CN109810954A - 一种热稳定口蹄疫o型重组病毒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用，属于兽药生物制品技术领域。所述病毒以O/rV病毒株为基本病毒株，包括结构蛋白VP2第98位突变为苯丙氨酸。所述重组病毒的制备方法，在VP2中同时引入了两个点突变S93F和Y98F，但在病毒传代过程中稳定保留了Y98F。所述含VP2 Y98F的FMDV O/rV‑3具有良好的热稳定性，且具有良好的免疫效果。本发明构建的含VP2 Y98F耐热突变株O/rV‑3可作为优质灭活疫苗生产种毒，显著提高灭活疫苗中的有效抗原含量，增加灭活疫苗的免疫效力，用于我国口蹄疫的有效防控。
Description
技术领域
本发明属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是严重威胁我国畜牧业发展的重大动物疫病。口蹄疫病原-口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus，FMDV)在我国长期驻留，引发疫情，不仅严重影响了畜牧业的健康发展，造成家畜及其产品的贸易障碍，而且给公共卫生和国家声誉造成严重的负面影响，因此我国十分重视对该病的防控。
FMDV属于小RNA病毒科，其基因组长约8500个核苷酸，由5'非编码区(Untranslated Regions，UTR)，一个大的开放阅读框(Openreading frame，ORF)和3'UTR组成。开放阅读框编码一个多聚蛋白，该蛋白经蛋白酶裂解加工后形成4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和10个非结构蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B1-3、3C和3D)。其中每一分子四种结构蛋白组成一个原体(5S)，每5个原体形成一个五聚体(12S)，12个五聚体组成病毒衣壳(75S)，病毒衣壳和RNA组成FMDV粒子(146S)。研究表明FMDV粒子对环境温度比较敏感，温度升高容易诱导病毒粒子解离成五聚体亚单位(12S)而导致疫苗的有效抗原(146S)含量降低，从而影响疫苗的免疫保护效力。因此，改善FMD疫苗的热稳定性，制备热稳定的FMD疫苗对于我国口蹄疫的防控具有重要意义。
近年来反向遗传操作技术的发展为改造病毒提供技术支持，其建立过程是通过在体外进行人工基因操作，使其建立的系统满足病毒复制和包装所需要的各种必要条件。但是由于反向遗传操作可能影响效率，例如成功拯救的重组狂犬病病毒其拯救效率较低，在107个转染细胞中大约只获得1个病毒粒子。另外，重组病毒在动物细胞上有效复制产生细胞病变也会影响其拯救效率。同时反向遗传操作后的病毒后期传代过程中发生回复突变不能长期稳定保持有益生物学特性。同时现有技术中采用反向遗传操作技术对病毒的毒力或病毒的产量等生物特性进行改性，目前现有技术中还没有一套关于热稳定性口蹄疫O型标记病毒的拯救方案。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于基于FMDV反向遗传操作提供一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用，所述热稳定口蹄疫O型重组病毒不仅具有较好的遗传稳定性，而且热稳定性也显著提高。
本发明提供的一种热稳定口蹄疫O型重组病毒，以O/rV病毒株为基本病毒株，包括结构蛋白VP2第98位酪氨酸突变为苯丙氨酸。
优选的，突变后的结构蛋白VP2的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
优选的，突变后的结构蛋白VP2的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
本发明提供了所述热稳定口蹄疫O型重组病毒的制备方法，包括以下步骤：
1)利用基因合成技术合成含结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸的特定核苷酸序列，插入pUC质粒中，得到pUC/VP2S93F+Y98F；
