KR101017811B1

KR101017811B1 - 핵산 분해제 및 핵산의 분해 방법

Info

Publication number: KR101017811B1
Application number: KR1020087011899A
Authority: KR
Inventors: 신이찌 요시다; 다까시 소에지마
Original assignee: 모리나가 뉴교 가부시키가이샤
Priority date: 2006-12-04
Filing date: 2007-07-17
Publication date: 2011-02-28
Also published as: JP4113556B2; RU2388473C2; JP2008137962A; CN102389577A; AU2007302638A1; US20100170777A1; NO20082129L; CA2633591A1; CA2633591C; EP2090169A4; RU2008124804A; AU2007302638B2; WO2008068923A1; KR20080088581A; CN101378657B; EP2090169A1; CN101378657A

Abstract

에티듐 모노아지드를 유효 성분으로 하는 살균, 소독제 등의 항균제로서 유용한 핵산 분해제를 제공한다.

에티듐 모노아지드, 핵산 분해제

Description

핵산 분해제 및 핵산의 분해 방법{AGENT FOR DEGRADING A NUCLEIC ACID AND METHOD OF DEGRADING A NUCLEIC ACID}

본 발명은 에티듐 모노아지드(에티듐 모노아자이드라고도 호칭함)를 유효 성분으로 하는 핵산 분해제, 및 세포를 포함하는 시료에 에티듐 모노아지드를 첨가하고, 이 세포를 포함하는 시료에 가시광선을 조사하여 세포 내의 핵산을 분해하는 공정을 포함하는, 세포의 핵산을 분해하는 방법이다.

종래, 살균·소독제로서는, 알코올이나 크레졸, 산화제 등이 대표적 약제로서 범용되었지만, 이들은 단백질 변성제로서, 세균을 사멸시키는 점에서는 즉효성이 부족한 것이었다. 또한, 항균제로서는, 세포벽 합성 저해제, 단백질 합성 저해제, 핵산 대사 저해제, 에너지 대사 저해제, 대사 길항제 등이 예시되지만, 항균제로서의 작용의 발휘에는 모두 세균의 증식이 관여하고 있어, 즉각적인 효과를 기대하는 점에서는 충분하지 않았다.

에티듐 모노아지드(3-amino-8-azido-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridinium chloride: 이하 EMA라 약기하는 경우가 있음)는 DNA에 광 라벨링을 행하기 위해 합성된 브롬화에티듐을 기본 골격으로 하는 아지드 화합물이다(비특허 문헌 1). 또한, EMA는 진핵 세포의 토포이소머라제 포이즌으로서 알려져 있고(비특허 문헌 2), 핵 염색제인 프로피듐 요오다이드와 같은 약제와 마찬가지로, 세포의 생사 판별제로서 이용되고 있었다(비특허 문헌 3).

그러나, EMA가 세포의 핵산을 랜덤하게 절단하는 작용에 대해서는 종래부터 알려져 있지 않았다.

비특허 문헌 1: 뉴클레익 애시즈 리서치(Nucleic Acids Res.), 제5권, 1978년, 제4891-4903 페이지

비특허 문헌 2: 바이오케미스트리(Biochemistry), 제36권, 제50호, 1997년, 제15884 내지 15891 페이지

비특허 문헌 3: 어플라이드 앤드 인바이런멘탈 마이크로바이올로지(Appl. Environ. Microbiol.), 제71권, 제2호, 2005년, 제1018 내지 1024 페이지

<발명의 개시>

본 발명은 살균, 소독제 등의 항균제로서 유용한 핵산 분해제를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 항균제, 특히 세균을 사멸시키는 약제에 대하여 예의 검토를 거듭하였고, 세균의 세포벽을 투과함으로써 직접 세균의 핵산에 작용하고, 상기 핵산을 절단하는 핵산 분해제에 착안하여, 이러한 작용을 갖는 물질에 대하여 탐색을 행한 결과, 아지드 화합물인 EMA가, 살아 있는 세균의 세포벽을 투과하고, 핵산을 절단하는 효과를 가짐을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

상기 과제를 해결하는 본 발명의 제1 발명은, 에티듐 모노아지드를 유효 성분으로 하는 핵산 분해제이다.

상기 과제를 해결하는 본 발명의 제2 발명은, 제1 발명의 핵산 분해제를 포함하는 항균제이다.

