JP6893174B2 - 粒子に含まれる逆転写酵素活性の検出 - Google Patents
粒子に含まれる逆転写酵素活性の検出 Download PDFInfo
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-
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-
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
本出願は、2015年1月16日に出願された米国仮出願第62/104,252号の優先権及び利益を主張する。前記特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS−Webを介してASCII形式で提出されたシーケンスリストを含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2016年1月13日に作成された前記ASCIIコピーは、LIGO−02701WO_ST25.txtという名称で、サイズは15,131バイトである。
1.試料中の高濃度のタンパク質に基づく成分を希釈するために、より大きい容量の緩衝液、例えばプロテイナーゼK緩衝液中への被験試料の希釈は、ウイルス粒子が持たないRTのより完全なタンパク質消化を可能にする。
2.ウイルス粒子の、例えばプロテイナーゼKによるタンパク質消化の間にごく少量の界面活性剤、例えばTriton X−100の添加は、完全な消化を促進するのに役立つ。さらに、使用される界面活性剤の量は、ウイルス粒子が持つRT活性を減少させない。
3.プロテアーゼ阻害剤、例えばPMSFの添加によるプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼKの不活性化は、タンパク質消化工程の後に行われる。
4.プロテアーゼ阻害剤の存在下で、プロテアーゼの不活性化後のウイルス粒子の収集及び濃縮、例えばスクロースクッションを介した高速遠心分離を実施して、プロテアーゼ活性がPBRT反応中に持続しないことを確実にする。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルス」、「エンベロープウイルス」、「ウイルス粒子」は互換的に使用され、ある属性でウイルスに類似するが、感染性及び/または複製能があることが実証されていてもいなくてもよい構造体を指す。一方、「ウイルス様粒子(VLP)」は、ある属性でウイルスに類似しているが、遺伝物質がない構造体を指す。したがって、VLPは感染性ではなく、及び/または複製能を有しない。したがって、VLPは対象に有害ではない。しかし、対象にVLPをワクチン接種すると、免疫系にウイルスが存在するかのように、免疫応答が生じる。
少量のRT活性を測定するために、非常に感度の高いPCRベースのRT(PBRT)アッセイが必要であった。アルボウイルスRT−PCRアッセイの開発を含む別の研究では、RT−PCR実験において再現性のある性能を示すデング4型ゲノムの特定の配列が同定された。この配列をRNA鋳型として含むインビトロ転写RNAをPBRTアッセイにおけるRT活性の検出に用いた。表1は、Den4 RT−PCRアッセイに用いたプライマー及びプローブ配列を示す。
粒子が持つRT酵素活性と遊離のRT酵素活性とを区別するための例示的なプロテアーゼとして、プロテイナーゼK(PK)を選択した。適切な条件下では、PKは、所定の試料中の非粒子含有RT活性を全て効果的に排除するが、インタクトなエンベロープレトロウイルス粒子中のRT活性はタンパク質分解消化から保護されると考えられた。この方法論の条件は、ノロウイルスVLP原薬試料をモデルとして用いて開発された。VLP薬物物質の遊離(非ウイルス粒子含有)酵素活性の対照として、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)RTを補充した。インタクトなレトロウイルス粒子に含有されるRTの対照として、VLP原薬の試料にマウス白血病ウイルス(MLV)粒子を補充した。アッセイは、AMV RT補充によるRT活性がPK活性によって排除され、MLV粒子補充からのRT活性が保護された(すなわち、RT活性が持続した)場合に成功したと考えられた。アッセイの極めて重要な部分は、タンパク質分解活性がPBRTアッセイ工程に引き継がれず、それによってRT−PCR性能が低下しないように、PK処理後のPK活性を完全に不活性化する能力であると思われた。また、PK抑制剤がPBRTアッセイを妨害してはならないと決定された。
1.試料中の高濃度のウイルス様粒子を希釈するための、より大きい容量のプロテイナーゼK緩衝液中で試験すべき試料の希釈であって、ウイルス粒子に含まれていないRTのより完全なタンパク質分解を可能にする。
