JP4113556B2 - 核酸分解剤および核酸の分解方法 - Google Patents
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Description
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、第5巻、1978年、第4891−4903頁 バイオケミストリー(Biochemistry)、第36巻、第50号、1997年、第15884〜15891頁 アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー(Appl. Environ. Microbiol.)、第71巻、第2号、2005年、第1018〜1024頁
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、エチジウムモノアジドを有効成分とし、可視光線照射によって核酸を分解する抗菌剤である。
前記課題を解決する本発明の第三の発明は、核酸を含む試料にエチジウムモノアジドを添加する工程、および当該核酸を含む試料に可視光線を照射して試料中の核酸を分解する
工程を含む、核酸を含む試料(ただし、死細胞を除く)中の核酸を分解する方法である。
前記課題を解決する本発明の第四の発明は、細胞を含む試料にエチジウムモノアジドを添加する工程、および当該細胞を含む試料に可視光線を照射して細胞内の核酸を分解する工程を含む、細胞(ただし、死細胞を除く)内の核酸を分解する方法である。
なお、本発明において、核酸にはDNA及びRNAが含まれる。本発明の核酸分解剤が対象とする核酸には、1本鎖DNA、2本鎖DNA、1本鎖RNA、及び2本鎖RNAが含まれる。本発明を適用する試料にはこれらのいずれが含まれていても良く、2種以上が含まれていても良い。また、本発明の核酸分解剤の対象としては、例えば、染色体DNA及びプラスミドDNA、並びにrRNA、mRNA及びtRNA等が挙げられる。
-phenanthridinium chloride:EMA)は、化学式(1)で示される化合物である。エチジウムモノアジドは市販のものを使用することが可能である。
なお、本発明の核酸分解剤は液体であっても、EMAそのものであっても良く、使用時に適宜希釈、溶解すればよい。
例えば、500Wのハロゲン電球を20cmの距離から照射する場合、照射時間は5分〜1時間程度、好ましくは5〜30分で十分に核酸分解効果を発揮させることが可能である。
分解効果を高めることができる。
(1)試験方法
1.0×106CFU/mlの大腸菌E.coli/DH5α株の生菌懸濁液1mlについて冷却遠心処理を行ない、上清を除いたペレットに、0.5mlの10mMトリス-塩酸緩衝溶液(pH8.0)を添加し、1250U/mlプロテイナーゼK溶液を10μl、および10%SDS溶液を200μl添加後、50℃にて、一晩、溶菌操作を行った。
0、200μg/ml)を4μl添加して、遮光下、4℃で1時間放置した。その後、サンプルから20cm離した状態で500Wのハロゲン電球(FLOOD PRF 100V 500W;岩崎電気、東京)の可視光線を20分間照射し、全量を0.7%アガロースゲルにより電気泳動した。分子量マーカーとしてλ-EcoT14 I digest(宝バイオ社製)を使用した。泳動後のゲルは1μg/ml臭化エチジウム溶液で染色し、UVトランスイルミネーターを用いてUV254nmで照射し、その映像をポラロイドフィルム667に記録した。コントロールとして無処理(EMA:0μg/ml、可視光未照射)の核酸溶液を用いて、同様に電気泳動した。
本試験の結果を図1に示す。その結果、19,329bp付近の染色体DNA由来のバンドは、EMAの濃度が100ng/mlから1μg/mlにかけて徐々に減少し、10μg/mlの時点で顕著に消失することが確認され、EMAにより生菌(大腸菌)から単離した核酸中の染色体DNAが分解されることが明らかとなった。