상기 과제를 해결하는 본 발명의 제3 발명은, 핵산을 포함하는 시료에 에티듐 모노아지드를 첨가하는 공정, 및 상기 핵산을 포함하는 시료에 가시광선을 조사하여 시료 중의 핵산을 분해하는 공정을 포함하는, 핵산을 포함하는 시료 중의 핵산을 분해하는 방법이다.

상기 과제를 해결하는 본 발명의 제4 발명은, 세포를 포함하는 시료에 에티듐 모노아지드를 첨가하는 공정, 및 상기 세포를 포함하는 시료에 가시광선을 조사하여 세포 내의 핵산을 분해하는 공정을 포함하는, 세포 내의 핵산을 분해하는 방법이다.

도 1은 시험관 내에서의 EMA가 대장균 염색체 DNA 및 rRNA 등에 미치는 영향을 나타내는 전기영동 사진이다. M은 분자량 마커(λ/EcoT14 I digest)를 나타낸다. IR(-)는 가시광 조사 없음, IR은 가시광 조사(500W 할로겐 전구, 20분)를 나타낸다. E0-100n 또는 μ의 수치는 EMA의 최종 농도(0 내지 100 ng/ml 또는 ㎍/ml)를 나타낸다.

도 2는 생체 내에서의 EMA가 대장균 염색체 DNA 및 rRNA 등에 미치는 영향을 나타내는 전기영동 사진이다. M은 분자량 마커(λ/EcoT14 I digest)를 나타낸다. IR(-)는 가시광 조사 없음, IR은 가시광 조사(500W 할로겐 전구, 20분)를 나타낸 다. E0-100n 또는 μ의 수치는 EMA의 최종 농도(0 내지 100 ng/ml 또는 ㎍/ml)를 나타낸다.

도 3은 EMA에 의한 항균 효과 및 용량 반응 곡선이다. X축은 EMA의 최종 농도(㎍/ml)를 나타낸다. Y축은 각 EMA 처리구에서의 생균수(CFU/ml)의 초발 생균수에 대한 감소를 상용 대수에 의해 표시하고 있다.

도 4는 대장균 E. coli DH5α 염색체 DNA를 EMA 및 가시광 조사 처리(500W 할로겐 전구, 20분)하고, 전자 현미경하에서 관찰한 결과를 나타내는 사진이다. EMA의 최종 농도는 (1) 0, (2) 0.01 ㎍/ml, (3) 1 ㎍/ml, 및 (4) 10 ㎍/ml이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

다음으로, 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대하여 상세히 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 바람직한 실시 형태에 한정되지 않고, 본 발명의 범위 내에서 자유롭게 변경할 수 있는 것이다. 한편, 본 명세서에 있어서 백분율은 특별히 언급이 없는 한 질량에 의한 표시이다.

본 발명의 핵산 분해제는, 단리된 핵산에 직접 작용하여 랜덤하게 분해되는 효과를 갖는 동시에, 핵산을 포함하는 시료 중에 존재하는 핵산에 대해서도, 유효 성분인 EMA가 시료 중에 침투하여 직접 작용하고, 이들 핵산을 랜덤하게 절단하는 효과를 갖는다.

한편, 본 발명에 있어서, 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 본 발명의 핵산 분해제가 대상으로 하는 핵산에는, 1본쇄 DNA, 2본쇄 DNA, 1본쇄 RNA, 및 2본쇄 RNA가 포함된다. 본 발명을 적용하는 시료에는 이들 모두가 포함될 수도 있고, 2 종 이상이 포함될 수도 있다. 또한, 본 발명의 핵산 분해제의 대상으로서는, 예를 들면 염색체 DNA 및 플라스미드 DNA, 및 rRNA, mRNA 및 tRNA 등을 들 수 있다.

핵산을 포함하는 시료로서는, 모든 생물 세포, 예를 들면, 원핵 세포(박테리아)나 진핵 세포 등(원생 생물, 진균, 식물, 동물 등), 바이러스 등을 들 수 있지만, 박테리아나 진균, 바이러스 등이 특히 바람직하다.