所述结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸均突变为苯丙氨酸的核苷酸序列为SEQIDNo.5；
2)将所述pUC/VP2S93F+Y98F或pOMQ-Z123用Bam H I和Bss H II酶消化，得到含VP2突变片段或线性pOMQ-Z123；
3)将所述步骤2)得到的含VP2突变的片段和线性pOMQ-Z123连接，得到pBG；
4)将所述步骤3)中的pBG或pSK-Z4用Spe I和BglII酶消化，回收5400bp目的片段或线性pSK-Z4；
5)将所述步骤5)中5400bp目的片段和线性pSK-Z4连接，得到pQEC；
6)将所述pQEC转染至单层BSR/T7细胞，培养，收获和冻融细胞，收集病毒；
7)将步骤6)收集的病毒传代培养8代以上，得到热稳定口蹄疫O型重组病毒。
优选的，所述步骤2)中Bam H I和Bss H II酶消化的条件为37℃。
优选的，所述步骤5)中Spe I和Bgl II酶消化的条件为37℃。
优选的，所述步骤3)或步骤5)中连接用酶为T4连接酶；所述连接的条件为16℃过夜连接。
本发明提供了所述热稳定口蹄疫O型重组病毒的制备方法或所述制备方法制备的热稳定口蹄疫O型重组病毒在热稳定口蹄疫O型灭活疫苗生产中的应用。
本发明提供的热稳定口蹄疫O型病毒O/rV-3，包括结构蛋白VP2第98位酪氨酸突变为苯丙氨酸。其中结构蛋白VP2的第98位氨基酸的突变能够增加衣壳蛋白亚单位之间的静电作用力，进而提高病毒的热稳定性。本发明提供的热稳定口蹄疫O型重组病毒具有较好的遗传稳定性，测序验证VP2蛋白序列的遗传稳定性，虽然O/rV-3病毒第8代VP293F回复为S，但98F蛋白在病毒传至第20代仍然稳定存在。经一步生长曲线结果表明，结构蛋白VP2Y98F的突变修饰没有影响O/rV-3病毒的复制；重组病毒热诱导的失活实验表明：和亲本病毒O/rV相比，含VP298F的O/rV-3病毒的热稳定性显著提高。
同时本发明提供的热稳定口蹄疫O型重组病毒，经过重组病毒酸诱导的失活实验证明：在pH值6.0的环境中处理60min后，亲本病毒O/rV的失活率为0.0038min-1，O/rV-3病毒的失活率为0.0028min-1，且O/rV-3病毒剩余感染性粒子的百分数显著高于亲本病毒剩余感染性粒子的百分数。因此，和亲本病毒相比，含VP298F的O/rV-3病毒不仅具有好的耐热性，而且耐酸能力也显著提高。
本发明提供了所述热稳定口蹄疫O型重组病毒的制备方法，利用基因合成技术合成含FMDV结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸的特定核苷酸序列，并替换含有缅甸98谱系VP1基因的FMDV OZK/93-08的半长pOMQ-Z123中对应的核苷酸序列，再与pSK-Z4质粒连接，得到的pQEC经侵染BSR/T7细胞，组装成热稳定口蹄疫O型重组病毒。本发明采用两位点突变的方法，保持98位的酪氨酸突变为苯丙氨酸的突变保持稳定不变。实验表明：O/rV-1病毒(与O/rV-3病毒相比仅93位氨基酸突变为苯丙氨酸)，传至第8代VP293F回复为S，同时O/rV-3病毒第8代VP293位苯丙氨酸回复为丝氨酸，但是98位苯丙氨酸在传至第20代仍然稳定存在，而仅对VP2中98位氨基酸突变为苯丙氨酸的病毒O/rV-2，传至第6代时，也发生回复突变。这些对比试验结果表明本发明提供的制备方法通过将93位和98位氨基酸同时发生突变有利于在传代过程中保护98位氨基酸不易发生回复突变。
本发明提供了所述热稳定口蹄疫O型重组病毒或所述制备方法制备的热稳定口蹄疫O型重组病毒在热稳定口蹄疫O型灭活疫苗生产中的应用。本发明提供的热稳定口蹄疫O型重组病毒制备的灭活疫苗免疫动物后在不同时间产生的中和抗体水平与亲本病毒O/rV制备的疫苗免疫动物产生的中和抗体水平相似(P>0.05)，表明VP2Y98F的突变没有影响重组病毒的抗原性。本发明将保护的热稳定口蹄疫O型重组病毒作为疫苗候选株，实验证明：含VP298F的O/rV-3重组病毒制备的疫苗在4℃冷藏1、3和6月后免疫豚鼠所产生的平均中和抗体均明显高于O/rV亲本病毒制备的疫苗免疫豚鼠所产生的抗体，说明所述的重组病毒O/rV-3制备的疫苗稳定性显著高于亲本病毒O/rV制备疫苗的稳定性，从而使该疫苗中146S的有效抗原含量明显高于亲本病毒制备疫苗中146S的抗原含量，进而在机体内诱导了高的中和抗体的产生，提高了疫苗的免疫效力，因此适合发展优质的口蹄疫疫苗。
