CN109251907A

CN109251907A - 基因突变特异性扩增效率提高的dna聚合酶

Info

Publication number: CN109251907A
Application number: CN201810691174.5A
Authority: CN
Inventors: 李炳哲; 朴日铉; 李辉皓
Original assignee: Gene Caster Co Ltd
Current assignee: Gene Caster Co Ltd
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2038-06-28
Also published as: KR101958659B1; KR20190007214A; TWI733038B; TW201908482A; CN109251907B

Abstract

本发明有关一种基因突变特异性扩增效率提高的DNA聚合酶及其用途，具体来说就是特定氨基酸位点上诱发突变，基因变异特异性扩增效率提高的DNA聚合酶，编码所述聚合酶的核酸序列，包括所述核酸序列的载体并向所述载体提供转基因的寄主细胞。本发明还提供一种利用基因突变特异性扩增效率提高的DNA聚合酶在一个以上的模板中在活体外(in vitro)检测出一个以上的基因变异或SNP的方法，包含所述DNA聚合酶的用于检测基因变异或SNP的组合物以及包含所述组合物的PCR试剂盒。

Description

基因突变特异性扩增效率提高的DNA聚合酶

技术领域

本发明有关一种基因突变特异性扩增效率提高的DNA聚合酶及其用途，具体来说就是氨基酸位点上诱发突变，基因变异特异性扩增效率提高的DNA聚合酶，编码所述聚合酶的核酸序列，包括所述核酸序列的载体并向所述载体提供转基因的寄主细胞。本发明还提供一种利用基因突变特异性扩增效率提高的DNA聚合酶在一个以上的模板中在活体外(invitro)检测出一个以上的基因变异或SNP的方法，包含所述DNA聚合酶的用于检测基因变异或SNP的组合物以及包含所述组合物的PCR试剂盒。

背景技术

自首例人类基因序列被发现以来，研究人员集中于去发现单核苷酸突变(单核苷酸多态性，SNPs)等个体之间的遗传差异。遗传体中单核苷酸变异对各种各样的疾病来说与互不相同的耐药性和致病因素有关，随着这一点越来越明确而成为关注的对象。未来医学有关核苷酸变异的知识可用于个体遗传供给的疗法，可预防无效或导致副作用的药物治疗(Shi,Expert Rev.Mol.Diagn.1.363-365(2001))。在时间和成本上有效率的核苷酸变异鉴定技术的开发将带来药物遗传学的进一步发展。

SNPs在人类基因组中占据主要的遗传变异，可以诱发个体间差异的90％以上。(Kwok,Annu.Rev.Genomics Hum,Genet.2,235-258(2001)；Kwok and Chen,Curr.IssuesMol.Biol.5,43-60(2003)；Twyman and Primrose,Pharmacogenomics 4,67-79(2003))。为了检测这些遗传变异和突变等其他核酸变异，可以使用各种方法。例如，可以通过在适当的杂交条件下将待分析的核酸样品与对于序列变体具有特异性的杂交引物杂交来实现对靶核酸的变体的鉴定(Guo et al.,Nat.Biotechnol.15,331-335(1997))。

但是，发现这种杂交方法，尤其在测定时必需的灵敏度方面无法满足临床需要。因此，PCR已被广泛使用于分子生物学、SNP及其他等位基因序列变体等突变检测的诊断检测方法中(Saiki等人，Science 239，487-490(1988))，其中，考虑到变体的存在，在杂交前通过聚合酶链式反应(PCR)扩增待检测的靶核酸。用于这种测定的杂交引物，通常使用单链寡核苷酸。所述测定的修改的具体实例包括使用荧光杂交探针(Livak,Genet.73-5 2017-07-12Anal.14,143-149(1999))。通常，已经试图将SNP和其他序列变异的测定方法自动化。(Gut,Hum.Mutat.17,475-492(2001))。

相应技术领域中已知的序列变异特异性杂交的方案由所谓的基因变异特异性扩增提供。在这些检测方法中，在扩增过程中已使用了变异特异性扩增引物，这通常在引物的3’-末端中具有所谓的差异性末端核苷酸残基，残基仅对待检测的目标核酸的一个特异性变异互补。此方法中，核苷酸变异体是根据PCR扩增后DNA产物的存在或缺失进行测定的。基因变异特异性扩增的原理是基于基因变异特异性扩增引物末端中标准(canonical)或非标准引物-模板复合物的形成。一种精确配对的3’引物末端中，DNA聚合酶引起扩增，另一方面，在错配引物末端的延伸则被抑制。

例如美国专利第5,595,890号公开了一种基因变异特异性扩增的方法及其应用，又如公开的一种用于检测k-ras肿瘤基因中有关临床的点突变(point mutation)的应用。此外美国专利第5,521,301号公开了一种等位基因特异性扩增方法，用于ABO血型系统的基因型分析。与此相比，美国专利第5,639,611号则公开了利用等位基因-特异性扩增来检测导致镰状细胞贫血的点突变。然而，基因变异特异性扩增或等位基因-特异性扩增存在选择性低的问题，因此需要经过更复杂的且时间和成本密集最优化的步骤。

如上所述用于检测序列变异、多态性和集中于点突变的方法，特别在所检测的序列变异与具有相同核酸分段(或相同的基因)的显性突变相比不充分的时候，需要等位基因-特异性扩增(或基因变异特异性扩增)。

例如，利用基因变异特异性扩增在血液、血清或血浆等体液中检测出散发性肿瘤细胞时，这一状况就会发生(美国专利第5,496,699号)。为此，先将DNA从血液、血清或血浆等体液中分离出来，DNA由缺乏的散发性肿瘤细胞和过量的非增殖性细胞组成。因此，在过量的野生型DNA存在的情况下，在k-ras基因中的肿瘤DNA重要的突变应该从多个复制中被检测到。

传统技术所公开的基因变异特异性扩增的所有方法都存在必须使用3'-末端差异寡核苷酸残基的缺陷。此外，还有一个缺陷是尽管使用了3'-差异核苷酸残基，并且即使目标核酸与所要检测的序列变异体不完全一致，在合适的DNA聚合酶存在的条件下，引物延伸发生在较低水平。特别是具体的序列变异体被检测出包含不同序列变异体的过量的背景核酸时，会产生假阳性结果。这些基于PCR的方法存在缺陷的主要原因是用于充分地区分错配碱基的方法中使用的聚合酶的不良合成。因此至今还不能用PCR直接获取有无突变的明确信息。迄今为止，对突变的明确诊断还需要更多的时间以及投入成本的提纯和分析方法。因此，能够提高基因变异特异性或对立等位基因-特异性PCR扩增的选择性的一种新方法将对通过PCR的直接基因变异或SNP分析的可信度和强效性产生重大影响。

本发明的发明者们致力于开发能够提高基因变异特异性PCR扩增选择性的一种新型的DNA聚合酶，结果证实对Taq聚合酶特定位点上的氨基酸残基诱发突变时，基因变异特异性扩增效率显著提高，从而完成了本发明。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而研制的，提供一种DNA聚合酶，用于检测含有基因变异或SNP的目标序列中一个或多个基因变异或SNP。

本发明的另一目的是提供本发明涉及的编码DNA聚合酶的核酸序列，包含所述核酸序列的载体以及转基因为所述载体的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供一种根据本发明制备DNA聚合酶的方法。

本发明的另一目的是提供利用本发明的DNA聚合酶在活体外(in vitro)检测一个以上的模板中的一个或多个基因变异或SNP的试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种包含本发明涉及的DNA聚合酶的用于检测基因变异或SNP的组合物。

本发明的另一目的是提供一种包含本发明涉及的用于检测基因变异或SNP的组合物的用于基因变异或SNP检测的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供了一种由序列号为1的氨基酸序列(SEQ ID NO：7的碱基序列)构成的带有Taq聚合酶的一种DNA聚合酶，这种DNA聚合酶包括：