본 발명의 핵산 분해제는, 박테리아나 진균, 바이러스 등에 작용시킨 경우, 세포 내의 핵산을 직접 분해하는 작용에 의해, 이들 박테리아나 진균, 바이러스 등의 증식을 정지시키고, 사멸시키는 효과를 갖는다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 핵산 분해제는 환경 미생물에 대한 항균제 또는 살균·소독제 등, 또는 항바이러스제 등으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항균제가 대상으로 하는 환경 미생물은 특별히 한정되지 않지만, 예로서 박테리아 및 진균류를 들 수 있다. 박테리아에게는 그램 양성균 및 그램 음성균 모두가 포함된다. 그램 양성균으로서는, 포도상구균(스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)) 등의 스타필로코커스속 세균, 스트렙토코커스속 세균, 리스테리아속 세균, 바실루스속 세균, 마이코박테리움속 세균, 클로스트리디움속 세균 등을 들 수 있다. 또한, 그램 음성균으로서는, 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 등의 에쉐리키아속 세균, 엔테로박터속 세균으로 대표되는 장내 세균군, 살로넬라속 세균, 비브리오속 세균, 슈도모나스속 세균, 레지오넬라속 세균, 캄필로박터속 세균 등을 들 수 있다.

본 발명의 항균제가 대상으로 하는 진균류는 특별히 한정되지 않지만, 칸디 다속 세균, 아스퍼질러스속 세균, 사카로마이세스속 세균, 페니실리움속 세균 등을 들 수 있다.

본 발명의 유효 성분인 에티듐 모노아지드(3-amino-8-azido-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridinium chloride: EMA)는, 화학식 1로 표시되는 화합물이다. 에티듐 모노아지드는 시판되는 것을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 핵산 분해제의 사용량은 세포 외 또는 세포 내 중 어느 핵산을 분해하는지에 따라서, 또한 분해하는 핵산의 양에 따라서 적절히 선택하는 것이 가능하다. 또한, 사용시에 핵산 분해제 중에 포함되는 EMA량으로서는, 1 ㎍/ml 내지 1000 ㎍/ml, 바람직하게는, 10 ㎍/ml 내지 1000 ㎍/ml, 특히 바람직하게는, 100 ㎍/ml 내지 100O ㎍/ml의 농도를 들 수 있다. 이러한 농도의 핵산 분해제를 대상에 작용시킴으로써, 효과적으로 핵산을 분해하는 것이 가능하다.

한편, 본 발명의 핵산 분해제는 액체일 수도 있고, EMA 그 자체일 수도 있으며, 사용시에 적절히 희석, 용해시키면 좋다.

또한, 본 발명의 핵산 분해제는 항균제로서도 사용 가능하다. 본 발명의 핵산 분해제를 항균제로서 사용하는 경우도 핵산 분해제와 마찬가지이다.

또한, 핵산을 분해시킬 때에는 가시광선을 조사한다. 조사하는 가시광선의 파장은 380 ㎚ 내지 800 ㎚, 바람직하게는 450 ㎚ 내지 600 ㎚이다. 또한, 가시광선은 단파장일 수도 있고, 상기 범위에 분포하는 혼합광일 수도 있다. 또한, 상기 범위 외의 파장의 빛을 포함할 수도 있다. 한편, 조사시에는, 대상이 되는 시료에 대하여 충분량 조사가 가능하면, 광원으로부터 시료까지의 거리는 적절히 선택하는 것이 가능하다.

한편, 본 발명의 핵산 분해제 또는 항균제의 대상을, 태양광 등 자연광의 조사하에 둠으로써도 가시광선을 조사할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 분해제는, 예를 들면 0.5 내지 100 W/㎠의 광 강도로 조사한 경우, 5분 내지 1 시간 정도, 바람직하게는 5 내지 30분 정도이면 충분히 핵산 분해 효과를 발휘시킬 수 있다.

예를 들면, 500 W의 할로겐 전구를 20 cm의 거리에서 조사하는 경우, 조사 시간은 5분 내지 1 시간 정도, 바람직하게는 5 내지 30분이면 충분히 핵산 분해 효과를 발휘시키는 것이 가능하다.

본 발명의 핵산 분해제의 효과는, 핵산 분해제의 첨가 및 가시광선 조사 처리 전후에서의 핵산을 전기영동하고, 이들을 비교함으로써 평가할 수 있다. 또한, 균에 대하여 적용했을 때에는, 생균수를 측정함으로써도 간접적으로 평가할 수 있다.

