JP7191175B2 - 細胞株からラブドウイルスを検出および除去する方法 - Google Patents

細胞株からラブドウイルスを検出および除去する方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
[0001] 本願は、全ての目的のため本明細書に参照によりその全体の内容が組み込まれる、２０１３年１０月３日に出願された米国特許仮出願第６１／８８６，４３８号に対する優先権を主張するものである。
本明細書に添付して電子的に提出されたテキストファイルの説明
[0002] 本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる：配列表のコンピュータ読み取り可能フォーマットコピー（ファイル名：LIGO_026_01WO_SeqList_ST25.txt；記録された日付：２０１４年１０月３日；ファイルサイズ１８Ｋｂ）。
[0003] ＳＦ２１およびＳＦ９細胞等の昆虫細胞は、ヒト疾患における使用のための治療用生物学的産物の産生を含む、タンパク質発現のために一般的に用いられる。昆虫細胞は、バキュロウイルス発現系と併せて用いられることが多い。このようなバキュロウイルス－昆虫細胞発現系は、高密度に成長し、十分なレベルのタンパク質を発現するそれらの能力や大規模懸濁培養に容易に適応させることができるという事実があることから、生物学的産物の産生のために用いられてきた。これらの細胞は、広範な検査の結果、混入ウイルスを含まないと長らく考えられてきた。
[0004] 本技術分野において、混入ウイルスを含まない昆虫細胞、昆虫細胞が混入ウイルスを含まないかを決定するための方法、および混入ウイルスを含まない昆虫細胞から産生されるヒト治療法に適した産物が必要とされている。
[0005] 一態様において、本開示は、試料中の混入因子（agent）を検出するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部の実施形態において、試料は、昆虫細胞株において産生されるかまたはこれを用いて作製されるタンパク質、ペプチド、原体（drug substance）、生物学的産物、ウイルス、ワクチン抗原またはウイルス様粒子（VLP）調製物である。一部の実施形態において、昆虫細胞株は、Ｓｆ９またはＳｆ２１である。一部の実施形態において、混入因子は、ウイルスまたはウイルスゲノムの一部である。一部の実施形態において、本開示は、本明細書において「Ｓｆ９ラブドウイルス」と称する新規ウイルスの検出のための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一態様において、本開示は、Ｓｆ９ラブドウイルスの核酸配列および他の特徴を提供する。別の態様において、本開示は、試料中のＳｆ９ラブドウイルスまたはＳｆ９ラブドウイルス核酸またはＳｆ９ラブドウイルス粒子が、複製することができるかを決定するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部の実施形態において、本開示は、（ｉ）試料が、ＲＴ－ＰＣＲによって測定される検出可能レベルのＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡを含有するか；（ｉｉ）Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡが、試料中のヌクレアーゼ抵抗性粒子に存在するか；および／または（ｉｉｉ）Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡが、複製することができるかを決定するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。
[0006] 一態様において、本発明は、配列番号１または配列番号１の逆相補体（reverse complement）の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００または少なくとも２０００個の近接ヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ウイルスを検出するための方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示されているウイルスを検出するための方法は、ＰＣＲアッセイにおいて１種または複数のプライマーおよび１種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含む。一部の実施形態において、プローブは、標識されたプローブである。
[0007] 一部の実施形態において、本開示は、ウイルスを検出するための方法であって、約１分子のＲＮＡ～約５０分子のＲＮＡの間の感度レベルを有する方法を提供する。
[0008] 一態様において、本開示は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはウイルス様粒子（VLP）調製物からウイルスを除去するための方法であって、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物が、昆虫細胞を用いて作製されるかまたは昆虫細胞において産生され、ウイルスが、配列番号１に対し少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％相同性を有する配列を含む方法を提供する。さらなる実施形態において、ウイルスは、配列番号１の配列を含む。複数の実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である。さらなる実施形態において、Ｓｆ９細胞は、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１として寄託された細胞株に由来する。
[0009] 一態様において、本開示は、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物であって、配列番号１に対し少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％相同性を有するヌクレオチド配列を含むウイルスを実質的に含まないタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰを提供する。さらなる実施形態において、ウイルスは、配列番号１の配列を含む。実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である。さらなる実施形態において、Ｓｆ９細胞は、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１として寄託された細胞株に由来する。本発明は、このような物質を含み、薬学的に許容される担体と任意選択により組み合わされた組成物、ならびにこのような物質におけるウイルスの存在または非存在を検出するためのキットも包含する。
[0010] 一態様において、本開示は、試料中の粒子上に凝集した、および／またはその中にキャプシド形成した、Ｓｆ９ラブドウイルスの存在または非存在を検出するための方法を提供する。一部の実施形態において、試料は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物である。一部の実施形態において、本方法は、（ｉ）ＲＮＡを分解する酵素による処理に試料を付す工程と、（ｉｉ）酵素活性を停止させ、粒子を破壊するために、カオトロピック剤等、１種または複数の剤に試料を付す工程と、（ｉｉｉ）ＲＴ－ＰＣＲによって、得られた試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在または非存在を検出する工程とを含む。さらなる実施形態において、本方法は、工程（ｉ）において酵素処理に試料を付す前に、ＲＴ－ＰＣＲによって試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在または非存在を検出する工程を含む。一部の実施形態において、工程（ｉ）および（ｉｉ）の後に検出されるＲＮＡシグナルは、工程（ｉ）に先立ち検出されるＲＮＡシグナルと比較される。一部の実施形態において、酵素処理および粒子破壊後に検出されるＲＮＡは、試料中の粒子に存在する。
[0011] 一態様において、本開示は、配列番号１によるウイルスの断片または配列番号１に相補的な配列の断片であって、標識または化学修飾された断片をさらに提供する。
[0012] 一態様において、本開示は、Ｓ．ｅｘｉｇｕａ細胞と、ラブドウイルスとを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、ラブドウイルスは、配列番号１に対し少なくとも７０％相同性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ラブドウイルスは、配列番号１の配列を含む。
[0013]図１は、センス配向性（５’から３’）で示される、Ｓｆ９ラブドウイルスゲノムのマップを提示する。 [0014]図２は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって撮像された、Ｓｆ９ラブドウイルスの９枚の個々の画像を提示する。 [0015]図３は、感染前（pre-infection）の、または継代０、１もしくは２の、Ｓｆ９細胞馴化培地に曝露された昆虫細胞（AMCY-SeE1、AMCY-SeE4、AMCY-SeE5、HvAM1、HzAM1、HzFB33、HsAM1またはAgAM1）中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの検出を示すグラフである。全細胞ＲＮＡ１μｇ当たりのフェムトグラム（fg）ラブドウイルスＲＮＡとして、データを表す。
[0016] 本開示は、試料中の混入因子を同定するためおよび／または試料から混入因子を除去するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部には、本開示は、昆虫細胞株Ｓｆ９細胞に存在することが同定された新規ウイルスを提供する。治療目的の生物学的産物を産生するために創薬において一般的に用いられるＳｆ９細胞および他の昆虫細胞株は、混入ウイルスを含まないと以前から考えられてきた。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に開示されている新規ウイルスが、Ｓｆ９細胞に存在したことを見出した。本明細書に記載されている研究に基づき、新規ウイルスは、ラブドウイルスであると決定された。このラブドウイルスは、Ｓｆ９以外の細胞株に見出されたものの、本明細書に開示されているラブドウイルスは、本明細書において「Ｓｆ９ラブドウイルス」と称する。Ｓｆ９ラブドウイルスの配列は、配列番号１として本明細書に提示されている。
[0017] 本開示は、ウイルスの核酸および他の特徴、ウイルスの検出における使用のための方法、アッセイおよびキット、ならびにウイルスを実質的に含まない細胞または生物学的産物を提供する。一実施形態において、生物学的産物は、治療および／または診断目的の産物である。さらなる実施形態において、治療および／または診断目的の生物学的産物は、少なくとも一部には、昆虫細胞株を用いて作製される。さらなる実施形態において、昆虫細胞株は、Ｓｆ９またはＳｆ２１である。