附图说明
图1为pQEA、PQEB和pQEC重组质粒的氨基酸突变示意图；
图2为重组质粒的酶切鉴定图；
图3为间接免疫荧光结果；
图4为重组FMDV的电镜观察；
图5为FMDV的一步生长曲线；
图6为O/rV-3和O/rV在42℃条件下处理4小时的灭活率；
图7为O/rV-3和O/rV在49℃条件下处理1小时的灭活率；
图8为O/rV-3和O/rV在42℃条件下处理4小时后剩余感染性粒子的百分数；
图9为O/rV-3和O/rV在49℃条件下处理1小时后剩余感染性粒子的百分数；
图10为O/rV-3和O/rV病毒在pH值6.0条件下处理2小时的失活率；
图11为O/rV-3和O/rV在49℃、pH值6.0条件下处理2小时后剩余感染性粒子的百分数；
图12为O/rV和O/rV-3灭活疫苗免疫猪产生的平均中和抗体(VNT)；
图13为FMDV疫苗4℃保存1、3和6月免疫豚鼠产生的中和抗体的稳定性柱形图。
具体实施方式
本发明提供的一种热稳定口蹄疫O型重组病毒，以O/rV病毒株为基本病毒株，包括结构蛋白VP2第98位酪氨酸突变为苯丙氨酸。
在本发明中，所述热稳定口蹄疫O型重组病毒是在O/rV病毒株的基础上进行改造。
在本发明中，所述O/rV病毒株制备方法优选包括以下步骤：
将含缅甸98谱系VP1基因的FMDV OZK/93-08的半长质粒pOMQ-Z123和pSK-Z4分别用SpeⅠ和BglⅡ酶消化，得到的5400bp的目的基因和线性化的pSK-Z4连接，得到全长质粒pQED，将所述全长质粒pQED转染BSR/T7细胞，培养，收集细胞反复冻融，得到的病毒为O/rV的病毒株。所述pOMQ-Z123半长质粒和pSK-Z4半长质粒在公开号为CN102614507A，发明名称为一种O型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法的专利中公开。
在本发明中，所述热稳定口蹄疫O型重组病毒的氨基酸突变示意图见图1，所述含缅甸98谱系VP1基因的FMDV OZK/93-08的半长质粒pOMQ-Z123包括5′UTR到2C的区段，其中VP1结构蛋白区段(灰色区域)是替换成缅甸98谱系VP1基因。pSK-Z4半长质粒包括3A到3′UTR的区段。
在本发明中，所述改造的方法包括对结构蛋白VP2进行突变。所述结构蛋白VP2的突变方案为结构蛋白VP2第98位酪氨酸突变为苯丙氨酸。突变后的结构蛋白VP2的氨基酸序列优选为SEQ ID No.1。突变后的结构蛋白VP2的核苷酸序列优选为SEQ ID No.2。推测结构蛋白VP2的第98位氨基酸的突变能够增加衣壳蛋白亚单位之间的静电作用力，进而提高病毒的热稳定性。
本发明提供了所述热稳定口蹄疫O型重组病毒的制备方法，包括以下步骤：
1)利用基因合成技术合成含FMDV结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸的特定核苷酸序列，插入pUC质粒中，得到pUC/VP2S93F+Y98F；
所述结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸的核苷酸序列为SEQIDNo.5；
2)将所述pUC/VP2S93F+Y98F或pOMQ-Z123用Bam H I和Bss H II酶消化，得到含VP2突变的特定片段或线性pOMQ-Z123；
3)将所述步骤2)得到的含VP2突变的特定片段和线性pOMQ-Z123连接，得到pBG；
4)将所述步骤3)中的pBG或pSK-Z4用Spe I和BglII酶消化，回收5400bp目的片段或线性pSK-Z4；
5)将所述步骤4)中5400bp目的片段和线性pSK-Z4连接，得到pQEC；
6)将所述pQEC转染至单层BSR/T7细胞，培养，收获和冻融细胞，收集病毒；
7)将步骤6)收集的病毒传代培养8代以上，得到热稳定口蹄疫O型重组病毒O/rV-3。
本发明利用基因合成技术合成含FMDV结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸的特定核苷酸序列，插入pUC质粒中，得到pUC/VP2S93F+Y98F；所述含结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸核苷酸序列为SEQ ID No.5。