(a)序列号为1的氨基酸序列中第507个氨基酸残基的取代；以及

(b)序列号为1的氨基酸序列中第536个氨基酸残基的取代、第660个氨基酸残基的取代或第536个和第660个两个氨基酸残基的取代、或第536个、第587个和第660个三个氨基酸残基的取代。

根据本发明的一个优选实施例，所述第507个氨基酸残基的置换是由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)，所述第536个氨基酸残基的置换是由赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，所述第587个氨基酸残基的置换是由异亮氨酸(I)取代精氨酸(R)，所述第660个氨基酸残基的置换是由缬氨酸(V)取代精氨酸(R)。

根据本发明另一个优选实施例，所述DNA聚合酶区分匹配的引物和错配的引物，所述匹配的引物和错配的引物与目标序列杂交，对于所述错配引物杂交的目标序列，其3'末端可以包括非典型核苷酸。

根据本发明的另一个优选的实施例，所述DNA聚合酶显示包含匹配引物的目标序列的扩增比包含错配引物的目标序列的扩增更低的Ct值(高扩增效率)提高。

本发明还提供编码本发明涉及的DNA聚合酶的核酸序列、包括所述核酸序列的载体、转基因为所述载体的宿主细胞。

本发明还提供一种DNA聚合酶的制备方法，包括培养所述寄主细胞的步骤；从培养物及其培养上清液中分离DNA聚合酶的步骤。

本发明还提供一种检测方法，包括与本发明涉及的DNA聚合酶接触的

a)一个或多个模板；

b)一个以上匹配的引物、一个以上错配的引物或一个以上匹配的引物和一个以上错配的引物两者；以及

c)核苷酸三磷酸酯；

使所述一个以上匹配的引物和错配的引物与目标序列杂交，对于和所述错配的引物杂交的目标序列，从其3’末端开始到第7个碱基位点上包括非常规(non-canonical)核苷酸，在一个以上模板中活体外(in vitro)检测一个以上的基因变异或SNP。

根据本发明的一个优选实施例，所述方法可以包括采用双链特异性染料进行熔体温度(melting point)分析。

根据本发明的另一个优选实施例，所述方法可以通过实时PCR、标准PCR后琼脂糖凝胶中的分析、通过实时PCR的基因变异特异性扩增或等位基因-特异性扩增、四引物扩增-受阻突变体系PCR或等温扩增来完成。

本发明还提供一种包含本发明涉及的DNA聚合酶的用于检测基因变异或SNP的组合物。

本发明还提供一种包含用于检测基因变异或SNP的组合物的试剂盒。

根据本发明的一个实施例，所述PCR试剂盒可用于转染PCR(竞争性等位基因特异性TaqMan PCR)、微滴式数字PCR(Droplet digital PCR)或核酸质谱分析系统(MassARRAY)。

根据本发明的一个优选实施例，所述PCR试剂盒还包括一个以上的匹配的引物、一个以上的错配的引物或者一个以上的匹配的引物和一个以上的错配的引物两者，所述一个以上匹配的引物和一个以上错配的引物与目标序列杂交，对于和所述错配的引物杂交的目标引物，从其3’末端开始到第7个碱基位点上可包括非常规(non-canonical)核苷酸。

根据本发明的另一个优选实施例，所述PCR试剂盒还可包括核苷酸硫磷酸脂。

根据本发明的另一个优选实施例，所述PCR试剂盒还可包括：

a)一个或多个缓冲剂；

b)一种结合双链DNA的定量化试剂；

c)聚合酶阻断抗体；

d)一个以上对比值或对比序列；以及

e)一个或多个模板。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明涉及的基因变异特异性扩增效率提高的DNA聚合酶与常规的Taq聚合酶相比，具有较高的错配的匹配延伸选择性，无需任何基质变异也能发生可靠的基因变异特异性扩增。此外，本发明涉及的DNA聚合酶可有效地应用于疾病的医学诊断和重组DNA的研究。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1显示了分别包括R536K、R660V和R536K/R660V变异的Taq DNA聚合酶的制备过程，其中，(a)显示了片段PCR和重叠PCR的示意图，(b)显示了用电泳鉴定片段PCR中的扩增产物，(c)显示了利用重叠PCR扩增全长后，通过电泳确认扩增产物的结果；

图2是为了提取凝胶，用限制性酶EcoRI/XbaI分解后用电泳鉴定处理SAP的pUC 19载体和经提纯的图1(c)重叠PCR产物的结果；

图3是分别包括E507K、E507K/R536K、E507K/R660V和E507K/R536K/R660V变异的Taq DNA聚合酶的制备过程中片段PCR和重叠PCR的示意图；

图4是为了提取凝胶，用限制性酶EcoRI/XbaI分解后用电泳鉴定SAP处理的pUC 19载体和经提纯的图3中重叠PCR产物的结果；

图5是采集口腔上皮细胞制备PCR模板的过程示意图；

图6显示的是利用本发明E507K/R536K,E507K/R660V以及E507K/R536K/R660V Taq聚合酶对rs1408799进行AS-qPCR的结果，对比组采用了包含E507K变异的Taq聚合酶；

图7显示的是采用本发明涉及的具备E507K/R536K,E507K/R660V以及E507K/R536K/R660V的Taq聚合酶，对rs1015362进行AS-qPCR检测的结果，对比组采用了包括E507K变异的Taq聚合酶；

图8显示的是采用本发明涉及的具备E507K/R536K,E507K/R660V以及E507K/R536K/R660V的Taq聚合酶对rs49114进行AS-qPCR的结果，对比组采用的是包括E507K变异的Taq聚合酶；

图9显示的是包括E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq DNA聚合酶的制备过程，(a)显示的是图示化的片段PCR和重叠PCR，(b)显示的是用电泳鉴定片段PCR中扩增产物的结果；

图10显示的是使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在KRAS基因中对包括Q61H的SNP的模板进行AS-qPCR的结果，(a)和(b)是使用长度为24mer的引物的结果，(c)和(d)是使用长度为18mer的引物的结果，对比组则采用了包含E507K/R536K/R660V变异的Taq聚合酶；

图11显示的是使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在KRAS基因中对包括G13D的SNP的模板进行AS-qPCR的结果，对比组则采用了包含E507K/R536K/R660V变异的Taq聚合酶；

图12显示的是使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在KRAS基因中对包括G12S的SNP的模板进行AS-qPCR的结果，对比组则采用了包含E507K/R536K/R660V变异的Taq聚合酶；

图13显示的是使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在EGFR基因中对包括L585R的SNP的模板进行AS-qPCR的结果，对比组则采用了包含E507K/R536K/R660V变异的Taq聚合酶。

具体实施方式

以下将对本发明进行更为详细的说明。

正如上文所述，为了改善传统技术所公开的基因变异特异性扩增方法的不足，需要持续开发能提高基因变异特异性扩增率选择性的方法，这些方法的开发将对基于PCR直接进行SNP分析的可信度和强效性产生重大影响。本发明的发明者们致力于开发一种能提高基因变异特异性PCR扩增选择性的方法，证实当Taq聚合酶特定位点的氨基酸残基被诱发突变时，基因变异特异性扩增效率显著提高，从而完成了本发明。

本发明涉及的基因变异特异性扩增效率提高的DNA聚合酶与常规Taq聚合酶相比，具有较高的错配的匹配延伸选择性，无需任何基质变异也能发生可信度高的基因变异特异性扩增。此外，本发明涉及的DNA聚合酶可有效地应用于疾病的医学诊断和重组DNA的研究。

以下将对本说明书使用的术语进行说明。

“氨基酸”指的是可导入肽、多肽或蛋白质的任何单体单元。正如本文所使用的，术语“氨基酸”包括以下20种天然或经遗传编码的α-氨基酸:丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、以及缬氨酸(Val或V)。

