CN106103720A - 自细胞系检测和除去弹状病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及用于在昆虫细胞中生成的产品中检测病毒的存在和用于自昆虫细胞中生成的产品除去病毒的组合物、方法、混合物和试剂盒。本公开文本还涉及在昆虫细胞中生成且没有或基本上没有病毒的蛋白质、肽、多肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原和病毒样颗粒。本公开文本还涉及用于检测样品中的弹状病毒的组合物、方法、测定法和试剂盒。

Description

自细胞系检测和除去弹状病毒的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2013年10月3日提交的美国临时专利申请61/886,438的优先权，通过提及将其全部内容收入本文用于所有目的。
与本文一起电子提交的文本文件的描述
通过提及将与本文一起电子提交的文本文件的内容完整收入本文：序列表的计算机可读形式拷贝(文件名：LIGO_026_01WO_SeqList_ST25.txt；记录日期：2014年10月3日；文件大小18Kb)。
发明背景
昆虫细胞(诸如SF21和SF9细胞)通常用于蛋白质表达，包括用于生产在人疾病中使用的治疗性生物产品。昆虫细胞经常与杆状病毒表达系统结合使用。此类杆状病毒-昆虫细胞表达系统由于其生长至高密度并表达足够水平的蛋白质的能力以及由于它们可以容易地适应大规模悬浮培养的实情而已经用于生产生物产品。由于广泛的测试，长期以来一直认为这些细胞没有污染性病毒。
本领域中需要没有污染性病毒的昆虫细胞、用于测定昆虫细胞是否没有污染性病毒的方法、和自没有污染性病毒的昆虫细胞生成且适合于人疗法的产品。
发明概述
在一个方面，本公开内容提供了用于检测样品中的污染性媒介物的组合物、方法、测定法和试剂盒。在一些实施方案中，样品是在昆虫细胞系中生成或使用昆虫细胞系生成的蛋白质、肽、药物物质、生物产品、病毒、疫苗抗原或病毒样颗粒(VLP)制备物。在一些实施方案中，昆虫细胞系是Sf9或Sf21。在一些实施方案中，污染性媒介物是病毒或病毒基因组的一部分。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于检测新病毒的组合物、方法、测定法和试剂盒，所述新病毒在本文中称作“Sf9弹状病毒”。在一个方面，本公开内容提供了Sf9弹状病毒的核酸序列和其它特征。在另一个方面，本公开内容提供了用于测定样品中的Sf9弹状病毒或Sf9弹状病毒核酸或Sf9弹状病毒颗粒是否能够复制的组合物、方法、测定法和试剂盒。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于测定(i)样品是否含有可检测水平的Sf9弹状病毒RNA(如通过RT-PCR测量的)；(ii)Sf9弹状病毒RNA是否存在于样品中的核酸酶抗性颗粒中；和/或(iii)Sf9弹状病毒RNA是否能够复制的组合物、方法、测定法和试剂盒。
在一个方面，本发明提供了用于检测病毒的方法，其包括检测包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的反向互补物的至少25、至少50、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500或至少2000个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，用于检测本文中公开的病毒的方法包括在PCR测定法中使用一种或多种引物和一种或多种经标记的探针。在一些实施方案中，探针是经标记的探针。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于检测病毒的方法，其中所述方法具有介于约1个RNA分子和约50个RNA分子之间的灵敏度水平。
在一个方面，本公开内容提供了用于自蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或病毒样颗粒(VLP)制备物除去病毒的方法，其中所述蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物是使用昆虫细胞生成或在昆虫细胞中生成的，且其中所述病毒包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的序列。在又一个实施方案中，病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞或Sf21细胞。在其它实施方案中，Sf9细胞是自以ATCC CRL-1711保藏的细胞系衍生的。
在一个方面，本公开内容提供了在昆虫细胞中生成的蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物，其中蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP基本上没有包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的核苷酸序列的病毒。在又一个实施方案中，病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞或Sf21细胞。在其它实施方案中，Sf9细胞是自以ATCC CRL-1711保藏的细胞系衍生的。本发明还涵盖包含此类物质且任选与药学可接受载剂组合的组合物以及用于检测此类物质中病毒的存在或缺失的试剂盒。
在一个方面，本公开内容提供了用于检测Sf9弹状病毒的存在或缺失的方法，所述Sf9弹状病毒在样品中的颗粒上聚集和/或在样品中的颗粒中壳体化。在一些实施方案中，样品是蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物。在一些实施方案中，方法包括下列步骤：(i)使样品经受用会降解RNA的酶处理；(ii)使样品经受一种或多种药剂，诸如离液剂，以停止酶活性并破坏颗粒；(iii)通过RT-PCR检测所得的样品中Sf9弹状病毒RNA的存在或缺失。在其它实施方案中，方法包括在使样品经受步骤(i)中的酶处理之前通过RT-PCR检测样品中Sf9弹状病毒RNA的存在或缺失。在一些实施方案中，与步骤(i)前检测的RNA信号比较步骤(i)和(ii)后检测的RNA信号。在一些实施方案中，酶处理和颗粒破坏后检测的RNA在样品中在颗粒中存在。
在一个方面，本公开内容进一步提供了依照SEQ ID NO:1的病毒的片段或与SEQID NO:1互补的序列的片段，其中片段是经标记的或经化学修饰的。
在一个方面，本公开内容提供了包含甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)细胞和弹状病毒的组合物。在一些实施方案中，弹状病毒包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列。在一些实施方案中，弹状病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。
附图简述
图1提供了以有义取向(5’至3’)显示的Sf9弹状病毒基因组的图。
图2提供了通过透射电子显微术(TEM)成像的Sf9弹状病毒的9幅个别图像。
图3的图显示了在感染前或传代0、1或2时暴露于Sf9细胞条件化培养基的昆虫细胞(AMCY-SeE1、AMCY-SeE4、AMCY-SeE5、HvAM1、HzAM1、HzFB33、HsAM1或AgAM1)中Sf9弹状病毒RNA信号的检测。数据以每μg总细胞RNA的飞克(fg)弹状病毒RNA表示。
发明详述