[0018] 一態様において、本開示は、Ｓｆ９細胞におけるウイルスの存在を検出するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。一態様において、本開示は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物におけるウイルスの存在を検出するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。さらなる実施形態において、原体は、Ｓｆ９細胞等、昆虫細胞を用いて作製されたかまたは昆虫細胞において産生された。一態様において、本開示は、Ｓｆ９ラブドウイルスが、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物等、試料中の粒子上に凝集されるかまたはその内にキャプシド形成されるかを決定するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。一態様において、本開示は、試料（例えば、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物）において同定されたＳｆ９ラブドウイルスが、複製することができるかを決定するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。
[0019] 一態様において、本開示は、試料中のウイルスの検出に関する。一実施形態において、標的核酸は、単離、増幅および検出される。標的ＲＮＡ配列を検出および増幅するための方法（例えば、逆転写PCR（RT-PCR）による）を含む、核酸を単離、増幅または検出するための方法は、本技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版（２０１２） ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）に記載されている。
[0020] 一態様において、本開示は、配列番号１または配列番号１の逆相補体の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００または少なくとも２０００個の近接ヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ウイルスを検出するための方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示されているウイルスを検出するための方法は、ＰＣＲアッセイにおいて１種または複数のプライマーおよび１種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含む。さらなる実施形態において、本方法は、配列番号２（ＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＡＧ）の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号３（ＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＴ）の配列を有するリバースプライマーを用いる工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、配列番号４（ＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＡＴＡＣ）の配列を有するプローブを用いる工程を含む。
[0021] 一部の実施形態において、本開示は、配列番号１によるウイルスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、配列番号１によるウイルスの断片または配列番号１に相補的な配列の断片をさらに提供する。一部の実施形態において、Ｓｆ９ラブドウイルスゲノムまたはラブドウイルスゲノムに相補的な配列の断片は、標識または化学修飾される。
[0022] 一部の実施形態において、本開示は、Ｓｆ９ラブドウイルスを検出することができる配列を含む標識されたプローブを提供する。一部の実施形態において、標識されたプローブは、Ｓｆ９ラブドウイルスゲノムの一部またはＳｆ９ラブドウイルスゲノムにおける配列の逆相補体に相補的である。
[0023] 一部の実施形態において、配列、断片またはプローブは、例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６－カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシローダミンならびにシアニン色素等、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体からなる群から選択されるフルオロフォアで標識される。一実施形態において、プローブは、６－カルボキシ－フルオレセイン（FAM）で標識される。一部の実施形態において、本開示は、ウイルスを検出するための方法であって、約１分子のＲＮＡ～約５０分子のＲＮＡの間の感度レベルを有する方法を提供する。さらなる実施形態において、本方法は、約２分子のＲＮＡ～約２０分子のＲＮＡの間の感度レベルを有する。他の実施形態において、本方法の感度レベルは、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４または約２５分子のＲＮＡである。
[0024] 一態様において、本開示は、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、ウイルスもしくはＶＬＰ調製物、または昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、ウイルスもしくはＶＬＰ調製物を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、ＶＬＰ調製物は、カリシウイルスＶＬＰ調製物である。さらなる実施形態において、ＶＬＰ調製物は、ノロウイルスＶＬＰ調製物である。ＶＬＰ調製物は、１種または複数のウイルスまたはウイルス株由来の１種もしくは複数のカプシドタンパク質またはカプシドタンパク質の一部を含む一価または多価ＶＬＰ調製物を含む。例えば、ノロウイルスＶＬＰ調製物は、１種または複数のノロウイルス遺伝子群（genogroup）由来の１種もしくは複数のカプシドタンパク質またはカプシドタンパク質の一部を含む一価または多価ＶＬＰ調製物を含む。本明細書における「一価ＶＬＰ」が、単一ウイルス株由来のＶＬＰ抗原を含有するＶＬＰを指す一方、本明細書における「多価ＶＬＰ」は、２種以上のウイルス株由来のＶＬＰ抗原を含有するＶＬＰを指す。異なる一価ＶＬＰが、同じＶＬＰ製剤において共に存在してもよい。例えば、一部の実施形態において、ノロウイルスＶＬＰ調製物は、１種のノロウイルス遺伝子群由来のＶＰ１および／またはＶＰ２カプシドを含むことができる、あるいは１種のノロウイルス遺伝子群由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質と共に、第２のノロウイルス遺伝子群由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含むことができる。ノロウイルスＶＬＰ調製物の例は、ノロウイルス遺伝子群Ｉ、遺伝子型１／ノロウイルス遺伝子群ＩＩ、遺伝子型４（ＧＩ．１／ＧＩＩ．４）二価ＶＬＰであり、これは、例えば、に記載されている。
[0025] 一態様において、本開示は、試料中の、配列番号１に対し少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％相同性の配列を有するウイルスの存在または非存在を検出するためのキットであって、１種または複数のプライマーを含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含む。さらなる実施形態において、フォワードプライマーは、配列番号２の配列を有し；リバースプライマーは、配列番号３の配列を有し；プローブは、配列番号４の配列を有する。一部の実施形態において、プローブは、例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６－カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシローダミンならびにシアニン色素等、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体からなる群から選択されるフルオロフォアで標識される。一実施形態において、プローブは、６－カルボキシ－フルオレセイン（FAM）で標識される。
[0026] 一態様において、本開示は、Ｓｆ９ラブドウイルスが試料に存在するかを決定し、Ｓｆ９ラブドウイルスが複製することができるかを決定するための、検査のための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＲＴ－ＰＣＲによって試料中のＳｆ９ラブドウイルスの存在または非存在を検出する工程を含み、この方法は、ＰＣＲアッセイにおいて１種または複数のプライマーおよび１種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含み、このアッセイは、配列番号２（ＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＡＧ）の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３（ＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＴ）の配列を有するリバースプライマーと、配列番号４（ＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＡＴＡＣ）の配列を有する標識されたプローブの使用を含む。実施形態において、本開示は、試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルが、粒子および／または凝集体に存在するかを決定するための方法であって、試料をＲＮａｓｅ Ａ処理に付し、続いてＲＮａｓｅ Ａ活性を停止し、粒子を破壊するためにカオトロピック剤で処理する工程を含む方法をさらに提供する。次に、処理された試料を上述のＲＴ－ＰＣＲアッセイに付す。得られた試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルは、Ｓｆ９ラブドウイルスが、試料中の粒子に存在することを示す。実施形態において、本開示は、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡが複製することができるかを決定するための方法をさらに提供する。そのため、例えば、Ｓ．ｅｘｉｇｕａ細胞等、Ｓｆ９ラブドウイルス複製に許容的な細胞株と共に試料をインキュベートし、続いて細胞を継代する。増加するＳｆ９ラブドウイルスＲＴ－ＰＣＲシグナルは、ウイルスが複製することができることを示す。よって、本開示は、Ｓｆ９ラブドウイルスの存在または非存在を検出するためのならびにＳｆ９ラブドウイルスの感染力を評価するためのキットを提供する。実施形態において、本キットは、（ｉ）Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡの検出のためのフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブと、（ｉｉ）ＲＮａｓｅと、（ｉｉｉ）カオトロピック剤と、（ｉｖ）Ｓ．ｅｘｉｇｕａ細胞株とを含む。