氨基酸是典型的有机酸，包括被取代或未取代的氨基、被取代或未取代的羧基、以及一个以上的侧链(sidechain)或基团(group)，或者这些集团的任何类似物，示例性的侧链包括巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼基、氰基、卤基、酰肼、烯基、炔基、醚基、硼酸酯、硼酸基、二氧磷基、膦磺酸基、膦基、杂环、烯酮、亚胺、醛基、酯基、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。

其他示范性氨基酸包括但不限于下列各项:含有光活化交联剂的氨基酸、金属键氨基酸、自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、含金属氨基酸、具有新型官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、经光栅化和/或可光致异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包括生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸，其他经碳酸酯修饰的氨基酸、包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代氨基酸、化学可降解性和/或光降解氨基酸、含有碳-链接糖的氨基酸、氧化还原-活性氨基酸、含硫羧酸的氨基酸、含一个以上毒性部分的氨基酸。

在本发明的DNA聚合酶中，术语“突变体”是指相对于天然存在或未修饰的DNA聚合酶包含一个以上氨基酸替换的重组多肽。

术语“热稳定聚合酶”(是指热稳定的酶)是指具有热抵抗性，保持足够的活性以实现后续的多核苷酸延伸反应，在实现双链核酸变性所需时间内处理为升温时不会发生不可逆变性(失活)。正如本发明中所使用的，适合在PCR等反应中的循环温度下使用。本发明中的不可逆变性是指永久性的酶活性的完全丧失。关于热稳定聚合酶，酶活性是指以适当的方式催化核苷酸的组合，形成与模板核酸链相互补充的多核苷酸延伸产物。源于嗜热菌的热稳定性DNA聚合酶例举如下:海栖热袍菌(thermotoga maritima)、水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热栖热菌(thermus thermophilus)、黄栖热菌(thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformus)、栖热菌属种Sps17、栖热菌属种Z05、热坚栖热菌(thermuscaldophilus)、石灰性芽孢杆菌(bacillus caldo tenax)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、以及源于非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)的DNA聚合酶。

术语“热活性”是指在RT-PCR和/或PCR反应中的逆转录或退火/在延伸阶段的常用温度(即45-80℃)下保持催化性能的酶。热稳定酶是指在核酸改性所要求的高温处理时不可逆失活或不改性的酶。热活性酶可以是热稳定性的也可能不是热稳定性。一种热活性DNA聚合酶可以是包括下述依赖于嗜热物种或嗜温物种的DNA或RNA，但不仅限于此。

术语“宿主细胞”是指在细胞培养基中培养时，高等植物或动物两者的单细胞原核生物和真核生物体(例如细菌、酵母和放线菌)以及单细胞。

术语“载体(vector)”是一种DNA分子，可以克隆并可将基因等外源DNA转移到受体细胞，包括质粒、噬菌体、人工染色体等。在本发明中“质粒”、“载体”或“质粒载体”在使用时具有相同含义。

术语“核苷酸”(nucleotide)”是以单链(single strand)或双链(double strand)形式存在的脱氧基核苷酸(deoxyribonucleic acid；DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid；RNA)，除非另有特别提及,否则可以包括天然核苷酸的类似物。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指DNA或RNA聚合物、或者是可与其类似物相对应的聚合物。核酸可包括如染色体或染色体的分割、载体(如表达载体)、表达组件、裸露DNA或RNA聚合物、聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是单链、双链或三链，不限于任何特定长度。除非另有提及，某些核酸序列除了明确规定的任何序列外还包括互补序列或可对其进行编码。

术语“引物”是指在多核苷酸开始延伸的条件下放置时，可作为模板-方向核酸合成启动点的多核苷酸。引物也可用于多种其他寡核苷酸介导的合成过程，包括从头合成(denovo)RNA和作为试管内转录相关过程的启动子。典型的引物是单链寡核苷酸(例如寡脱氧核苷酸)。引物的合适长度通常在6至40个核苷酸范围内，更典型的长度在15到35个核苷酸的范围内，随着使用目的的不同而不同。短引物分子通常要求较低的温度，以与模板形成足够稳定的杂交配合物。引物不需要反映模板的精确序列，但必须具有足够的互补性才能与模板杂交，使引物延伸。在具体的实现例中，术语“引物对”是指包括扩增的核酸序列的5'-末端互补杂交的5'-正义链引物以及扩增序列的3'–末端杂交的3'-反义链引物的一组引物。必要时,可加入用分光镜的、光化学的、生化的、免疫化学的或化学手段检测到的标签对引物进行标记。例如，有用的标记包括以下:³²P、荧光染料、电子密度试剂、酶(通常用于ELISA分析)、生物素或半抗原或者可以利用抗血清或单克隆抗体的蛋白质。

术语“5'-核酸水解酶(nuclease)探针”是指包括用于进行靶向核酸检测的5'-核酸水解酶反应的一个或多个发光标记部分的寡核苷酸。在一些实施例中，举例来说，5'-核酸水解酶探针只包括单一发光部分(例如，荧光染料等等)。某些实施例中，5'-核酸水解酶探针包括自我互补区域，以使探针能在选择条件下形成发夹结构。某些实施例中，5'-核酸水解酶探针包括两个或更多的标记部分，其中一个标记从核苷酸分离或降解后，辐射强度增强而被释放。某些实施例中，5'-核酸水解酶探针用两种不同的荧光染料标记，例如5'-末端报道染料和3'-末端淬灭染料或部分标记。某些实施例中，5'-核酸酶探针除了末端外，还在末端位置以外的一个或多个位置标记。一般来说，如果探针是完好的，则在两种荧光材料之间发生能量转移，从而使报道染料发出荧光的部分消光。聚合酶链反应的延伸阶段期间，例如，与模板核酸结合的5'-核酸水解酶探针具有活性，使报道染料的荧光发光不再被淬灭，例如通过Taq聚合酶或其他聚合酶的5'至3'-核酸水解酶活性进行降解。某些实施例中，5'-核酸水解酶探针可以用多种不同的报道染料和3'-末端淬灭染料或部分进行标记。

术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“福斯特共振能量转移”是指两个以上的发色团、供体发色团和受体发色团(称为淬灭剂)之间的能量转移。一般来说，当供体通过发射适当波长的光而激发时，会将能量转移到受体中。受体通常会以不同波长的光的形式转移的能量重新发射。当受体是“暗”淬灭剂时，那么它会以光以外的形式转移的能量发射。某些荧光物质是作为供体还是受体的作用取决于FRET对其他成员的特性。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的淬灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗淬灭剂包括以下:黑洞猝灭剂^TM(BHQ),(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.),Iowa Black^TM(IntegratedDNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa),和BlackBerry^TMQuencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。

指称核酸碱、三磷酸核苷或核苷酸时，术语“常规”或“天然”指的是所描述的多核苷酸中天然发生的(即，对于DNA它们是dATP,dGTP,dCTP和dTTP)。此外，dITP和7-癸氮-dGTP经常代替dGTP被使用，在测序等试管内DNA合成反应中可以用来代替dATP。