本公开内容提供了用于鉴定样品中的污染性媒介物和/或用于自样品除去污染性媒介物的组合物、方法、测定法和试剂盒。部分地，本公开内容提供了鉴定为存在于昆虫细胞系Sf9细胞中的新病毒。长期以来一直认为Sf9细胞和其它昆虫细胞系(其通常用于药物开发以生产治疗目的的生物产品)没有污染性病毒。然而，令人惊讶地，本发明人发现了本文中公开的新病毒存在于Sf9细胞中。基于本文中描述的工作，确定新病毒是弹状病毒。虽然在与Sf9不同的细胞系中找到了弹状病毒，但是本文中公开的弹状病毒在本文中称作“Sf9弹状病毒”。本文中以SEQ ID NO:1提供了Sf9弹状病毒的序列。
本公开内容提供了病毒的核酸和其它特征，在检测病毒中使用的方法、测定法和试剂盒，和基本上没有病毒的细胞或生物产品。在一个实施方案中，生物产品是用于治疗和/或诊断目的的产品。在又一个实施方案中，用于治疗和/或诊断目的的生物产品是至少部分使用昆虫细胞系生成的。在又一个实施方案中，昆虫细胞系是Sf9或Sf21。
在一个方面，本公开内容提供了用于检测Sf9细胞中病毒的存在的组合物、测定法、方法和试剂盒。在一个方面，本公开内容提供了用于检测的蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物中病毒的存在的组合物、测定法、方法和试剂盒。在又一个实施方案中，药物物质是使用昆虫细胞(诸如Sf9细胞)生成的或者是在昆虫细胞(诸如Sf9细胞)中生成的。在一个方面，本公开内容提供了用于测定Sf9弹状病毒是否在样品(诸如蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物)中的颗粒上聚集或在样品中的颗粒内壳体化的组合物、测定法、方法和试剂盒。在一个方面，本公开内容提供了用于测定样品(例如蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物)中鉴定的Sf9弹状病毒是否能够复制的组合物、测定法、方法和试剂盒。
在一个方面，本公开内容涉及检测样品中的病毒。在一个实施方案中，分离、扩增并检测靶核酸。本领域中公知用于分离、扩增或检测核酸的方法，包括用于检测和扩增靶RNA序列的方法(例如通过逆转录PCR(RT-PCR))，例如在Sambrook et al,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Fourth Edition(2012)和Ausubel et al,CurrentProtocols in Molecular Biology(2011)中。
在一个方面，本公开内容提供了用于检测病毒的方法，其包括检测包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:1的反向互补物的至少25、至少50、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1250、至少1500或至少2000个连续核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，用于检测本文中公开的病毒的方法包括在PCR测定法中使用一种或多种引物和一种或多种经标记的探针。在其它实施方案中，方法包括使用具有依照SEQ ID NO:2(TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG)的序列的正向引物和具有依照SEQ ID NO:3(CTCGCTGCTGAGCGGTTT)的序列的反向引物。在一些实施方案中，方法包括使用具有依照SEQID NO:4(AGGATTGGAGAATTATAC)的序列的探针。
在一些实施方案中，本公开内容提供了依照SEQ ID NO:1的病毒。在一些实施方案中，本公开内容进一步提供了依照SEQ ID NO:1的病毒的片段，或与SEQ ID NO:1互补的序列的片段。在一些实施方案中，Sf9弹状病毒基因组或与弹状病毒基因组互补的序列的片段是经标记的或经化学修饰的。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含能够检测Sf9弹状病毒的序列的经标记的探针。在一些实施方案中，经标记的探针与Sf9弹状病毒基因组的一部分或者与Sf9弹状病毒基因组中的序列的反向互补物互补。
在一些实施方案中，用选自下组的荧光团标记序列、片段或探针：荧光素和荧光素衍生物，诸如例如FAM、VIC、JOE、5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素和香豆素衍生物、萤光黄(lucifer yellow)、德克萨斯红(texas red)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料。在一个实施方案中，用6-羧基-荧光素(FAM)标记探针。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于检测病毒的方法，其中所述方法具有介于约1个RNA分子和约50个RNA分子之间的灵敏度水平。在其它实施方案中，方法具有介于约2个RNA分子和约20个RNA分子之间的灵敏度水平。在其它实施方案中，方法的灵敏度水平是约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、或约25个RNA分子。
在一个方面，本公开内容提供了在昆虫细胞中生成的蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原、病毒或VLP制备物，或包含在昆虫细胞中生成的蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原、病毒或VLP制备物的组合物。在一些实施方案中，VLP制备物是杯状病毒(Calicivirus)VLP制备物。在其它实施方案中，VLP制备物是诺如病毒(Norovirus)VLP制备物。VLP制备物包括单价或多价VLP制备物，其包含来自一种或多种病毒或病毒株的一种或多种壳体蛋白或壳体蛋白的部分。例如，诺如病毒VLP制备物包括单价或多价VLP制备物，其包含来自一种或多种诺如病毒原型基因小组(genotype)的一种或多种壳体蛋白或壳体蛋白的部分。如本文中使用的，“单价VLP”指含有来自单一病毒株的VLP抗原的VLP，而如本文中使用的，“多价VLP”指含有来自两种或更多种病毒株的VLP抗原的VLP。不同单价VLP可以在同一VLP配制剂中一起存在。例如，在一些实施方案中，诺如病毒VLP制备物可以包含来自一种诺如病毒原型基因小组的VP1和/或VP2壳体，或者可以包含来自一种诺如病毒原型基因小组的VP1和/或VP2蛋白以及来自第二种诺如病毒原型基因小组的VP1和/或VP2蛋白。诺如病毒VLP制备物的例子是诺如病毒原型基因小组I、基因型1/诺如病毒原型基因小组II、基因型4(GI.1/GII.4)二价VLP，其记载于例如。
在一个方面，本公开内容提供了用于检测样品中具有与SEQ ID NO:1至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源的序列的病毒的存在或缺失的试剂盒，其中试剂盒包含一种或多种引物。在一些实施方案中，试剂盒包含正向引物、反向引物和探针。在其它实施方案中，正向引物具有依照SEQ ID NO:2的序列；反向引物具有依照SEQ ID NO:3的序列；且探针具有依照SEQ ID NO:4的序列。在一些实施方案中，探针是用选自下组的荧光团标记的：荧光素和荧光素衍生物，诸如例如FAM、VIC、JOE、5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素和香豆素衍生物、萤光黄、德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料。在一个实施方案中，探针是用6-羧基-荧光素(FAM)标记的。
