CN106967833A - 用于二倍体a基因组棉种和/或四倍体棉种鉴定的引物及其pcr鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一个适用于棉花A基因组和包含A亚基因组棉种(Gossypium)的鉴别。使用本发明的特异PCR引物，根据其PCR产物是否能凝胶成像，可区分、鉴别A(亚)基因组棉种与B，C，D，E，F，G，K棉种。本发明所述引物仅在A组二倍体基因组棉种和四倍体棉种中产生特异条带，在B、C、D、E、F、G、K组的14个二倍体棉种无产物。

Description

用于二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种鉴定的引物及其 PCR鉴定方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及对适用于棉花二倍体A基因组棉种及四倍体棉种鉴定的特异引物pa203，及其PCR鉴定方法。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
棉花是世界上重要的经济作物，棉属共包含52个棉种，共5个四倍体和47个二倍体。棉花二倍体棉种分为A、B、C、D、E、F、G和K8个染色体组。四倍体棉种为异源四倍体，其染色体组为AD。如今，世界范围内主要的栽培种是陆地棉(AD)1和海岛棉(AD)2，分别占栽培面积的95％和5％左右。目前，D组棉种雷蒙德氏棉、A组棉种亚洲棉，以及两个四倍体棉种陆地棉、海岛棉的基因组测序已经完成，染色体序列已经公布。基因组测序将对棉花基因组研究，四倍体棉的进化研究以及对棉花育种都会有很大的帮助。通过对棉种特异引物的筛选发掘，来进行PCR克隆棉种鉴定实验，将是一个便捷快速鉴定棉种及DNA的经济实用方法。
发明内容
本发明的目的包括：
提供一个适用于二倍体A基因组棉种及四倍体棉种鉴定的特异引物pa203；
以及基于该引物鉴定的棉种的PCR方法。
本发明具体的，提供了一对用于棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种鉴定的引物pa203，所述引物pa203从5’到3’的的核苷酸序列为
正向引物：CACCGAATAGAAGGCAAGGA，
反向引物：ACTAGGGGTGCATAGCGAGA；
以及引物pa203用于棉花二倍体A基因组棉种和四倍体棉种鉴定的用途。
所述棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种选自表1所述棉种。
表1
本发明公开了一种鉴定棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种的方法，包括以下步骤：
1)使用权利要求1所述引物pa203，，以待测棉种的核基因组全部DNA为模板进行PCR扩增；
2)PCR扩增产物做电泳检测；如果得到一条700bp的目的产物，则待测棉种为棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种。
优选的，步骤1)所述PCR扩增体系为：pa203正向引物和反向引物各0.5μL，总DNA 4μL，2×Taq Mix 5μL；反应体系为10μL；
步骤1)所述PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；50℃-55℃退火35秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃保持5分钟，10℃
存放。
进一步优选的，步骤1)所述PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；50℃退火35秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃保持5分钟，10℃存放。
优选的，步骤2)所述电泳为琼脂糖凝胶电泳；
进一步优选的，步骤2)所述Taq Mix由Taq酶、dNTP、Buffer组成，MIX中Taq酶的浓度为2×,dNTP的浓度为1mM，Buffer由1000mM KCl 200mM Tris-HCl(pH 8.3)，30mM MgCl2组成。
本发明所述的一种鉴定棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种的方法，还包括：步骤3)e-PCR验证。
本发明的另一个目的是提供一种采用该特异引物对核基因组DNA做PCR扩增，结合e-PCR及Blast程序验证，进行鉴别二倍体A基因组及四倍体棉种，并将其与他棉种区分开来方法。
根据本发明的特异引物pa203，该引物用Primer Premier 5软件以亚洲棉基因组5号染色体设计而来，用该引物可扩增出大约长度为700bp的片段。利用该特异引物对棉种DNA做PCR扩增，只在所有二倍体A基因组棉种及四倍体棉种产生特异条带，在B、C、D、E、F、G、K基因组棉种均不能产生条带。
根据本发明的PCR操作方法包括以下步骤：
1)根据以下信息合成引物，引物纯化方式选择PAGE；
pa203.f
CACCGAATAGAAGGCAAGGA
pa203.r
ACTAGGGGTGCATAGCGAGA
2)引物合成，棉种DNA准备。
3)PCR实验，反应体系如下：
上述体系保证模板DNA的浓度为40ng/μL，其中Taq Mix是2×的，可以由Taq酶+dNTP+Buffer组合而成。
PCR反应过程如下：
上述退火温度可以在50-55摄氏度之间自由掌握。
4)琼脂糖凝胶电泳。
5)凝胶成像仪成像读带。
6)执行e-PCR比对验证。
结果显示此对引物会在亚洲棉5号染色体，海岛棉A亚组10号染色体，陆地棉A亚组11号染色体，产生700bp左右的产物。在雷蒙德氏棉和四倍体D亚组中没有显示匹配结果。
PCR技术是一个方便快捷，节约高效的实验方法，本发明可以作为棉种鉴定的一个特异标记，这对快速鉴定包含A(亚)基因组棉种，及解决实验工作中意外将A(亚)基因组棉种与其他棉种DNA混淆问题，具有重要实用价值。
附图说明
图1A：以β-Actin(肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白)作为PCR的内参引物，用来检测各棉种DNA的可用性。
图1B：以pa203做为引物对各棉种做PCR测试。
具体实施方式
实施例1 以pa203为引物，棉种DNA为模板做PCR验证。
1材料和方法
1.1实验材料
实验材料是表3中显示的各棉种的核基因组DNA，浓度为40ng/μL；引物为pa203特异引物：pa203.f CACCGAATAGAAGGCAAGGA
pa203.r ACTAGGGGTGCATAGCGAGA
通用引物β-Actin。引物均由英潍捷基公司合成，纯化方式paGE。Taq Mix为Vazyme公司的2×Taq Master Mix for paGE。DNA loading buffer为Vazyme公司生产。
50μL的96孔板；TAKARA公司的PCR仪；琼脂糖凝胶由含1％琼脂糖的TAE制成，电泳液为TAE；电泳仪由北京六一公司生产；凝胶成像仪器为VILBER公司生产。
1.2实验方法
1)将DNA，引物，Taq Mix按上述体系比例加入50μL灭菌的96孔板中；
2)将96孔板离心，震荡，离心后，放入PCR仪，运行上述PCR流程，约2.5h；
3)将产物取出，按比例混合DNA loading buffer，点胶；
4)电压110，电流200mA，电泳时间30min；
5)取胶，读带；
6)e-PCR测试。
2实验结果
读胶结果显示，β-Actin测试证明22个棉种的DNA均可用(图1A)；特异引物pa203在5个四倍体棉种陆地棉、海岛棉、毛棉、黄褐棉、达尔文氏棉，及3个二倍体A组棉种：草棉、亚洲棉、阿非利加棉均可以产生目的条带，在其他B-K基因组的13个棉种均没有检测到产物(图1B)。图1中，各基因组对应棉种的名称见下表3。
表3 图1从左至右对应的各棉种DNA
e-PCR结果显示此对引物会在亚洲棉5号染色体，海岛棉A亚组10号染色体，陆地棉A亚组11号染色体，产生700bp左右的产物(表4)。
表4 pa203在亚洲棉海岛棉陆地棉中的e-PCR结果