指称核酸碱基、核苷、或三磷三磷酸核苷时，术语“非常规”或“修饰”包括某些多核苷酸中天然生成的常规碱基、核苷或核苷酸的修饰、衍生物或类似物。某些非常规核苷酸与常规dNTP相比，在核糖糖的2′位点被修饰。因此即使对RNA自然发生的核苷酸是核糖核苷(即ATP、GTP、CTP、UTP、集合rNTP)，但由于核苷酸在糖的2’位点具有羟基，相对来说dNTP缺失，并且正如本发明中所用的核苷酸一样，核糖核苷作为DNA聚合酶的底物，是一种非常规的核苷酸。如本文所用，非常规核苷酸包括但不限于用作核酸测序终止子的化合物。示例性终止子化合物包括但不限于具有2'，3'-二脱氧结构的化合物，被称为双脱氧核苷三磷酸。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP，被统称为ddNTP。终止子化合物的其他例子包括核糖核苷酸的2'-PO₄类似物。其他非常规核苷酸包括但不限于硫代dNTP([[α]-S]dNTP)、5'-[α]-硼(borano)-dNTP、[α]-甲基-膦酸dNTP、核糖核苷三磷酸(rNTP)。非常规的碱基可用放射性同位素如³²P、³³P或³⁵S；荧光标记；化学发光标记；生物发光标记；半抗原标签如生物素；或酶标签如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白来标记。荧光标记可以包括带负电荷的染料如荧光素家族的染料、或带中性电荷的染料如罗丹明家族的染料、或带正电荷的染料如花青家族。荧光素家族的染料包括例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN及ZOE。罗丹明家族的染料包括TexasRed、ROX、R110、R6G及TAMRA。用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、Texas Red和TAMRA标记的各种染料或核苷酸通过Perkin-Elmer(波士顿，马萨诸塞州)、Applied Biosystems(福斯特市，加州)、Invitrogen/Molecular Probes(尤金，俄勒冈州)市场销售。花青家族染料包括Cy2、Cy3、Cy5、及Cy7，通过GE Healthcare UK Limited(Amersham Place,Little Chalfont,白金汉郡，英格兰)市场销售。

术语“错配的区分”，是指通过在核酸上将一个或多个核苷酸粘附(例如共价地)，以模板依赖性方式延伸核酸(例如引物或其它寡核苷酸)时，用于从错配-包含序列区分完全互补的序列的生物催化(例如聚合酶、连接酶等酶)的能力。术语“错配的区分”，是指延伸的核酸(如引物或其它寡核苷酸)与核酸杂交的模板相比，从3'末端核酸具有错配的错配-包含(约互补)序列区分完全互补的序列的生物催化能力。在一些实施方案中，延伸的核酸对于完全互补序列在3'末端包含错配。在一些实施方案中，延伸的核酸对于完全互补序列在末端第二个(N-1)3'-位置和/或N-2位置上包含错配。

除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有和当事人通常所理解的相同含义。

本发明有关一种DNA聚合酶，作为由序列号为1的氨基酸序列(SEQ ID NO：7的碱基序列)组成的具有Taq聚合酶的DNA聚合酶，包括：(a)序列号为1的氨基酸序列中第507个氨基酸残基的取代；及

所述“Taq聚合酶”是一种取自高温性细菌栖热水生菌(Thermus aquaticus)的名称而命名的耐热性DNA聚合酶，首先从所述细菌中分离出来。栖热水生菌作为一种栖息在温泉和热水喷发孔中的细菌，确认Taq聚合酶能够承受PCR过程要求的蛋白质改性条件(高温)。Taq聚合酶的最佳活性温度为75～80℃，在92.5℃下的半衰期为2小时以上、95℃下的半衰期是40分钟、97.5℃下的半衰期是9分钟，72℃以下可以在10秒内克隆1,000个碱基对DNA。其缺失3'→5'核酸末端水解酶(核酸外切酶exonuclease)的校正活性缺失，测定出9,000个核苷酸中约1个的错误率。例如使用耐热Taq可以在高温(60℃以上)下运行PCR。Taq聚合酶的序列1中显示的氨基酸序列作为标准序列。

根据本发明一个优选的实施例，所述第507个氨基酸残基的置换是由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)，所述第536个氨基酸残基的置换是由赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，所述第587个氨基酸残基的置换是由异亮氨酸(I)取代精氨酸(R),所述第660个氨基酸残基的置换是由缬氨酸(V)取代精氨酸(R)。

本发明中，序列号为1的氨基酸序列中第507个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)的Taq聚合酶被命名为“E507K”(序列号2，碱基序列为SEQ ID NO：8)；序列号1的氨基酸序列中，第507个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)，第536个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代精氨酸(R)的Taq聚合酶被命名为"E507K/R536K"(序列号3，碱基序列为SEQ ID NO：9)；序列号为1的氨基酸序列中，第507个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)，第660个氨基酸残基由缬氨酸(V)取代了精氨酸(R)的Taq聚合酶被命名为"E507K/R 660V"(序列号4，碱基序列为SEQ ID NO：10)；最后将序列号为1的氨基酸序列中的第507个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)，536个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，第660个氨基酸残基由缬氨酸(V)取代了精氨酸(R)的Taq聚合酶被命名为“E507 K/R536K/R660V"(序列号5，碱基序列为SEQ ID NO：11)。最终，将序列号为1的氨基酸序列中第507个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)、第536个氨基酸残基由赖氨酸(K)取代精氨酸(R)、第587个氨基酸残基由异亮氨酸(I)取代精氨酸(R)、第660个氨基酸残基由缬氨酸(V)取代了精氨酸(R)的Taq聚合酶命名为“E507K/R536K/R587I/R660V”(序列号6，碱基序列为SEQ ID NO：12)。

根据本发明的一个优选实施例，所述DNA聚合酶区分匹配的引物和错配的引物，所述匹配的引物和错配的引物与目标序列杂交，所述错配的引物，对于杂交的目标序列，在其3'末端包含非典型核苷酸。

所述错配的引物是寡核苷酸，必须充分互补以与目标引物杂交，但不能反映目标序列的确切序列。

所述“典型核苷酸(canonical nucleotide)”或“互补核苷酸”是指标准的沃森克里克碱基对、A-U、A-T和G-C。

所述“非典型核苷酸(non-canonical nucleotide)”或“非互补核苷酸”是指除沃森克里克碱基对之外的A-C、A-G、G-U、G-T、T-C、T-U、A-A、G-G、T-T、U-U、C-C、C-U。

根据本发明的一个优选实施例，所述DNA聚合酶显示的Ct值显示包含匹配的引物的目标序列的扩增低于包含错配的引物的目标序列的扩增。

例如，通过将一个或多个核苷酸共价连接至引物，DNA聚合酶可以比以目标序列依赖性方式错配的引物更高效率地延伸匹配的引物。在这里，更高的效率可通过以下例子观察到，如RT-PCR中与错配的引物相比，匹配的引物的Ct值更低。匹配的引物和错配的引物之间的Ct值的差异为10或更高，优选10～20，或者不存在由错配的引物引起的扩增子合成。

例如，在第一次反应中匹配的正向引物和反向引物，在同一实验配置下的第二次反应中使用了错配的正向引物和匹配的反向引物，这意味着由标准PCR形成的产物对第一次反应的影响大于第二次反应。

Ct(阈值交叉循环)值表示定量PCR的DNA定量方法，取决于绘制对数相循环数量上的荧光。基于DNA的荧光检测的阈值设置为至少比背景稍高。荧光超过阈值的循环数称为Ct或根据MIQE准则称为Cq(定量循环，quantification cycle)。给定反应的Ct值定义为荧光发射交叉固定极限值的循环次数。例如，SYBR Green I和荧光探针可用于模板DNA定量的实时PCR。在PCR期间每个循环收集来自样品的荧光，并对照循环次数绘图。起始模板浓度与荧光信号的荧光信号最初显示时间成反比。模板浓度越高，信号越早出现(在较低的循环数出现)。

本发明还涉及编码上述DNA聚合酶的核酸序列和包含该核酸序列的载体和宿主细胞。使用编码本发明的DNA聚合酶的核酸可以制备各种载体。可以使用包括来源于可与宿主细胞互换的物种的复制子和控制序列的任何载体。本发明的载体可以是表达载体并且包括与编码本发明的DNA聚合酶的核酸序列可操作地连接的控制转录和翻译的核酸区域。调控序列是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。例如，适用于原核生物的调控序列包括启动子、任何操作序列和alc核糖体结合位点。另外，载体可以含有“正调节因子(Positive Retroregulatory Element，PRE)”以增强转录的mRNA的半衰期。控制转录和翻译核酸区域通常适用于用于表达聚合酶的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的各种类型的合适的表达载体和合适的调控序列。通常，转录和翻译调控序列可以包括例如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。在典型的实施方案中，调空序列包括启动子和转录起始和终止序列。载体通常还包含含有几个用于插入外源DNA的限制性位点的多位点接头区域。在某些实施方案中，使用“融合标记”来促进纯化，并且如果需要，随后去除标签/标志(例如“组氨酸标签(His-tag)”)。然而，当从使用“加热步骤”的嗜温宿主(例如大肠杆菌)纯化热活性和/或热稳定性蛋白时，这些通常是不必要的。使用标准重组DNA技术制备含有编码DNA复制序列、调控序列、表型选择基因的合适载体和关注的突变聚合酶。如本领域已知，分离的质粒、病毒载体和DNA片段被分解并剪切并以特定顺序连接在一起以产生期望的载体。

