CN114686599A

CN114686599A - 宿主昆虫细胞dna残留含量定量检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN114686599A
Application number: CN202011644677.0A
Authority: CN
Inventors: 余双庆; 牛苗; 戴阳光; 董哲岳; 李秀; 董小岩; 吴小兵
Original assignee: Beijing Wujiahe Gene Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Wujiahe Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-07-01

Abstract

本发明提供了一种定量检测宿主细胞DNA残留量的引物、探针序列，及检测方法。该方法可应用于rAAV载体制品成品中，检测Sf9细胞DNA残余含量，也可应用于其他生物制品中Sf9或其他宿主细胞基因组DNA残留量检测。此外，本发明也可应用于其他SF9细胞表达的重组蛋白制品中宿主细胞残余DNA的检测。

Description

宿主昆虫细胞DNA残留含量定量检测方法及试剂盒

技术领域：

本发明涉及生物制品质量控制中残留杂质检测领域，具体涉及一种定量检测在昆虫细胞中生产的生物制品(例如rAAV载体制品或蛋白制品)中宿主昆虫细胞的DNA残留含量的检测方法和相应引物及探针、试剂盒，及其在生物制品质量控制中的应用。

背景技术：

重组生物制品不可避免地被来自用于制备该蛋白的细胞的基因组DNA污染。近年来，生物制品的治疗用途得到了较快的发展，基因治疗相关的载体也受到广泛关注。例如，与其他病毒载体相比，由AAV(腺相关病毒，adeno-associated virus)改造而来的重组AAV(rAAV)载体以其低致病性，低免疫原性，宿主范围广泛且稳定表达等独特优势脱颖而出，成为最有前景的病毒载体，并广泛应用于临床研究。目前，在rAAV载体的生产方式中，杆状病毒昆虫表达系统由于具有生物安全性好，感染效率高，生产工艺便于放大等优点，得到了广泛的应用。该系统利用杆状病毒携带AAV包装所需的顺式和反式作用元件，通过感染昆虫细胞Sf9(Spodoptera frugiperda cell，草地贪夜蛾细胞)，在其中生产rAAV载体。Sf9细胞作为宿主细胞，尽管经过一系列纯化后，其基因组得到极大程度的去除，但rAAV载体制品中仍不可避免的含有少量宿主细胞DNA残余。

由于连续传代细胞(continuous cell lines，CCLs)调控生长的基因失调，使得传代细胞系具有无限的寿命。因此，理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致瘤活性的潜在能力，需要对其DNA残留量进行质量控制。一直以来，各国药品监管部门对DNA杂质的限量要求非常严格。2020年FDA发布的Chemistry,Manufacturing,andControl(CMC)Information for Human Gene Therapy Investigational New DrugApplications(INDs)产业指南中建议，连续非致瘤细胞的DNA残留量限制为小于10ng/剂量，并将大小限制为约200bp以下。此外，FDA还建议用于残留DNA的检测方法对至少10pg/剂量敏感。因此，开发准确、灵敏的Sf9细胞DNA残留量检测方法，对于基因治疗药物的质量控制至关重要。

在rAAV载体制品中，核酸成分较复杂，主要包括rAAV载体DNA、目的基因片段和杆状病毒DNA等，其中外源宿主基因组DNA种类繁多、片段大小不一，而相对含量又很低、属于微量杂质，因此对其进行灵敏、快速、特异、准确的检测是一项困难的工作。《中国药典》(三部)2010版附录IXB“外源性DNA残留量测定法”收录了2种方法—“DNA探针杂交法”和“荧光染色法”。DNA杂交法需要的条件相对简单，但该方法存在耗时长，操作繁琐，稳定性、敏感性、特异性较差的缺点。荧光染色法是利用PicoGreen这种高灵敏度的双链DNA荧光染料对DNA含量进行定量测定。该方法经中检院检验，灵敏度达300pg/mL，DNA含量在1.25～80ng/mL范围内线性良好(R²≥0.99)。该方法缺点为容易受到RNA、ssDNA、dsDNA的干扰，对于含有大量核酸的病毒载体类制品，不适用；对于大剂量的产品，灵敏度难以达到检测需求。

此外，实时定量PCR技术也具有检测微量杂质所需的灵敏度。例如，现有技术WO2012028740A1通过实时定量PCR方法检测残留宿主细胞DNA，其以18SrRNA基因作为qPCR的靶向序列，检测和定量来自用于生产重组蛋白的真核宿主细胞的残留基因组DNA，定量范围为低皮克级至高飞克级。该方法适用于多种真核生物宿主细胞残余基因组DNA含量检测，其中包括Sf9细胞。US9512475B2也公开了一种类似的方法，以ALU序列作为靶序列。上述方法的不足之处是，方法仅证明适用于重组蛋白制品的检测，而rAAV载体制品与蛋白制品有很大不同。重组蛋白制品中，主要制品成分为蛋白，核酸成分含量小且均来源于宿主细胞和杆状病毒，无其他核酸成分干扰。而以杆状病毒昆虫细胞生产系统生产的rAAV载体制品中，主要制品成分为由衣壳蛋白及核酸组成的病毒颗粒。此外还有病毒包装与纯化过程中引入的宿主细胞蛋白及DNA、辅助杆状病毒蛋白及DNA、以及血清和氯化铯等组分。相比之下，rAAV载体制品核酸成分较复杂，除宿主细胞Sf9基因组外，还有AAV载体基因组、杆状病毒基因组的干扰。除此之外，不同rAAV载体制品中还包含用于基因治疗的不同的目的基因。现有方法的引物探针序列与多种干扰核酸成分可能存在非特异结合影响检测结果的准确性。同时，尽管详细的实时定量PCR方法可能不同，但均需要在分析之前纯化DNA。