2.ウイルス粒子のプロテイナーゼK消化中にごく少量のTriton X−100を添加すると、完全な消化が促進される。さらに、使用されるTriton X−100の量は、ウイルス粒子が持つRT活性を減少させない。
3.タンパク質分解消化工程の後に、PMSFの添加によるプロテイナーゼKの不活性化が必要である。
4.プロテイナーゼKの不活性化後のウイルス粒子のスクロースクッションを介した高速遠心分離による回収及び濃縮は、PMSFの存在下で行われ、プロテイナーゼK活性がPBRT反応中に持続しないことを確実にする。
実施例1のPBRTアッセイに従って、3つのノーウォークVLP原薬の0.5mL試料を分析した。試料1は補充されなかった。陽性対照として機能する試料2及び3には、それぞれAMV RTまたはMLVが補充された。補充後、25μLの各試料を取り置いてベースラインRT活性を、すなわちタンパク質分解消化前のものを測定した。各試料の残りの部分をPK消化に供した後、高速遠心分離によってインタクトなウイルス粒子を回収した。RT活性をアッセイする前に、すべての試料を2×AMV希釈緩衝液(非イオン性界面活性剤の供給源)で1:2に希釈して、いずれかのエンベロープ粒子を溶解(破壊)させ、それによってすべてのRT活性を測定するのを確実にした。実施例1に記載のPBRTアッセイを用いて、PK消化され及び取り置いた試料をRT活性についてアッセイした。この実験からのデータを表3に示す。
粒子に関連したエルアンチウイルス(errantivirus)RNA配列は、健常な非バキュロウイルス感染Sf9細胞から収穫した培地と比較して、産生終了(EOP)収穫物画分(すなわち、バキュロウイルス溶解Sf9細胞)においてより広まっていることが示されている;EOP収穫物質画分は、健康なSf9細胞から収穫された培地よりも遊離及び粒子結合RTの両方がより多く含まれていると考えられる。
先の実施例に示されたデータは、RT−PCR緩衝液中のMg2+イオンを使用する実験において生成された。Mn2+イオンを必要とする酵素から新規のRT活性を検出する可能性を考慮に入れるために、RT−PCRマスターミックス緩衝液中に3mMのMnCl2を添加して原薬の評価実験を繰り返した。これらの実験の結果を表6に示す。
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載された本発明を限定するのではなく、すべての点において例示的であるとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等物の意味及び範囲内に入るすべての変更は、その中に包含されることが意図される。
Claims (18)
- 試験試料中のウイルス粒子に含まれる逆転写酵素活性の存在を検出するための方法であって、
(1)前記試験試料にプロテアーゼを添加し、前記プロテアーゼを添加して得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にする条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、
(2)前記消化溶液中にプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、前記プロテアーゼを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、
(3)インタクトなウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む溶液を生成する工程と、
(4)前記界面活性剤を含む溶液または前記界面活性剤を含む溶液の画分に、単離されたRNA分子、前記単離されたRNA分子の第1の部分に対応する核酸配列にハイブリダイズする第1のプライマー、前記単離されたRNA分子の第2の部分の相補体にハイブリダイズする第2のプライマー、及びDNAポリメラーゼを添加し、それによってPCRに基づく逆転写酵素(PBRT)アッセイ溶液を調製する工程と、
(5)ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素活性が前記試験試料中に存在する場合、逆転写産物が前記単離されたRNA分子から合成され、PCR増幅産物が前記逆転写産物から合成されることを可能にする条件下で、前記PBRTアッセイ溶液をインキュベートする工程と、
(6)前記PCR増幅産物を同定し、それによって前記試験試料中の前記ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素の存在を検出する工程と、を含む、方法。 - 前記単離されたRNA分子に対応する核酸配列にハイブリダイズする検出可能な標識を含む単離された核酸プローブが、工程(3)の後または工程(4)の間に添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記試験試料を緩衝液で希釈する、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤の濃度が0.002%未満であるように、インタクトなウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で工程(1)の間に界面活性剤を添加する、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤を含む溶液または前記PBRTアッセイ溶液中の前記界面活性剤の濃度が0.1%〜0.3%であるように、工程(3)の間に前記界面活性剤が添加される、請求項1に記載の方法。