在本发明的一个优选实施例中，表达载体含有用于选择转化宿主细胞的选择标记基因。选择基因在本领域中是已知的，并且根据所使用的宿主细胞会有所不同。合适的选择基因可以包括编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，由此可以在存在这些抗生素的情况下转化培养这些载体的细胞。

在本发明的一个优选实施例中，将编码本发明DNA聚合酶的核酸序列单独导入细胞或与载体结合使用后导入。导入或其等价表达是指核酸以后续整合、扩增和/或表达等合适的方式进入细胞。导入方法包括CaPO₄沉淀、脂质体融合、脂联素、电泳、病毒感染等。

原核生物作为宿主细胞用于本发明的早期克隆阶段。对于快速制备大量DNA，制造单链DNA模板用于产生定位突变，筛选大量突变体，产生的突变体DNA序列化特别有用。合适的原核细胞的宿主细胞包括E.coli K12菌株94(ATCC No.31,446)、E.coli菌株W3110(ATCCNo.27,325)、E.coli K12菌株DG116(ATCC No.53,606)、E.coli X1776(ATCC No.31,537)以及E.coli B；E.coli等众多不同的菌株,如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539,以及其他各种不同的种类,可将包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)等芽胞杆菌群、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)等其他肠道菌群、或马氏沙雷菌(Serratia marcesans)以及其他各种单假胞菌群(Pseudomonas sp.)的原核生物属用作主体。一种典型的用于E.coli转基因的质粒包括pBR 322、pUCI 8、pUCI9、pUCI18、pUC119和Bluescript M13。不过还可以利用许多其他合适的载体。

本发明还提供了一种制备DNA聚合酶的方法，包括培养所述寄主细胞的步骤；以及培养物和其培养上清液中分离DNA聚合酶的步骤。

本发明的DNA聚合酶是在诱导或引起DNA聚合酶表达的适当条件下，通过培养基因转化为含有编码DNA聚合酶核酸序列的表达载体的宿主细胞而制备的。在适合蛋白质表达的条件下培养转基因宿主细胞的方法已在业界公开。一种来自λpL启动子-含有的质粒载体的适合于制备聚合酶的寄主细胞包括E.coli菌株DG116(ATCC No.53606)。根据表达,聚合酶可以收获和分离。

一旦纯化，就可以鉴定本发明的DNA聚合酶的错配区别。例如，通过比较引物3-末端中具有单一碱基错配的目标序列的扩增与完全匹配至引物的目标序列的扩增的测定错配区别活性。扩增可通过TaqMan^TM的使用等进行实时检测。可以通过比较两种反应的Ct来估计聚合酶区分两种目标序列的能力。

因此，本发明提供一种检测方法，包括使DNA聚合酶接触的：

a)一个以上的模板；

b)核苷酸三磷酸酯；和

c)一个以上匹配的引物、一个以上错配的引物或者一个以上匹配的引物和一个以上错配的引物两者；使所述一个以上匹配的引物和错配的引物与目标序列杂交，对于和所述错配的引物杂交的目标序列，从其3’末端开始到第7个碱基位置上包括非标准(non-canonical)核苷酸，在一个以上的模板中活体外(in vitro)检测一个以上的基因变异或SNP。

所述“SNP(单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphisms)”是指在DNA序列中显示一个基因序列(A、T、G或C)差异的遗传性变化或变异。

在本发明的活体外(in vitro)基因变异或SNP检测方法中，目标序列可存在于检测样品中，可包括DNA、cDNA或RNA，其中较佳的是基因组DNA。测试样品可以是由细菌、细菌培养物或细胞培养物制备而成的一种细胞裂解物。此外，测试样品可能包含于动物中，较佳的包含于脊椎动物中，而包括在人类受试者中则最佳。一个目标序列可能包含在基因组DNA中，较佳的是包含在个体的基因组DNA中，更佳的是包含于细菌或脊椎动物中，而最佳的是包含于人类受试者的基因组DNA中。

本发明的SNP检测方法可包括利用SYBR Green I等双链特异染料进行熔体温度分析。

熔体温度曲线分析可以在包括板载软件(SDS 2.1)的ABI 5700/7000(96孔格式)或ABI 7900(384孔格式)设备等实时PCR设备上进行。又或，熔体温度曲线分析可作为终点分析进行。

“结合双链DNA的染料”或“双链特异染料”，和未与双链DNA结合时相比，可在与双联DNA结合时具有更高荧光的情况下使用。这种染料的实例包括SOYTO-9、SOYTO-13、SOYTO-16、SOYTO-60、SOYTO-64、SYTO-82、溴乙烷(EtBr)、SYTOX Orange、TO-PRO-1、SYBR Green I、TO-PRO-3或EvaGreen。除了EtBr和EvaGreen(Quiagen)，这些染料已被用于实时应用测试。

本发明的活体外(in vitro)基因变异或SNP检测方法可以通过实时PCR、标准PCR后的琼脂糖凝胶分析、通过实时PCR的基因变异特异扩增或等位基因特异性扩增、四引物扩增受阻突变体系PCR或等温扩增进行，但并不限制于此。

例如，本发明的SNP检测方法可利用测序、迷你-测序、等位基因特异性PCR(Alleespecific PCR)、动态等位基因特异性杂交(dynamic allele-specifichybridization；DASH)；PCR扩展分析(例如单碱基延伸(single base extension；SBE)、PCR-SSCP、PCR-RFLP分析或TaqMan技术、SNPlex平台(赛默飞世尔公司，Applied Biosystems)、核酸质谱分析系统(例如Sequenom公司的MassARRAY系统)、Bio-Plex系统(伯乐生命医学，Bio-Rad)等进行。

所述“标准PCR”是普通技术人员所知的用于扩增DNA或cDNA的单拷贝或多拷贝的技术。几乎所有的PCR都使用Taq聚合酶或Klen Taq等热稳定DNA聚合酶。DNA聚合酶通过使用单链DNA作为模板并使用寡核苷酸(引物)从核苷酸酶组装新的DNA链。通过PCR产生的扩增子，可以在琼脂糖凝胶中分析。

所述“实时PCR”是在PCR时可实时监测并监控其过程，因此，是在整个PCR过程中收集数据而不是在PCR结束时收集。在实时PCR中，反应的特征是在循环中首次检测到扩增的时间点，而不是固定循环数后积累的目标量。主要采用基于染料的检测和基于探针的检测两种方法进行定量PCR。

所述“等位基因特异性扩增(Allele Specific Amplification,ASA)”是一种扩增技术，其PCR引物被设计为单个核苷酸残基可以区分其他模板。

所述“等位基因-特异性扩增或基因突变特异性扩增”通过十分高效的方法检测基因变异。与大多数检测基因变异或SNP的其他方法不同的是，不需要目标基因物质的预扩增。ASA在区分匹配和错配引物/目标序列复合物的基础上，将扩增和检测结合在一个反应中。在反应过程中扩增的DNA的增加可以通过由于和双链DNA结合而发光的SYBR Green I等染料所引起的荧光信号的增加进行实时监控。通过实时PCR的等位基因特异性扩增或基因变异特异性扩增在发生错配的情况下表现出荧光信号的延迟或缺失。在基因变异或SNP检测中，其提供了是否存在基因变异或SNP的有关信息。