Claims (9)

1.一对用于棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种鉴定的引物pa203，所述引物pa203从5’到3’的的核苷酸序列为
正向引物：CACCGAATAGAAGGCAAGGA，
反向引物：ACTAGGGGTGCATAGCGAGA。
2.权利要求1所述的引物pa203用于棉花二倍体A基因组棉种和四倍体棉种鉴定的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种选自表1所述棉种。
表1
4.一种鉴定棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种的方法，包括以下步骤：
1)使用权利要求1所述引物pa203，，以待测棉种的核基因组全部DNA为模板进行PCR扩增；
2)PCR扩增产物做电泳检测；如果得到一条700bp的目的产物，则待测棉种为棉花二倍体A基因组棉种和/或四倍体棉种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤1)所述PCR扩增体系为：pa203正向引物和反向引物各0.5μL，总DNA 4μL，2×TaqMix 5μL；反应体系为10μL；
步骤1)所述PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；50℃-55℃退火35秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃保持5分钟，10℃存放。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；50℃退火35秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃保持5分钟，10℃存放。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)所述Taq Mix由Taq酶、dNTP、Buffer组成，MIX中Taq酶的浓度为2×,dNTP的浓度为1mM，Buffer由1000mM KCl，200mM Tris-HCl(pH 8.3)，30mM MgCl2组成。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法还包括：
步骤3)e-PCR验证。
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