在本发明中，所述FMDV结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变均为苯丙氨酸是在O/ZK/93-08毒株的VP2基因序列的基础上进行两位点突变得到的。所述O/ZK/93-08毒株的VP2基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4。所述FMDV结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸突变为苯丙氨酸的核苷酸序列见SEQ ID No.3。所述O/ZK/93-08毒株在公开号为CN102614507A，发明名称为一种O型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法的专利中公开。
在本发明中，合成的序列插入pUC质粒的方法为双酶切连接法。本发明对所述pUC质粒的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pUC质粒即可。
得到pUC/VP2S93F+Y98F后，本发明将所述pUC/VP2S93F+Y98F或pOMQ-Z123用Bam HI和Bss H II酶消化，得到含VP2的特定突变片段或线性pOMQ-Z123。
在本发明中，所述Bam H I和Bss H II酶消化的条件优选为37℃。所述pUC/VP2S93F+Y98F经过Bam H I和Bss H II酶消化得到含VP2突变的特定片段。所述含VP2突变的特定片段长度为1134bp。
得到含VP2突变的特定片段后，本发明将所述含VP2突变的特定片段和线性pOMQ-Z123连接，得到pBG。
在本发明中，所述连接用酶为T4连接酶；所述连接的条件优选为16℃过夜连接。为了确定连接产物为含有目标片段的质粒，本发明优选将得到的pBG半长质粒测序。测序用引物包括引物OZ1725(+)和OZ3004(-)；所述OZ1725(+)的核苷酸序列为SEQ ID No.5；所述OZ3004(-)的核苷酸序列为SEQ ID No.6。本发明对所述测序公司没有限制，采用本领域所熟知的测序公司即可。在本发明实施例中，测序委托金唯智生物技术有限公司进行。测序合格的pBG用于后续实验。
得到测序合格的pBG和pSK-Z4后，本发明将所述pBG或pSK-Z4用Spe I和BglII酶消化，回收5400bp目的片段或线性pSK-Z4。
在本发明中，所述Spe I和BglII酶消化的条件优选为37℃。pBG经Spe I和BglII酶消化后，得到约5400bp目的片段。所述pSK-Z4经Spe I和Bgl II酶消化后得到两段带有粘性末端的pSK-Z4。
酶消化后，本发明将所述5400bp目的片段和线性pSK-Z4连接，得到pQEC。所述连接用酶为T4连接酶；所述连接的条件优选为16℃。
得到pQEC后，本发明将所述pQEC转染至单层BSR/T7细胞，培养，收获和冻融细胞，收集病毒。
在本发明中，为了检测全长质粒pQEC的正确与否，所述pQEC用Spe I和PstI进行酶切鉴定，结果切出与预期大小相符的目的条带(838bp，4000bp和6528bp)(见图2)。将酶切鉴定正确的重组质粒用引物OZ1725(+)、OZ3004(-)进行序列测定，验证构建质粒的正确性。
所述pQEC转染前优选进行NotI线化后用DNA片段回收试剂盒纯化回收作为转染模板。本发明对所述pQEC转染至单层BSR/T7细胞的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方式即可。在本发明实施例中，所述转染用脂质体LipofectamineTM2000介导转染，具体操作方法见操作说明书记载。将转染后6h，在单层BSR/T7细胞中加含8％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司)，置37℃5％CO2培养箱继续培养。转染BSR/T7细胞60h后均出现典型的致细胞病变(cytopathogenic effct,CPE)。所述细胞病变的细胞呈纤维状分布，细胞变大、变圆，呈葡萄状。转染72h后收获BSR/T7细胞。将收获的BSR/T7细胞反复冻融2～3次后，收集病毒。