所述“四引物扩增受阻突变体系PCR”在单管PCR反应中与对照片段一同同时扩增野生型和突变等位基因。非等位基因特异性对照扩增子通过突变区侧面的两个常见的(外部)引物扩增。两个等位基因特异性(内部)引物设计为与普通引物相反的方向，可与普通引物一同同时扩增野生型和突变型扩增子。结果，两个等位基因-特异性扩增子的突变位置与普通(外部)引物是不对称的，因此具有不同的长度，易于用标准凝胶电泳分离。所述对照扩增子不仅扩增失败，而且对假阴性提供内部对比，使两个等位基因-特异性扩增子中至少一个存在于四引物扩增受阻突变体系PCR中。

所述“等温放大”是指核酸的扩增无需依赖于热循环仪，而是可在较低的温度下完成，理想的状态是在扩增过程中不需要改变温度。等温扩增使用的温度可以在室温(22-24℃)到大约65℃之间，或是大约60-65℃、45-50℃、37-42℃或22-24℃的室温。等温扩增产物可通过凝胶电泳、ELISA、ELOSA(酶联寡核苷酸试验，Enzyme linkedoligosorbent assay)、实时PCR、ECL(改进的化学发光)、分析RNA、DNA和蛋白质或浊度的基于芯片的毛细管电泳装置生物分析仪(bioanalyzer)检测。

在本发明的一个实施例中，使用E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660VTaq聚合酶，确认对于包含SNP(rs1408799、rs1015362和/或rs4911414)的模板，其延伸错配引物的能力是否降低。

结果如图6至8所示，与E507K Taq聚合酶相比，可以证实E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V Taq聚合酶的由错配引物引起的扩增延迟，其效果在E507K/R536K/R660V Taq聚合酶中最为明显。

由此证实，所述三种DNA聚合酶与常规Taq聚合酶(E507K)相比具有更高的错配选择性。因此预计本发明的DNA聚合酶可有效应用于疾病的医学诊断和重组DNA的研究。

本发明的另一个实施例中，使用E507K/R536K/R/R660V Taq聚合酶，确认了对于KRAS基因中包含Q61H、G13D或G12S的和SNP的模板以及EGFR基因中包括L858R的SNP的模板，其延伸错配引物的能力是否降低。

其结果如图10至图13中显示，确认了包含E507K/R536K/R587I/R660V变异的TaqDNA聚合酶具有较包含E507K/R536K/R660V变异的Taq聚合酶更优秀的错配延伸选择性。由此可见，本发明的含有E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq DNA聚合酶能够应用于疾病的医学诊断以及重组DNA的研究中。

本发明还涉及一种含有本发明涉及的DNA聚合酶的用于检测基因变异或SNP的组合物及包括其的PCR试剂盒。

根据本发明的一个理想的实施例，所述PCR试剂盒适用于常规PCR(第1代PCR)、实时PCR(第2代PCR)、数字PCR(第3代PCR)或核酸质谱分析系统(MassARRAY)而使用。

本发明的PCR试剂盒，所述数字PCR可以是竞争性等位基因特异性TaqMan PCR(Competitive allele-specific TaqMan PCR)或微滴式数字PCR(Droplet digital PCR；ddPCR)，更具体的，可以是等位基因特异性转染PCR或等位基因特异性微滴式数字PCR，但并不限于此。

所述“转染PCR”作为一种在含有大量正常的野生型gDNA的样本中检测并量化稀有突变的方法，将等位基因-特异性qPCR与等位基因-特异性MGB阻断剂组合后，可产生优于传统等位基因-特异性PCR的特异性，以抑制来自野生型等位基因的非-特异性扩增。

所述“微滴式数字PCR”作为一种用2万颗液滴分割并扩增20μl的PCR反应，计算目标DNA数字的系统，根据液滴中目标DNA的扩增与否，如数字信号般接收并计算阳性液滴(1)和阴性滴液(0)，通过泊松分布计算目标DNA的拷贝数，最终以每μl样本的拷贝数确认结果值，还可用于稀有突变检测、极少量基因扩增，突变类型的检测等。

所述“MassARRAY”作为一种采用MALDI-TOF质谱法((MALDI-TOF质谱仪)进行基因形质分析(基因型分析，genotyping)等多种遗传体研究的多路复用分析法，可用于低成本迅速分析多个样本和靶标或特定目标的定制型(customized)分析。

本发明的PCR试剂盒可包括普通技术人员所知的在引物延伸过程中使用的任意试剂或其他要素。

根据本发明的一个优选实施例，所述PCR试剂盒包括一个以上的匹配引物、一个以上的错配引物或者同时包含一个以上匹配引物和一个以上错配引物。所述一个以上匹配的引物和一个以上错配的引物与目标序列杂交，所述错配的引物，相对于杂交目标序列，可以包括从其3'末端到第7个碱基位点上的非标准(non-canonical)核苷酸。

本发明的PCR试剂盒还可包括核苷酸三磷酸酯。

本发明的PCR试剂盒还包括:a)一个以上的缓冲区；b)与双链DNA结合的定量化试剂；c)聚合酶阻断抗体；d)一个以上的对比值或对照序列；和e)一个以上的模板。

以下，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅仅是对本发明的举例说明，业界具备一般知识的人应该理解，本发明的权利范围并不局限于所述实施例。

实施例1 诱发Taq聚合酶突变

1-1.片段PCR

在本实施例中，序列号为1的氨基酸序列中，(按照以下方法制备SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的)第536个氨基酸残基的精氨酸被赖氨酸取代的Taq DNA聚合酶(以下称为“R536K”)、第660个氨基酸残基的精氨酸被缬氨酸取代的Taq DNA聚合酶(以下称为“R660V”)以及第536个氨基酸残基的精氨酸被赖氨酸取代和第660个氨基酸残基的精氨酸被缬氨酸取代的Taq DNA聚合酶(以下称为“R536K/R660V”)，制备方法如下。

首先，利用表1所示的突变特异性引物通过PCR扩增Taq DNA聚合酶片段(F1至F5)，如图1(a)所示。反应条件如表2所示。

表1

表2

通过电泳确认PCR产物，结果如图1(b)所示，确认了各片段的条带，由此确认了目标片段已被扩增。

1-2.重叠(overlap)PCR

将所述1-1中扩增的各片段作为模板，使用两末端的引物(Eco-F和Xba-R引物)扩增全长。反应条件如表3和表4所示。

表3

表4

其结果，如图1(c)所示，确认了“R536K”、“R660V”和“R536K/R660V”的Tag聚合酶被扩增。

1-3.连接(ligation)

在表5所示的条件下，用限制性酶EcoRI/XbaI将pUC19在37℃下分解4小时后纯化DNA，，将纯化的DNA按照表6所示的条件在37℃用SAP处理1小时以制备载体。

表5

表6

对于插入物(insert)，将所述实施例1-2的重叠PCR产物纯化，并在表7所示条件下，用限制性酶EcoRI/XbaI在37℃下分解3小时，然后与制备的载体一同进行凝胶提取(图2)。

表7

在表8所示的条件下，在室温(RT)下连接2小时后，转化大肠杆菌E.coli DH5α并在含有氨苄青霉素的培养基上筛选。从获得的菌落制备的质粒进行测序,获得了引入所期突变的Taq DNA聚合酶突变体(“R536K”、“R660V”和“R536K/R660V”)。

表8

实施例2 引入E507K突变

2-1.片段PCR

对所述实施例1中制备的“R536K”、“R660V”及“R536K/R660V”的Taq聚合酶的活性进行测试，结果确认活性下降(数据未图示)，分别对“R536K”、“R660V”及“R536K/R660V”引入了E507K变异(序列号1的氨基酸序列中，第507个氨基酸残基的谷氨酸被赖氨酸取代)，作为对照组，在野生型(WT)Taq DNA聚合酶中也引入了E507K突变。引入了E507K突变的TaqDNA聚合酶的制备方法与实施例1相同。