[0027] 一態様において、本開示は、ラブドウイルス、ラブドウイルス核酸もしくはラブドウイルス粒子を含まない、またはラブドウイルス発現のない昆虫細胞を提供する。さらなる実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞である。一部の実施形態において、昆虫細胞は、本明細書に開示されているＳｆ９ラブドウイルスを含まず、Ｓｆ９ラブドウイルス核酸または粒子を含まない。一部の実施形態において、ラブドウイルスは、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞から除去されている。他の実施形態において、ラブドウイルス、ラブドウイルス核酸またはラブドウイルス粒子の発現は、昆虫細胞においてブロックされている。例えば、一部の実施形態において、ラブドウイルス発現は、ラブドウイルスゲノムに標的化されたｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドによってブロックされている。よって、一部の実施形態において、本開示は、Ｓｆ９ラブドウイルスゲノムまたはラブドウイルスゲノムに相補的な配列の断片を提供する。さらなる実施形態において、Ｓｆ９ラブドウイルスゲノムまたはラブドウイルスゲノムに相補的な配列の断片は、標識または化学修飾される。よって、一部の実施形態において、本開示は、配列番号１またはその相補的配列に対応する標識または化学修飾されたｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
[0028] 一態様において、本開示は、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物からラブドウイルスを除去するための方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、精製後にラブドウイルス（例えば、Sf9ラブドウイルス）の存在または非存在を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態において、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物からラブドウイルスを除去するための方法は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、SDR HyperDクロマトグラフィーおよび本技術分野において公知の、例えば、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる米国特許第８，４８１，６９３号に開示されている他のクロマトグラフィー方法）、濾過（例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーションおよび０．２μｍ濾過）、洗剤による処理または他の精製方法を含み、この方法は、精製後にラブドウイルスの存在または非存在を検出する工程をさらに含む。
[0029] ラブドウイルスは、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄｉａｅ科（目：Mononegavirales）に属し、この科は、マイナス（－）センスＲＮＡウイルスの多様な科であり、少なくとも６属：Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ（とりわけ、狂犬病ウイルスを含む）、ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（とりわけ、水疱性口内炎（vesicular stromatitis）ウイルス（VSV）を含む）、ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ（とりわけウシ流行熱ウイルスを含む）、ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（とりわけ、レタス壊死性黄変病（necrotic yellows）ウイルス等の植物ウイルスを含む）、ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（とりわけ、ジャガイモ黄萎病ウイルス等の植物ウイルスを含む）およびｎｏｒｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓを含む。
[0030] Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよび他のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ昆虫種由来の細胞等、昆虫細胞は、本技術分野において周知であり、組換えタンパク質の産生のため、例えば、ワクチンを含む治療用産物の産生のため、バキュロウイルスまたは他のウイルスの感染および複製の支持に一般的に用いられている。Ｓｆ９細胞株は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞から元々得られた、Ｓｆ２１細胞のクローン分離株である。Ｓｆ９細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１は、１９８３年にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ATCC）に寄託された。他の昆虫細胞株として、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓその他が挙げられるがこれらに限定されない。
[0031] 用語「Ｓｆ９ラブドウイルス」は、本明細書において、本明細書に開示されている新規ウイルスを指す。Ｓｆ９ラブドウイルスの核酸配列は、配列番号１として本明細書に提示されている。本明細書において、用語「複製コンピテント」または「複製可能」は、Ｓｆ９ラブドウイルスまたはＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡ分子の記載に用いられる場合、自己複製し、宿主細胞における転写をもたらすウイルスまたはＲＮＡ分子を意味する。
[0032] 本明細書において、用語「プライマー」は、ＰＣＲ反応において用いられるために十分な数の塩基を有する一連のヌクレオチド残基を指す。プライマーは、試料中の同一、同様または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認または明らかにするために用いることができる。本明細書において、用語「プローブ」は、同一、同様または相補的な核酸配列の検出において用いられる核酸配列を指す。
[0033] 一態様において、本開示は、試料中のウイルスを検出するためまたは試料からウイルスを除去するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供し、試料は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはＶＬＰ調製物である。本明細書において、用語「ウイルス様粒子およびＶＬＰ」は、互換的に用いられ、一属性においてウイルスに似ているが、感染性が明示されていない構造を指す。用語「原体」は、本明細書において、治療薬を含有し、医薬組成物または薬製品の製剤化に賦形剤と共に用いられる材料を指す。「生物学的産物」は、本明細書において、細胞または生物によって産生される産物または材料を指す。生物学的産物は、生物の天然の産物となり得るか、あるいはこの生物学的産物を産生するように何らかの仕方で変更された生物によって産生され得る。生物学的産物の例として、ワクチン、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、治療用タンパク質、ウイルス（例えば、バキュロウイルス等、例えば、遺伝子療法のための組換えウイルス）、酵素、成長因子、多糖、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸ならびに粒子（例えば、ウイルス様粒子）が挙げられるがこれらに限定されない。生物学的産物は、例えば、グリコシル化または放射標識によって変更することができる。
[0034] 一態様において、本開示は、複製することができるＳｆ９ラブドウイルスを検出するため、またはＳｆ９ラブドウイルスが複製コンピテントであるかを決定するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。よって、一態様において、本開示は、試料に存在するＳｆ９ラブドウイルスが複製することができるかを決定するための手段を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルを含む試料を、Ｓｆ９ラブドウイルス複製を支持することができる細胞株と共にインキュベートする工程を含む。一部の実施形態において、Ｓｆ９ラブドウイルス複製を支持することができる細胞株は、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ細胞株となり得る。このような細胞株のいくつかは、本明細書に開示されており、例えば、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ－ＳｅＥ１、ＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ－ＳｅＥ４およびＢＣＩＲＬ／ＡＭＣＹ－ＳｅＥ５等、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ細胞に由来する細胞株を含む。一部の実施形態において、Ｓ．ｅｘｉｇｕａ細胞株は、１０％ウシ胎仔血清を含有するＥＸ－Ｃｅｌｌ４２０培地において培養される。一部の実施形態において、複製するＳｆ９ラブドウイルスは、本明細書に開示されているとおりＲＴ－ＰＣＲによってＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルをいくつかの時点で測定することにより検出される。例えば、一実施形態において、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡを検出するためのＲＴ－ＰＣＲは、細胞株とのインキュベーションの前に、細胞株とのインキュベーションの直後に（継代０において）、および細胞株のその後の継代の後に（例えば、継代１および２の後に）試料において行われる。少なくとも１回の継代の後に、ＲＴ－ＰＣＲによって検出されるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの増加は、Ｓ．ｅｘｉｇｕａ細胞株においてウイルスが複製していることを示す。ＲＴ－ＰＣＲによって検出されるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの減少または変化の欠如は、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルが、複製することができるウイルスに関連しないことを示す。