在一个方面，本公开内容提供了用于测定Sf9弹状病毒是否存在于样品中以及测定Sf9弹状病毒是否能够复制的测试的组合物、方法、测定法和试剂盒。在一些实施方案中，方法包括通过RT-PCR检测样品中Sf9弹状病毒的存在或缺失，其中方法包括在PCR测定法中使用一种或多种引物和一种或多种经标记的探针，其中测定法包括使用具有依照SEQ IDNO:2(TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG)的序列的正向引物和具有依照SEQ ID NO:3(CTCGCTGCTGAGCGGTTT)的序列的反向引物，和具有依照SEQ ID NO:4(AGGATTGGAGAATTATAC)的序列的经标记的探针。在一些实施方案中，本公开内容进一步提供了用于测定样品中的Sf9弹状病毒RNA信号是否存在于颗粒和/或聚集体中的方法，其包括使样品经受RNA酶A处理，接着用离液剂处理以停止RNA酶A活性并破坏颗粒。然后，将经处理的样品经受RT-PCR测定法，如上文描述的。所得的样品中的Sf9弹状病毒RNA信号指示Sf9弹状病毒在样品中在颗粒中存在。在一些实施方案中，本公开内容进一步提供用于测定Sf9弹状病毒RNA是否能够复制的方法。为此目的，将样品与允许Sf9弹状病毒复制的细胞系(诸如例如甜菜夜蛾细胞)一起温育，接着细胞传代。增加的Sf9弹状病毒RT-PCR信号指示病毒能够复制。如此，本公开内容提供了用于检测Sf9弹状病毒的存在或缺失，以及用于评估Sf9弹状病毒的感染性的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含(i)用于检测Sf9弹状病毒RNA的正向和反向引物和探针；(ii)RNA酶；(iii)离液剂；和(iv)甜菜夜蛾细胞系。
在一个方面，本公开内容提供了没有弹状病毒、弹状病毒核酸或弹状病毒颗粒或没有弹状病毒表达的昆虫细胞。在其它实施方案中，昆虫细胞是Sf9或Sf21细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞没有本文中公开的Sf9弹状病毒，没有Sf9弹状病毒核酸或颗粒。在一些实施方案中，已经自Sf9或Sf21细胞除去弹状病毒。在其它实施方案中，在昆虫细胞中阻断弹状病毒颗粒、弹状病毒核酸或弹状病毒的表达。例如，在一些实施方案中，通过靶向弹状病毒基因组的siRNA或反义寡核苷酸阻断弹状病毒表达。如此，在一些实施方案中，本公开内容提供了Sf9弹状病毒基因组的片段或与弹状病毒基因组互补的序列的片段。在其它实施方案中，Sf9弹状病毒基因组的片段或与弹状病毒基因组互补的序列的片段是经标记的或经化学修饰的。如此，在一些实施方案中，本公开内容提供了经标记的或经化学修饰的与SEQ ID NO:1或其互补序列对应的siRNA或反义寡核苷酸。
在一个方面，本公开内容提供了用于自在昆虫细胞中生成的蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物除去弹状病毒的方法。在一些实施方案中，方法进一步包括在纯化后检测弹状病毒(例如Sf9弹状病毒)的存在或缺失。在一些实施方案中，用于自在昆虫细胞中生成的蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物除去弹状病毒的方法包括例如层析(例如离子交换层析、疏水性相互作用层析、SDR HyperD层析、和其它层析方法，其是本领域中已知且披露于例如美国专利No.8,481,693，通过提及将其完整收入本文)、过滤(例如超滤、渗滤和0.2μm过滤)、用去污剂处理、或其它纯化方法，其中所述方法进一步包括在纯化后检测弹状病毒的存在或缺失。
弹状病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridiae)(目：单负病毒目(Mononegavirales))，其是负(-)义RNA病毒的一个多种多样的科，包括至少6个属：狂犬病毒属(Lyssavirus)(其包括狂犬病病毒等)、水疱病毒属(vesiculovirus)(其包括水疱性口炎病毒(vesicular stromatitis virus,VSV)等)、短暂热病毒属(ephemerovirus)(其包括牛短暂热病毒(bovine ephemeral fever virus)等)、质型弹状病毒属(cytorhabdovirus)(其包括植物病毒，诸如莴苣坏死黄化病毒(lettuce necrotic yellows virus)等)、核型弹状病毒属(nucleorhabdovirus)(其包括植物病毒，诸如马铃薯黄矮病毒(potato yellowdwarf virus)等)和弹状病毒属(Novirhabdovirus)。
昆虫细胞(诸如来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和其它鳞翅类(Lepidopteran)昆虫物种的细胞)是本领域中公知的且通常用于支持杆状病毒或其它病毒的感染和复制以生成重组蛋白，例如治疗性产品，包括疫苗。Sf9细胞系是最初自草地夜蛾卵巢细胞获得的Sf21细胞的一个克隆隔离群。在1983年，Sf9细胞系ATCC CRL-1711保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。其它昆虫细胞系包括但不限于甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、玉米夜蛾(Helicoverpa zea)、亚曲夜蛾(Heliothis subflexa)、藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)等。
如本文中使用的，术语“Sf9弹状病毒”指本文中公开的新病毒。在本文中以SEQ IDNO:1提供Sf9弹状病毒的核酸序列。如本文中使用的，术语“有复制能力的”或“能够复制的”在用于描述Sf9弹状病毒或Sf9弹状病毒RNA分子时意指自身复制且在宿主细胞中提供转录的病毒或RNA分子。
如本文中使用的，术语“引物”指具有足够数目的碱基以用于PCR反应的一系列核苷酸残基。可以使用引物来扩增样品中相同、相似、或互补的DNA或RNA、确认或揭示所述DNA或RNA的存在。如本文中使用的，术语“探针”指在检测相同、相似或互补的核酸序列中使用的核酸序列。
在一个方面，本公开内容提供了用于检测样品中的病毒或者自样品除去病毒的组合物、方法、测定法和试剂盒，其中样品是蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原或VLP制备物。如本文中使用的，术语“病毒样颗粒和VLP”可互换使用，指在一种属性上类似于病毒，但是尚未证明为感染性的结构。如本文中使用的，术语“药物物质”指含有治疗性药物且用于与赋形剂一起配制药物组合物或药物产品的材料。如本文中使用的，“生物产品”指由细胞或生物体生成的产物或材料。生物产品可以是生物体的天然产物，或者可以由已经以某种方式改变，使得它生成生物产品的生物体生成。生物产品的例子包括但不限于疫苗、抗体(例如单克隆抗体)、治疗性蛋白质、病毒(例如用于基因疗法的重组病毒，诸如例如杆状病毒)、酶、生长因子、多糖、核酸(包括DNA和RNA)和颗粒(例如病毒样颗粒)。例如，可以通过糖基化或放射性标记来改变生物产品。
在一个方面，本公开内容提供了用于检测能够复制的Sf9弹状病毒，或者用于测定Sf9弹状病毒是否有复制能力的组合物、方法、测定法和试剂盒。如此，在一个方面，本公开内容提供了用于测定样品中存在的Sf9弹状病毒是否能够复制的手段。在一些实施方案中，方法包括将包含Sf9弹状病毒RNA信号的样品与能够支持Sf9弹状病毒复制的细胞系一起温育。在一些实施方案中，能够支持Sf9弹状病毒复制的细胞系可以是例如甜菜夜蛾细胞系。本文中公开了几种此类细胞系，它们包括自甜菜夜蛾细胞衍生的细胞系，诸如例如BCIRL/AMCY-SeE1、BCIRL/AMCY-SeE4和BCIRL/AMCY-SeE5。在一些实施方案中，在具有10％胎牛血清的EX-Cell 420培养基中培养甜菜夜蛾细胞系。在一些实施方案中，通过在几个时间点时通过如本文中公开的RT-PCR测量Sf9弹状病毒RNA信号来检测复制性Sf9弹状病毒。例如，在一个实施方案中，在与细胞系一起温育前；在与细胞系一起温育后立即(在传代0)，以及在细胞系的随后传代后(例如在传代1和2后)对样品进行检测Sf9弹状病毒RNA的RT-PCR。在至少一次传代后，如通过RT-PCR检测的Sf9弹状病毒RNA信号的增加指示病毒在甜菜夜蛾细胞系中复制。如通过RT-PCR检测的Sf9弹状病毒RNA信号的降低或无变化指示Sf9弹状病毒RNA信号与能够复制的病毒无关。