使用表9所示的突变特异性引物，如图3所示通过PCR扩增Taq DNA聚合酶各片段(F6至F7)。反应条件如表10所示。

表9

表10

*模板质粒：pUC19-Tag(WT)，

pUC19-Tag(R536K)，

pUC19-Tag(R660V)，

pUC19-Tag(R536K/R660V)

2-2.重叠(overlap)PCR

将所述2-1中扩增的各片段作为模板，使用两末端的引物(Eco-F和Xba-R引物)扩增全长。反应条件如表11所示。

表11

2-3.连接(ligation)

在表5所示的条件下，用限制性酶EcoRI/XbaI将pUC19在37℃下分解4小时并纯化DNA，在表6所示的条件下，将纯化的DNA在37℃用SAP处理1小时以制备载体。

对于插入物(insert)，将所述实施例2-2的重叠PCR产物纯化，并在表7所示条件下，用限制性酶EcoRI/XbaI在37℃下分解3小时，然后与制备的载体一同进行凝胶提取(图4)。

在表8所示的条件下，在室温(RT)下连接2小时后，转化大肠杆菌E.coli DH5α或DH10β并在含有氨苄青霉素的培养基上筛选。从获得的菌落制备的质粒进行测序,获得了引入所需突变的Taq DNA聚合酶突变体(“E507K/R536K”、“E507K/R660V”和“E507K/R536K/R660V”)。

实施例3 使用本发明的DNA聚合酶进行qPCR

使用各自含有所述实施例2中获得的“E507K/R536K”、“E507K/R660V”和“E507K/R536K/R660V”突变的Taq聚合酶，确认对于含有SNP的模板，其延伸错配的引物的能力是否降低。作为对照组，使用了含有E507K突变的“E507K”Taq聚合酶。

在本实施例中使用的包含SNP的模板为rs1408799、rs1015362和rs4911414，各模板的基因型和各自对应的特异性引物(IDT,美国)的序列信息如表12和表13所示。

表12

表13

qPCR条件(Applied Biosystems 7500 Fast)如下表14所示。

表14

探针进行双重标记，如下表15所示。

表15

使用购自Noble Bio的口腔上皮细胞收集试剂盒收集口腔上皮细胞，将其溶解于500μl裂解液(lysis solution)中，并以12,000×g离心3分钟。将上清液转移到新管中，每次使用1μl(图5)。

反应条件如表16所示，反应缓冲液的组成如表17所示。

表16

表17

除了表13所示的特异性引物以外，其他反应液以同样方式在两个试管中制备，通过添加各等位基因特异性引物进行qPCR。此时，合并各试管中检测到的荧光信号以在AB7500软件(v 2.0.6)上计算并分析达到阈值(threshold))荧光值的循环(Ct)值的差异。判断由错配引物引起的扩增中的Ct值延迟的时间越长，基因变异特异性或等位基因特异性就越好。

在rs1408799、rs1015362及rs4911414上进行AS-qPCR的结果，如图6至8所示，与对照组E507K相比，可以证实包含E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V变异的Taq聚合酶的情况下，错配引物引起的扩增延迟，其效果在E507K/R536K/R660V突变中最为明显。

确认了和包含E507K突变的Taq聚合酶相比，本发明的包含E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V突变的Taq DNA聚合酶具有更优秀的错配延伸选择性。由此可见，所述3种Taq DNA聚合酶可有效运用于疾病的医学诊断和重组DNA研究。

实施例4 R587I变异的导入

4-1.片段PCR

为了在实施例2中制备的“E507K/R536K/R660V”变异的Taq克隆中追加导入R587I变异(序列号1的氨基酸序列中第587个氨基酸残基由精氨酸置换为异亮氨酸)，利用下表18中记录的引物将图9(a)所示的2个片段扩增至PCR。反应条件如表19。

表18

表19

在电泳上确认PCR产物的结果如图9(b)所示证实，各片段的条带得到确认，目标片段扩增。

4-2.In-Fusion克隆(In-fusion cloning)

Taq质粒载体(E507K/R536K/R660V)在表20所示条件下，在37℃下经4小时分解为限制性酶KpnI/XbaI，经纯化(融化:25ul)后制备成分解线性载体。然后在表21的条件下，在37℃下进行In-Fusion克隆反应15分钟后生物转化成E.coli DH5α或DH10β，从含氨苄西林的培养基中筛选出来。对所得各克隆准备的质粒进行测序得到了导入R 587 I变异的TaqDNA聚合酶突变体(“E507K/R536K/R587I/R660V”)。

表20

表21

实施例5利用"E507K/R536K/R587I/R660V"Taq聚合酶进行qPCR

5-1.KRAS基因的Q61H变异区分

使用实施例4中获取的包含"E507K/R536K/R587I/R660V"变异的Taq聚合酶，确认了KRAS基因中含有Q61H的SNP的模板延长错配引物的能力有否降低。对比组使用了包含“E507K/R536K/R660V”变异的Taq聚合酶。

所述包含SNP的模板是从HepG2肝癌细胞株获取的gDNA(104copies,33ng/rxn)，通过常规的DNA萃取方法获取。经确认，检测目标部位均与NCBI参考序列(NG_007524.1)一致，并用作野生型(WT)。

针对所述模板的特异性引物的序列信息如下表22所示。

表22

qPCR条件(Applied Biosystems 7500 Fast)与所述实施例3的表14相同。

探针如下表23所示进行了标记。

表23

反应条件与所述实施例3的表16相同，反应缓冲液的组成如下表24。

表24

反应缓冲液(1X)

50mM Tris·Cl(pH8.8)

2.5mM MgCl₂

60mM KCL

2.5mM (NH₄)₂SO₄

25M TMAC

0.1％ Tween 20

0.01％ BSA

将所述表22的特异性引物之外的其余反应液以相同的量放入2个试管，各添加等位基因特异性引物后进行qPCR。此时，各试管中测得的荧光信号合并后用AB7500软件(v2.0.6)分析了达到计算并导出的临界点(threshold)荧光值的循环(Ct)值的差异。错配引物引起的扩增中的Ct值越延迟，基因变异特异性或等位基因特异性越好。

AS-qPCR结果如图10(a)和(b)所示，可确认与对比组E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq聚合酶ΔCt增加至5，错配引物引起的扩增延迟。

另外，本发明的的发明者们还将下表25中的引物制成18mer的长度代替所述表22的24mer长的引物使用，再一次反复进行了所述实验。除了使用下表26的反应缓冲液组成之外，所有条件和使用所述24mer长度的引物所进行的实验相同。

表25

表26

反应缓冲液(1X)

50mM Tris·Cl(pH8.8)

2.5mM MgCl₂

15mM (NH₄)₂SO₄

0.1％ Tween 20

0.01％ BSA

其结果，如图10(c)和10(d)所示，可以确认与对比组E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq聚合酶由错配引物引起的扩增延迟。尤其是，导入R587I的聚合酶的ΔCt明显增加。

5-2.KRAS基因的G13D变异区分

使用所述实施例4中获取的包含“E507K/R536K/R587I/R660V”变异的Taq聚合酶，确认了KRAS基因中包含G13D的SNP的模板延伸错配引物的能力有否降低。对比组则使用了包含“E507K/R536K/R660V”变异的Taq聚合酶。

针对所述模板的特异性引物的序列信息如下表27所示。

表27

qPCR条件(Applied Biosystems 7500Fast)与所述实施例3的表14相同。

探针如下表28所示进行了标记。

表28

反应条件与所述实施例3的表16相同，反应缓冲液的组成和所述实施例5-1的表24相同。

将所述表27的特异性引物之外的其余反应液以相同的量放入2个试管，各添加等位基因特异性引物后进行qPCR。此时，各试管中测得的荧光信号合并后用AB7500软件(v2.0.6)分析了达到计算并导出的临界点(threshold)荧光值的循环(Ct)值的差异。错配引物引起的扩增中的Ct值越延迟，基因变异特异性或等位基因特异性越好。

