JP7191175B2 - 細胞株からラブドウイルスを検出および除去する方法 - Google Patents
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Description
[0001] 本願は、全ての目的のため本明細書に参照によりその全体の内容が組み込まれる、2013年10月3日に出願された米国特許仮出願第61/886,438号に対する優先権を主張するものである。
[0002] 本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる:配列表のコンピュータ読み取り可能フォーマットコピー(ファイル名:LIGO_026_01WO_SeqList_ST25.txt;記録された日付:2014年10月3日;ファイルサイズ18Kb)。
[0039] Spodoptera frugiperda Sf9昆虫細胞株の組換えバキュロウイルス感染に起因する産生後細胞(End of production cell)(EOPC)材料を、昆虫起源のレトロウイルスエレメントのランダムスクリーニングに付した。この目的のため、EOPC材料からウイルス粒子会合(particle-associated)RNAを調製し、ランダムプライマーRT-PCRクローニングに付した。得られたプラスミドDNAクローンのDNA配列分析は、13,267ヌクレオチドからなり、6個のオープンリーディングフレームを含有する複製コンピテントラブドウイルスゲノムの存在と一致した配列コンティグの集合を可能にした。アミノ酸配列レベルの相同性検索から、植物起源のラブドウイルスに関する最高相同性スコアを伴う、多数のラブドウイルスのLタンパク質に対する弱いが一貫した相同性が明らかになった。
[0043] RNAを含有する可能性のあるウイルスまたはウイルス様粒子を検出するために、本発明者らは、ランダムRT-PCRクローニング目的のためEOPC材料から始めた。EOPC材料を清澄化してデブリを除き、続いてヌクレアーゼ消化に付して、遊離(粒子会合していない)核酸を排除した。ヌクレアーゼ消化後に、ウイルス粒子を採取するために、20%ショ糖クッションを通して100,000×gで材料を遠心分離した。このプロセスにおいて著しい量のインタクトなバキュロウイルスも採取されることが予想された。次に、高速ペレット形成された材料を核酸抽出に付し、続いて、いかなるウイルスRNAもインタクトに保ちつつ、バキュロウイルスおよびゲノムDNAを除去するために、RNase不含DNaseで処理した。
1.このウイルスの大型のオープンリーディングフレームと、Genbankにおいて報告される多数のラブドウイルス配列のL(大型のポリメラーゼ)遺伝子との間のアミノ酸配列相同性;
2.残る遺伝子のゲノム構築およびサイズが、一般にラブドウイルスに典型的である;
3.GおよびLの間の短いアクセサリー遺伝子の存在が、多くの種類のラブドウイルスに共通する;
4.このウイルスおよびその他のウイルスのN、P、MおよびG遺伝子の間の相同性の非存在。後者は、メンバー間の相同性が多くはL遺伝子産物のみに見出されるウイルスの大型で非常に多様な群を代表するラブドウイルスの典型である(Ammarら、Annu Rev Entomol 54; 447(2009);Jacksonら、Annu. Rev. Phytopathol 43, 623(2005);Walkerら、Virus Res. 162(1-2), 110(2011)を参照)。
[0050] 様々な培養画分におけるSf9ラブドウイルスRNAを定量するために、Taqman qRT-PCRアッセイを開発した。ラブドウイルスRNAの定量に用いたqRT-PCRアッセイは、RTおよびPCR工程の両方においてフォワードおよびリバースプライマーを用いる単一工程Taqmanアッセイであった。したがって、アッセイは、プラスおよびマイナス鎖RNAの両方を検出することができる。このアッセイにおいて陽性対照としておよび定量目的で用いられるRNA標準は、in vitro転写により産生されるマイナス鎖RNAであった。この標準を用いると、本アッセイは、およそ4分子のRNAの検出限界を有した。
EOPC60 FWD: TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG
EOPC60 REV: CTCGCTGCTGAGCGGTTT
EOPC60 Prb:6FAM-AGGATTGGAGAATTATAC