[0035] 本明細書において、細胞株、試料、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、ＶＬＰ調製物その他が、ウイルスを「実質的に含まない」という用語は、この細胞、試料、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、ＶＬＰ調製物その他が、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲアッセイその他によって測定される検出可能レベルのウイルスを含んでいないことを意味する。
[0036] 一部の実施形態において、本明細書に記載されている組成物、方法およびキットは、リボヌクレアーゼ（RNase）等、ＲＮＡを分解する酵素を利用する。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡを分解するヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＲＮａｓｅは、さもなければ凝集によって分解に抵抗性となり得るキャプシド形成していないＲＮＡを分解する徹底的な手段をもたらす。ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｉその他等、エンドリボヌクレアーゼ；またはＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｒ、エキソリボヌクレアーゼＩその他等、エキソリボヌクレアーゼであってもよい。リボヌクレアーゼＡ（RNase A）は、よく研究に用いられる膵臓リボヌクレアーゼであり、一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する。
[0037] カオトロピック剤は、本技術分野において公知であり、その例として、ブタノール、エタノール、プロパノール、フェノール、塩化マグネシウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化グアニジウム、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素および尿素が挙げられるがこれらに限定されない。カオトロピック剤は、水素結合を破壊することにより他の分子の疎水性作用を弱める。よって、カオトロピック剤は、核酸、タンパク質および脂質二重層等、分子の構造を破壊するおよび／またはこれを変性する。加えて、カオトロピック剤は、酵素を変性することにより、ＲＮａｓｅ酵素またはＤＮａｓｅ酵素の活性を妨げることができ、ＶＬＰ等、粒子を破壊または解体することもできる。
[0038] 本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、使用の前後関係がそれ以外を明らかに示さなければ、複数の項目（plural term）を含む。用語「または」は、包括的であると本明細書において理解される。語句「少なくとも１個」の意義は、語句「１個または複数」の意義に等しい。用語「を含み（comprise）」、「を含む（comprising）」、「を含有する（containing）」、「を有する（having）」その他は、「を含む（including）」その他を意味することができる。用語「約」の使用は、本願を通して、ある値が、その値の決定に用いられている方法の誤差の標準偏差を含み、必要に応じて、表示の値よりも２０％大きいまたは小さい値を含むと示すことを意図する。
実施例１．Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９昆虫細胞株におけるラブドウイルスの検出
[0039] Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９昆虫細胞株の組換えバキュロウイルス感染に起因する産生後細胞（End of production cell）（EOPC）材料を、昆虫起源のレトロウイルスエレメントのランダムスクリーニングに付した。この目的のため、ＥＯＰＣ材料からウイルス粒子会合(particle-associated)ＲＮＡを調製し、ランダムプライマーＲＴ－ＰＣＲクローニングに付した。得られたプラスミドＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、１３，２６７ヌクレオチドからなり、６個のオープンリーディングフレームを含有する複製コンピテントラブドウイルスゲノムの存在と一致した配列コンティグの集合を可能にした。アミノ酸配列レベルの相同性検索から、植物起源のラブドウイルスに関する最高相同性スコアを伴う、多数のラブドウイルスのＬタンパク質に対する弱いが一貫した相同性が明らかになった。
[0040] Ｓｆ９細胞関連ラブドウイルスのためのｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを開発し、使用可能な（working）Ｓｆ９細胞バンクの全細胞ＲＮＡ、馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおける一貫性あるシグナルが示された。１９８３年の凍結保存（freeze-down）に遡るＡＴＣＣ由来のＳｆ９細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）において同様のシグナルが検出され、ラブドウイルス混入物が、Ｓｆ９細胞株の元々の単離体に存在した可能性があることが明示された。
[0041] ＥＯＰＣ材料への曝露後に異なる継代レベルで収集された２種のヒト細胞株試料の分析は、継代１の細胞における強いラブドウイルスシグナルを明示したが、継代に伴うＥＯＰＣ材料の希釈と一致した、継代４～６の間におけるバックグラウンドレベルへと急速に減少するシグナルを明示し、ヒト細胞において複製するウイルスの明らかな能力を明示しなかった。
[0042] ノーウォークＶＬＰおよびコンセンサスＶＬＰワクチン製剤等、ノロウイルスＶＬＰワクチンは、例えば、これらそれぞれ、全ての目的のため本明細書に参照によりその全体が組み込まれる米国特許第７，９５５，６０３号、同第８，４３１，１１６号、同第８，４８１，６９３号および同第８，８４１，１２０号；ならびに米国特許出願公開第２０１１－０１８２９７５号、同第２０１３－０２７３１０２号および同第２０１４－０００４１４５号に記載されている。モノホスホリルリピドＡ（MPL）および水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）をアジュバントとする、筋肉内ノロウイルスＧＩ．１／ＧＩＩ．４二価ウイルス様粒子（VLP）ワクチンが、少なくとも１３３名の対象（総計２３４名の対象が試験に登録された；１３３名の対象にワクチンを与え、１０１名にプラセボを与えた）において検査された。
実施例２．ＥＯＰＣ材料における粒子会合ＲＮＡ配列のランダムプライマークローニングおよび分析
[0043] ＲＮＡを含有する可能性のあるウイルスまたはウイルス様粒子を検出するために、本発明者らは、ランダムＲＴ－ＰＣＲクローニング目的のためＥＯＰＣ材料から始めた。ＥＯＰＣ材料を清澄化してデブリを除き、続いてヌクレアーゼ消化に付して、遊離（粒子会合していない）核酸を排除した。ヌクレアーゼ消化後に、ウイルス粒子を採取するために、２０％ショ糖クッションを通して１００，０００×ｇで材料を遠心分離した。このプロセスにおいて著しい量のインタクトなバキュロウイルスも採取されることが予想された。次に、高速ペレット形成された材料を核酸抽出に付し、続いて、いかなるウイルスＲＮＡもインタクトに保ちつつ、バキュロウイルスおよびゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅで処理した。
[0044] その５’端にＮｏｔ Ｉ制限部位をタグ付けしたランダムＮ９プライマー（ＴＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮ）を、第１鎖逆転写酵素反応および第２鎖クレノウＤＮＡポリメラーゼ反応の両方のために用いて、Ｎｏｔ Ｉ配列タグ（ＴＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＴ）からなるＰＣＲプライマーを用いて増幅され得る二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲ増幅は、数本の別個のバンドの増幅をもたらし、単離されたＲＮＡ集団における限定的な量の配列複雑性（sequence complexity）を示した。この手順を数回反復し、各回に異なるが区別できるバンドを採取した（ランダムプライマー使用（priming）のため予想しなかった訳ではない）。最初に配列決定された１４２個のクローンのうち、１個のクローンは、昆虫ウイルス逆転写酵素に対し相同性を示すことが判明した一方、３２個のクローンは、ラブドウイルスのＬタンパク質に対する相同性が低いことが示された。ラブドウイルス相同性は、アミノ酸配列レベルのみで観察され、Ｌ遺伝子の一部を通して２４～２６％相同性の範囲内であった。残る配列は、リボソーム配列、バキュロウイルス配列またはヌクレオチドもしくはアミノ酸配列レベルにおいて公知の相同性がない配列を提示することが判明した。バキュロウイルスおよびリボソームクローンの単離は、ウイルスＲＮＡ単離プロセスにおいてヌクレアーゼ処理に抵抗したある特定のＲＮＡおよびＤＮＡ配列の存在を示唆する。
[0045] ラブドウイルス相同性を示す全クローンならびにＧｅｎｂａｎｋデータベースに対して検出可能な相同性を示さなかったクローンのさらなる配列分析は、それぞれおよそ７，０００および４，５００ヌクレオチドの２種の大型の配列コンティグの構築をもたらし、それぞれが、ラブドウイルスＬタンパク質に対し相同性を有するオープンリーディングフレームの一部を含有した。この２種の配列コンティグが、同じウイルスゲノム配列の一部であるかを決定するために、各コンティグ由来の１種のプライマーを用いて追加的なＲＴ－ＰＣＲクローニングを行った。追加的なクローニングの結果、これら２種のコンティグにわたる配列を示すクローンが単離された。最後に、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（rapid amplification of cDNA ends）（RACE）技法の使用により、５’および３’端クローンの単離が可能となり、１３，２６７ヌクレオチドの新規ラブドウイルスゲノム（配列番号１）の配列を完成した。
[0046] ラブドウイルスゲノムの特徴マップを図１に示す。マップは、次の判断基準に基づく、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーであるマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセンス配向性（５’から３’）を示す：
１．このウイルスの大型のオープンリーディングフレームと、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて報告される多数のラブドウイルス配列のＬ（大型のポリメラーゼ）遺伝子との間のアミノ酸配列相同性；