본 발명의 핵산 분해제는 단독으로 사용할 수도 있고, 다른 성분과 병용할 수도 있다. 다른 성분으로서는, 공지된 핵산 분해제, 예를 들면 DNA나 RNA에 대한 엑소뉴클레아제나 제한 효소류 등의 엔도뉴클레아제 등을 들 수 있으며, 이들과 병용함으로써 더욱 핵산 분해 효과를 높일 수 있다.

본 발명의 항균제의 사용 형태는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 용액 중에 첨가하여 사용할 수도 있고, 적절히 희석한 용액을 산포할 수도 있다. 또한, 본 발명의 항균제의 제형은 용도, 사용 형태 등에 따라 적절히 선택할 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 액제, 과립제, 정제 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 항균제는 단독으로 사용할 수도 있고, 다른 성분과 병용할 수도 있다. 다른 성분으로서는, 공지된 항균제나 살균제, 예를 들면 항생 물질, 에탄올이나 이소프로필알코올 등의 알코올류, 페놀이나 크레졸, 할로겐 화합물(염소, 요오드 등)이나 과산화물(오존, 과산화수소 등) 등의 산화제, 중금속 화합물 등을 들 수 있고, 이들과 병용함으로써 더욱 항균 효과를 높일 수 있다.

본 발명의 항균제는, 예를 들면 기구 등의 소독, 벽면이나 바닥면 등의 소독에 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항균제를 실내 공간에 산포함으로써, 인간에 감염되었을 경우에 중독화의 우려가 높은 세균류(병원성 대장균, 결핵균, 보툴리누스균, 탄저균 등)의 살균에 매우 유용하다.

본 발명의 항균제는, 세포 내의 핵산에 직접 작용하여 분해시키는 것이 가능하기 때문에, 균에서의 내성에 대한 문제를 거의 고려할 필요가 없는 점에서, 공지된 항균제에 비하여 우수한 항균 활성을 갖고, 또한 넓은 항균 스펙트럼을 갖는다.

다음으로 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

시험관 내에서의 EMA가 대장균 염색체 DNA, 및 rRNA 등의 핵산에 미치는 영향을 조사하기 위해 행하였다.

(1) 시험 방법

1.0×10⁶ CFU/ml의 대장균 E. coli/DH5α주의 생균 현탁액 1 ml에 대하여 냉각 원심 처리를 행하고, 상청액을 제거한 펠릿에 0.5 ml의 10 mM 트리스-염산 완충 용액(pH 8.0)을 첨가하고, 1250 U/ml 프로테이나제 K 용액을 10 ㎕, 및 10％ SDS 용액을 200 ㎕ 첨가한 후, 50℃에서 밤새 용균 조작을 행하였다.

그 후, 각 처리액을 2 ml 용적의 마이크로 튜브 2개에 반량씩 분주하고, 각각에 포화페놀 용액 0.5 ml를 첨가하여 15분간 온화하게 혼합한 후, 클로로포름을 0.5 ml 첨가하여 5분간 온화하게 혼합하였다. 이어서, 6,000×g, 4℃에서 10분간 냉각 원심 분리를 행하고, 상층의 수층 부분을 새롭게 준비한 2 ml 용적의 마이크로 튜브에 옮기고, 3M 아세트산나트륨(pH 5.2)을 70 ㎕, 및 99.5％ 냉에탄올 1.21 ml를 각각 첨가하여 온화하게 혼합하였다. 이어서, 15,000×g, 4℃에서 10분간 냉각 원심분리를 행하고, 상청액을 제거한 후, 70％ 냉에탄올을 0.4 ml 첨가하여 펠릿(침전물)을 세정하였다(이하, 상기 일련의 조작을 페놀/클로로포름 추출이라 약기하는 경우가 있음). 그 후, 펠릿에 10 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)＋1 mM EDTA·2Na 용액(TE 버퍼)을 0.5 ml 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하여 핵산을 용해 시켰다. 정제 핵산 용액의 농도를 UV 260 ㎚의 흡광치(핵산 50 ㎍/ml를 OD＝1, 셀 길이 1 cm: OD₂₆₀)에 의해 평가하였다.