因此急需开发一种高灵敏度、高特异性的针对rAAV载体制品宿主细胞DNA残留量的检测方法。这样的方法对于病毒载体制品的质量控制、工艺方法的优化具有重要意义。

发明概述

本发明提供了一种对rAAV载体制品中Sf9宿主昆虫细胞DNA残留量进行定量检测的方法，及相应试剂盒，其原理为：提取待测rAAV载体制品中的总DNA，以特异性靶向18SrRNA基因的引物及Taqman探针进行实时定量PCR，并用Sf9细胞基因组DNA作为标准品绘制标准曲线，从而检测和定量rAAV载体制品中Sf9细胞DNA残余含量。在一个方面，本发明还提供了所述的方法，并且其适合于以低成本、少耗时地进行高通量的操作。

在本发明的一个实施方案中，已经设计了至少一组Sf9细胞基因组DNA特异性引物。并已经证明这种新引物组能够从Sf9细胞基因组DNA，而不从AAV的DNA、杆状病毒的DNA或载体中目的基因DNA扩增DNA片段，因而具有宿主细胞残余基因组DNA特异性。上述特异性带来的有利结果是，消除了样品提取DNA纯化步骤的需求，并且允许检测步骤中的实时定量PCR对Sf9细胞基因组DNA进行高效的检测和定量。在另一个实施方案中，本发明的引物组能够从一种不同于Sf9细胞的宿主细胞的基因组DNA模板中扩增出靶序列，由于该细胞具有与Sf9细胞相同或高度相似的18S核糖体基因序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了包括特异性正向引物和特异性反向引物的引物对，所述正向引物在其3’最末端包含与Sf9细胞18S rRNA基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸相同的序列，所述反向引物在其3’最末端包含与Sf9细胞18S rRNA基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸反向互补的序列。在另一个实施方案中，所述正向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18个核苷酸；所述反向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18或22个核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，使用本发明的引物通过实时定量PCR，从样品中扩增出来自残留Sf9细胞基因组DNA的靶片段。在另一个实施方案中，所述靶片段的长度为小于150bp。在一个最优选的实施方案中，所述靶片段的长度为70bp。在一个实施方案中，由于样品中不存在模板，因此相应地，扩增产物中不存在靶片段。

本发明的另一个实施方案至少提供了一种用于检测提取的DNA或实时定量PCR测定法的提取物或扩增产物的探针，其中探针的长度是16至35个核苷酸、优选地18至22个核苷酸、最优选地22个核苷酸。在一个优选的实施方案中，探针带有荧光报告基团和/或荧光淬灭基团。在一个更优选的实施方案中，荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是TAMRA。

本发明涉及包含引物对和探针的组合，其中引物对和探针具有如上文所述的含义和重要性。

在一个实施方案中，本发明提供了通过PCR检测Sf9细胞基因组的方法，所述方法包括使用样品中残留的Sf9细胞基因组DNA作为模板、使用反向引物和正向引物的引物对。在一个实施方案中，所述方法使用包含引物对和探针的组合。其中引物对(包括正向引物和反向引物)和探针具有如上文所述的意思。在一个实施方案中，所述PCR是实时定量PCR。在一个实施方案中，样品是rAAV载体制品。在另一个实施方案中，样品是重组蛋白制品。在一个实施方案中，样品中不含有任何残留的Sf9细胞基因组DNA，因而没有Sf9细胞基因组DNA被检出。

在一个实施方案中，本发明提供了一种评价rAAV载体制品质量的方法，其中所述方法能够检测任何残留的Sf9细胞基因组DNA，如果其存在的话。

在一个实施方案中，本发明提供了组合物，以及组合物在用于评价rAAV载体制品质量中的用途，其中，组合物由正向引物和反向引物的引物对，和/或探针组成，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文所述的意思。

在一个实施方案中，本发明提供了正向引物和反向引物的引物对，和/或探针在制备检测剂中的用途，所述检测剂用于评价rAAV载体制品质量，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文所述的意思。

本发明涉及Sf9细胞基因组DNA作为检测标准品的用途，所述用途包括但不限于，在检测完成后，将其相关结果作为定量对照而用于制作适于定量的标准曲线。其中，Sf9细胞基因组DNA优选地是通过使用试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)对Sf9细胞进行基因组DNA抽提和纯化而制备获得。更优选地，上述步骤制得的Sf9细胞基因组DNA进一步由琼脂糖凝胶电泳法进行纯度分析和紫外分光光度计定量，并进行分装，以便于多次使用。