[0056] ノーウォークおよびコンセンサスVLP産生の実施からのEOPC材料による細胞の処理の後に、ウイルス組み込みの証拠に関してHEK293およびA549細胞を検査した。3種のヒト細胞株における培養により、複製コンピテントレトロウイルスの存在に関してノーウォークVLP EOPC材料(Meridian Part#85190、ロット08110043)およびコンセンサスVLP EOPC材料(Meridian Part#85188、ロット09110048)を検査したところ、増幅可能な逆転写酵素活性の非存在のために陰性であることが判明した。接種後の異なる継代におけるこれらの細胞株(Raji、293およびA549細胞)の試料を、追加的な検査に付した。
[0058] 4.5mLの原体試料をヌクレアーゼで処理して、いかなる残渣遊離核酸も排除し、続いて100,000×gの遠心分離により粒子を採取することにより、粒子会合したラブドウイルスRNAシグナルの存在に関してノーウォークVLP原体(NWDS13)を検査した。次に、再懸濁した材料をカオトロピック剤により溶解し、RNAを精製した。ヌクレアーゼ処理および遠心分離に先立ち、この試料に、エンベロープを有するウイルス粒子回収の内部対照としてマウス白血病ウイルス(MLV)の試料をスパイクした。その後のMLV qRT-PCR分析は、MLVスパイクの優れた回収を明示した。この調製物由来のRNAをSf9ラブドウイルスに関して検査し、元の原体試料中の1mL当たり240分子のラブドウイルスRNAに等しいシグナルが検出された。50μgの各VLPの推定的用量において、本発明者らは、ヒト用量当たり10分子未満のラブドウイルスRNAを計算した。特に、ウイルスクリアランス試験で、ノロウイルスVLP精製プロセスを用いエンベロープウイルスの感染力の15~18 logの累積的な低下を既に明示しているため、試験した試料は、原体に存在する粒子会合したRNAを提示するものの、これが、インタクトなゲノムRNAを有する残渣インタクトラブドウイルス粒子の存在の何らかの指標と結論付けることはできない。
[0062] 実施例5は、Sf9昆虫細胞に関連する新規ラブドウイルスの特徴評価について記載する。一実験は、ノーウォークVLP原体の1種の研究用ロットにおけるBenzonase抵抗性の、粒子会合したSf9ラブドウイルスRNAシグナルの証拠を報告し、ノロウイルスVLP上に凝集した、あるいはその内にパッケージングされた小型の残渣ラブドウイルスRNA断片の存在の可能性を示す。加えて、残渣インタクトラブドウイルス粒子混入の可能性は、実施例5に記載されている試験によって除外されなかった。先立つRNase A処理ありおよびなしで、Sf9ラブドウイルスRNAシグナルに関して精製ノーウォークVLP原体材料およびコンセンサスVLP原体材料それぞれの2種のロットを検査した。得られたデータは、原体において観察されたSf9ラブドウイルスRNAシグナルが、RNase A分解に対し感受性であり、VLPまたは残渣Sf9ラブドウイルス粒子においてキャプシド形成されるRNAを提示しなかったことを明示した。適切な工程を採用して、RT-PCR阻害剤を制御し、実際の粒子会合したラブドウイルスRNAが、RNase A分解に感受性ではないことを明示した。
[0073] ウイルスに以前に感染したことがない追加的な選択昆虫細胞株において複製するラブドウイルスの能力を明示するための試験を行った。
1. Ammar el D, Tsai CW, Whitfield AE, Redinbaugh MG, Hogenhout SA. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annu Rev Entomol, 54, 447-468 (2009).
2. Jackson AO, Dietzgen RG, Goodin MM, Bragg JN, Deng M. Biology of plant rhabdoviruses. Annu Rev Phytopathol, 43, 623-660 (2005).
3. Walker PJ, Dietzgen RG, Joubert DA, Blasdell KR. Rhabdovirus accessory genes. Virus Res, 162(1-2), 110-125).
4. Vaughn JL, Goodwin RH, Tompkins GJ, McCawley P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro, 13(4), 213-217 (1977).