제조한 핵산 용액은 멸균수로 175 ng/㎕로 조정하고, 이 핵산 용액을 마이크로 튜브에 4 ㎕ 분취하고, 각각에 EMA 수용액(각각 0, 0.02, 0.2, 2, 20, 200 ㎍/ml)을 4 ㎕ 첨가하여, 차광하에 4℃에서 1 시간 방치하였다. 그 후, 샘플로부터 20 cm 떨어진 상태에서 500W의 할로겐 전구(FLOOD PRF 100V 500W; 이와사키 덴키, 도쿄)의 가시광선을 20분간 조사하고, 전량을 0.7％ 아가로스 겔에 의해 전기영동하였다. 분자량 마커로서 λ-EcoT14 I digest(다카라 바이오사 제조)를 사용하였다. 영동 후의 겔은 1 ㎍/ml 브롬화에티듐 용액으로 염색하고, UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 UV 254 ㎚로 조사하고, 그 영상을 폴라로이드 필름 667에 기록하였다. 대조구로서 무처리(EMA: 0 ㎍/ml, 가시광 미조사)의 핵산 용액을 이용하여 마찬가지로 전기영동하였다.

(2) 시험 결과

본 시험의 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과, 19,329 bp 부근의 염색체 DNA 유래의 밴드는 EMA의 농도가 100 ng/ml로부터 1 ㎍/ml에 걸쳐서 서서히 감소하였고, 10 ㎍/ml의 시점에 현저히 소실되는 것이 확인되었고, EMA에 의해 생균(대장균)으로부터 단리한 핵산 중의 염색체 DNA가 분해되는 것으로 밝혀졌다.

또한, EMA의 농도가 1 ㎍/ml로, rRNA(16SrRNA, 23SrRNA)의 밴드 강도가 감소하였고, 10 ㎍/m² 이상에 있어서 소실되는 것이 확인되었고, rRNA도 분해되는 것으 로 밝혀졌다.

실시예 2

생체 내에서의 EMA가 대장균 염색체 DNA, 및 rRNA 등의 핵산에 미치는 영향을 조사하기 위해 행하였다.

(1) 시험 방법

EMA를 멸균수로 용해시켜 1000 ㎍/ml EMA 용액을 제조하고, 이것을 0.2 ㎛의 필터(Minisart-plus; 싸토리우스 AG사 제조)에 의해 무균 여과하였다. 이 EMA 용액을 이용하여, 1.0×10⁶ CFU/ml의 대장균 E. coli/DH5α주의 생균 현탁액 1 ml에 대하여 EMA의 최종 농도가 0(미첨가), 0.01, 0.1, 1, 10, 및 100 ㎍/ml가 되도록 첨가한 후, 차광하에 4℃에서 1 시간 방치하였다.

그 후, 얼음 위에서 상기 생균 현탁액으로부터 20 cm 떨어진 상태에서, 500W의 할로겐 전구(FLOOD PRF 100V 500W; 이와사키 덴키, 도쿄)의 가시광선을 20분간 조사하였다. 15,000×g, 4℃, 10분 동안 냉각 원심 처리를 행하고, 상청액을 제거하고, 핵산에 공유 결합하지 않은 EMA의 가시광 조사물이 물과 반응하여 생긴 생성물(히드록시아미노 에티듐)을 제거하였다. 펠릿에 0.5 ml의 10 mM 트리스-염산 완충 용액(pH 8.0)을 첨가하고, 1250 U/ml 프로테이나제 K 용액을 10 ㎕, 및 10％ SDS 용액을 200 ㎕ 첨가한 후, 50℃에서 밤새 용균 조작을 행하였다.

각 처리액을, 2 ml 용적의 마이크로 튜브 2개에 반량씩 분주하고, 각각에 포화 페놀 용액 0.5 ml를 첨가하여 15분간 온화하게 혼합한 후, 클로로포름을 0.5 ml 첨가하여 5분간 온화하게 혼합하였다. 이어서, 6,000×g, 4℃에서 10분간 냉각 원심 분리를 행하고, 상층의 수층 부분을 새롭게 준비한 2 ml 용적의 마이크로 튜브에 옮기고, 3M 아세트산나트륨(pH 5.2)을 70 ㎕, 및 99.5％ 냉에탄올 1.21 ml를 각각 첨가하여 온화하게 혼합하였다. 이어서, 15,000×g, 4℃에서 10분간 냉각 원심 분리를 행하고, 상청액을 제거한 후, 70％ 냉에탄올을 0.4 ml 첨가하여 펠릿(침전물)을 세정하였다(이하, 상기 일련의 조작을 페놀/클로로포름 추출이라 약기하는 경우가 있음). 그 후, 펠릿에 10 mM 트리스 염산 완충액＋1 mM EDTA·2Na 용액(TE 버퍼)을 0.5 ml 첨가하고, 4℃에서 밤새 방치하여 핵산을 용해시켰다. 정제 핵산 용액의 농도를 UV 260 ㎚의 흡광치(핵산 50 ㎍/ml를 OD＝1, 셀 길이 1 cm: OD₂₆₀)에 의해 평가하고, 정제 핵산의 순도를 OD₂₆₀/OD₂₈₀에 의해 평가하였다.