在一个实施方案中，本发明提供了用于评价rAAV载体制品质量的试剂盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物组成的引物对，或探针，或其组合，其中反向引物、引物对和组合具有如上文所述的意思。在一个优选的实施方案中，试剂盒进一步包含多种实时定量PCR所使用的通用常规试剂。在一个优选的实施方案中，试剂盒进一步包含定量对照标准品。

附图说明

图1显示了对梯度稀释的添加或不添加干扰质粒DNA的Sf9基因组DNA进行qPCR扩增检测后，对结果(CT值)线性拟合获得的标准曲线。横轴为模板浓度的以10为底的对数，纵轴为CT平均值。系列1(实心圆点)：代表Sf9基因组DNA，曲线为y＝-3.43x+26.765，R²＝0.9959；系列2(空心圆点)：代表Sf9基因组DNA+Bacmid1质粒+Bacmid2质粒，曲线为y＝-3.4689x+26.358，R²＝0.997。

图2显示了梯度稀释的Sf9细胞基因组DNA标准品的扩增曲线图。图中曲线A-G分别代表按照以下的浓度梯度的组：312.5ng/ml、62.5ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.02ng/ml，并分别标记为SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7。H为阴性对照。

图3显示了Sf9细胞基因组DNA标准品标准曲线，Y＝-3.457x+26.764，R²＝1，Eff％＝94.664％。横轴为浓度(ng/ml)，纵轴为CT平均值。

发明详述

术语和定义

除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明相关领域的技术人员通常理解的相同意义。尽管基本上与本文所述的那些方法和材料相似的任意方法和材料可以用于本发明的实施或检测，然而仅描述示例性的方法和材料。为了本发明的目的，下文定义以下术语。

除非上下文另外清楚地指明，否则术语“核苷酸”应当在本文中理解为除了指天然存在的核糖核苷酸单体或脱氧核糖核苷酸单体之外，还指相对于正在使用的核苷酸的特定上下文(例如，杂交至互补碱基)，在功能上等同的其相关的结构变体，包括衍生物和类似物。

在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，术语“同一性”指相同的两个或更多个序列或子序列。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用本领域通用的序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量，各序列具有指定百分数的相同核苷酸(例如，在指定区域范围内至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性)，则它们是彼此“基本上同一的”。这些定义同样包含了被比对序列的反向互补序列。

如本文所用的术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种仅在细胞中生成的单链DNA细小病毒，其中某些功能由共感染辅助病毒提供。AAV的基本信息和综述可以在病毒学领域的教科书中容易地找到。

如本文所用的术语“AAV载体”是指包括一种或多种外源性目的基因序列的载体，在本文中可以被称为重组AAV(rAAV)载体。当其存在于已被对rep和cap基因产物进行编码和表达的载体转染了的宿主细胞中时，这种AAV载体可以被复制并包装成传染性病毒颗粒。通常，AAV载体用于递送所述外源性目的基因的用途。

如本文所用的术语“PCR”指聚合酶链反应。

术语“实时定量PCR”通常指称作实时定量聚合酶链反应、定量聚合酶链反应或动力学聚合酶链反应的PCR技术，在本领域还经常被称作“荧光定量PCR”、“Real-time PCR”、“quantitative PCR”或“qPCR”等等。这项技术利用PCR同时地扩增并定量地测量靶核酸，大多数时候借助嵌入性荧光染料、或序列特异性探针定量，其中所述序列特异性探针含有仅与靶核酸杂交时才可检出的荧光报道分子。

术语“定量”在本文中可以指绝对定量，即准确或基本准确地测得待测物质的质量或质量浓度；也可以指相对定量，即相对于某项对照物质的质量或浓度的倍数或百分比；还可以指半定量，即虽然无法精确地或基本精确地测得待测物质的质量或质量浓度，但可以在一定程度上测得其大概的数字范围或变化趋势。在本文所述理想的实验条件下，本发明的试剂、方法和试剂盒能够获得绝对定量的结果。

如本文所用的术语“引物”指能够在qPCR反应中充当DNA复制反应起始子的寡核苷酸DNA。

如本文所用的术语“探针”指具有荧光报告基团和/或荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述荧光基团能够改变荧光强度，其中荧光强度的变化与反应中存在的与探针互补的DNA水平增加相关。能够用于实时定量PCR的探针有多种结构类型，例如taqman探针、分子信标和蝎形探针等等。出于本发明的目的，可以使用任意类型的探针。在本文所述理想的实验条件下，本发明优选使用taqman探针。Taqman探针在序列上与扩增产物反向互补杂交，并在与靶分子杂交后被PCR中所用taq酶的5’-3’的外切活性水解，3’端荧光淬灭基团被切割下来，引起荧光共振能量转移(FRET)作用消失，荧光报告基团在入射光的激发下发射出特定波长的荧光，从而被检测到。

术语“FAM”指作为荧光染料的6-荧光素氨基磷酸酯，产品的光谱学相关参数为Ex＝494nm/Em＝522nm，其荧光能够被荧光淬灭基团例如TAMRA在接近时淬灭。