如本文中使用的，细胞系、样品、蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原、VLP制备物等“基本上没有”病毒的术语意指细胞、样品、蛋白质、肽、药物物质、生物产品、疫苗抗原、VLP制备物等不包含可检测水平的病毒，如通过PCR或RT-PCR测定法等测量的。
在一些实施方案中，本文所述组合物、方法和试剂盒利用酶(诸如核糖核酸酶(RNA酶))来降解RNA。RNA酶是降解RNA的核酸酶。在一些实施方案中，RNA酶提供降解非壳体化RNA的彻底手段，所述非壳体化RNA在其它情况下可以由于聚集而对降解有抗性。RNA酶可以是内切核糖核酸酶，诸如RNA酶A、RNA酶H、RNA酶III、RNA酶I等；或外切核糖核酸酶，诸如RNA酶II、RNA酶R、外切核糖核酸酶I等。核糖核酸酶A(RNA酶A)是一种经常在研究中使用的胰腺核糖核酸酶，特异性切割单链RNA。
离液剂是本领域中已知的，包括但不限于丁醇、乙醇、丙醇、酚、氯化镁、过氯酸锂、乙酸锂、胍氯化物、十二烷基硫酸钠、硫脲和脲。离液剂通过破坏氢键键合来减弱其它分子的疏水性效应。如此，离液剂破坏分子(诸如核酸、蛋白质和脂双层)的结构和/或使分子(诸如核酸、蛋白质和脂双层)变性。另外，离液剂能够通过使酶变性来阻止RNA酶或DNA酶的活性，并且也能够破坏或分解颗粒，诸如VLP。
如本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数项，除非使用的上下文另有明确指示。术语“或”在本文中理解为包括在内的。短语“至少一个/种”的意义等同于短语“一个/种或多个/种”的意义。术语“包含”、“含有”、“具有”等可以意指“包括”等。贯穿本申请使用术语“约”意图指示数值包括测定数值采用的方法的误差的标准偏差或在适当的情况中包括大于或小于叙述数值的20％的数值。
实施例
实施例1：草地夜蛾Sf9昆虫细胞系中弹状病毒的检测
将源自草地夜蛾Sf9昆虫细胞系的重组杆状病毒感染的生产结束细胞(EOPC)材料进行针对昆虫起源的逆转录病毒元件的随机筛选。为此目的，自EOPC材料制备病毒颗粒结合RNA，并将它进行随机引物RT-PCR克隆。所得的质粒DNA克隆的DNA序列分析容许与有复制能力的弹状病毒基因组的存在一致的序列重叠区的装配，所述有复制能力的弹状病毒基因组由13,267个核苷酸组成且含有6个可读框。在氨基酸序列水平上的同源性搜索揭示了弱但一致的与许多弹状病毒的L蛋白的同源性，其中最高同源性得分与植物起源的弹状病毒有关。
针对Sf9细胞伴随弹状病毒开发出qRT-PCR测定法，并且证明了工作Sf9细胞库的杆状病毒裂解物、条件化培养基、和总细胞RNA中的一致信号。在ATCC衍生的Sf9细胞系(ATCC CRL-1711)(其追溯至1983年冻结物)中检出类似的信号，这指示弹状病毒污染物很可能存在于Sf9细胞系的初始隔离群中。
对在暴露于EOPC材料后的不同传代水平上收获的两份人细胞系样品的分析证明了传代1细胞中的强弹状病毒信号，但是与EOPC材料随传代的稀释一致，在传代4和6之间快速降低信号至背景水平，并且证明病毒没有在人细胞中复制的明显能力。
诺如病毒VLP疫苗，诸如诺瓦克(Norwalk)VLP和共有(Consensus)VLP疫苗配制剂记载于例如美国专利No.7,955,603、8,431,116、8,481,693和8,841,120；和美国专利申请公开文本No.2011-0182975、2013-0273102和2014-0004145，通过提及将每篇完整收入本文用于所有目的。已经在至少133名受试者(已经在研究中登记了总共234名受试者；133名受试者接受疫苗，101名接受安慰剂)中测试了以单磷酰脂质A(MPL)和氢氧化铝(Al(OH)3)为佐剂的肌肉内诺如病毒GI.1/GII.4二价病毒样颗粒(VLP)疫苗。
实施例2：EOPC材料中颗粒结合RNA序列的随机引物克隆和分析
为了检测可能的含有RNA的病毒或病毒样颗粒，为了随机RT-PCR克隆目的，我们用EOPC材料开始。将EOPC材料澄清碎片，然后进行核酸酶消化以消除游离的(不是颗粒结合的)核酸。在核酸酶消化后，以100,000x g将材料离心通过20％蔗糖垫以收集病毒颗粒。预期在此过程中也会收集显著量的完整杆状病毒。然后，将高速沉淀材料进行核酸提取，然后用无RNA酶的DNA酶处理以在使任何病毒RNA保持完整的情况中除去杆状病毒和基因组DNA。
对第一链逆转录酶反应和第二链Klenow DNA聚合酶反应两者使用在其5’端加NotI限制性位点标签的随机N9引物(TATTGCGGCCGCTTCTTNNNNNNNNN)，产生双链DNA，其可以使用由Not I序列标签(TATTGCGGCCGCTTCTT)组成的引物扩增。PCR扩增导致几个独特条带的扩增，这指示分离的RNA群体中有限量的序列复杂性。重复此规程几次，每次导致不同但独特的条带集合(由于使用随机引发而不是出乎意料的)。在最初测序的142个克隆中，发现一个克隆展现与昆虫病毒逆转录酶的同源性，而显示了32个克隆与弹状病毒的L蛋白是远缘同源的。仅在氨基酸序列水平上观察到弹状病毒同源性，并且它们贯穿部分L基因在24-26％同源性的范围中。发现剩余的序列代表核糖体序列、杆状病毒序列或在核苷酸或氨基酸序列水平上没有已知同源性的序列。杆状病毒和核糖体克隆的分离是抵抗病毒RNA分离过程期间的核酸酶处理的某些RNA和DNA序列的存在的指示。
显示弹状病毒同源性的所有克隆以及与Genbank数据库没有显示可检出同源性的克隆的进一步序列分析分别导致约7,000和4,500个核苷酸的两个大序列重叠群的建立，每个含有与弹状病毒L蛋白具有同源性的可读框的一部分。为了测定两个序列重叠群是否是相同病毒基因组序列的一部分，使用来自每个重叠群的一种引物进行额外的RT-PCR克隆。额外的克隆导致代表跨越这两个重叠群的序列的克隆的分离。最后，采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术容许分离完成13,267个核苷酸的新弹状病毒基因组的序列(SEQ ID NO:1)的5’和3’端克隆。
图1中显示了弹状病毒基因组的特征图。该图显示了基于下述标准作为弹状病毒科成员的负链RNA病毒的有义取向(5’至3’)：
1.此病毒的大可读框和Genbank中报告的许多弹状病毒序列的L(大聚合酶)基因之间的氨基酸序列同源性；
2.剩余基因的基因组组织和大小一般是弹状病毒典型的；
3.G和L之间的短附属基因的存在是许多类型的弹状病毒中共同的；
4.此病毒和任何其它病毒的N、P、M和G基因之间的任何同源性的缺失。后一种是代表大且非常多样的病毒组的弹状病毒典型的，其中仅在L基因产物中找到成员间的同源性。(参见Ammar et al.,Annu Rev Entomol 54；447(2009)；Jackson et al.,Annu.Rev.Phytopathol 43,623(2005)；Walker et al.,Virus Res.162(1-2),110(2011))。
N、P、M和G可读框的分配基于标准弹状病毒基因组布置和编码序列的大小。与这点一致的是G基因清楚编码具有预期的疏水性信号肽和跨膜域的1型膜糖蛋白的实情。
