CN103184270A

CN103184270A - 检测结核分枝杆菌（tb）的耐药基因突变型的方法和试剂盒

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Publication number: CN103184270A
Application number: CN2011104482014A
Authority: CN
Inventors: 陈唯军; 赵雁林; 赵金银; 王胜芬; 刘利成; 逄宇; 王鹏志; 周杨; 吴伟力; 刘琦; 徐磊
Original assignee: Beijing Macro & Micro-Test Bio-Tech Co Ltd; Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Beijing Macro & Micro-Test Bio-Tech Co Ltd; Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2011-12-28
Publication date: 2013-07-03

Abstract

本发明提供了一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的方法和试剂盒。与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多个耐药位点，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。

Description

检测结核分枝杆菌(TB)的耐药基因突变型的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及多重PCR扩增技术和飞行时间质谱基因分型系统(MassArray)。且更具体而言，本发明涉及检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的方法和试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌(M.tuberculosis，TB)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。

抗生素类药物是治疗结核病的主要手段，其中一线抗结核药物主要有：异烟肼(Isoniazid，INH)、利福平(Rifampicin，RFP)、氟喹若酮(fluoroquinolones，FQ)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、链霉素(Streptomycin，SM)等。但近年来，耐药菌株的出现，特别是耐多药结核菌(multi-drug resistanttuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核菌(extensively drug resistanttuberculosis，XDR-TB)的流行和传播引起了全球各国学者的极大关注。我国第四次全国结核病流调数据显示，TB总耐药率为27.8％，初始耐药率和获得性耐药率分别为18.6％和46.5％，耐多药率为10.7％，其中初始和获得性耐多药率分别为7.6％和17.1％。

TB的耐药分子机制大致有三种类型：1.降低细胞膜的通透性和外排泵机制；2.产生降解或灭活酶类；3.药物靶位的改变。具体耐药基因突变如下：

1、异烟肼(INH)的耐药基因

INH进入菌体后，在分支杆菌过氧化氢-过氧化物酶作用下氧化脱氢化脱氢生成亲电子形式，这种形式能与分支菌酸生化合成途径中的烯酰基还原酶-NADH复合体结合，抑制其活性，干扰分支菌酸合成，从而发挥抗菌作用。TB耐INH主要与katG基因、inhA基因突变有关。katG基因，即过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因，可引起INH耐药性的主要原因是katG基因的点突变、部分缺失或碱基对的插入，而其完全缺失仅占INH耐药菌株的7％～24％。katG基因常见的点突变是315位Ser→Thr。inhA基因是一种与分枝菌酸生物合成有关的烯酰基还原酶的编码基因，inhA基因的突变率较高的主要在inhA上游调控区-15位点及Ser94Ala位点。

2、利福平(RFP)的耐药基因

RFP是通过特异地与DNA依赖的RNA聚合酶的B亚单位(rpoB)结合，抑制RNA聚合酶活性，干扰分支杆菌RNA的转录及合成，阻碍蛋白质合成而发挥抗菌作用。当结核杆菌rpoB基因发生一个或多个位点的突变、缺失或颠换时，就会对RFP产生耐药，95％左右的RFP耐药菌株的产生都是因为rpoB基因发生改变所致。rpoB基因的突变主要集中在一个高度保守的核心区域内，即507-533位编码27个氨基酸密码子的81个bp的区域。该区域内的各种突变中，有48％为531位点丝氨酸(Ser)的错义突变；22％为526位点组氨酸(His)的错义突变；此外还有510(Gln)、511(Leu)、512(Ser)、513(Gln)、515(Met)、516(Asp)、522(Ser)、524(Leu)、533(Leu)等位点的突变或缺失。

3、乙胺丁醇(EMB)的耐药基因

EMB是一种阿拉伯糖类似物，作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯乳聚糖，从而影响细胞壁分支菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物的形成，导致菌细胞的死亡。最近的研究表明，结核杆菌耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变或emb蛋白过度表达有关，该操纵子由embC、embA和embB三个基因组成，其中embB基因突变是EMB产生的主要原因。

4、链霉素(SM)的耐药基因

SM的主要作用部位在核糖体30S亚基，能引起遗传密码错读、翻译启动的抑制及校对的异常，从而抑制蛋白质的合成，发挥抗菌作用。结核杆菌耐SM的机理与其核糖体30S亚基S12蛋白的编码基因(rpsL)和/或16SrRNA编码基因(rrs)突变有关。rpsL基因最常见的突变位点是43位Lys(AAG)→Arg(AGG)的突变，88位也可发生同样突变，但较为罕见，少数还可见43位Lys→Thr的突变。rrs基因的突变可见于491位、512位、513位、516位、903位、904位等。