２．残る遺伝子のゲノム構築およびサイズが、一般にラブドウイルスに典型的である；
３．ＧおよびＬの間の短いアクセサリー遺伝子の存在が、多くの種類のラブドウイルスに共通する；
４．このウイルスおよびその他のウイルスのＮ、Ｐ、ＭおよびＧ遺伝子の間の相同性の非存在。後者は、メンバー間の相同性が多くはＬ遺伝子産物のみに見出されるウイルスの大型で非常に多様な群を代表するラブドウイルスの典型である（Ammarら、Annu Rev Entomol 54; 447（2009）；Jacksonら、Annu. Rev. Phytopathol 43, 623（2005）；Walkerら、Virus Res. 162（1-2）, 110（2011）を参照）。
[0047] Ｎ、Ｐ、ＭおよびＧオープンリーディングフレームの割り当ては、標準ラブドウイルスゲノムレイアウトおよびコード配列のサイズに基づいた。これと一致したのは、Ｇ遺伝子が、期待された疎水性シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを有する１型膜糖タンパク質を明らかにコードするという事実であった。
[0048] Ｓｆ９ラブドウイルスは、昆虫細胞株から単離されたが、他のラブドウイルスとの相同性の関係性によると、これは、媒介昆虫（insect vector）に保有された植物ウイルスとなり得ることを示す（下表１を参照）。植物ラブドウイルスは、媒介昆虫によって保有されることが多く、一般に、媒介昆虫において数世代にわたり複製する（Ammarら（2009））。実際に、Ｓｆ９細胞株（元のSf21細胞株の派生物）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ（fall armyworm））の卵巣組織に由来し、ウイルスが、媒介昆虫宿主において垂直伝播できることを示唆する（Vaughnら、In Vitro, 13（4）; 213（1977））。
[0049] 表１中の相同性データの検査は、Ｓｆ９ラブドウイルスが、Ｌ遺伝子アミノ酸配列相同性を介した検査では他のラブドウイルスと遠縁であることを示した。最高スコアによるヒットは、全ての植物ラブドウイルスであり、続いて哺乳類ラブドウイルスであった。重要なことに、Ｓｆ９ラブドウイルスにおける他の遺伝子のいずれも、ＲＮＡまたはアミノ酸配列レベルのいずれにおいてもその他のウイルスとはいかなる相同性も示さず、このレベルの相違は、植物ラブドウイルスに典型的である（Ammarら（2009）；Jacksonら（2005）；Walkerら（2011））。
Figure 0007191175000001
Figure 0007191175000002
実施例３．Ｓｆ９細胞、馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおけるＳｆ９ラブドウイルスの定量
[0050] 様々な培養画分におけるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡを定量するために、Ｔａｑｍａｎ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを開発した。ラブドウイルスＲＮＡの定量に用いたｑＲＴ－ＰＣＲアッセイは、ＲＴおよびＰＣＲ工程の両方においてフォワードおよびリバースプライマーを用いる単一工程Ｔａｑｍａｎアッセイであった。したがって、アッセイは、プラスおよびマイナス鎖ＲＮＡの両方を検出することができる。このアッセイにおいて陽性対照としておよび定量目的で用いられるＲＮＡ標準は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により産生されるマイナス鎖ＲＮＡであった。この標準を用いると、本アッセイは、およそ４分子のＲＮＡの検出限界を有した。
[0051] プライマーおよびプローブ配列は、Ｌ遺伝子内のヌクレオチド７２００～７２６４位に及ぶ６４ヌクレオチド標的配列に位置する。プライマーおよびプローブ配列を次に示す：
ＥＯＰＣ６０ ＦＷＤ： ＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＡＧ
ＥＯＰＣ６０ ＲＥＶ： ＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＴ
ＥＯＰＣ６０ Ｐｒｂ：６ＦＡＭ－ＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＡＴＡＣ
[0052] プラスミドＤＮＡの直鎖化に続く、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたＥＯＰＣクローン６０ ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、定量目的の検量線ＲＮＡを調製した。鋳型プラスミドＤＮＡをその後、ＤＮａｓｅで消化し、検量線ＲＮＡを精製した。およそ５ｋｂのＲＮＡが予想されたが、グリオキサール（gyoxal）－アガロースゲル分析によって示されるとおり、等しい強度の２種のＲＮＡ、３．５ｋｂおよび５ｋｂが産生された。２種のＲＮＡのうち小さい方は、標的配列を含有するのに十分な大きさであり、未成熟な転写終結の結果として産生された可能性がある。定量目的では、したがって、検量線ＲＮＡの平均分子量は、４．２５ｋｂまたは１．４×１０６ダルトンである。検量線ＲＮＡは、逆転写酵素工程なしのＰＣＲ反応においては、微量のシグナルしか生じないことが示され、これが鋳型ＤＮＡを含まないことを明示する。Ｔａｑｍａｎアッセイにおける検量線としてのこのＲＮＡの使用は、４分子の検量線ＲＮＡに等しい０．０１ｆｇのＲＮＡの再現性のある検出限界を明示した。
[0053] ＥＯＰＣ ６０ Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて、膜濃縮および超遠心の前後でＳｆ９細胞馴化培地におけるＳｆ９ラブドウイルスを追跡した。これらのデータを表２に示し、培地におけるウイルスシグナルが、０．２ミクロン滅菌濾過膜によって保持されないが、１００，０００ｋＤ分子量カットオフ膜によって十分に保持されることを明示する。加えて、１００，０００×ｇ遠心分離は、より少容量に再懸濁することができるペレットへとウイルスシグナルを濃縮する。これらのデータは、Ｓｆ９細胞馴化培地におけるインタクトなラブドウイルス粒子の存在と一致した。
Figure 0007191175000003
[0054] 表３は、Ｓｆ９馴化培地、バキュロウイルスライセートおよび全細胞ＲＮＡの様々な供給源中のＳｆ９ラブドウイルスの濃度に関する追加的なデータを示す。ＥＯＰＣ材料（Sf9細胞のバキュロウイルスライセート）中に著しい量のラブドウイルスＲＮＡが検出された。ＥＯＰＣ材料の直接的サンプリングは、１ｍＬ当たりおよそ２×１０ｅ＋０８ＲＮＡコピーのラブドウイルスＲＮＡ濃度を明示した。ウイルス粒子が、高速遠心分離によってＥＯＰＣ材料から採取された場合、およそ４．５×１０ｅ＋０７の力価が計算された。この４倍の矛盾は、ＥＯＰＣ材料の直接的サンプリングが、粒子会合および遊離ＲＮＡの両方を検出する一方、高速遠心分離が、粒子会合したＲＮＡに特異的であるという見込みと一致した。ラブドウイルスＲＮＡシグナルは、１ｍＬ当たり１０ｅ＋０７ＲＮＡコピー近くで、Ｓｆ９細胞馴化培地においても検出された。
Figure 0007191175000004
[0055] 生存Ｓｆ９細胞中のラブドウイルスＲＮＡ濃度に関して、対数期Ｓｆ９細胞は、細胞当たりおよそ１５００ ＲＮＡコピーを含有することが判明し、これは、低レベル感染を示唆し、細胞壊死性の観察の欠如と一致した。データは、ラブドウイルス感染が、その元々の単離体（Vaughnら、1977）由来のＳｆ９細胞株に固有であり、１９８３年に寄託されたアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ATCC）Ｓｆ９クローン（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）の分析に由来するルーチン培養の間の偽りの混入によるものではないという見解を支持する。この場合、ラブドウイルスＲＮＡシグナルは、ＡＴＣＣ細胞株において細胞当たり３２７３ ＲＮＡコピーで検出され、Ｓｆ９の使用可能な細胞バンク（WCB）内で観察されるレベルと一致した。
実施例４．Ｓｆ９ラブドウイルスは、ヒト細胞株Ａ５４９およびＨＥＫ２９３において複製しない
[0056] ノーウォークおよびコンセンサスＶＬＰ産生の実施からのＥＯＰＣ材料による細胞の処理の後に、ウイルス組み込みの証拠に関してＨＥＫ２９３およびＡ５４９細胞を検査した。３種のヒト細胞株における培養により、複製コンピテントレトロウイルスの存在に関してノーウォークＶＬＰ ＥＯＰＣ材料（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｐａｒｔ＃８５１９０、ロット０８１１００４３）およびコンセンサスＶＬＰ ＥＯＰＣ材料（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｐａｒｔ＃８５１８８、ロット０９１１００４８）を検査したところ、増幅可能な逆転写酵素活性の非存在のために陰性であることが判明した。接種後の異なる継代におけるこれらの細胞株（Raji、２９３およびＡ５４９細胞）の試料を、追加的な検査に付した。
[0057] Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの存在に関して、継代０、１、４および６由来のＡ５４９およびＨＥＫ２９３細胞の追加的な凍結細胞試料を検査した。この目的のため、細胞試料を解凍し、全細胞ＲＮＡを調製し、ＥＯＰＣ６０ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイに付した。これらのデータは、表４に示され、継代０で収集された細胞のＲＮＡにおける強いラブドウイルスＲＮＡシグナルを明示するが、このシグナルは、培養における細胞の継続した継代に伴い、バックグラウンドレベルへと劇的に下落する。これらのデータは、継代に伴うＥＯＰＣの希釈と一致し、Ｓｆ９単離ラブドウイルスの複製と一致しない。したがって、Ｓｆ９ラブドウイルスがヒト細胞において複製することができることの証拠はない。
Figure 0007191175000005
実施例５．Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在に関するノーウォーク原体の検査
[0058] ４．５ｍＬの原体試料をヌクレアーゼで処理して、いかなる残渣遊離核酸も排除し、続いて１００，０００×ｇの遠心分離により粒子を採取することにより、粒子会合したラブドウイルスＲＮＡシグナルの存在に関してノーウォークＶＬＰ原体（ＮＷＤＳ１３）を検査した。次に、再懸濁した材料をカオトロピック剤により溶解し、ＲＮＡを精製した。ヌクレアーゼ処理および遠心分離に先立ち、この試料に、エンベロープを有するウイルス粒子回収の内部対照としてマウス白血病ウイルス（MLV）の試料をスパイクした。その後のＭＬＶ ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＭＬＶスパイクの優れた回収を明示した。この調製物由来のＲＮＡをＳｆ９ラブドウイルスに関して検査し、元の原体試料中の１ｍＬ当たり２４０分子のラブドウイルスＲＮＡに等しいシグナルが検出された。５０μｇの各ＶＬＰの推定的用量において、本発明者らは、ヒト用量当たり１０分子未満のラブドウイルスＲＮＡを計算した。特に、ウイルスクリアランス試験で、ノロウイルスＶＬＰ精製プロセスを用いエンベロープウイルスの感染力の１５～１８ ｌｏｇの累積的な低下を既に明示しているため、試験した試料は、原体に存在する粒子会合したＲＮＡを提示するものの、これが、インタクトなゲノムＲＮＡを有する残渣インタクトラブドウイルス粒子の存在の何らかの指標と結論付けることはできない。