Claims (17)
- 配列番号1または配列番号1の逆相補体配列の少なくとも250個の近接ヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ウイルスを検出するための方法。
- PCRアッセイにおいて1種または複数のプライマーおよび1種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 配列番号2(TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG)の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3(CTCGCTGCTGAGCGGTTT)の配列を有するリバースプライマーとを用いる工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 標識されたプローブのヌクレオチド配列が、配列番号4(AGGATTGGAGAATTATAC)による配列である、請求項3に記載の方法。
- 約2分子のRNA~約20分子のRNAの間の感度レベルを有する、請求項1に記載の方法。
- 昆虫細胞において産生されたタンパク質またはウイルス様粒子(VLP)調製物からウイルスを除去するための方法であって、ウイルスが配列番号1の少なくとも250個の近接ヌクレオチドを有する配列を含み、以下の工程:
(a)クロマトグラフィー、濾過、および洗剤による処理からなる群より選択される方法でタンパク質またはVLPを精製する工程;ならびに
(b)精製の後、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法を用いてタンパク質またはVLP中のラブドウイルスの存在または非存在を検出する工程;
を含む方法。 - ウイルスが、配列番号1の配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 昆虫細胞が、SF9細胞である、請求項6または7に記載の方法。
- SF9細胞が、ATCC CRL-1711として寄託された細胞株に由来する、請求項8に記載の方法。
- 試料中の、配列番号1の少なくとも250個の近接ヌクレオチドを有する粒子会合したSf9ラブドウイルスRNAを検出するための方法であって、
(i)試料をRNaseで処理する工程であって、前記RNaseがRNase Aであってもよい、工程と、
(ii)試料中のRNaseを不活性化し、粒子を破壊する工程であって、前記不活性化および破壊がカオトロピック剤を用いて行われてもよい、工程と、
(iii)RT-PCRによって、RNase処理した試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程と
を含み、RNase処理した試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在が、検出されたSf9ラブドウイルスRNAが、試料中の粒子上に凝集していたことまたは粒子内にパッケージングされていたことを示し、
RT-PCRが、配列番号2の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3の配列を有するリバースプライマーと、配列番号4の配列を有するプローブとを用いて行われる、方法。 - RNaseによる試料の処理に先立ち、RT-PCRによって試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 試料中の、配列番号1の少なくとも250個の近接ヌクレオチドを有する複製コンピテントSf9ラブドウイルスを検出するための方法であって、Spodoptera exigua細胞株と共に試料をインキュベートする工程と、試料とのインキュベーション後に前記細胞株を少なくとも1回継代する工程と、試料と前記細胞株とのインキュベート後および前記細胞の各継代の後の時点で、Sf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程とを含み、
試料と前記細胞株とのインキュベーションの直後に検出されるSf9ラブドウイルスRNAシグナルのレベルと比べた、1回または複数の継代のうち少なくとも1回の後のSf9ラブドウイルスRNAシグナルのレベルの増加が、Sf9ラブドウイルスが試料に存在し、複製することができることを示し、
検出する工程が、配列番号2の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3の配列を有するリバースプライマーと、配列番号4の配列を有するプローブとを用いるRT-PCRによって行われる、方法。 - 試料中の、配列番号1の少なくとも250個の近接ヌクレオチドを有する複製コンピテントなSf9ラブドウイルスの存在または非存在を検出するための方法であって、
(i)試料をRNaseで処理する工程であって、前記RNaseがRNase Aであってもよい、工程と、
(ii)RNaseを不活性化し、試料中の粒子を破壊する工程であって、前記不活性化および破壊がカオトロピック剤を用いて行われてもよい工程と、
(iii)RT-PCRによって、RNase処理した試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程と、
(iv)Spodoptera exigua細胞株と共にRNase処理した試料をインキュベートする工程と、
(v)前記細胞株を少なくとも1回継代する工程と、
(vi)RNase処理した試料とのインキュベーション後および少なくとも1回の細胞継代のそれぞれの後の時点で、前記細胞株から全RNAを精製する工程と、
(vii)RT-PCRによって、各時点由来の全RNA中のSf9ラブドウイルスRNAを検出する工程と、を含み、
RNase処理した試料と前記細胞株とのインキュベーションの直後に検出されるSf9ラブドウイルスRNAのレベルと比べた、少なくとも1回の継代の後に検出されるSf9ラブドウイルスRNAのレベルの増加が、Sf9ラブドウイルスが複製することができることを示し、
RT-PCRが、配列番号2の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3の配列を有するリバースプライマーと、配列番号4の配列を有するプローブとを用いて行われる、方法。 - RNaseによる試料の処理に先立ち、RT-PCRによって試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程をさらに含み、
RT-PCRが、配列番号2の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3の配列を有するリバースプライマーと、配列番号4の配列を有するプローブとを用いて行われる、請求項13に記載の方法。 - 試料の検査のためのアッセイにおいて用いられる方法であって、試料が原体である、請求項10、12または13に記載の方法。
- S.exigua細胞と、配列番号1の少なくとも250個の近接ヌクレオチドを有するラブドウイルスとを含む組成物。
- ラブドウイルスが、配列番号1の配列を含む、請求項16に記載の組成物。
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