5、喹诺酮类(FQ)的耐药基因

FQ是复治病例主要的抗结核药物。FQ的作用靶位是细菌的DNA旋转酶，阻抑DNA的复制，最终导致菌体死亡。DNA旋转酶由gyrA和gyrB两种基因编码的两个A亚单位和两个B亚单位组成。gyrA基因长2517bp，gyrB基因长2060bp。喹诺酮类耐药结核菌中，突变大多发生在gyrA基因保守区67～106位的密码子区。常见94位Asp→Asn或His或Ala，90位Ala→Val，88位Gly→Cys，83位Ala→Val的突变。gyrA基因突变与药物浓度和结构有关，gyrB基因突变可能改变胞内药物的蓄积而呈现低度耐药。

目前在临床实验室仍然用常规方法，即绝对浓度法、比例法和抗性比率法，但这些方法均以细菌生长为终点判断结果，由于结核分枝杆菌生长缓慢，在得到分离培养物后仍需4～6周方能获得结果，所以急需建立快速、准确、可靠的药物敏感性试验方法。近年来，随着分子生物学理论和技术的发展，结核分枝杆菌的耐药机制及耐药的分子基础大部分已被阐明，建立了快速检测结核分枝杆菌耐药基因的方法，为结核分枝杆菌快速药物敏感性试验开辟了一条新的途径。

但目前的分子检测方法主要以限制性片段长度多态性分析、PCR测序、基因芯片为主，普遍存在低通量、低分辨率、高背景信号、高成本等缺陷。

MassArray分子量阵列技术是世界上领先的基因突变分析技术。MassArray结合了简单、可靠的引物延伸反应和先进的MALDI-TOF质谱技术，可以快速经济地进行基因型分析，达到目前市场上最高的准确率和性价比。基于MassArray分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以便捷的设计多达40种的基因型检测。实验设计灵活，价格低廉。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的方法。

本发明的另一个目的是提供一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的的试剂盒。

根据本发明的一个方面，提供了一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的方法。其中，所述结核分枝杆菌的耐药基因选自KatG、inhAregulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA中；优选地，所述结核分枝杆菌的耐药基因包括KatG、inhA regulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA；更优选地，所述结核分枝杆菌的耐药基因由KatG、inhAregulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA组成。具体地，所述结核分枝杆菌的耐药基因突变型选自KatG Ser315Thr、KatG Ser315Asn、KatG Ser315Ile、inhA regulatory-17G＞T、inhA regulatory-15C＞T、inhASer94Ala、kasA Gly269Ser、kasA G312Ser、rpoB Ser531Leu、rpoB His526Tyr、rpoB His526Asn、rpoB His526Asp、rpoB Asp516Val、rpoB Asp516Gly、rrs513A＞T、rrs 513A＞C、rrs 516C＞T、rpsL Lys43Arg、rpsL Lys88Arg、embBMet306Ile、embB Met306Val、embB Met306Leu、gyrA Asp94Gly、gyrAAsp94Ala、gyrAAsp94Tyr和gyrAAsp94His中；优选地，所述结核分枝杆菌的耐药基因突变型包括上述所列的耐药基因突变型；更优选地，所述结核分枝杆菌的耐药基因突变型由上述所列的耐药基因突变型组成。所述方法包括：

1)PCR扩增引物的制备：

PCR扩增引物为根据所选择的待检测的TB药物的耐药基因突变型设计的特异性针对每种耐药基因的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3′端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基，在5′端具有标签序列(例如，acgttggatg)，以区分扩增引物与延伸引物。

优选地，本发明的扩增引物选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20中；更优选地，本发明的扩增引物包括SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20；且最优选地，本发明的扩增引物由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20组成。

2)质谱延伸引物的制备：

质谱延伸引物的长度为17-28个碱基并且其3′端位于耐药基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为耐药基因突变位点。其中，延伸产物和延伸引物之间的分子量差异不小于9Da；按照引物间，引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4500-8500Da之间。

优选地，本发明的延伸引物选自SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38中；更优选地，本发明的延伸引物包括SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38；且最优选地，本发明的延伸引物由SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38组成。

3)检测模板的制备：提取待测样本DNA。

采用适当的商业化试剂盒提取样本DNA，如：分离培养物可采用Tiangen的细菌基因组DNA提取试剂盒，临床样本(如痰液等)可采用Tiangen粪便基因组DNA提取试剂盒。

4)以步骤3)中提取的DNA为模板，使用步骤1)中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。

5)通过SAP酶处理，除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。

6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤2)中的质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。

7)纯化步骤6)中获得的延伸产物。

8)将纯化后的产物在质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。

根据本发明的另一个方面，提供了一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的的试剂盒，该试剂盒包括以下成分：