虽然Sf9弹状病毒是自昆虫细胞系分离的，但是与其它弹状病毒的同源性关系指示这可以是由昆虫载体携带的植物病毒(参见下文表1)。植物弹状病毒经常是由昆虫载体携带的，并且一般以多世代在昆虫载体中复制(Ammar et al.(2009))。实际上，Sf9细胞系(初始Sf21细胞系的衍生物)是自草地夜蛾(秋粘虫)的卵巢组织衍生的，这提示了病毒能够在昆虫载体宿主中垂直传递(Vaughn et al.,In Vitro,13(4)；213(1977))。
经由L基因氨基酸序列同源性的检查，表1中的同源性数据的检查显示了Sf9弹状病毒与其它弹状病毒远缘相关。具有最高得分的命中都是植物弹状病毒，接着是哺乳动物弹状病毒。重要地，Sf9弹状病毒中的其它基因无一在RNA或氨基酸序列水平上显示与任何其它病毒的任何同源性，并且这种水平的趋异性是植物弹状病毒典型的(Ammar et al.(2009)；Jackson et al.(2005)；Walker et al.(2011))。
表1：Sf9弹状病毒与其它弹状病毒L蛋白氨基酸序列的亲缘关系
实施例3：Sf9细胞、条件化培养基、和杆状病毒裂解物中Sf9弹状病毒的量化。
开发出Taqman qRT-PCR测定法以量化各种培养物级分中的Sf9弹状病毒RNA。用于量化弹状病毒RNA的qRT-PCR测定法是单步骤Taqman测定法，其在RT和PCR步骤两者中采用正向和反向引物。因此，测定法能够检测正和负链RNA两者。此测定法中作为阳性对照且为了量化目的采用的RNA标准品是经由体外转录生成的负链RNA。使用此标准品，测定法具有约4个RNA分子的检测限。
引物和探针序列定位于跨越L基因内的核苷酸位置7200-7264的64个核苷酸靶序列。引物和探针序列如下：
EOPC60 FWD：TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG
EOPC60 REV：CTCGCTGCTGAGCGGTTT
EOPC60 Prb：6FAM-AGGATTGGAGAATTATAC
通过在将质粒DNA线性化后使用T7RNA聚合酶体外转录EOPC克隆60DNA来制备用于量化目的的标准曲线RNA。随后，用DNA酶消化模板质粒DNA，并纯化标准曲线RNA。预期约5kb的RNA，但是生成相等强度的两种RNA，即3.5kb和5kb，如通过Gyoxal-琼脂糖凝胶分析显示的。两种RNA中的较小者大得足以含有靶序列，并且很可能是由于过早的转录终止而生成的。为了量化目的，因此，标准曲线RNA的平均分子量是4.25kb或1.4x 106道尔顿。当在没有逆转录酶步骤的PCR反应中运行时，显示了标准曲线RNA仅产生痕量信号，证明了它没有模板DNA。在Taqman测定法中使用此RNA作为标准曲线证明了0.01fg RNA的可再现检测限，其等同于4个标准曲线RNA分子。
使用EOPC 60Taqman测定法来追踪膜浓缩和超速离心之前和之后Sf9细胞条件化培养基中的Sf9弹状病毒。表2中显示了这些数据，并且它们证明了培养基中的病毒信号不受0.2微米无菌过滤膜保留，但是受到100,000kD分子量截留膜完全保留。另外，100,000x g离心将病毒信号浓缩成团粒，可以将所述团粒重悬浮入较小的体积中。这些数据与Sf9细胞条件化培养基中完整弹状病毒颗粒的存在一致。
表2：膜浓缩和超速离心之前和之后的Sf9细胞条件化培养基中的Sf9弹状病毒RNA信号
表3显示了关于各种来源的Sf9条件化培养基、杆状病毒裂解物中以及总细胞RNA中Sf9弹状病毒浓度的另外的数据。在EOPC材料(Sf9细胞的杆状病毒裂解物)中检出显著量的弹状病毒RNA。EOPC材料的直接取样证明了每mL约2x 10e+08个RNA拷贝的弹状病毒RNA浓度。在通过高速离心自EOPC材料收集病毒颗粒时，计算出约4.5x 10e+07的滴度。此4倍差异与下述可能性一致，即EOPC材料的直接取样检出颗粒结合的和游离的RNA两者，而高速离心是对颗粒结合的RNA特异性的。在Sf9细胞条件化培养基中也以接近每mL 10e+07RNA个拷贝检出弹状病毒RNA信号。
表3：条件化培养基、杆状病毒裂解物和总细胞RNA中的Sf9弹状病毒浓度
关于活Sf9细胞中的弹状病毒RNA浓度，发现了对数期Sf9细胞含有每个细胞约1500个RNA拷贝，这指示低水平感染，并且与没有观察到的细胞病变一致。支持弹状病毒感染在Sf9细胞系(Vaughn et al.,1977)中自其初始分离就是固有的而不是由于常规培养期间的假性污染的观念的数据来自对在1983年保藏的美国典型培养物保藏中心(ATCC)Sf9克隆(ATCC CRL-1711)的分析。在此情况中，在ATCC细胞系中以每个细胞3273个RNA拷贝检出弹状病毒RNA信号，这与在Sf9工作细胞库(WCB)内看到的水平一致。
实施例4：Sf9弹状病毒在人细胞系A549和HEK293中不复制。
对HEK293和A549细胞测试用来自诺瓦克和共有VLP生产运行的EOPC材料处理这些细胞后病毒整合的证据。经由在三种人细胞系上培养对诺瓦克VLP EOPC材料(MeridianPart#85190，批次08110043)和共有VLP EOPC材料(Meridian Part#85188，批次09110048)测试有复制能力的逆转录病毒的存在，并且由于缺失可扩增的逆转录酶活性而发现呈阴性。以接种后的不同传代将这些细胞系(Raji，293和A549细胞)的样品经受额外的测试。
对来自传代0、1、4和6的A549和HEK293细胞的别的冷冻细胞样品测试Sf9弹状病毒RNA信号的存在。为此目的，融化细胞样品，制备总细胞RNA，并将其进行EOPC60 qRT-PCR测定法。表4中显示了这些数据，并且它们证明了在传代0时收获的细胞的RNA中的强弹状病毒RNA信号，但是此信号随着细胞在培养中的继续传代而剧烈下降至背景水平。这些数据与EOPC随传代的稀释而不与Sf9分离的弹状病毒的复制一致。因此，没有Sf9弹状病毒能够在人细胞中复制的证据。
表4：人细胞系A549和HEK293中缺失Sf9弹状病毒复制的证据
实施例5：对诺瓦克药物物质测试Sf9弹状病毒RNA的存在。
对诺瓦克VLP药物物质(NWDS13)测试颗粒结合弹状病毒RNA信号的存在，即用核酸酶处理4.5mL药物物质样品以消除任何残留的游离核酸，然后经由以100,000x g的离心来收集颗粒。然后，用离液剂溶解重悬浮的材料，并纯化RNA。在核酸酶处理和离心前，对样品掺入鼠白血病病毒(MLV)样品作为回收包膜病毒颗粒的内部对照。随后的MLV qRT-PCR分析证明了MLV掺入物的优秀回收。对来自此制备物的RNA测试Sf9弹状病毒，并且检出与初始药物物质样品中每mL为240个弹状病毒RNA分子等同的信号。在50μg每种VLP的推测剂量，我们计算出每个人剂量小于10个弹状病毒RNA分子。虽然测试的样品呈现药物物质中存在的颗粒结合RNA，但是不能得出结论这是存在具有完整基因组RNA的残留的完整弹状病毒颗粒的任何指示，尤其是因为病毒清除研究已经使用诺如病毒VLP纯化方法证明了15至18个对数的累积包膜病毒感染性降低。
在两种不同情况中使用核酸酶消化以消除游离的核酸。在EOPC材料的情况中，使用核酸酶消化来消除游离的核酸，从而可以分离病毒颗粒结合RNA以进行RT-PCR克隆。这些是导致弹状病毒cDNA克隆鉴定的实验。在这些实验中，滴定澄清的EOPC材料至pH 7.0，并分别将Benzonase和Turbo DNA酶添加至终浓度50和5个单位/mL。由于EOPC材料基于Sf900II昆虫细胞培养基，核酸酶活性的活化不需要添加镁。在添加核酸酶后，于37℃温育材料2小时，此后添加EDTA至终浓度20mM。然后，通过以100,000x g离心通过蔗糖垫收集病毒颗粒，并使用来自Qiagen的QIAamp病毒RNA分离试剂盒分离颗粒结合核酸。此试剂盒采用离液剂来灭活任何遗留的核酸酶活性，导致完整颗粒结合RNA的分离。随后，用来自LifeTechnologies的Turbo无DNA试剂盒处理此材料以消除杆状病毒DNA，其会与病毒颗粒结合RNA共分离。虽然对核酸酶处理步骤不采用内部对照，但是在所得的cDNA克隆中鉴定出相对较少的核糖体或杆状病毒序列的实情指示核酸酶处理的有效性。