术语“TAMRA”指作为染料的5-羧基-四甲基罗丹明N-琥珀酰亚胺酯。当其接近荧光分子例如FAM时，能够作为荧光淬灭基团使得后者的荧光不能被检测到。

术语“常规”指基于本领域充分认可的已出版参考文献的实验方法和材料。

术语“18s rRNA基因”指编码真核生物细胞中核糖体小亚基(18S rRNA)的基因，是真核生物体内含量最多的核糖体DNA，其序列在真核生物中高度保守，且属于中度重复序列，拷贝数较高，在真核基因组中重复数十至数万(<10⁵)次的重复顺序。通过针对18s rRNA基因的至关重要位置精心设计qPCR引物，可能在qPCR过程中产生特定大小的扩增产物，这种引物对提供了足够的特异性和选择性，从而无需使用纯化的DNA制备物作为qPCR分析的样品。

本发明提供了通过实时定量PCR从样品裂解物中对Sf9宿主细胞DNA残留量进行定量检测的方法，及其评价对rAAV载体制品的质量中的用途。

在本发明的一个实施方案中，提供了包括特异性正向引物和特异性反向引物的引物对，所述正向引物在其3’最末端包含与Sf9细胞18S rRNA基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸相同的序列，所述反向引物在其3’最末端包含与Sf9细胞18S rRNA基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸反向互补的序列。

在另一个实施方案中，所述正向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18个核苷酸；所述反向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18或22个核苷酸。

在一个特定的实施方案中，本发明的正向引物与以下任一条序列表示的寡核苷酸分子具有相同的3’末端起向5’方向至少15个连续的核苷酸：

5’-ACGTCCCTGCCCTTTGTA-3’(SEQ ID NO:1)；

5’-ATAAGCTCGCGTTGATTA-3’(SEQ ID NO:4)；

5’-ACTACCGATTGAATGATT-3’(SEQ ID NO:7)。

在一个特定的实施方案中，本发明的反向引物与以下任一条序列表示的寡核苷酸分子具有相同的3’末端起向5’方向至少15个连续的核苷酸：

5’-GGTCCGAAGACCTCACTAAATC-3’(SEQ ID NO:2)；

5’-TAAATCATTCAATCGGTA-3’(SEQ ID NO:5)；

5’-TGAACGTCGGAAGAGCGC-3’(SEQ ID NO:8)。

在一个特定的实施方案中，本发明的探针与以下任一条序列表示的寡核苷酸分子具有至少80％的同一性，并且5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团：

5’-ACACCGCCCGTCGCTACTACCG-3’(SEQ ID NO:3)；

5’-CGTCCCTGCCCTTTGTACACAC-3’(SEQ ID NO:6)；

5’-AGTGAGGTCTTCGGACCGGTGC-3’(SEQ ID NO:9)。

本发明的另一个实施方案是一种检测样品中残留昆虫宿主细胞DNA残留量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获取样品，提取总DNA，并使用前述的引物对和探针组合进行实时定量PCR检测。

在一个具体的实施方案中，在实时定量PCR时对样品和标准品进行分组。在另一个更具体的实施方案中，分组设置为：(1)标准品为Sf9细胞DNA，使用时用DNA稀释液将标准品稀释成7个浓度梯度，分别为312.5ng/mL、62.5ng/mL、12.5ng/mL、2.5ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.02ng/mL的标准曲线浓度梯度。(2)样品DNA模板。(3)阴性对照。在一个更具体的实施方案中，阴性对照为DNA稀释液，所述的DNA稀释液为RNase-Free Water中加入终浓度为0.01％-0.1％F68(Pluronic F68)，该DNA稀释液能高效稀释低浓度的DNA样品，而且尽可能减少了液体挂壁的现象，适用于PCR的扩增。

在一个具体的实施方案中，实时定量PCR方法反应体系包括2×Q-PCR反应预混液、引物对、Taqman探针和DNA模板。所述2×Q-PCR反应预混液包括Taq酶、dNTPs、Mg²⁺及PCR缓冲液，均为常见组分，其含量亦为常规。反应体系为20uL。所述的DNA模板可以来自待测样品、标准品和阴性对照。

在一个具体的实施方案中，实时定量PCR反应程序为：50℃保温2min后95℃预变性10min；95℃15s，60℃60s，40个循环。

在一个具体的实施方案中，实时定量PCR完成后，根据标准品DNA浓度与检测获得Ct值结果，拟合标准曲线，进而通过标准曲线计算得到待测样本中Sf9细胞DNA的量。

在本发明的一个实施方案中，所述检测样本为昆虫杆状病毒表达系统生产的rAAV载体制品。在本发明的另一个实施方案中，所述检测样本为宿主细胞DNA含量较高的上游工艺样品以及纯化工艺之后的微量宿主细胞残留的各中间过程样品。

在本发明的另一个实施方案中，所述检测样本利用昆虫细胞生产的重组蛋白制品。优选地，所述昆虫细胞是Sf9细胞。

在本发明的一些实施方案中，提供了试剂盒，其包含本发明的方法所使用的除了待测样本之外的全部或部分试剂，包括引物和/或探针。在另一些实施方案中，试剂盒用于评价rAAV载体制品质量。

