estéril se selecciona del grupo que consiste de sangre, fluido cerebroespinal, fluido de placenta, urea, alimentos, bebidas, cosméticos, y muestras usadas para el examen de calidad del agua. 24. El método de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 23, en donde los productos de amplificación de ia etapa de amplificación se cuantifican en la etapa de detección y el organismo objeto que se detectará en la muestra se cuantifica de los resultados de cuantificación obtenidos. 25. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el producto de amplificación del gen previsto se cuantifica o digitaliza en la etapa de detección y el número de individuos del organismo objete que se detectará contenido en la muestra, es determinado a partir de los resultados. 26. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la digitalización de los productos de amplificación se realiza utilizando un método de determinación de la absorbancia o un método densitométrico. 27. El método de detección de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el gen deseado es un gen para identificar el organismo objeto que se detectará y el organismo objeto que se detectará contenido en la muestra se cuantifica/identifica a partir de los resultados del análisis del producto de amplificación del gen previsto. 28. Un método de cuantificación/identificación para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores, (B) y (M), para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará, y una preparación de polimerasa de ADN termoestable; (2) una primera etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de (3 a 10) productos de amplificación en la primera etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para los productos de amplificación del gen previsto para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra; (3) una segunda etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores, (F), para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará, y una preparación de polimerasa de ADN termoestabie producida utilizando una bacteria como un anfitrión; y (4) una segunda etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de (3 a 10) productos de amplificación en la segunda etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para los productos de amplificación del gen previsto para cuantificar los productos de amplificación en la primera etapa de cuantificación/identificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará y en la segunda etapa de amplificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra a partir de los resultados de cuantificación obtenidos; en donde los cebadores son (B), (F), y (M): (B) un conjunto de cebadores capaces de amplificar una pluralidad de regiones de los genes ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todas o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los cebadores, (F) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes ARNr 18S de todos los hongos y cebadores que contienen todas o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los cebadores, y (M) un conjunto de cebadores que amplifica específicamente un gen resistente al antibiótico que refleja una epidemia del momento tal como un gen mecA que exhibe resistencia a la meticilina; en donde la preparación de poiimerasa de ADN termoestable en la primera etapa de amplificación es cualquiera de: (A) una preparación de poiimerasa de ADN termoestable producida utilizando las células eucariotas como anfitrión; y (B) una preparación de poiimerasa de ADN termoestable, en donde: (B- 1 ) la poiimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la poiimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la poiimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando los cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la poiimerasa de ADN termoestable. 29. Un método de cuantificación/identificación para que un organismo objeto sea detectado en una muestra, que comprende: (1) una primera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores, (B), para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará, y una preparación de polimerasa de ADN termoestable; (2) una primera etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de (3 a 10) productos de amplificación en la primera etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para los productos de amplificación del gen previsto para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra; (3) una segunda etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores, (F), para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará, y una preparación de polimerasa de ADN termoestable producida utilizando una bacteria como anfitrión, (4) una segunda etapa de cuantificación/identificación para analizar una combinación de temperaturas de fusión (valores Tm) de una pluralidad de (3 a 10) productos de amplificación en la segunda etapa de amplificación basada en una combinación de temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para los productos de amplificación del gen deseado para cuantificar los productos de amplificación en la primera etapa de cuantificación/identificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará y la segunda etapa de amplificación para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra a partir de los resultados de cuantificación obtenidos; (5) una tercera etapa de amplificación para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores, ( ), para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará, y una preparación de polimerasa de ADN termoestable, y (6) una tercera etapa de cuantificación/identificación para analizar las temperaturas de fusión (valores Tm) de los productos de amplificación en la tercera etapa de amplificación basado en las temperaturas de fusión específicas (valores Tm) para los productos de amplificación del gen previsto para realizar la cuantificación/identificación del organismo objeto que se detectará en la muestra; en donde los cebadores son (B), (F), y (M): (B) un conjunto de cebadores capaces de amplificar una pluralidad de regiones de los genes ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todas o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los cebadores, (F) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes ARNr 18S de todos los hongos y cebadores que contienen todas o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los cebadores, y ( ) un conjunto de cebadores que amplifica específicamente un gen resistente al antibiótico que refleja una epidemia del momento tal como un gen mecA que exhibe resistencia a la meticilina; en donde la preparación de polimerasa de ADN termoestable en la primera etapa de amplificación es cualquiera de: (A) una preparación de polimerasa de ADN termoestable producida utilizando las células eucariotas como anfitrión; y (B) una preparación de polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de la polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando los cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable. 30. El método de cuantificación/identificación de acuerdo con . la reivindicación 28 ó 29, en donde las regiones de amplificación de los genes bacterianos ARNr 16S son 3 a 10 regiones. 