CN101363799A - 结核病用药评估试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测个体对结核病药物敏感性的试剂盒。该试剂盒包括检测KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点和rpsL基因的L43A位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、检测embB基因的第306个密码子基因型的特异性引物对及DNA测序引物、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。通过检测KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点、rpsL基因的L43A位点和embB基因的第306个密码子的基因型，来分析评估个体对结核病药物的敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体对结核病药物敏感性的试剂盒。
背景技术
结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，全球约有20亿人受结核分支杆菌感染，其中约有5000万人感染了耐药结核分支杆菌，使耐药结核病例数明显增多，结核患者中又有发生自然耐药的危险。耐药性和结核分支杆菌代谢的分子生物学研究将推动新型药物的开发和建立适宜推广的快速鉴定结核分支杆菌耐药基因类型的方法，便于人们了解结核病患者的耐药状况，指导临床的化疗和防止耐药菌的播散。
异烟肼(INH)作为抗结核治疗的首选药物，对结核病的有效控制发挥了重要作用。但近年来结核分支杆菌对INH耐药性以及多重耐药的出现已成为抗结核治疗中的重大障碍。研究表明，INH实际上是一个药物前体，需经结核分支杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶活化后才发挥抗结作用，而过氧化氢酶-过氧化物酶则由katG基因所编码。最新研究认为KatG基因的变异(包点突变、缺失、插入等)导致的结核分枝杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶活性降低或缺失可以解释90％以上的INH耐药。INH耐药性结核分支杆菌中，KatG基因突变较其完全缺失更为普遍，是结核菌耐INH的主要机制，其中315位密码子AGC(Ser)→ACC(Th r)的点突变与结核菌耐INH更为密切。这个突变点导致过氧化氢酶活性较野生株降低50％左右，可以作为检测结核杆菌对异烟肼耐药的简易指标，从而可以了解结核病患者的耐药状况，指导临床的治疗和防止耐药菌体的播散。
RNA聚合酶的β亚基rpoB基因突变已作为MTB耐RFP的遗传标志，其中531位Ser(TCG)→Leu(TTG)氨基酸错义突变最常见，可以把检测这个区域的突变作为一种检测结核杆菌耐RFP简易、快速的方法。另外由于异烟肼和利福平是临床最常用的药物，有作者报告90％-95％耐利福平株同时也耐异烟肼，因而单独进行利福平敏感性分析也可作为耐多药的筛选指标。
链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，它主要作用于核糖体30S亚基，诱导遗传密码的错读，抑制转译过程的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质的合成，发挥抗菌作用。研究表明，结核分枝杆菌耐受SM与编码核糖体30S亚基，S12蛋白的rpsL基因和编码16SrRNA的rrs基因突变有关。临床分离耐SM菌株约有80％可见rpsL和(或)rrs基因突变，其中rpsL的突变率高于rrs。rspL基因最常见的是43位密码子突变，使Lys密码子(AAG)突变成精氨酸(Arg)，也可见88位密码子发生同样的突变，rspL的突变常引起高水平的耐药。rrs突变常发生于915区和530环区，它常引起中等水平的耐药。少数耐SM结核分枝杆菌分离株中发现双位点的突变，如rspL43位密码子和rrs513位密码子突变，rpsL88位和rrs904位突变。
embB为结核杆菌arabinosyltransferase(阿拉伯糖基转移酶)蛋白编码基因，主要作用是在阿拉伯糖代谢通路中将阿拉伯糖基转移，促进肺结核病菌的细胞壁的生物合成。阿拉伯糖基转移酶(arabinosyltransferase)是肺结核病菌的细胞壁的生物合成所需的一种酶，基因的突变或过度表达可导致持续合成阿拉伯聚糖而耐药。研究发现embB基因具有单核苷酸多态性，其中最常见的是位点306的突变。该酶在306位点发生改变，使酶与乙胺丁醇(EMB)不能作用，从而使结核杆菌对乙胺丁醇产生抗性。
发明内容
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与结核病药物敏感性相关基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评估后，KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点、rpsL基因的L43A位点和embB基因的第306个密码子通过国家生物基因检测技术应用评估认证中心认定，可用于检测评估结核病药物敏感性。
基于KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点、rpsL基因的L43A位点和embB基因的第306个密码子的基因型可用来评估个体对结核病药物敏感性的基础上，本发明提供一种检测个体对结核病药物敏感性的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点和rpsL基因的L43A位点的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测embB基因的第306个密码子基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水等)。
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点、rpsL基因的L43A位点和embB基因的第306个密码子而设计，能特异性扩增出包含这些位点DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。
所述的特异性荧光探针对是指针对KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点和rpsL基因的L43A位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这些SNP位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。
所述的DNA测序引物是指针对embB基因的第306个密码子基因型而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这个密码子基因型的DNA测序引物。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。DNA测序引物可用常规的合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
1.荧光定量PCR反应套装
10X荧光定量PCR反应缓冲液3μl，
25mM dNTP混合液0.3μl，
25mM MgCl2溶液1.8μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.075μl，
20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，
10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，
去离子水15.975μl。
2.PCR反应套装
10X PCR反应缓冲液2.5μl，
25mM dNTP混合液0.2μl，
25mM MgCl2溶液1.5μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，
20μM APOE基因特异性引物对每条引物各0.25μl，
去离子水19.175μl。
3.PCR产物纯化套装
lunits/μl SAP酶0.75μl，
10units/μl ExoI酶0.375μl，
去离子水3.875μl。
4.测序反应套装
25％ BigDye mix 1μl，
3.2μM DNA测序引物1μl，
125mM EDTA溶液1μl，
100％乙醇溶液15μl，
70％乙醇溶液30μl，
HIDI溶液8μl，
去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒，进行3次独立的荧光定量PCR反应，每次反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3：PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应套装。
反应的体系为总体积25μl，包含浓度为12.5ng/μl的DNA模板1μl、10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mMdNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。
步骤4：PCR产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25μl，包含PCR产物20μl，1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。
步骤5：DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应套装，反应的体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，25％ BigDye mix1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，去离子水2μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
步骤6：基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的密码子的基因型。
实施例2.对病人进行结核病药物敏感性评估的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对病人基因组DNA的AKatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点、rpsL基因的L43A位点和embB基因的第306个密码子进行检测，确定这些位点的基因型。
步骤3：个体结核病药物敏感性的评估分析
通过对病人基因型的分析，出具个体结核病药物敏感性的评估分析报告单。报告中详细说明了被检测病人结核病药物敏感性的有效性，可供医师参考调整病人的用药方式和剂量。
Claims (5)
1.一种检测个体对结核病药物敏感性的试剂盒，其特征在于：包括检测KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点和rpsL基因的L43A位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、检测embB基因的第306个密码子基因型的特异性引物对及DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、PCR反应缓冲液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对针对KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点、rpsL基因的L43A位点和embB基因的第306个密码子而设计，能特异性扩增出包含这些位点DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性荧光探针对是指针对KatG基因的S315T位点、rpoB基因的S531L位点和rpsL基因的L43A位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这些SNP位点基因型的Taqman探针对。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是指针对embB基因的第306个密码子基因型而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这个密码子基因型的DNA测序引物。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
1)荧光定量PCR反应套装：10X荧光定量PCR反应缓冲液3μl，25mM dNTP混合液0.3μl，25mM MgCl2溶液1.8μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.075μl，20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，去离子水15.975μl。
2)PCR反应套装：10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mM dNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
3)PCR产物纯化套装：lunits/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
4)测序反应套装：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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