使用核酸酶消除游离的核酸的第二种情况牵涉对诺瓦克VLP药物物质测试颗粒结合弹状病毒序列的存在。在此情况中，经由添加Tris-HCl，pH 7.4至终浓度30mM将VLP样品调节至pH 7.5，接着用NaOH滴定。在添加鼠白血病病毒(MLV)的内部对照样品后，然后添加MgCl2至终浓度10mM，并且分别添加Benzonase和Turbo DNA酶至终浓度每mL 25和5个单位。容许核酸酶消化于37℃进行1小时，此后调节样品至20mM EDTA，并在20％蔗糖垫上以100,000x g离心，并使用来自Life Technologies的MagMAX病毒RNA分离试剂盒自团粒分离RNA。内部MLV掺入物证明了颗粒结合RNA受到保护而免于核酸酶消化，并且在最终的RNA制备物中发现颗粒结合RNA。虽然不采用对照来监测游离核酸的消化程度，但是预期在存在有利的反应条件的情况中显著数量的核酸酶的使用会消除基本上所有游离的核酸，尤其是因为药物物质中仅存在痕量的核酸。
研究结果指示已经在Sf9细胞系中鉴定出植物或昆虫起源的弹状病毒，并且很可能的是，此病毒污染是在Sf9细胞系中自其初始分离就固有的。完整测序Sf9弹状病毒基因组，证明了与植物弹状病毒最近的同源性，而且它展现出所有弹状病毒典型的基因组组织和可读框大小分布。在Sf9细胞条件化培养基中及在杆状病毒裂解物中检测病毒颗粒，并按照每个细胞的RNA拷贝量化弹状病毒RNA。没有由于内源感染所致的Sf9细胞中的细胞病变的证据。另外，研究指示了病毒缺失在人细胞中复制的能力。已经显示了本文中公开的药物物质制备方法有效除去和/或灭活包膜病毒。例如，可以通过去污剂处理来破坏包膜病毒，并且可以通过酸处理，接着离心以除去无活性且聚集的杆状病毒来灭活并除去杆状病毒。例如，已经显示了方法中的步骤除去模式包膜病毒A-MuLV(GI.1DS制备物中累积>18.22log10降低和GII.4DS制备物中累积>15.73log10降低)和AcNPV(GI.1DS制备物中累积>15.30log10降低和GII.4DS制备物中累积>11.54log10降低)。
实施例6：对药物物质分析RNA酶A抗性Sf9弹状病毒RNA信号
实施例5描述了与Sf9昆虫细胞有关的新型弹状病毒的表征。一项实验报告了诺瓦克VLP药物物质的一个研究批次中Benzonase抗性颗粒结合Sf9弹状病毒RNA信号的证据，这指示了聚集至诺如病毒VLP上或者在诺如病毒VLP内包装的小残留弹状病毒RNA片段存在的可能性。另外，实施例5中描述的研究没有排除残留的完整弹状病毒颗粒污染的可能性。在具有和没有在先RNA酶A处理的情况中对两个批次(为纯化的诺瓦克VLP药物物质材料和共有VLP药物物质材料)测试Sf9弹状病毒RNA信号。所得的数据证明了在药物物质中观察到的Sf9弹状病毒RNA信号对RNA酶A降解是敏感的，并且不代表在VLP或残留的Sf9弹状病毒颗粒中壳体化的RNA。采取合适的步骤以控制RT-PCR抑制剂，并且证明实际的颗粒结合弹状病毒RNA对RNA酶A降解没有易感性。
在此研究中，如下进行实验以进一步解决诺瓦克和共有VLP药物物质中的核酸酶抗性Sf9弹状病毒RNA信号的问题，即调查总共4个批次的药物物质材料，并采用核糖核酸酶A(RNA酶A)作为降解非壳体化弹状病毒RNA信号的更彻底的手段，所述非壳体化弹状病毒RNA信号在其它情况中由于聚集而可以对降解有抗性。在用和不用RNA酶A处理药物物质后，实验设计包括在存在离液剂(以破坏RNA酶A活性)的情况中的RNA纯化步骤和通过一种灵敏的qRT-PCR测定法量化任何剩余的Sf9弹状病毒RNA信号。
对诺瓦克药物物质的分析。在pH 6.5于37℃在添加或不添加RNA酶A至终浓度10μg/mL(4x 1014个RNA酶A分子/mL)的情况中温育诺瓦克药物物质材料1小时。在温育后，使用MagMax病毒分离方案对样品进行RNA纯化，所述MagMax病毒分离方案采用强离液剂以立即灭活RNA酶活性，并且破坏可能含有壳体化RNA的任何VLP或病毒颗粒。通过speedvac干燥进一步浓缩纯化的RNA样品，并使用实施例3中描述的EOPC-60qRTPCR测定法进行qRT-PCR分析。用或不用RNA酶A处理840μL药物物质材料，然后将其在使RNA酶活性变性的条件下进行RNA提取。最终的纯化的RNA样品自初始药物物质样品浓缩84倍。在一式三份qRT-PCR反应中测试3x 1μL每份纯化的RNA样品。
下文的表5显示了此实验的结果，其中两个诺瓦克VLP药物物质批次中仅一个(NWDS 16)展现出Sf9弹状病毒RNA信号，并且此信号等同于初始药物物质材料中每mL 51个RNA拷贝。诺瓦克药物物质批次NWDS09未能产生信号(初始药物物质中每mL<12个RNA拷贝)。虽然批次NWDS 16材料呈阳性，但是用RNA酶A处理的相同材料没有展现出信号。此观察结果与非颗粒壳体化(非受保护)状态的Sf9弹状病毒RNA信号的存在一致。
表5：在RNA提取前具有和没有RNA酶A处理的情况中诺瓦克药物物质RNA样品的弹状病毒RNA Ct值
*基于PCR样品大小和样品浓缩的程度，Ct值36.5对应于每ML初始药物物质51个Sf9弹状病毒RNA拷贝。对于此研究中采用的样品大小且基于每个反应1个RNA拷贝的检测限，Ct值≥40指示药物物质中每mL<12个RNA拷贝。
表6显示了临qRT-PCR分析前添加限定的弹状病毒RNA掺入物作为RT-PCR抑制剂的对照后相同样品的Ct值。所有4份样品的相似Ct值提供了缺失污染性RT-PCR抑制剂的证据。
表6：作为RT-PCR抑制剂的测试，掺入有对照弹状病毒RNA的诺瓦克药物物质样品的弹状病毒RNA Ct值。
处理 NWDS16 NWDS09
无 20.36 20.73
RNA酶A 20.35 20.46
对共有药物物质材料的分析。在pH 6.5于37℃在添加或不添加RNA酶A至终浓度10μg/mL(4x 1014个RNA酶A分子/mL)的情况中温育来自R&D批次DCN12或DCN15的共有药物物质材料1小时。在温育后，使用MagMax病毒分离方案对样品进行RNA纯化，所述MagMax病毒分离方案采用强离液剂以立即灭活RNA酶活性，并且破坏可以含有壳体化RNA的任何VLP或病毒颗粒。通过speedvac干燥进一步浓缩纯化的RNA样品，并使用实施例3中描述的EOPC-60qRT-PCR测定法进行qRT-PCR分析。用或不用RNA酶A处理1000μL药物物质材料，然后将其在使RNA酶活性变性的条件下进行RNA提取。最终的纯化的RNA样品自初始药物物质样品浓缩100倍。在一式三份qRT-PCR反应中测试3x 1μL每份纯化的RNA样品。
下文的表7显示了此实验的结果。两个共有VLP药物物质批次中仅一个(DCN12)展现出Sf9弹状病毒RNA信号，并且此信号等同于初始药物物质材料中每mL 128个RNA拷贝。共有药物物质批次DCN15未能产生信号(初始药物物质中每mL<10个RNA拷贝)。虽然批次DCN12材料呈阳性，但是用RNA酶A处理的相同材料没有展现出信号。此观察结果与非颗粒壳体化(非受保护)状态的Sf9弹状病毒RNA信号的存在一致。
表7：在RNA提取前具有和没有RNA酶A处理的情况中共有药物物质RNA样品的弹状病毒RNA Ct值。
*基于PCR样品大小和样品浓缩的程度，Ct值35.6对应于每mL初始药物物质128个Sf9弹状病毒RNA拷贝。对于此实验中采用的样品大小和浓缩程度且基于每个反应1个RNA拷贝的检测限，Ct值≥40指示药物物质中每mL<10个RNA拷贝。
表8显示了临qRT-PCR分析前添加限定的弹状病毒RNA掺入物作为RT-PCR抑制剂的对照后相同样品的Ct值。所有4份样品的相似Ct值提供了缺失污染性RT-PCR抑制剂的证据。
表8：作为RT-PCR抑制剂的测试，掺入有对照弹状病毒RNA的共有药物物质样品的弹状病毒RNA Ct值。
处理 DCN12 DCN15
无 20.70 20.77
RNA酶A 20.81 20.69