AS-qPCR结果如图11所示，可确认与对比组E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq聚合酶由错配引物引起的扩增延迟。

5-3.KRAS基因的G12S变异区分

使用所述实施例4中获取的包含“E507K/R536K/R587I/R660V”变异的Taq聚合酶，确认了KRAS基因中包含G13S的SNP的模板延伸错配引物的能力有否降低。对比组则使用了包含“E507K/R536K/R660V”变异的Taq聚合酶。

针对所述模板的特异性引物的序列信息如下表29所示。

表29

qPCR条件(Applied Biosystems 7500 Fast)与所述实施例3的表14相同。

探针如下表30所示进行了标记。

表30

将所述表29的特异性引物之外的其余反应液以相同的量放入2个试管，各添加等位基因特异性引物后进行qPCR。此时，各试管中测得的荧光信号合并后用AB7500软件(v2.0.6)分析了达到计算并导出的临界点(threshold)荧光值的循环(Ct)值的差异。错配引物引起的扩增中的Ct值越延迟，基因变异特异性或等位基因特异性越好。

AS-qPCR结果如图12所示，可确认与对比组E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq聚合酶由错配引物引起的扩增延迟。

5-4.EGFR基因的L858R变异区分

使用所述实施例4中获取的包含“E507K/R536K/R587I/R660V”变异的Taq聚合酶，确认了EGFR基因中包含L858R的SNP的模板延伸错配引物的能力有否降低。对比组则使用了包含“E507K/R536K/R660V”变异的Taq聚合酶。

所述包含SNP的模板是从HepG2肝癌细胞株获取的gDNA(10⁴copies,33ng/rxn)，通过常规的DNA萃取方法获取。经确认，检测目标部位均与NCBI参考序列(NG_007726.3)一致，并用作野生型(WT)。

针对所述模板的特异性引物的序列信息如下表31所示。

表31

qPCR条件(Applied Biosystems 7500 Fast)与所述实施例3的表14相同。

探针如下表32所示进行了双重标记。

表32

将所述表31的特异性引物之外的其余反应液以相同的量放入2个试管，各添加等位基因特异性引物后进行qPCR。此时，各试管中测得的荧光信号合并后用AB7500软件(v2.0.6)分析了达到计算并导出的临界点(threshold)荧光值的循环(Ct)值的差异。错配引物引起的扩增中的Ct值越延迟，基因变异特异性或等位基因特异性越好。

AS-qPCR结果如图13所示，可确认与对比组E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq聚合酶由错配引物引起的扩增延迟。

如上所述，确认了包含本发明E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq DNA聚合酶与包含E507K/R536K/R660V变异的Taq聚合酶相比，在某些情况下具有优异的错配延伸选择性。由此可见，包含本发明E507K/R536K/R587I/R660V变异的Taq DNA聚合酶可有效运用于疾病的医学诊断和重组DNA研究。

序列表

<110> 基因凯斯特有限公司

<120> 基因突变特异性扩增效率提高的DNA聚合酶

<130> DAG35897

<150> KR 10-2017-0088373

<151> 2017-07-12

<160> 55

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 2

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Lys Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 3

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Lys Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Lys Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 4

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

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<210> 10

<211> 2499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60

cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120

gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180

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tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300

gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360

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<211> 2499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<210> 12

<211> 2499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctctagact atcactcctt ggcggagagc ca 32

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccagtgttag gttatttcta acttg 25

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<212> DNA

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gctcggagca catggtcaa 19

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<212> DNA

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gctcggagca catggtcag 19

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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actgtgtgtc tgaaacagta 20

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<212> DNA

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gtaagtcttt gctgagaaat tcattg 26

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<212> DNA

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gtaagtcttt gctgagaaat tcattt 26

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<212> DNA

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agtatccagg gttaatgtga aag 23

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<212> DNA

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agatatttgt aaggtattct ggcct 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgctgaacaa atagtcccga ccag 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttctctagt tgcctttaag attt 24

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 34

cccaagcggg gtgatgacgg ggatgtt 27

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<212> DNA

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<212> DNA

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gatattctcg acacagcagg tcaa 24

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<212> DNA

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gatattctcg acacagcagg tcac 24

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<212> DNA

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acaaagaaag ccctccccag 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ctcgacacag caggtcac 18

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<212> DNA

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<400> 49

taaacttgtg gtagttggag cta 23

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<212> DNA

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catattcgtc cacaaaatga ttctgaat 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

agctgtatcg tcaaggcact cttgc 25

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

acctggcagc caggaacgta 20

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

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<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gcacccagca gtttggccc 19

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

cagcatgtca agatcacaga ttttgggc 28

Claims

1.一种由序列号为1的氨基酸序列构成的带有Taq聚合酶的DNA聚合酶，这种DNA聚合酶包括：

(a)序列号为1的氨基酸序列中第507个氨基酸残基的取代；以及

2.根据权利请求项1所述的DNA聚合酶，其特征是，所述第507个氨基酸残基的置换是由赖氨酸(K)取代谷氨酸(E)，所述第536个氨基酸残基的置换是由赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，所述第587个氨基酸残基的置换是由异亮氨酸(I)取代精氨酸(R),所述第660个氨基酸残基的置换是由缬氨酸(V)取代精氨酸(R)。

3.根据权利请求项1所述的DNA聚合酶，其特征是，所述DNA聚合酶区分匹配的引物和错配的引物，所述匹配的引物和错配的引物与目标序列杂交，对于所述错配引物杂交的目标序列，其3'末端包括非典型核苷酸。

4.根据权利请求项1所述的DNA聚合酶，其特征是，所述DNA聚合酶包含匹配的引物的目标序列的扩增显示的Ct值比包含错配的引物的目标序列的扩增低。

5.一种编码权利请求项2的DNA聚合酶的核酸序列。

6.一种包括权利请求项5中的核酸序列的载体。

7.一种转基因为权利请求项6中所述载体的宿主细胞。

8.一种检测方法，包括使权利请求项1或权利请求项2的DNA聚合酶接触的：

a)一个或多个模板；

c)核苷酸三磷酸酯；

使所述一个以上匹配的引物和错配的引物与目标序列杂交，对于和所述错配的引物杂交的目标序列，从其3’末端开始到第7个碱基位点上包括非常规核苷酸，在一个以上模板中活体外检测一个以上的基因变异或SNP。

9.根据权利请求项8所述的方法，其特征是，包括采用双链特异性染料进行熔体温度分析。

10.根据权利请求项8所述的方法，其特征是，通过实时PCR、标准PCR后琼脂糖凝胶中的分析、通过实时PCR的基因变异特异性扩增或等位基因-特异性扩增、四引物扩增-受阻突变体系PCR或等温扩增来完成。

11.一种包含权利请求项1或权利请求项2的DNA聚合酶的用于检测基因变异或SNP的组合物。

12.一种包含权利请求项11中组合物的PCR试剂盒。

13.根据权利请求项12，所述PCR试剂盒的特征是：

所述PCR试剂盒可用于转染PCR、微滴式数字PCR或核酸质谱分析系统。

14.根据权利请求项12所述的PCR试剂盒，包括一个以上的匹配引物、一个以上的错配引物或者一个以上的匹配引物和一个以上的错配引物两者，所述一个以上匹配引物和一个以上错配引物与目标序列杂交，对于和所述错配引物杂交的目标引物，从其3’末端开始到第7个碱基位点上可包括非常规核苷酸。

15.根据权利请求项12所述的PCR试剂盒，其特征是，还可包括核苷酸硫磷酸脂。

16.根据权利请求项12所述发PCR试剂盒，其特征是，还可包括：

a)一个或多个缓冲剂；

b)一种结合双链DNA的定量化试剂；

c)聚合酶阻断抗体；

d)一个以上对比值或对比序列；以及

e)一个或多个模板。