在本发明的一个尤其具体的实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含：PCR扩增反应液、标准品、阴性对照以及DNA稀释液。所述PCR扩增反应液包括Taq酶、dNTPs、Mg²⁺、PCR缓冲液、引物对及Taqman探针；所述的标准品为Sf9细胞DNA，浓度为10-50ng/μL，使用时，用DNA稀释液将标准品稀释成7个浓度梯度，分别为312.5ng/mL、62.5ng/mL、12.5ng/mL、2.5ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.02ng/mL的标准曲线浓度梯度。所述阴性对照为DNA稀释液；所述的DNA稀释液为RNase-Free Water中加入F68(Pluronic F68)，使F68终浓度为0.05％；所述的引物对由正向引物和反向引物组成，所述正向引物与序列SEQ ID NO:1、4或7表示的寡核苷酸分子具有相同的3’末端起向5’方向至少15个连续的核苷酸，优选地，其序列为SEQ ID NO:1、4或7；所述反向引物与序列SEQ ID NO:2、5或8表示的寡核苷酸分子具有相同的3’末端起向5’方向至少15个连续的核苷酸，优选地，其序列为SEQ ID NO:2、5或8；所述的探针与序列SEQ ID NO:3、6或9表示的寡核苷酸分子具有至少80％的序列同一性，优选地，其序列为SEQ ID NO:3、6或9；并且探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，优选地，荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是TAMRA。

在另一个实施方案中，所述试剂盒用于评价重组生物制品的质量。优选地，该重组生物制品是rAAV载体。在另一个实施方案中，该重组生物制品是重组蛋白制品。

本发明的另一个实施方案是一种评价重组生物制品质量的方法，其中所述方法能够检测任何残留的昆虫宿主细胞例如Sf9细胞基因组DNA存在与否及其含量，所述方法包括使用具有如上文定义的意思的方法。

本发明的另一个实施方案是组合物，以及组合物在用于评价生物制品例如rAAV载体制品质量中的用途，其中，组合物由正向引物和反向引物的引物对，和/或探针组成，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文定义的意思。

本发明的另一个实施方案是正向引物和反向引物的引物对，和/或探针在制备检测剂中的用途，所述检测剂用于评价生物制品例如rAAV载体制品质量，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文定义的意思。

在本发明的一些实施方案中，本发明的方法的定量检测限为0.1pg(0.02ng/ml，对应于一个典型的样品在反应体系中的加入量5μL)。

如同上文中一些内容所述的，在本发明的一些实施方案中，重组蛋白产物制品或其他病毒制品作为待测样本用于上述宿主细胞残余DNA检测/定量方法和质量评价方法中。

在本发明的一些实施方案中，样品前处理方法为蛋白酶K法、CTAB法、SDS裂解法、试剂盒(磁珠)法和碱裂解法等常规的DNA提取方法，本文所述的这些方法具有与本领域技术人员所常规使用的相同的含义、适用情形和效果，其具体步骤可参见例如本领域常用的那些教科书，诸如J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社；李钧敏著，《分子生物学实验》，浙江大学出版社，第一版，等。在一些具体的实施方案中，本发明的方法选择例如SDS裂解法，因其人工操作简单、耗时短、试剂成本低，更适合于进行高通量操作。

在本发明的一些实施方案中，生物制品中的待测宿主细胞残余DNA不来自Sf9细胞，甚至不来自昆虫细胞，然而由于其具有完全相同的18S核糖体基因上的扩增目的区段，因此也能够被本发明的引物对/探针组合所扩增和检测，因此也适用于本发明的方法。

以下通过一些说明性但非限制性的实施例来具体解释本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解的是，一些未记载在以下实施例中但属于常规或简单或等同替代方式也落入本发明的保护范围。

实施例

实施例1材料与方法

本发明所用的寡核苷酸分子引物及探针均合成自北京擎科新业生物技术有限公司，

Universal Master Mix II，with UNG，2×(目录号：4440038)购自美国赛默飞世尔科技有限公司，RNase-Free Water(目录号：RP2501)购自北京百泰克生物技术有限公司，宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(目录号：SK030203D100)购自湖州申科生物技术有限公司，DNeasy Blood&Tissue Kit(目录号：69506)购自德国凯杰公司。7500Fast实时荧光定量PCR仪来自美国ABI公司。Sf9细胞株来源于美国威洛克公司。

实施例2对照标准品的制备

使用QIAGEN公司提供的DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒抽提纯化获得Sf9细胞基因组DNA，并对获得的基因组DNA进行标定，作为本方法Sf9基因组DNA标准品。DNA抽提过程参照试剂盒说明书，取生长状态良好的Sf9细胞，用蛋白水解酶消化蛋白，之后导入DNeasy微型离心柱，低盐洗去杂质，高盐洗脱目的基因组DNA。利用紫外分光光度计测定DNA溶液260nm与280nm处吸收值，二者比值可知DNA纯度(OD260/OD280＝1.8～2.0)。结果如表1所示，两名实验员分别进行3次测定，获得6次测定结果，6次检测DNA纯度均合格，将6次测定DNA浓度取平均值，作为标准品DNA浓度即62.33ng/μl。