- 工程(3)の前に前記不活性化プロテアーゼ溶液を濃縮する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 可溶性逆転写酵素を含む陽性対照試料または逆転写酵素を持つ粒子を含む陽性対照試料を得て、工程(1)〜(6)、(2)〜(6)、(3)〜(6)、または(4)〜(6)に従って処理する、請求項1に記載の方法。
- 前記陽性対照試料が前記試験試料を含む、請求項7に記載の方法。
- 試料を得て、工程(1)〜(6)に従って処理するが、工程(4)において単離されたRNA分子を添加することなく処理し、それによって陰性対照試料を生成する、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、ビオチン、コロイド粒子、ジゴキシゲニン、高電子密度試薬、酵素、蛍光色素、ハプテン、磁気ビーズ、金属ビーズ、及び放射性同位体からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記試験試料がウイルス様粒子(VLP)原薬である、請求項1に記載の方法。
- 前記VLP原薬がノロウイルスVLP原薬である、請求項11に記載の方法。
- 前記ノロウイルスがノーウォークウイルスである、請求項12に記載の方法。
- 前記単離されたRNA分子が、配列番号1の配列を有するデング熱ウイルス4型ゲノムの断片と少なくとも95%同一である、請求項1に記載の方法。
- 前記単離されたRNA分子が、配列番号5の配列と少なくとも95%同一である、請求項14に記載の方法。
- 前記第1のプライマーが配列番号3の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のプライマーが配列番号2の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- ウイルス様粒子(VLP)原薬中のエンベロープレトロウイルス粒子の存在を検出するための方法であって、
(1)VLP原薬の試料を得る工程と、
(2)Triton X−100界面活性剤を補ったプロテイナーゼK緩衝液で前記試料を希釈し、それにより希釈試料を得る工程であって、
前記Triton X−100がインタクトなウイルス粒子を破壊するのに不十分な量で存在する、工程と、
(3)前記希釈試料にプロテイナーゼKを添加し、前記プロテイナーゼKを添加して得られた溶液中に存在するいずれかの可溶性逆転写酵素を消化することを可能にするが、ウイルス粒子に含まれる逆転写酵素のすべては消化しない条件下で、前記得られた溶液をインキュベートし、それによって消化溶液を生成する工程と、
(4)フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を添加することにより前記消化溶液中の前記プロテイナーゼKを不活性化し、それによって不活性化プロテアーゼ溶液を生成する工程と、
(5)前記不活性化プロテアーゼ溶液を、スクロースクッションを介した高速遠心分離により遠心分離し、それによって濃縮溶液を生成する工程と、
(6)インタクトなウイルス粒子を破壊するのに十分な量の界面活性剤を添加し、それによって界面活性剤を含む濃縮溶液を生成する工程と、
(7)前記界面活性剤を含む濃縮溶液または前記界面活性剤を含む濃縮溶液の画分に、単離されたRNA分子、前記単離されたRNA分子に対応する核酸配列の5’末端にハイブリダイズする第1のプライマー、前記単離されたRNA分子の3’末端にハイブリダイズする第2のプライマー、前記単離されたRNA分子にハイブリダイズする単離された核酸プローブ、及びDNAポリメラーゼを添加し、それによってPCRに基づく逆転写酵素(PBRT)アッセイ溶液を調製する工程と、
(8)逆転写酵素を含むレトロウイルス粒子が前記PBRTアッセイ溶液中に存在する場合、前記単離されたRNA分子から逆転写産物が合成され、かつ前記逆転写産物からPCR増幅産物が合成されることを可能にする条件下で、前記PBRTアッセイ溶液をインキュベートする工程と、
(9)前記PCR増幅産物を同定し、それによって前記VLP原薬中の前記エンベロープレトロウイルス粒子の存在を検出する工程と、を含む、方法。
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