1)PCR反应液Mix：包括1×PCR反应缓冲液(购自Sequenom公司)、PCR扩增引物；

2)PCR反应Taq酶(购自Sequenom公司)；

3)SAP反应缓冲液(购自Sequenom公司)；

4)SAP酶(购自Sequenom公司)；

5)Extension反应液Mix：包括反应缓冲液(购自Sequenom公司)、质谱延伸引物

6)Extension反应Taq酶(购自Sequenom公司)

7)MassARRAY芯片。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；

2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；

3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；

4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多个耐药位点，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。

特别地，本发明的技术方案采用飞行时间质谱基因分型系统，通过设计一套全新的质谱延伸引物，实现了对上述5种TB药物(INH、RFP、SM、EMB、FQ)的耐药基因突变型的检测和分型。其与其它现有方法相比，能够同时准确检测出TB耐药性，具有高通量、自动化、低成本的特点，有显著的优点。

附图说明

图1为显示以从100％的CMCC 93009菌株提取的DNA为模板按照本发明的一个实施方式进行检测的质谱峰图分析结果的图；其中，图1A～图1C浓度依次为10⁵个菌/ml、10⁴个菌/ml、10³个菌/ml。

图2为显示以从含5％的INH耐药临床分离株的CMCC 93009菌株提取的DNA为模板按照本发明的一个实施方式进行检测的质谱峰图分析结果的图；其中，图2A～图2C浓度依次为10⁵个菌/ml、10⁴个菌/ml、10³个菌/ml。

图3为显示以从含25％的INH耐药临床分离株的CMCC 93009菌株提取的DNA为模板按照本发明的一个实施方式进行检测的质谱峰图分析结果的图；其中，图3A～图3C浓度依次为10⁵个菌/ml、10⁴个菌/ml、10³个菌/ml。

图4为显示以从含50％的INH耐药临床分离株的CMCC 93009菌株提取的DNA为模板按照本发明的一个实施方式进行检测的质谱峰图分析结果的图；其中，图4A～图4C浓度依次为10⁵个菌/ml、10⁴个菌/ml、10³个菌/ml。

图5为显示以从含75％的INH耐药临床分离株的CMCC 93009菌株提取的DNA为模板按照本发明的一个实施方式进行检测的质谱峰图分析结果的图；其中，图5A～图5C浓度依次为10⁵个菌/ml、10⁴个菌/ml、10³个菌/ml。

图6为显示以从100％的INH耐药临床分离株提取的DNA为模板按照本发明的一个实施方式进行检测的质谱峰图分析结果的图；其中，图6A～图6C浓度依次为10⁵个菌/ml、10⁴个菌/ml、10³个菌/ml。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

引物序列由上海生工合成，PCR扩增试剂、SAP酶、Extension反应液均购自Sequenom公司，PCR扩增仪为AB公司9700型号，质谱分析仪为Sequenom公司MassARRAY Compact Analyzer。

实施例

本发明的实施例提供了对5种抗结核药物(TB药物(INH、RFP、SM、EMB、FQ))的耐药基因突变型进行检测的方法。

实施例1引物的设计

(1)PCR扩增引物：

根据所选择的待检测的5种TB药物的耐药基因突变型，设计出特异性针对每种耐药基因的扩增引物，扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3′端具有与其所针对的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在5′端具有10个碱基(acgttggatg)的标签序列，以区分扩增引物与延伸引物。

(2)质谱延伸引物：

设计延伸引物，所述延伸引物的长度为17-28个碱基，并且其3′端位于耐药突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为耐药突变位点。其中，延伸引物的野生型延伸产物与突变型延伸产物之间的分子量差异不小于9Da(Da＝道尔顿)，且各个耐药突变位点的延伸产物间的分子量差异不小于30Da。按照引物之间、引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体、引物自身不形成发夹结构以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4500-8500Da之间。

本发明设计的针对所述的耐药基因突变位点信息如表1所示，扩增引物参见表2，延伸引物参见表3。

表1：耐药基因突变信息

其中，上述符号“＞”表示碱基突变。

表2：针对所述PCR扩增的PCR扩增引物序列

表3：针对所述延伸反应的质谱延伸引物

实施例2

检测模板的制备

培养的结核杆菌标准株CMCC 93009菌株和INH耐药临床分离株进行细胞计数，分别稀释到10⁵个菌/ml、10⁴个菌/ml、10³个菌/ml浓度梯度，每个浓度制备成不同比例的混合液：(1)100％CMCC 93009菌株，(2)93009菌株中加入5％的INH耐药临床分离株，(3)93009菌株中加入25％的INH耐药临床分离株，(4)93009菌株中加入50％的INH耐药临床分离株，(5)93009菌株中加入75％的INH耐药临床分离株，(6)100％的INH耐药临床分离株。将上述不同浓度不同比例的混合液，提取DNA(采用Tiangen细菌DNA试剂盒提取，操作方法按照试剂盒说明书提取)。