表1 Sf9细胞提取基因组DNA浓度标定

实施例3样品总DNA提取(样品前处理)

将同一份rAAV制品平均分成6份，分别用以下两种方式平行处理3次：方式一，参照试剂盒说明书，使用试剂盒(磁珠)法提取rAAV样品中DNA；方式二：使用0.2％-10％SDS直接裂解处理rAAV样品。结果如表2所示。

表2 SDS裂解法与试剂盒(磁珠)法提取DNA浓度

进一步将三质粒系统生产的rAAV载体等体积与Sf9细胞DNA标准品混合，使Sf9细胞DNA标准品终浓度为625ng/ml，再分别用SDS裂解法和试剂盒(磁珠)法处理后检测Sf9细胞DNA残余，计算回收率。结果如表3所示，SDS裂解法回收率较好且稳定，三次重复结果稳定在80％-120％。磁珠法回收率高至306.34％，低至33.27％。但SDS裂解法的耗时更少，试剂成本也明显更低，可能更适宜于高通量操作。

表3 SDS裂解法与试剂盒(磁珠)法样品前处理后Sf9基因组DNA回收率检测

实施例4引物探针的靶基因选择和序列筛选

为了获得非常适用于本发明的方法、能够获得理想的检测和定量效果的引物和探针序列，本实施例以不同靶基因，及相同靶基因不同位点设计一系列引物及探针。表4中提供了其中一部分的序列信息。Taqman探针的5’端标记有FAM荧光报告基因，3’端标记有TAMRA淬灭基团。其中第1组为以PCNA为靶基因经计算机筛选出评分较好的引物、探针组合；第2-4组为以18s rRNA为靶基因，经过前期大量的计算机筛选、经验判断和初步验证后，选择的评分和效果俱佳的引物探针组合；第5组为现有技术WO2012028740A1在其实时定量PCR方法中使用的引物探针组合。

表4设计引物及探针序列

使用表4中引物及探针序列进行qPCR反应。将Sf9细胞基因组DNA标准品用DNA稀释液稀释为终浓度312.5ng/ml、62.5ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.02ng/ml，作为反应模板。qPCR结果如表5所示。

表5各组引物及探针序列qPCR标准曲线CT平均值

经表5可见，以18s rRNA为靶基因的4对引物及探针序列中，第2、3、4组标曲R²值及扩增效率较第5组好，灵敏度相当；而以PCNA为靶基因的引物及探针序列获得的标准曲线检测限相较其他组引物对较高，且R²值及扩增效率相较第2、3、4组较差。因此，第2、4组的各条特异性引物探针序列与模板的特异性结合的效果最好，在实时荧光定量PCR中扩增效果最佳，可以很好地满足检测需求；第3组略次之，但仍然明显优于第5组。而第1组特异性引物探针组合的各方面表现都最差，不建议使用。

以第2组引物及探针组合，即具有以下序列的寡核苷酸分子为例，对本方法进行说明性而非限制性的验证(实施例5)：

正向引物：5’-ACGTCCCTGCCCTTTGTA-3’；(SEQ ID NO:1)

反向引物：5’-GGTCCGAAGACCTCACTAAATC-3’；(SEQ ID NO:2)

探针：5’-FAM-ACACCGCCCGTCGCTACTACCG-TAMRA-3’(SEQ ID NO:3)

实施例5方法学验证

5.1特异性

在杆状病毒生产系统生产的rAAV制品中除Sf9基因组DNA外，还包含AAV的rep、cap基因、目的基因、和杆状病毒基因组DNA。因此为了验证引物和探针特异性，在Sf9细胞基因组中，同时加入实验室自行制备的包含AAV基因rep、cap和辅助杆状病毒基因组的Bacmid1质粒、包含目的基因和辅助杆状病毒基因组的Bacmid2质粒(Bacmid1和Bacmid2质粒的详情和具体制备方法可参见如公开号为CN111088284的中国专利所述内容)，加入量为1×10⁵copies/ml，进行PCR扩增。结果如表6、图1所示，添加其他DNA的与未添加其他DNA扩增标准曲线一致，说明引物与探针不会与其他DNA组分产生非特异扩增，具有高度特异性，专属性较好。

表6专属性qPCR检测CT平均值

5.2重复性

将rAAV样品用RNase-Free Water稀释成高、中、低三个浓度的样品，重复检测高、中、低浓度的rAAV样品三次，计算所得9个数据的偏差(CV％)，结果如表7所示，CV％＝4.25％，该方法检测rAAV样品中Sf9基因组DNA残余重复性好。

表7重复性检测

5.3灵敏度及定量限

为验证本方法的灵敏度及定量限，将Sf9细胞DNA标准品用DNA稀释液稀释为系列浓度梯度：312.5ng/ml、62.5ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.02ng/ml，并分别标记为SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7。扩增曲线如图2所示，扩增曲线有明显指数增长期，且各个梯度浓度的扩增曲线间隔均一，说明本方法对以上浓度梯度的模板检测效果良好。绘制标准曲线如图3所示，R²>0.99且90<Eff％<110。另一组重复3次的结果见表8。可见Sf9细胞基因组DNA在100fg～1562.5pg之间呈良好线性关系，即CT值与DNA模板量的1g值呈良好的线性关系，而该方法定量限为0.02ng/ml，即在样本中能够检出0.1pg的残留Sf9细胞基因组DNA。相比之下，现有技术WO2012028740A1的方法的检测下限为0.2pg.