[0059] ２通りの異なるシナリオにおいてヌクレアーゼ消化を用いて、遊離核酸を排除した。ＥＯＰＣ材料の場合、ウイルス粒子会合したＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲクローニングのために単離することができるように、ヌクレアーゼ消化を用いて、遊離核酸を排除した。これは、ラブドウイルスｃＤＮＡクローンの同定を導く実験である。このような実験において、清澄化されたＥＯＰＣ材料を滴定してｐＨ７．０とし、それぞれ最終濃度５０および５ユニット／ｍＬとなるようＢｅｎｚｏｎａｓｅおよびＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅを添加した。ＥＯＰＣ材料はＳｆ９００ＩＩ昆虫細胞培地に基づくため、マグネシウムの添加は、ヌクレアーゼ活性の活性化に必要とされなかった。ヌクレアーゼ添加後に、材料を３７℃で２時間インキュベートし、その後、最終濃度２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加した。次に、ショ糖クッションを通した１００，０００×ｇの遠心分離によりウイルス粒子を採取し、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ単離キットを用いて粒子会合した核酸を単離した。このキットは、カオトロピック剤を用いて、いかなる持ち越されたヌクレアーゼ活性も不活性化し、インタクトな粒子会合したＲＮＡの単離をもたらす。この材料をその後、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴｕｒｂｏ ＤＮＡフリーキットで処理して、ウイルス粒子会合したＲＮＡと同時単離され得るバキュロウイルスＤＮＡを排除した。ヌクレアーゼ処理工程には内部対照を用いなかったが、得られたｃＤＮＡクローンにおいて相対的に僅かなリボソームまたはバキュロウイルス配列が同定されたという事実は、ヌクレアーゼ処理の有効性を示す。
[0060] 遊離核酸を排除するためのヌクレアーゼの使用の第２の事例は、粒子会合したラブドウイルス配列の存在に関してノーウォークＶＬＰ原体を試験することが関与した。この場合、最終濃度３０ｍＭとなるようＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加し、続いてＮａＯＨで滴定することにより、ＶＬＰ試料を調整してｐＨ７．５とする。マウス白血病ウイルス（MLV）の内部対照試料の添加後に、最終濃度１０ｍＭとなるようＭｇＣｌ２を添加し、それぞれ１ｍＬ当たり最終濃度２５および５ユニットとなるようＢｅｎｚｏｎａｓｅおよびＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅを添加した。３７摂氏度で１時間ヌクレアーゼ消化を進め、その後、試料を２０ｍＭ ＥＤＴＡに調整し、２０％ショ糖クッション上にて１００，０００×ｇで遠心分離し、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＭａｇＭＡＸウイルスＲＮＡ単離キットを用いてペレットからＲＮＡを単離した。内部ＭＬＶスパイクは、粒子会合したＲＮＡがヌクレアーゼ消化から保護され、最終ＲＮＡ調製物に見出されたことを明示した。遊離核酸の消化の程度をモニターするための対照を用いなかったが、特に、微量の核酸しか原体に存在しないため、有利な反応条件の存在下での著しい量のヌクレアーゼの使用は、基本的にあらゆる遊離核酸を排除することが予想される。
[0061] 試験の結果は、植物または昆虫起源のラブドウイルスが、Ｓｆ９細胞株において同定され、このウイルス混入が、その元々の単離体由来のＳｆ９細胞株に固有である可能性が高いことを示した。Ｓｆ９ラブドウイルスゲノムを完全に配列決定したところ、植物ラブドウイルスに最も近い相同性が明示され、あらゆるラブドウイルスに典型的なゲノム構築およびオープンリーディングフレームサイズ分布が示された。Ｓｆ９細胞馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおいてウイルス粒子が検出され、細胞当たりのＲＮＡコピーを単位としてラブドウイルスＲＮＡを定量した。内在性感染によるＳｆ９細胞における細胞壊死性の証拠はない。加えて、本試験は、ウイルスが、ヒト細胞において複製する能力を欠くことを示した。本明細書に開示されている原体製造プロセスは、エンベロープを有するウイルスを有効に除去および／または不活性化することが示された。例えば、エンベロープを有するウイルスは洗剤処理によって破壊することができ、バキュロウイルスは、酸処理によって不活性化および除去し、続いて遠心分離して、不活性かつ凝集したバキュロウイルスを除去することができる。例えば、プロセスにおける工程は、モデルとなるエンベロープを有するウイルス、Ａ－ＭｕＬＶ（ＧＩ．１ ＤＳ製造における累積的＞１８．２２ ｌｏｇ１０低下およびＧＩＩ．４ ＤＳ製造における＞１５．７３ ｌｏｇ１０）およびＡｃＮＰＶ（ＧＩ．１ ＤＳ製造における累積的＞１５．３０ ｌｏｇ１０低下およびＧＩＩ．４ ＤＳ製造における＞１１．５４ ｌｏｇ１０）を除去することが示された。
実施例６．ＲＮａｓｅ Ａ抵抗性Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルに関する原体の分析
[0062] 実施例５は、Ｓｆ９昆虫細胞に関連する新規ラブドウイルスの特徴評価について記載する。一実験は、ノーウォークＶＬＰ原体の１種の研究用ロットにおけるＢｅｎｚｏｎａｓｅ抵抗性の、粒子会合したＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの証拠を報告し、ノロウイルスＶＬＰ上に凝集した、あるいはその内にパッケージングされた小型の残渣ラブドウイルスＲＮＡ断片の存在の可能性を示す。加えて、残渣インタクトラブドウイルス粒子混入の可能性は、実施例５に記載されている試験によって除外されなかった。先立つＲＮａｓｅ Ａ処理ありおよびなしで、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルに関して精製ノーウォークＶＬＰ原体材料およびコンセンサスＶＬＰ原体材料それぞれの２種のロットを検査した。得られたデータは、原体において観察されたＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルが、ＲＮａｓｅ Ａ分解に対し感受性であり、ＶＬＰまたは残渣Ｓｆ９ラブドウイルス粒子においてキャプシド形成されるＲＮＡを提示しなかったことを明示した。適切な工程を採用して、ＲＴ－ＰＣＲ阻害剤を制御し、実際の粒子会合したラブドウイルスＲＮＡが、ＲＮａｓｅ Ａ分解に感受性ではないことを明示した。
[0063] 本試験において、総計４ロットの原体材料を調査し、さもなければ凝集により分解抵抗性となり得るキャプシド形成されないラブドウイルスＲＮＡシグナルを分解する、より徹底的な手段としてリボヌクレアーゼＡ（RNase A）を用いることにより、ノーウォークおよびコンセンサスＶＬＰ原体におけるヌクレアーゼ抵抗性Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの問題にさらに取り組むための実験を行った。ＲＮａｓｅ Ａありおよびなしでの原体の処理後に、実験設計は、カオトロピック剤（RNase A活性を破壊するため）の存在下におけるＲＮＡ精製工程と、高感度ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイによるあらゆる残るＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの定量化を含んだものであった。
[0064] ノーウォーク原体の分析。ｐＨ６．５、３７℃で１時間、最終濃度１０μｇ／ｍＬ（４×１０１４ＲＮａｓｅ Ａ分子／ｍＬ）となるＲＮａｓｅ Ａの添加ありまたはなしで、ノーウォーク原体材料をインキュベートした。インキュベーション後に、ＲＮａｓｅ活性を直ちに非活性化し、キャプシド形成したＲＮＡを有し得るいかなるＶＬＰまたはウイルス粒子も破壊するための強いカオトロピック剤を用いたＭａｇＭａｘウイルス単離プロトコールを用いて、試料をＲＮＡ精製に付した。精製したＲＮＡ試料をｓｐｅｅｄｖａｃ乾燥によりさらに濃縮し、実施例３に記載されているＥＯＰＣ－６０ ｑＲＴＰＣＲアッセイを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ分析に付した。８４０μＬの原体材料をＲＮａｓｅ Ａで処理してまたは処理せず、続いてＲＮａｓｅ活性の変性条件下でＲＮＡ抽出に付した。最終精製ＲＮＡ試料を、元の原体試料から８４倍に濃縮した。３×１μＬの各精製ＲＮＡ試料を３重のｑＲＴ－ＰＣＲ反応において検査した。
[0065] 下表５は、２種のノーウォークＶＬＰ原体ロットのうち１種のみ（NWDS16）が、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルを提示し、このシグナルが、元の原体材料における１ｍＬ当たり５１ ＲＮＡコピーに等しかった本実験の結果を示す。ノーウォーク原体ロットＮＷＤＳ０９は、シグナルを生じることができなかった（元の原体における１ｍＬ当たり＜１２ ＲＮＡコピー）。ロットＮＷＤＳ１６材料は陽性であったが、ＲＮａｓｅ Ａで処理した同じ材料は、シグナルを提示しなかった。この観察は、非粒子キャプシド形成（非保護）状態におけるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの存在と一致した。
Figure 0007191175000006
[0066] 表６は、ＲＴ－ＰＣＲ阻害剤の対照として、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の直前に、規定されたラブドウイルスＲＮＡスパイクを添加した後の同じ試料のＣｔ値を示す。全４種の試料の同様のＣｔ値は、混入ＲＴ－ＰＣＲ阻害剤の非存在の証拠をもたらした。
Figure 0007191175000007
[0067] コンセンサス原体材料の分析。Ｒ＆ＤロットＤＣＮ１２またはＤＣＮ１５由来のコンセンサス原体材料を、ｐＨ６．５、３７℃で１時間、最終濃度１０μｇ／ｍＬ（４×１０１４ＲＮａｓｅ Ａ分子／ｍＬ）となるＲＮａｓｅ Ａの添加ありまたはなしでインキュベートした。インキュベーション後に、ＲＮａｓｅ活性を直ちに非活性化し、キャプシド形成したＲＮＡを有し得るいかなるＶＬＰまたはウイルス粒子も破壊するために強いカオトロピック剤を用いるＭａｇＭａｘウイルス単離プロトコールを用いて、試料をＲＮＡ精製に付した。精製されたＲＮＡ試料をｓｐｅｅｄｖａｃ乾燥によってさらに濃縮し、実施例３に記載されているＥＯＰＣ－６０ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ分析に付した。１０００μＬの原体材料をＲＮａｓｅ Ａで処理してまたは処理せず、続いてＲＮａｓｅ活性の変性条件下でＲＮＡ抽出に付した。最終精製ＲＮＡ試料を、元の原体試料から１００倍に濃縮した。３回複製ｑＲＴ－ＰＣＲ反応において、３×１μＬの各精製ＲＮＡ試料を検査した。