また、EMAの濃度が1μg/mlで、rRNA(16SrRNA、23SrRNA)のバンド強度が減少し、10μg/ml以上において消失することが確認され、rRNAも分解されることが明らかとなった。
(1)試験方法
EMAを滅菌水で溶解して1000μg/mlEMA溶液を調製し、これを0.2μmのフィルター(Minisart-plus; ザルトリウスAG社製)により無菌ろ過した。当該EMA溶液を用いて、1.0×106CFU/mlの大腸菌E.coli/DH5α株の生菌懸濁液1mlに対して、EMAの終濃度が0(未添加)、0.01、0.1、1、10、及び100μg/mlとなるように添加後、遮光下4℃、1時間放置した。
本試験の結果を図2に示す。その結果、19,329bp付近の染色体DNA由来のバンドは、EMAの濃度が10μg/mlから徐々に減少し、100μg/mlの時点で顕著に消失することが確認され、EMAにより生菌(大腸菌)内に存在する染色体DNAが分解されることが明らかとなった。
また、EMAの濃度が10μg/mlで、rRNA(16SrRNA、23SrRNA)のバンド強度が減少し、生菌(大腸菌)内のrRNAも分解されることが明らかとなった。
(1)試験方法
エチジウムモノアジド(EMA)を滅菌水で溶解して1000μg/mlEMA溶液を調製し、これを0.2μmのフィルター(Minisart-plus; ザルトリウスAG社製)により無菌ろ過した。当該EMA溶液を用いて、1.0×106CFU/mlの大腸菌E.coli/DH5α株の生菌懸濁液1mlに対して、EMAの終濃度が0(未添加)、0.01、0.1、1、10、及び100μg/mlとなるように添加後、遮光下4℃、1時間放置した。
EMAによる抗菌効果を、用量反応曲線として図3に示す。その結果、大腸菌にEMAを10μg/mlの濃度で反応させた場合に、初発生菌数と比較して、生菌数が102 CFU/mlのオーダーで低減し、100μg/mlの濃度で反応させた場合に、初発生菌数に比して生菌数は105CFU/mlのオーダーで低減させることが可能であることが確認された。
すなわち、EMAは大腸菌(生菌)に対して抗菌効果を有することが明らかとなった。
(1)試験方法
前記実施例1と同様の方法により、核酸を抽出した後、滅菌水9mlに核酸を溶解した。調製した核酸溶液を32ml蔗糖密度勾配(16mlの10%蔗糖溶液と16mlの40%蔗糖溶液を使用)の上端に静かにロードし、スイングローター(日立工機社製:RPS-27-2)を用いて、20℃において26,000rpmで18時間の超遠心処理を行った。遠心処理後、蔗糖密度勾配溶液の底に穴を空け、1mlずつ分画した。
電子顕微鏡で観察する際、シャドウイングを白金−パラジウム粉末で行い、電子顕微鏡(日本電子社製、JEOL T-2000 EX)にて写真撮影を行った。
本試験の結果を図4に示す。図4は大腸菌の染色体DNAについて、EMAを0〜10μg/mlの濃度で作用させ、可視光照射(500Wハロゲン電球、20分間)後に電子顕微鏡下で観察した結果を示している。その結果、EMAを0〜0.01μg/mlで反応させても染色体DNAが切断されるという影響は観察されなかったが、1μg/ml以上で反応させることによって、染色体DNAの切断現象が確認された。この結果は、実施例1における結果とも対応し、EMAによる染色体DNAの切断現象が視覚的に確認された。
Claims (4)
- エチジウムモノアジドを有効成分とし、可視光線照射によって核酸を分解する核酸分解剤(ただし、死細胞に用いられる場合を除く)。
- エチジウムモノアジドを有効成分とし、可視光線照射によって核酸を分解する抗菌剤。
- 核酸を含む試料にエチジウムモノアジドを添加する工程、および当該核酸を含む試料に可視光線を照射して試料中の核酸を分解する工程を含む、核酸を含む試料(ただし、死細胞を除く)中の核酸を分解する方法。
- 細胞を含む試料にエチジウムモノアジドを添加する工程、および当該細胞を含む試料に可視光線を照射して細胞内の核酸を分解する工程を含む、細胞(ただし、死細胞を除く)内の核酸を分解する方法。
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