表8 Sf9细胞基因组DNA标准品扩线性拟合标准曲线

由上述结果可知，本发明的方法相比于现有技术取得全面显著改进。为了尽可能检测到较小的残留DNA片段，提高灵敏度，本发明设置了更小的扩增靶区段长度。尽管这一长度(70bp)已经达到了qPCR反应中常规实践的下限，甚至小于现有技术WO2012028740A1中的188bp的一半，但是通过对灵敏度和特异性更好的引物探针的选择，弥补了小产物可能带来的缺点，保证了扩增和检测效果，即灵敏性和定量的准确性。并且，结果还显示出，本发明获得了更好的可重复性，即检测的可靠性，说明样品前处理方法的改进具有重要意义。

实施例6 Sf9宿主细胞DNA残余检测试剂盒制备

将本发明的方法中所用的组分制备成试剂盒的形式，即能够针对不同的模板进行快速、便捷的检测反应。

例如，制备包含以下组分的试剂盒I：

DNA稀释液(1ml/管)×5，

Q-PCR预混液(1ml/管，2×)×1，

Sf9细胞基因组DNA标准品(31.25ng/μL),

引物及探针(10μM)：

正向引物序列：5’-ACGTCCCTGCCCTTTGTA-3’；(SEQ IDNO:1)

反向引物序列：5’-GGTCCGAAGACCTCACTAAATC-3’；(SEQID NO:2)

Taqman探针序列：5’-FAM-ACACCGCCCGTCGCTACTACCG-TAMRA-3’(SEQ ID NO:3)

例如，制备包含以下组分的试剂盒II：

DNA稀释液(1ml/管)×5，

Q-PCR预混液(1ml/管，2×)×1，

Sf9细胞基因组DNA标准品(31.25ng/μL),

引物及探针(10μM)：

正向引物序列：5’-ATAAGCTCGCGTTGATTA-3’(SEQ ID NO:4)

反向引物序列：5’-TAAATCATTCAATCGGTA-3’(SEQ ID NO:5)

Taqman探针序列：5’-FAM-CGTCCCTGCCCTTTGTACACAC-

TAMRA-3’(SEQ ID NO:6)

例如，制备包含以下组分的试剂盒III：

DNA稀释液(1ml/管)×5，

Q-PCR预混液(1ml/管，2×)×1，

Sf9细胞基因组DNA标准品(31.25ng/μL),

引物及探针(10μM)：

正向引物序列：5’-ACTACCGATTGAATGATT-3’(SEQ ID NO:7)

反向引物序列：5’-TGAACGTCGGAAGAGCGC-3’(SEQ ID NO:8)

Taqman探针序列：5’-FAM-AGTGAGGTCTTCGGACCGGTGC-TAMRA-3’(SEQ ID NO:9)

实施例7 rAAV载体制品中间过程样、成品、半成品检测

材料和试剂：实施例6中的Sf9宿主细胞DNA残余检测试剂盒I

待检样品：(1)收获液样品，稀释1000倍后检测；(2)酶消化后样品；(3)超离后成品

样品前处理：裂解法，在0.2mL的离心管中，样品和裂解液混合，95℃孵育30min。孵育完成后稀释10-100倍，用于检测。

制备20μl PCR反应体系，其中，PCR预混液(2×)10μl，正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl，DNA模板5μl，DNA模板为Sf9细胞DNA标准品，浓度分别为312.5ng/ml、62.5ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.02ng/ml，阴性对照5μl，PCR反应体系配置完成后，在QuantStudio 5荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，PCR程序：50℃2min；95℃10min；95℃15s；60℃60s；40个循环。结果如表9所示，前处理过程将样品稀释2倍，获得DNA基因组样品(1)、(2)进行Q-PCR检测前稀释100倍用于检测，因此，收获液中Sf9残余DNA含量为3.12×10⁶ng/ml；酶消化后样品中浓度为4312.98ng/ml；成品中浓度为31.98ng/ml。

表9 qPCR检测CT值

实施例8携带不同目的基因rAAV制品的Sf9基因组DNA残余检测材料和试剂：实施例6中的Sf9宿主细胞DNA残余检测试剂盒I

待检样品：(1)携带目的基因1的rAAV制品收获液原液；(2)携带目的基因2的rAAV制品收获液原液；(3)携带目的基因3的rAAV制品收获液原液。样品前处理：裂解法，在0.2mL的离心管中，样品和裂解液混合，95℃孵育30min。孵育完成后稀释10-100倍，用于检测。