[0068] 下表７は、本実験の結果を示す。２種のコンセンサスＶＬＰ原体ロットのうち１種のみ（DCN12）が、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルを提示し、このシグナルは、元の原体材料における１ｍＬ当たり１２８ ＲＮＡコピーに等しかった。コンセンサス原体ロットＤＣＮ１５は、シグナルを生じることができなかった（元の原体における１ｍＬ当たり＜１０ ＲＮＡコピー）。ロットＤＣＮ１２材料は陽性であったが、ＲＮａｓｅ Ａで処理した同じ材料は、シグナルを提示しなかった。この観察は、非粒子キャプシド形成（非保護）状態におけるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルの存在と一致した。
Figure 0007191175000008
[0069] 表８は、ＲＴ－ＰＣＲ阻害剤の対照として、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の直前に、規定されたラブドウイルスＲＮＡスパイクを添加した後の同じ試料のＣｔ値を示す。全４種の試料の同様のＣｔ値は、混入ＲＴ－ＰＣＲ阻害剤の非存在の証拠をもたらした。
Figure 0007191175000009
[0070] ＲＮａｓｅ Ａ処理が、ラブドウイルス粒子内部のＲＮＡを分解しないことを明示するための対照実験。上述のデータは、精製ノーウォークおよびコンセンサスＶＬＰ原体材料におけるキャプシド形成したラブドウイルスＲＮＡの非存在の証拠をもたらしているが、追加的な対照実験を行って、ＲＮａｓｅ Ａ処理が、ウイルス粒子においてキャプシド形成されることが公知のＲＮＡシグナルの低下または排除をもたらさないことを明示した。これらのデータは、表６および８に示すデータを補強した。この対照実験において、著しい量のＳｆ９ラブドウイルスを含有することが公知の産生後（EOP）材料を、ノーウォークおよびコンセンサス原体のため上述のとおり処理し、シグナルをＲＴ－ＰＣＲによって定量した。２８０μＬのＥＯＰ材料をＲＮａｓｅ Ａで処理してまたは処理せず、続いてＲＮａｓｅ活性の変性条件下でＲＮＡ抽出に付した。最終精製ＲＮＡ試料を、元のＥＯＰ試料から５．６倍に濃縮した。３回複製ｑＲＴ－ＰＣＲ反応において、３×１μＬの各精製ＲＮＡ試料を検査した。データを下表９に示す。ＲＮＡ抽出工程に先立つＲＮａｓｅ Ａ処理は、ＥＯＰ材料において検出されるラブドウイルスＲＮＡシグナルに影響しなかった。ＥＯＰ材料におけるラブドウイルスＲＮＡに対するＲＮａｓｅ Ａの理論混合比は、＞１０，０００：１であった。これらのデータは、カオトロピック剤を用いて、著しい濃度のＲＮａｓｅ Ａを不活性化することに成功し、分解されない、粒子会合ＲＮＡの精製の成功をもたらすことを明示する。
Figure 0007191175000010
実施例７．Ｓｆ９ラブドウイルスの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）[0071] Ｓｆ９細胞馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおいて同定されたＳｆ９ラブドウイルスを、接線流濾過およびショ糖勾配遠心分離により部分的に精製し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により撮像した。多数の明らかにエンベロープを有する球状から楕円形（oblong）の粒子が観察された。２７０個の粒子の測定は、６５．６×４９．６ｎｍの平均寸法を明らかにした。ウイルス粒子のこれらの観察は、Ｓｆ９培養物およびライセートにおける明らかに機能的な粒子会合したラブドウイルスゲノムＲＮＡの存在を示す以前の分子生物学データと一致した。
[0072] 本試験において、Ｓｆ９ラブドウイルスの透過型電子顕微鏡像を作製するように設計された実験を行った。「空ベクター」バキュロウイルスに感染させたＳｆ９細胞の１０リットルのウェーブバッグ（wave bag）培養を確立し、その後に収集した。清澄化したライセートを、接線流濾過によりおよそ１１２ｍＬに濃縮した。２×６ｍＬの濃縮物をそれぞれ２個の２０～６０％ショ糖密度工程勾配上に重層し、１００，０００×ｇで９０分間１０℃にて遠心分離した。ショ糖工程溶液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０（クエン酸緩衝食塩水、CBS）を用いて調製した。ショ糖勾配を１．５ｍＬ画分へと分画し、実施例３に記載されているＳｆ９ラブドウイルス特異的ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイ（EOPC60アッセイ）を用いて画分を分析した。最も強いＳｆ９ラブドウイルスシグナルを含有するピーク画分（各勾配から画分＃１３）をプールした。プールした画分を、最終容量３２ｍＬとなるようＣＢＳで調整し、続いてＣＢＳにおける４ｍＬの３０％ショ糖クッション上に重層し、１００，０００×ｇで１時間１０℃にて遠心分離した。遠心分離後に、上清をデカントし、ペレット形成した材料を３００μＬのＣＢＳに再懸濁した。この最終材料を、酢酸ウラニルによるネガティブ染色後にＴＥＭ分析に付した。球状から楕円形の、サイズおよび形状の両方が若干不規則な多数のエンベロープを有するウイルス粒子の存在を明示する複数の顕微鏡像を撮った。大部分の顕微鏡像は、精製ウイルス粒子調製物に混入するデブリまたは他の材料が殆どないクリーンな画像を示した。２７０個の粒子の寸法の分析は、６５．６１±１４．５２×４９．５６±１１．５８ｎｍの平均サイズを明示した。代表的ＴＥＭ画像を図２に示す。
実施例８．昆虫細胞感染力試験
[0073] ウイルスに以前に感染したことがない追加的な選択昆虫細胞株において複製するラブドウイルスの能力を明示するための試験を行った。
[0074] 本明細書に開示されているＳｆ９ラブドウイルスは、組換えバキュロウイルスに感染した後のＳｆ９細胞ライセートにおいて最初に発見されたが、このウイルスは、バキュロウイルス感染に独立的なＳｆ９細胞馴化培地においても検出および定量された。健康なＳｆ９細胞内のラブドウイルスＲＮＡレベルも同様に定量した。検査した全Ｓｆ９細胞においてウイルスが同定され、細胞壊死性効果を誘導しないほど十分に低いレベルで複製すると思われた。
[0075] Ｓｆ９ラブドウイルスの感染力アッセイを開発するため、実験を開始して、追加的な昆虫細胞株においてＳｆ９ラブドウイルスが繁殖できるかを決定した。表１０は、米国農務省（U.S. Department of Agriculture）（USDA）の農業研究局（Agricultural Research Service）（ARS）から入手した数種類の昆虫細胞株のリストを示す。
Figure 0007191175000011
[0076] 表１０に示す細胞株のそれぞれを、１０ｍｌのＥＸ－Ｃｅｌｌ４２０培地＋１０％ウシ胎仔血清の入ったＴ２５組織培養フラスコに配置し、培養培地のうち５ｍＬを除去し、Ｓｆ９細胞の持ち越しがないことを確実にするために遠心分離および０．２ミクロン膜による濾過に付したＳｆ９細胞由来の５ｍｌの馴化培地とこれを交換することにより、Ｓｆ９ラブドウイルスに曝露した。Ｓｆ９馴化培地を細胞培養に２４時間残し、その後、培地を除去し、ＥＸ－Ｃｅｌｌ４２０培地＋１０％ＦＢＳにおいて昆虫細胞株をさらに培養した。コンフルエンスに達したら、各培養物の細胞のおよそ１０％を採取し、凍結細胞ペレット（ｐ０）として貯蔵した一方、継続した成長および継代のためにそれぞれの新たな継代培養を確立した。このようにして、各細胞株の２種の追加的な凍結細胞ペレットを継代数ｐ１およびｐ２のために採取した。
[0077] Ｓｆ９ラブドウイルスに曝露された各細胞株由来の凍結細胞試料の採取後に、各細胞試料ならびにＳｆ９ラブドウイルスに曝露されていない各細胞株由来の対照細胞から全細胞ＲＮＡを精製した。上述のＳｆ９ラブドウイルスｑＲＴ－ＰＣＲアッセイにおいて、いずれかのラブドウイルスＲＮＡシグナルの検出および定量に関して各ＲＮＡ試料を検査した。「全細胞ＲＮＡ１μｇ当たりのｆｇラブドウイルスＲＮＡ」を単位としてデータを表し、これを図３に示す。
[0078] 図３におけるデータの検査は、いくつかの有意な観察をもたらす。第一に、細胞株ＨｓＡＭ１は、Ｓｆ９細胞馴化培地への曝露の前後にＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルを提示し、この細胞株が、Ｓｆ９ラブドウイルスまたはそのごく近縁の種に既に感染されていることを示す。Ｓｆ９細胞馴化培地へのさらなる曝露は、感染力シグナルのさらなる増加をもたらさなかった。第二に、細胞株ＨｖＡＭ１、ＨｚＡＭ１、ＨｚＦＢ３３およびＡｇＡＭ１は、Ｓｆ９ラブドウイルスを有意に複製する能力を提示しなかった。予想されるとおり、馴化培地への即時曝露後に、低レベルＲＮＡシグナルが観察されたが、このようなシグナルは、その後の継代におけるウイルス複製の場合に予想されるとおり増加しなかった。最後に、対照的に３種のＳ．ｅｘｉｇｕａ細胞株は、Ｓｆ９ラブドウイルスの著しい複製を示し、ＲＮＡシグナルは各継代に伴い少なくとも２桁増加する。継代２におけるこれらの細胞におけるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルレベルは、Ｓｆ９細胞において構成的に観察されるレベルに等しい。
[0079] よって、試験の結果は、Ｓｆ９ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株において元々同定されたＳｆ９ラブドウイルス（または近縁種）が、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｌｅｘａ卵巣に由来する異なるｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ種由来の第２の昆虫細胞株に構成的に存在することを示した。加えて、Ｓｆ９ラブドウイルスは、元のＳ．ｅｘｉｇｕａ卵に由来する３種のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ細胞株において容易に複製することが観察された。
[0080] 上述の説明的な実施例に表記されているとおり、本発明における多数の修正および変種は、当業者であれば想到すると予想される。結果的に、添付の特許請求の範囲に現れる限定のみを本発明に課すべきである。本明細書に引用されているあらゆる刊行物は、全ての目的のため本明細書に参照によりそれらの全体が組み込まれる。
参考文献
1. Ammar el D, Tsai CW, Whitfield AE, Redinbaugh MG, Hogenhout SA. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annu Rev Entomol, 54, 447-468 (2009).