31. El método de cuantificación/identificación de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29, en donde las regiones de amplificación de los genes fúngicos ARNr 18S son 3 a 10 regiones. 32. El método de cuantificación/identificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, que adicionalmente comprende la etapa de corregir los errores de medición de los valores Tm de los productos de amplificación usando una concentración constante de ADN de una cepa estándar de Escherichia coll como molde para que un control estándar mida un valor Tm estándar cada vez que utilice un conjunto de cebador capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes ARNr 16S de todas las bacterias y un conjunto de cebadores que contiene todo o parte de cada una de las secuencias base de los cebadores. 33. El método de cuantificación/identificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en donde la combinación de las temperaturas de fusión (TmM1 a TmMN: N = 3 a 10) de los productos de amplificación basados en las regiones de amplificación, se analiza en base a la combinación de las temperaturas de fusión (Tms1 a TmSn: n = 3 a 10) específicas para el organismo objeto que se detectará para cuantificar/identifica el organismo objeto que se detectará. 34. El método de cuantificación/identificación de acuerdo con la reivindicación 33, que adicionalmente comprende la etapa de minimizar la influencia de los errores de medición identificando el organismo objeto que se detectará utilizando no sólo las combinaciones del valor Tm sino también las combinaciones de las diferencias entre los valores Tm para un algoritmo para identificar el organismo. 35. Un conjunto para cuantificar e identificar un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra, que comprende las preparaciones de polimerasa de ADN termoestable para amplificar el ácido nucleico preparado de la muestra y los cebadores para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará; en donde las preparaciones de polimerasa de ADN termoestable son: (A) una preparación de polimerasa de ADN termoestable producida utilizando las células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de polimerasa de ADN termoestable, en donde: ( B - 1 ) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando los cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica ia polimerasa de ADN termoestable. 36. Un conjunto para cuantificar y/o identificar un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra, que comprende: cualquiera de (A) una preparación de polimerasa de ADN termoestable producida utilizando las células eucariotas como un anfitrión; y (B) una preparación de polimerasa de ADN termoestable, en donde: (B-1) la polimerasa de ADN termoestable tiene contaminación con 10 fg o menos de ácido nucleico derivado bacterialmente distinto de un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable basada en 1 unidad de polimerasa de ADN, y (B-2) no se detecta ninguno de los productos de amplificación del ácido nucleico derivado bacterialmente incluso cuando 32 ciclos o más de la reacción de amplificación de gen se realizan en la preparación bajo condiciones que no contienen ningún molde utilizando los cebadores capaces de amplificar solamente el ácido nucleico derivado bacterialmente distinto del gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable, para amplificar el ácido nucleico preparado de la muestra, una preparación de polimerasa de ADN termoestable para amplificar el ácido nucleico preparado de la muestra, producida utilizando las células bacterianas como anfitrión; y cebadores para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará. 37. El sistema de acuerdo con la reivindicación 36, en donde los cebadores son los siguientes cebadores (B), (F) y (M): (B) un conjunto de cebadores capaces de amplificar una pluralidad de regiones de los genes ARNr 16S de todas las bacterias y cebadores que contienen todas o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los cebadores, (F) un conjunto de cebadores capaz de amplificar una pluralidad de regiones de los genes ARNr 18S de todos los hongos y cebadores que contienen todas o 1/3 o más de cada una de las secuencias base de los cebadores, y (M) un conjunto de cebadores que amplifica específicamente un gen resistente al antibiótico que refleja una epidemia del momento tal como un gen mecA que exhibe resistencia a la meticilina. 38. Un sistema para cuantificar e identificar un organismo objeto que se detectará contenido en una muestra, que comprende: (1) un amplificador para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico utilizando el ácido nucleico preparado de la muestra, cebadores para amplificar un gen específico previsto para el organismo objeto que se detectará, y una polimerasa de ADN termoestable, (2) un dispositivo de cuantificación para cuantificar un producto amplificado en la etapa de amplificación, (3) una computadora para calcular la cantidad del organismo objeto que se detectará en la muestra a partir del resultado de cuantificación del producto de amplificación del gen previsto, y (4) una base de datos para calcular la cantidad del organismo objeto que se detectará en la muestra a partir del resultado de cuantificación del producto de amplificación del gen deseado, en donde el sistema es para realizar el método de detección o método de cuantificación/identificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 34.