각 핵산 용액을 175 ng/㎕로 제조하고, 각각 4 ㎕를 0.7％ 아가로스 겔로 전기영동하였다. 분자량 마커로서 λ-EcoT14 I digest(다카라 바이오사 제조)를 사용하였다. 영동 후의 겔은 1 ㎍/ml 브롬화에티듐 용액으로 염색하고, UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 UV 254 ㎚로 조사하고, 그 영상을 폴라로이드 필름 667에 기록하였다. 대조구로서, 대장균 생균 현탁액이 무처리(EMA 0 ㎍/ml, 가시광 미조사)된 것에 대하여 핵산 추출을 행한 것을 사용하였다.

(2) 시험 결과

본 시험의 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 19,329 bp 부근의 염색체 DNA 유래의 밴드는, EMA의 농도가 10 ㎍/ml부터 서서히 감소하였고, 100 ㎍/ml의 시점에 현저히 소실되는 것이 확인되어, EMA에 의해 생균(대장균) 내에 존재하는 염색체 DNA가 분해되는 것으로 밝혀졌다.

또한, EMA의 농도가 10 ㎍/ml로, rRNA(16SrRNA, 23SrRNA)의 밴드 강도가 감소하여, 생균(대장균) 내의 rRNA도 분해되는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

EMA에 의한 생균에 대한 항균 효과를 조사하기 위해 행하였다.

(1) 시험 방법

에티듐 모노아지드(EMA)를 멸균수로 용해시켜 1000 ㎍/ml EMA 용액을 제조하고, 이것을 0.2 ㎛의 필터(Minisart-plus; 싸토리우스 AG사 제조)에 의해 무균 여과하였다. 이 EMA 용액을 이용하여, 1.0×10⁶ CFU/ml의 대장균 E.coli/DH5α주의 생균 현탁액 1 ml에 대하여, EMA의 최종 농도가 0(미첨가), 0.01, 0.1, 1, 10, 및 100 ㎍/ml가 되도록 첨가한 후, 차광하에 4℃에서 1 시간 방치하였다.

그 후, 얼음 위에서 상기 생균 현탁액으로부터 20 cm 떨어진 상태에서, 500W의 할로겐 전구(FLOOD PRF 100V 500W; 이와사키 덴키, 도쿄)의 가시광선을 20분간 조사하였다. 15,000×g, 4℃, 10분간 냉각 원심 처리를 행하고, 상청액을 제거하고, 핵산에 공유 결합하지 않은 EMA의 가시광 조사물이 물과 반응하여 생긴 생성물(히드록시아미노 에티듐)을 제거하였다. 펠릿에 동량의 생리 식염수를 부은 후, 단계 희석을 행하고, L 한천 평판 배지를 이용하여 37℃에서 24 시간 배양에 의해 생균수를 측정하였다.

(2) 시험 결과

EMA에 의한 항균 효과를, 용량 반응 곡선으로서 도 3에 나타내었다. 그 결과, 대장균에 EMA를 10 ㎍/ml의 농도로 반응시킨 경우에, 초발 생균수와 비교하여, 생균수가 10² CFU/ml의 오더로 감소하였고, 100 ㎍/ml의 농도로 반응시켰을 경우에, 초발 생균수에 비하여 생균수는 10⁵ CFU/ml의 오더로 감소시키는 것이 가능한 것으로 확인되었다.

즉, EMA는 대장균(생균)에 대하여 항균 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4

시험관 내에서의 EMA가 대장균 염색체 DNA에 미치는 영향을 전자 현미경으로 관찰하기 위해 행하였다.