对照实验以证明RNA酶A处理不会降解弹状病毒颗粒内部的RNA。由于上述数据提供了纯化的诺瓦克和共有VLP药物物质材料中缺失壳体化弹状病毒RNA的证据，进行额外的对照实验以证明RNA酶A处理不导致已知在病毒颗粒中壳体化的RNA信号的降低或消除。这些数据确证表6和8中显示的数据。在此对照实验中，如上文对诺瓦克和共有药物物质描述的那样处理已知含有显著数量的Sf9弹状病毒的生产结束(EOP)材料，并通过RT-PCR量化信号。用或不用RNA酶A处理280μL EOP材料，然后使其在使RNA酶活性变性的条件下进行RNA提取。最终的纯化的RNA样品自初始EOP样品浓缩5.6倍。在一式三份qRT-PCR反应中测试3x 1μL每份纯化的RNA样品。下文表9中提供了数据。在RNA提取步骤前的RNA酶A处理对EOP材料中检测的弹状病毒RNA信号没有影响。RNA酶A与EOP材料中的弹状病毒RNA的化学计量比率是>10,000:1。这些数据证明了离液剂能成功用于灭活显著浓度的RNA酶A，这导致非降解的颗粒结合RNA的成功纯化。
表9：在RNA提取前具有和没有RNA酶A处理的情况中EOP材料的弹状病毒RNA Ct值。
实施例7：Sf9弹状病毒的透射电子显微术(TEM)。
经由切向流过滤和蔗糖梯度离心部分纯化Sf9细胞条件化培养基和杆状病毒裂解物中鉴定的Sf9弹状病毒，并通过透射电子显微术(TEM)对其成像。观察到许多明显有包膜、球形至椭圆形颗粒。270个颗粒的测量揭示了65.6x49.6nm的均值尺寸。病毒颗粒的这些观察结果与先前的显示Sf9培养物和裂解物中明显功能性的、颗粒结合的弹状病毒基因组RNA的存在的分子生物学数据一致。
在此研究中，进行设计为产生Sf9弹状病毒的透射电子显微照片的实验。建立用“空载体”杆状病毒感染的Sf9细胞的10升Wave袋培养物，随后收获。通过切向流过滤将澄清的裂解物浓缩至约112mL。分别在两个20-60％蔗糖密度步式梯度上分层2x 6mL浓缩物，并且于10℃以100,000x g离心90分钟。使用含有150mM NaCl的10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0(柠檬酸盐缓冲盐水，CBS)制备蔗糖步式溶液。将蔗糖梯度分级成1.5mL级分，并使用实施例3中描述的Sf9弹状病毒特异性qRT-PCR测定法(EOPC60测定法)分析级分。合并含有最强Sf9弹状病毒信号的峰级分(来自每个梯度的级分#13)。用CBS调节合并的级分至终体积32mL，然后在4mL CBS中的30％蔗糖垫上分层，并于10℃以100,000x g离心1小时。在离心后，弃去上清液，并在300μL CBS中重悬浮沉淀的材料。在用醋酸铀酰的负染色后，对此最终材料进行TEM分析。捕获多张显微照片，证明了球形至椭圆形并在大小和形状两者上略微不规则的许多包膜病毒颗粒的存在。大多数显微照片显示了就污染纯化的病毒颗粒制备物的碎片或其它材料而言较少的清楚图像。对270个颗粒的尺寸的分析证明了65.61±14.52x 49.56±11.58nm的均值大小。图2中提供了代表性TEM图像。
实施例8：昆虫细胞感染性研究
进行了一项研究以证明弹状病毒在先前没有感染病毒的别的选定昆虫细胞系中复制的能力。
最初在用重组杆状病毒感染后的Sf9细胞裂解物中发现本文中公开的Sf9弹状病毒，但是在不依赖于杆状病毒感染的Sf9细胞条件化培养基中也检出并量化病毒。也量化健康Sf9细胞内的弹状病毒RNA水平。在测试的所有Sf9细胞中鉴定病毒，并且病毒表现为以充分低的水平复制，足以不诱导细胞病变效应。
为了开发用于Sf9弹状病毒的感染性测定法，启动一项实验以测定Sf9弹状病毒是否能在别的昆虫细胞系上增殖。表10显示了自美国农业部(USDA)的农业研究服务中心(ARS)接受的一批几种昆虫细胞系。
表10：用于测试Sf9弹状病毒感染性的自USDA接受的一批细胞系。
细胞系名称 物种和器官起源
BCIRL/AMCY-SeE1 甜菜夜蛾卵
BCIRL/AMCY-SeE4 甜菜夜蛾卵
BCIRL/AMCY-SeE5 甜菜夜蛾卵
BCIRL/HvAM1 烟芽夜蛾卵巢
BCIRL/HzAM1 玉米夜蛾卵巢
BCIRL-HzFB33 玉米夜蛾脂肪体
BCIRL-HsAM1 亚曲夜蛾卵巢
BCIRL-AgAM1 藜豆夜蛾卵巢
在装有10ml EX-Cell 420培养基+10％胎牛血清的T25组织培养烧瓶中放置表10中提供的每种细胞系，并将所述每种细胞系暴露于Sf9弹状病毒，这通过取出5mL培养基并用5ml来自Sf9细胞的条件化培养基替换它来进行，所述条件化培养基已经经过离心，并过滤流过0.2微米膜以确保无Sf9细胞遗留。容许Sf9条件化培养基在细胞培养物上保持24小时，此后除去培养基并在EX-Cell 420培养基+10％FBS中进一步培养昆虫细胞系。在达到汇合后，收集每种培养物的约10％细胞，并以冷冻的细胞团粒(p0)贮存它们，而建立每种的新传代培养物以进行继续生长和传代。这样，对于传代数目p1和p2，收集每种细胞系的两份另外的冷冻细胞团粒。
在自暴露于Sf9弹状病毒的每种细胞系收集冷冻的细胞样品后，自每份细胞样品以及自来自没有暴露于Sf9弹状病毒的每种细胞系的对照细胞纯化总细胞RNA。在上文描述的Sf9弹状病毒qRT-PCR测定法中测试每份RNA样品以检测和量化任何弹状病毒RNA信号。按照“每μg总细胞RNA的fg弹状病毒RNA”表示数据，并且在图3中提供该数据。
对图3中的数据的检查导致几个有意义的观察结果。第一，细胞系HsAM1在暴露于Sf9细胞条件化培养基之前和之后展现出Sf9弹状病毒RNA信号，指示此细胞系早就感染有Sf9弹状病毒或紧密相关亲缘物。对Sf9细胞条件化培养基的进一步暴露没有导致感染性信号的进一步增加。第二，细胞系HvAM1、HzAM1、HzFB33、和AgAM1没有展现出显著复制Sf9弹状病毒的能力。在立即暴露于条件化培养基后像预期的那样观察到低水平RNA信号，但是这些信号没有像在后续传代中的病毒复制的情况中预期的那样增加。最后，且比较而言，三种甜菜夜蛾细胞系显示了Sf9弹状病毒的明显复制，RNA信号随每次传代而增加至少两个数量级。在传代2时这些细胞中的Sf9弹状病毒RNA信号水平等同于Sf9细胞中组成性观察到的那些水平。
如此，研究的结果显示了最初在Sf9草地夜蛾细胞系中鉴定的Sf9弹状病毒(或紧密亲缘物)在自亚曲夜蛾卵巢衍生的来自不同鳞翅类物种的第二种昆虫细胞系中组成性存在。另外，观察到Sf9弹状病毒在最初自甜菜夜蛾卵衍生的三种甜菜夜蛾细胞系中容易复制。
预期本领域技术人员会想到上文例示性实施例中列出的本发明的许多修改和变型。因此，只有所附权利要求书中出现的此类限制应当置于本发明。通过提及将本文中引用的所有出版物完整收入本文用于所有目的。
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Claims (47)

1.一种用于检测病毒的方法，其包括检测包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的反向互补序列的至少50个连续核苷酸的核酸序列。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括检测包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的反向互补序列的至少1000个连续核苷酸的核酸。
3.权利要求1的方法，其中所述方法包括检测包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的反向互补序列的至少1500个连续核苷酸的核酸。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法包括在PCR测定法中使用一种或多种引物和一种或多种经标记的探针。
5.权利要求4的方法，其中所述方法包括使用具有依照SEQ ID NO:2(TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG)的序列的正向引物和具有依照SEQ ID NO:3(CTCGCTGCTGAGCGGTTT)的序列的反向引物。