2. Jackson AO, Dietzgen RG, Goodin MM, Bragg JN, Deng M. Biology of plant rhabdoviruses. Annu Rev Phytopathol, 43, 623-660 (2005).
3. Walker PJ, Dietzgen RG, Joubert DA, Blasdell KR. Rhabdovirus accessory genes. Virus Res, 162(1-2), 110-125).
4. Vaughn JL, Goodwin RH, Tompkins GJ, McCawley P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro, 13(4), 213-217 (1977).

Claims (17)

  1. 配列番号１または配列番号１の逆相補体配列の少なくとも２５０個の近接ヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ウイルスを検出するための方法。
  2. ＰＣＲアッセイにおいて１種または複数のプライマーおよび１種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 配列番号２（ＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＡＧ）の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３（ＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＴ）の配列を有するリバースプライマーとを用いる工程を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 標識されたプローブのヌクレオチド配列が、配列番号４（ＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＡＴＡＣ）による配列である、請求項３に記載の方法。
  5. 約２分子のＲＮＡ～約２０分子のＲＮＡの間の感度レベルを有する、請求項１に記載の方法。
  6. 昆虫細胞において産生されたタンパク質またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）調製物からウイルスを除去するための方法であって、ウイルスが配列番号１の少なくとも２５０個の近接ヌクレオチドを有する配列を含み、以下の工程：
    （ａ）クロマトグラフィー、濾過、および洗剤による処理からなる群より選択される方法でタンパク質またはＶＬＰを精製する工程；ならびに
    （ｂ）精製の後、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法を用いてタンパク質またはＶＬＰ中のラブドウイルスの存在または非存在を検出する工程；
    を含む方法。
  7. ウイルスが、配列番号１の配列を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 昆虫細胞が、ＳＦ９細胞である、請求項６または７に記載の方法。
  9. ＳＦ９細胞が、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１として寄託された細胞株に由来する、請求項８に記載の方法。
  10. 試料中の、配列番号１の少なくとも２５０個の近接ヌクレオチドを有する粒子会合したＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡを検出するための方法であって、
    （ｉ）試料をＲＮａｓｅで処理する工程であって、前記ＲＮａｓｅがＲＮａｓｅ Ａであってもよい、工程と、
    （ｉｉ）試料中のＲＮａｓｅを不活性化し、粒子を破壊する工程であって、前記不活性化および破壊がカオトロピック剤を用いて行われてもよい、工程と、
    （ｉｉｉ）ＲＴ－ＰＣＲによって、ＲＮａｓｅ処理した試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在または非存在を検出する工程と
    を含み、ＲＮａｓｅ処理した試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在が、検出されたＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡが、試料中の粒子上に凝集していたことまたは粒子内にパッケージングされていたことを示し、
    ＲＴ－ＰＣＲが、配列番号２の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３の配列を有するリバースプライマーと、配列番号４の配列を有するプローブとを用いて行われる、方法。
  11. ＲＮａｓｅによる試料の処理に先立ち、ＲＴ－ＰＣＲによって試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在または非存在を検出する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 試料中の、配列番号１の少なくとも２５０個の近接ヌクレオチドを有する複製コンピテントＳｆ９ラブドウイルスを検出するための方法であって、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ細胞株と共に試料をインキュベートする工程と、試料とのインキュベーション後に前記細胞株を少なくとも１回継代する工程と、試料と前記細胞株とのインキュベート後および前記細胞の各継代の後の時点で、Ｓｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在または非存在を検出する工程とを含み、
    試料と前記細胞株とのインキュベーションの直後に検出されるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルのレベルと比べた、１回または複数の継代のうち少なくとも１回の後のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡシグナルのレベルの増加が、Ｓｆ９ラブドウイルスが試料に存在し、複製することができることを示し、
    検出する工程が、配列番号２の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３の配列を有するリバースプライマーと、配列番号４の配列を有するプローブとを用いるＲＴ－ＰＣＲによって行われる、方法。
  13. 試料中の、配列番号１の少なくとも２５０個の近接ヌクレオチドを有する複製コンピテントなＳｆ９ラブドウイルスの存在または非存在を検出するための方法であって、
    （ｉ）試料をＲＮａｓｅで処理する工程であって、前記ＲＮａｓｅがＲＮａｓｅ Ａであってもよい、工程と、
    （ｉｉ）ＲＮａｓｅを不活性化し、試料中の粒子を破壊する工程であって、前記不活性化および破壊がカオトロピック剤を用いて行われてもよい工程と、
    （ｉｉｉ）ＲＴ－ＰＣＲによって、ＲＮａｓｅ処理した試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在または非存在を検出する工程と、
    （ｉｖ）Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ細胞株と共にＲＮａｓｅ処理した試料をインキュベートする工程と、
    （ｖ）前記細胞株を少なくとも１回継代する工程と、
    （ｖｉ）ＲＮａｓｅ処理した試料とのインキュベーション後および少なくとも１回の細胞継代のそれぞれの後の時点で、前記細胞株から全ＲＮＡを精製する工程と、
    （ｖｉｉ）ＲＴ－ＰＣＲによって、各時点由来の全ＲＮＡ中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡを検出する工程と、を含み、
    ＲＮａｓｅ処理した試料と前記細胞株とのインキュベーションの直後に検出されるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡのレベルと比べた、少なくとも１回の継代の後に検出されるＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡのレベルの増加が、Ｓｆ９ラブドウイルスが複製することができることを示し、
    ＲＴ－ＰＣＲが、配列番号２の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３の配列を有するリバースプライマーと、配列番号４の配列を有するプローブとを用いて行われる、方法。
  14. ＲＮａｓｅによる試料の処理に先立ち、ＲＴ－ＰＣＲによって試料中のＳｆ９ラブドウイルスＲＮＡの存在または非存在を検出する工程をさらに含み、
    ＲＴ－ＰＣＲが、配列番号２の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号３の配列を有するリバースプライマーと、配列番号４の配列を有するプローブとを用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
  15. 試料の検査のためのアッセイにおいて用いられる方法であって、試料が原体である、請求項１０、１２または１３に記載の方法。
  16. Ｓ．ｅｘｉｇｕａ細胞と、配列番号１の少なくとも２５０個の近接ヌクレオチドを有するラブドウイルスとを含む組成物。
  17. ラブドウイルスが、配列番号１の配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
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