实施例3TB药物的耐药基因突变型的检测方法

(1)以实施例2中提取的DNA为模板，使用实施例1中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物。PCR扩增反应体系参见表4。其中，所有试剂购买自Sequenom公司。

表4：PCR扩增反应体系

PCR反应条件为94℃，15分钟；94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸3分钟。在本实施例中，使用实施例2中提取的DNA作为PCR扩增的DNA模板。同时，将无菌双蒸水作为阴性对照。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。

(2)通过SAP酶处理，除去步骤(1)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表5。所有试剂购买自sequenom公司。

表5：SAP酶反应体系

试剂	体积/反应
		水(HPLE级)	1.53μl
SAP酶缓冲液	0.17μl
		SAP酶	0.30μl
步骤(1)中获得PCR扩增产物	5.0μl
		总体积	7.0μl

SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。

(3)以(2)中获得的扩增产物为模板，使用实施例1中的质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表6。所有试剂购买自sequenom公司。

表6：延伸反应体系

试剂	体积/反应
		水	0.619μl
iPLEX缓冲液	0.200μl
		iPLEX ddNTP混合物	0.200μl
表3中的延伸引物混合物	^*0.940μl
		iPLEX酶	0.041μl
步骤(3)中获得的产物	7.00μl

总体积

9.00μl

^*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。

延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。

(4)采用树脂(购买自Sequenom公司)纯化步骤(3)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，16.00μl水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。

(5)将纯化后的产物在Sequenom MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件(由sequenom公司提供)进行分析，得到分型结果。

检测结果：

质谱峰图分析结果如图1-图6所示。INH耐药突变位点KatG Ser315出现突变，且INH耐药临床分离株突变率越高，峰图越明显。

Claims

1.一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的方法，其中，所述结核分枝杆菌的耐药基因选自KatG、inhAregulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA中，所述方法包括：

1)PCR扩增引物的制备：PCR扩增引物为根据所选择的待检测的耐药基因突变型设计的特异性针对每种耐药基因的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列，所述扩增引物在3′端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基，在5′端具有标签序列，以区分扩增引物与延伸引物；

2)质谱延伸引物的制备：质谱延伸引物的长度为17-28个碱基并且其3′端位于耐药基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为耐药基因突变位点；

3)检测模板的制备：提取待测样本DNA；

4)以步骤3)中提取的DNA为模板，使用步骤1)中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物；

5)通过SAP酶处理，除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP；

6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤2)中的质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物；

7)纯化步骤6)中获得的延伸产物；

8)将纯化后的产物在质谱仪上进行质谱检测，所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述扩增引物选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20中。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述延伸引物选自SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38中。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述结核分枝杆菌的耐药基因包括KatG、inhA regulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述扩增引物包括SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述延伸引物包括SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述结核分枝杆菌的耐药基因由KatG、inhA regulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA组成。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述扩增引物由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20组成。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述延伸引物由SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38组成。

10.一种检测结核分枝杆菌的耐药基因突变型的试剂盒，其中，所述结核分枝杆菌的耐药基因选自KatG、inhAregulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA中，或者优选地所述结核分枝杆菌的耐药基因包括KatG、inhA regulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA，或者优选地所述结核分枝杆菌的耐药基因由KatG、inhA regulatory、inhA、kasA、rpoB、rrs、rpsL、embB和gyrA组成，该试剂盒包括以下成分：

1)PCR反应液Mix，其包括PCR反应缓冲液和PCR扩增引物；

2)PCR反应Taq酶；

3)SAP反应液，其包括SAP反应缓冲液和SAP酶；

4)Extension反应液Mix，其包括反应缓冲液和质谱延伸引物；

5)Extension反应Taq酶；和

6)MassARRAY芯片，

其中，所述PCR扩增引物为根据所选择的待检测的耐药基因突变型设计的特异性针对每种耐药基因的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列，所述扩增引物在3′端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基，在5′端具有标签序列，以区分扩增引物与延伸引物，

其中，所述质谱延伸引物的长度为17-28个碱基并且其3′端位于耐药基因突变位点的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为耐药基因突变位点。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其中，优选地，所述扩增引物选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20中；更优选地，所述扩增引物包括SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20；且最优选地，所述扩增引物由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：20组成。

12.如权利要求10或11所述的试剂盒，其中，优选地，所述延伸引物选自SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38中；更优选地，所述延伸引物包括SEQID NO：21～SEQ ID NO：38；且最优选地，所述延伸引物由SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：38组成。