(1) 시험 방법

상기 실시예 1과 동일한 방법에 의해 핵산을 추출한 후, 멸균수 9 ml에 핵산을 용해시켰다. 제조한 핵산 용액을 32 ml 수크로오스 밀도 구배(16 ml의 10％ 수크로오스 용액과 16 ml의 40％ 수크로오스 용액을 사용)의 상단에 조용히 올려 두고, 스윙 로터(히타치 고키사 제조: RPS-27-2)를 이용하여, 20℃에서 26,000 rpm으로 18 시간의 초원심 처리를 행하였다. 원심 처리 후, 수크로오스 밀도 구배 용액의 바닥에 구멍을 뚫고 1 ml씩 분획하였다.

그 후, 각 분획액에 대하여, 10％(vol/vol)가 되도록 3M 아세트산나트륨 용액(pH 5.2)을 첨가하고, 추가로 2배량의 99.5％ 에탄올을 첨가하였다. 이어서, 4 ℃에서 15,000×g으로 10분간 냉각 원심 처리를 행하여 펠릿을 회수하고, 이 펠릿을 70％ 에탄올로 세정한 후, 멸균수 100 ㎕로 용해시켰다.

각 분획액으로부터 얻어진 샘플 중, 아가로스 겔 전기영동으로, 48 kbp의 긴 염색체 DNA만을 포함하는 샘플에 대하여, 추가로 멸균수를 이용하여 DNA 농도가 175 ng/㎕가 되도록 제조하고, 이 DNA 용액 4 ㎕에 대하여, EMA 수용액(0, 0.02, 2, 20 ㎍/ml)을 4 ㎕ 첨가하고, 차광하에 4℃에서 1 시간 방치하였다. 그 후, 얼음 위에서 상기 500W 할로겐 전구의 가시광선을 20분간 조사하였다.

상기 가시광 조사 후의 DNA 용액(8 ㎕)에 대하여, 멸균수를 이용하여 5배 희석(32 ㎕ 첨가)하였다. 0.02％ 시토크롬 C 용액 1 ㎕를, 8％ 포름알데히드 용액 5 ㎕에 첨가하고, 이 전량을 상기 DNA 용액 40 ㎕에 혼합하고, 10분간 실온에서 방치하였다. 그 후, 시토크롬 C막을 핀셋으로 채취하고, 90％ 에탄올로 탈수 처리를 행하였다. 이어서, 0.5 mM 아세트산 우라늄/0.5 mM 염산/90％ 에탄올 용액으로 염색한 후, 90％ 에탄올, 및 이소펜탄으로 탈수 처리하였다.

전자 현미경으로 관찰할 때, 섀도윙을 백금-팔라듐 분말로 행하고, 전자 현미경(니혼 덴시사 제조, JEOL T-2000 EX)으로 사진 촬영을 행하였다.

(2) 시험 결과

본 시험의 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 대장균의 염색체 DNA에 대하여, EMA를 0 내지 10 ㎍/ml의 농도로 작용시키고, 가시광 조사(500W 할로겐 전구, 20분간) 후에 전자 현미경하에서 관찰한 결과를 나타내고 있다. 그 결과, EMA를 0 내지 0.01 ㎍/ml로 반응시키더라도 염색체 DNA가 절단된다는 영향은 관찰되지 않았 지만, 1 ㎍/ml 이상으로 반응시킴으로써, 염색체 DNA의 절단 현상이 확인되었다. 이 결과는, 실시예 1에서의 결과와도 대응하였고, EMA에 의한 염색체 DNA의 절단 현상이 시각적으로 확인되었다.

본 발명의 핵산 분해제는 살아 있는 세균의 세포벽을 투과하는 성질을 갖고, 이 세균의 염색체 DNA나 RNA 등을 랜덤하게 절단하는 것이 가능하기 때문에, 세균학 및 생화학 분야에 있어서 환경 미생물에 대한 항균제, 특히 살균·소독제로서 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 핵산 분해제는 연구 분야에도 바람직하게 사용할 수 있다.

Claims

에티듐 모노아지드를 유효 성분으로 하는 핵산 분해제.
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핵산을 포함하는 시료에 에티듐 모노아지드를 첨가하는 공정, 및 상기 핵산을 포함하는 시료에 가시광선을 조사하여 시료 중의 핵산을 분해하는 공정을 포함하는, 핵산을 포함하는 시료 중의 핵산을 분해하는 방법.
세포를 포함하는 시료에 에티듐 모노아지드를 첨가하는 공정, 및 상기 세포를 포함하는 시료에 가시광선을 조사하여 세포 내의 핵산을 분해하는 공정을 포함하는, 세포 내의 핵산을 분해하는 방법.