制备20μl PCR反应体系，其中，PCR预混液(2×)10μl，正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl，DNA模板5μl，DNA模板为Sf9细胞DNA标准品，浓度分别为312.5ng/ml、62.5ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.02ng/ml，阴性对照5μl。PCR反应体系配置完成后，在QuantStudio 5荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，PCR程序：50℃2min；95℃10min；95℃15s；60℃60s；40个循环。

结果如表10所示，前处理过程将样品稀释2倍，获得DNA基因组样品进行Q-PCR检测前稀释100倍用于检测，因此携带目的基因1、2、3的rAAV成品中Sf9基因组残余浓度分别为4304.86ng/ml、4311.24ng/ml、4298.78ng/ml。

表10 qPCR检测CT值

本发明不仅适用于rAAV载体制品的成品检测，也可应用于载体制备过程中中间过程样品(如超离前样品、超离后样品等)、半成品、成品的检测，可以为rAAV载体制品生产过程的质量控制以及生产工艺优化提供可靠的数据，为rAAV制品的研发和安全生产提供重要支持。

序列表

<110> 北京五加和基因科技有限公司

<120> 宿主昆虫细胞DNA残留含量定量检测方法及试剂盒

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgtccctgc cctttgta 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtccgaaga cctcactaaa tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaccgcccg tcgctactac cg 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataagctcgc gttgatta 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaatcattc aatcggta 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtccctgcc ctttgtacac ac 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actaccgatt gaatgatt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaacgtcgg aagagcgc 18

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtgaggtct tcggaccggt gc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacagctgca ccatcagact 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgtgagaga tcacggcaga 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcgcgaatt cgccacttgg c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggctaccac atccaaggaa 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctggaatta ccgcggct 18

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttggagggca agtct 15

Claims

1.引物对，其特征在于，选自以下引物对之中任一对：

(1)正向引物：5’-ACGTCCCTGCCCTTTGTA-3’(SEQ ID NO:1)，和反向引物：5’-GGTCCGAAGACCTCACTAAATC-3’(SEQ ID NO:2)；

(2)正向引物：5’-ATAAGCTCGCGTTGATTA-3’(SEQ ID NO:4)，和反向引物：5’-TAAATCATTCAATCGGTA-3’(SEQ ID NO:5)；

(3)正向引物：5’-ACTACCGATTGAATGATT-3’(SEQ ID NO:7)，和反向引物：5’-TGAACGTCGGAAGAGCGC-3’(SEQ ID NO:8)。

2.根据权利要求1所述的引物对进一步与寡核苷酸探针的组合，其特征在于，选自以下三种组合之中任一种：

(1)正向引物：5’-ACGTCCCTGCCCTTTGTA-3’(SEQ ID NO:1)，反向引物：5’-GGTCCGAAGACCTCACTAAATC-3’(SEQ ID NO:2)，和探针：5’-ACACCGCCCGTCGCTACTACCG-3’(SEQ ID NO:3)；

(2)正向引物：5’-ATAAGCTCGCGTTGATTA-3’(SEQ ID NO:4)，和反向引物：5’-TAAATCATTCAATCGGTA-3’(SEQ ID NO:5)，和探针：5’-CGTCCCTGCCCTTTGTACACAC-3’(SEQ IDNO:6)；

(3)正向引物：5’-ACTACCGATTGAATGATT-3’(SEQ ID NO:7)，和反向引物：5’-TGAACGTCGGAAGAGCGC-3’(SEQ ID NO:8)，和探针：5’-AGTGAGGTCTTCGGACCGGTGC-3’(SEQ IDNO:9)；

其中，所述探针在5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

3.一种检测样品中残留昆虫宿主细胞DNA残留量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获取样品，提取总DNA，并使用权利要求2所述的引物对和探针组合进行实时定量PCR检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在实时定量PCR步骤中，分组设置为：(1)标准品，稀释成7个浓度梯度，分别为312.5ng/mL、62.5ng/mL、12.5ng/mL、2.5ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.02ng/mL的标准曲线浓度梯度；(2)样品；(3)阴性对照。

5.根据权利要求4所述的方法，其中标准品为经提取、纯化和定量的Sf9细胞基因组DNA。

6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其中实时定量PCR方法反应体系包括2×Q-PCR反应预混液、引物对、探针和DNA模板，反应体积为20μL，所述2×Q-PCR反应预混液包括Taq酶、dNTPs、Mg2+及PCR缓冲液，所述DNA模板来自待测样品、标准品和阴性对照。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其中实时定量PCR反应结束后，根据标准品DNA浓度与检测获得Ct值结果，拟合标准曲线，进而通过标准曲线计算得到待测样本中Sf9细胞DNA的量。

8.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其中总DNA提取方法选自蛋白酶K法、CTAB法、SDS裂解法、试剂盒(磁珠)法和碱裂解法。

9.试剂盒，其包含权利要求1所述引物对，或包含权利要求2所述的引物对和探针的组合。

10.根据权利要求9的试剂盒，其进一步包含以下试剂中的至少一种：Taq酶、dNTPs、含有Mg²⁺的PCR缓冲液、和标准品，其中标准品为经提取、纯化和定量的Sf9细胞基因组DNA。