6.权利要求5的方法，其中所述经标记的探针的核苷酸序列依照SEQ ID NO:4(AGGATTGGAGAATTATAC)。
7.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法具有介于约2个RNA分子和约20个RNA分子之间的灵敏度水平。
8.权利要求7的方法，其中所述方法的灵敏度水平是约20个RNA分子。
9.权利要求7的方法，其中所述方法的灵敏度水平是约4个RNA分子。
10.一种用于自昆虫细胞衍生的蛋白质或病毒样颗粒(VLP)制备物除去病毒的方法，其中所述病毒包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列。
11.权利要求10的方法，其中所述病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。
12.权利要求10或11的方法，其中所述昆虫细胞是SF9细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述SF9细胞是自以ATCC CRL-1711保藏的细胞系衍生的。
14.一种自昆虫细胞衍生的蛋白质或病毒样颗粒(VLP)制备物，其中所述蛋白质或VLP基本上没有包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的核苷酸序列的病毒。
15.权利要求14的蛋白质或VLP，其中所述病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。
16.权利要求14或15的蛋白质或VLP，其中所述昆虫细胞是SF9细胞。
17.权利要求16的蛋白质或VLP，其中所述SF9细胞是自以ATCC CRL-1711保藏的细胞系衍生的。
18.一种组合物，其包含在昆虫细胞中生成的蛋白质或病毒样颗粒制备物，其中所述组合物基本上没有包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列的病毒。
19.权利要求18的组合物，其中所述病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。
20.权利要求18或19的组合物，其中所述昆虫细胞是SF9细胞。
21.权利要求20的组合物，其中所述SF9细胞是自以ATCC CRL-1711保藏的细胞系衍生的。
22.权利要求18至21中任一项的组合物，其中所述组合物是疫苗。
23.一种批准用于人的生物制品，其基本上没有与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的病毒，其中所述生物制品在昆虫细胞中生成。
24.权利要求23的生物制品，其中所述病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。
25.权利要求23或24的生物制品，其中所述昆虫细胞是SF9细胞。
26.权利要求25的生物制品，其中所述SF9细胞是自以ATCC CRL-1711保藏的细胞系衍生的。
27.权利要求23或24的生物制品，其中所述生物制品是疫苗或病毒样颗粒制备物。
28.一种用于检测具有与SEQ ID NO:1至少70％同源的序列的病毒的存在或缺失的试剂盒，该试剂盒包含一种或多种引物。
29.权利要求28的试剂盒，其包含正向引物、反向引物和探针。
30.一种用于检测细胞中病毒的存在或缺失的方法，其包括：
(i)具有依照SEQ ID NO:2的序列的正向引物，
(ii)具有依照SEQ ID NO:3的序列的反向引物，和
(iii)具有依照SEQ ID NO:4的序列的探针。
31.权利要求29或30的试剂盒，其中所述探针是用6-羧基荧光素(FAM)标记的。
32.一种用于检测样品中的颗粒结合Sf9弹状病毒的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)用RNA酶处理所述样品；
(ii)灭活所述RNA酶并破坏所述样品中的颗粒；
(iii)通过RT-PCR检测所述经RNA酶处理的样品中Sf9弹状病毒RNA的存在或缺失；
其中所述经RNA酶处理的样品中Sf9弹状病毒RNA的存在指示所检测的Sf9弹状病毒聚集至所述样品中的颗粒上或在所述样品中的颗粒内包装。
33.权利要求32的方法，其中所述RNA酶是RNA酶A。
34.权利要求32的方法，其中使用具有依照SEQ ID NO:2的序列的正向引物、具有依照SEQ ID NO:3的序列的反向引物和具有依照SEQ ID NO:4的序列的探针进行所述RT-PCR。
35.权利要求32的方法，其中使用离液剂进行步骤(ii)。
36.权利要求32的方法，其进一步包括在用RNA酶处理所述样品前通过RT-PCR检测所述样品中Sf9弹状病毒RNA的存在或缺失。
37.一种用于检测样品中的有复制能力的Sf9弹状病毒的方法，所述方法包括将所述样品与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)细胞系一起温育，在与所述样品一起温育后将所述细胞系传代至少一次，并在下述时间点时检测Sf9弹状病毒RNA的存在或缺失：在将所述细胞系与所述样品一起温育后和在所述细胞的每次传代后；
其中相对于将所述细胞系与所述样品一起温育后立即检测到的Sf9弹状病毒RNA信号水平，一次或多次传代的至少一项后Sf9弹状病毒RNA信号的水平升高指示所述Sf9弹状病毒存在于所述样品中且能够复制。
38.一种用于检测样品中有复制能力的颗粒结合Sf9弹状病毒的存在或缺失的方法，所述方法包括：
(i)用RNA酶处理所述样品；
(ii)灭活所述RNA酶并破坏所述样品中的颗粒；
(iii)通过RT-PCR检测所述经RNA酶处理的样品中Sf9弹状病毒RNA的存在或缺失；
(iv)将所述经RNA酶处理的样品与甜菜夜蛾细胞系一起温育；
(v)将所述细胞系传代至少一次；
(vi)在下述时间点时自所述细胞系纯化总RNA：在与所述经RNA酶处理的样品一起温育后，和在所述至少一次细胞传代的每项后；并
(vii)通过RT-PCR在来自每个时间点的所述总RNA中检测Sf9弹状病毒RNA；
其中相对于将所述细胞系与所述经RNA酶处理的样品一起温育后立即检测到的Sf9弹状病毒RNA的水平，至少一次传代后检测到的Sf9弹状病毒RNA的水平升高指示Sf9弹状病毒能够复制。
39.权利要求38的方法，其中所述RNA酶是RNA酶A。
40.权利要求38的方法，其中使用具有依照SEQ ID NO:2的序列的正向引物、具有依照SEQ ID NO:3的序列的反向引物和具有依照SEQ ID NO:4的序列的探针进行所述RT-PCR。
41.权利要求38的方法，其中使用离液剂进行步骤(ii)。
42.权利要求38的方法，其进一步包括在用RNA酶处理所述样品前通过RT-PCR检测所述样品中Sf9弹状病毒RNA的存在或缺失。
43.权利要求32、37或38的方法，其中所述样品是药物物质，且其中在所述药物物质的释放测定法中使用所述方法。
44.一种用于检测样品中有复制能力的Sf9弹状病毒的存在或缺失的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)用于检测Sf9弹状病毒RNA的正向和反向引物和探针；
(ii)RNA酶；
(iii)离液剂；和
(iv)甜菜夜蛾细胞系。
45.一种组合物，其包含甜菜夜蛾细胞和弹状病毒。
46.权利要求45的组合物，其中所述弹状病毒包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列。
47.权利要求46的组合物，其中所述弹状病毒包含依照SEQ ID NO:1的序列。
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