本发明将收集的病毒传代培养8代以上，得到热稳定口蹄疫O型重组病毒O/rV-3。所述传代培养优选在BHK-21上连续传代。本发明对所述传代的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的传代方案即可。
基于本发明提供的热稳定口蹄疫O型重组病毒经过反向遗传操作对病毒的复制能力没有影响以及其热稳定性和耐酸性均优于基本病毒株的性能，本发明还提供了热稳定口蹄疫O型重组病毒或所述制备方法制备的热稳定口蹄疫O型重组病毒在热稳定口蹄疫O型灭活疫苗生产中的应用。
在本发明中，所述热稳定口蹄疫O型灭活疫苗生产的方法优选将所述热稳定口蹄疫O型重组病毒经过灭活得到热稳定口蹄疫O型疫苗。
在本发明中，O/rV-3病毒中VP2Y98F的突变没有影响病毒的抗原性。为了检测热稳定口蹄疫O型标记疫苗的稳定性情况，实施了保存期稳定性实验，结果表明O/rV-3制备的疫苗稳定性显著高于亲本病毒O/rV制备疫苗的稳定性，从而使该疫苗中146S的有效抗原含量明显高于亲本病毒制备疫苗中146S的抗原含量，在机体内诱导了高的中和抗体的产生，提高了疫苗的免疫效力。因此，生产的热稳定口蹄疫O型灭活疫苗能够用于O型口蹄疫的有效防控。
下面结合实施例对本发明提供的一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
pQEC全长质粒的构建方法
在含缅甸98谱系VP1基因的O/ZK/93-08病毒株的基础上将结构蛋白VP2第93S和98Y突变F(VP2S93F+Y98F)。利用基因合成技术合成含FMDVVP2S93F+Y98F的约1134bp的基因序列(SEQ ID No.5)，将所述基因片段插入pUC质粒中，得到的含两个氨基酸突变的克隆质粒命名为pUC/VP2S93F+Y98F。将pUC/VP2S93F+Y98F质粒分别用Bam H I和Bss H II内切酶消化，回收约1134bp的目的片段，并将其连入用同样内切酶消化的质粒pOMQ-Z123中(该质粒在已公开专利CN 102614507A中报道过)，得到半长重组质粒pBG。将pBG半长质粒送金唯智生物技术有限公司，用引物OZ1725(+)和OZ3004(-)进行序列测定验证插入序列的的正确性，引物序列见表1。
表1 OZ1725(+)和OZ3004(-)引物序列信息
| 引物名称 | 核酸序列 | 序列 |
| OZ1725(+) | taacaactactacatgcagc | SEQIDNo.6 |
| OZ3004(-) | ttcagccctgtgtcccactc | SEQIDNo.7 |
测序正确的质粒pBG用SpeⅠ和BglⅡ限制性内切酶消化后分别回收约5400bp的目的片段，并将其插入用同样酶消化的pSK-Z4质粒中，得到全长重组质粒pQEC(pQEC重组质粒的突变示意图见图1)。
对比例1
在含缅甸98谱系VP1基因的O/ZK/93-08病毒株的基础上将结构蛋白VP293S突变为F(VP2S93F)。利用基因合成技术合成含FMDVVP2S93F的约1134bp的基因序列(SEQ IDNo.8)，其中含该位点突变的克隆质粒命名为pUC/VP2S93F。将pUC/VP2S93F两质粒分别用Bam H I和Bss H II内切酶消化，回收约1134bp的目的片段，并将其连入用同样内切酶消化的质粒pOMQ-Z123中(该质粒在已公开专利CN 102614507A中报道过)，得到半长重组质粒pBE。将pBE半长质粒送金唯智生物技术有限公司，用引物OZ1725(+)和OZ3004(-)进行序列测定验证插入序列的的正确性，引物序列见表1。
测序正确的质粒pBE用SpeⅠ和BglⅡ限制性内切酶消化后分别回收约5400bp的目的片段，并将其插入用同样酶消化的实施例1中制备的pSK-Z4线化质粒中，得到全长重组质粒pQEA(pQEA重组质粒的突变示意图见图1)。
对比例2
在含缅甸98谱系VP1基因的O/ZK/93-08病毒株的基础上将VP298位酪氨酸(Serine，S)突变为苯丙氨酸(phenylalanine，F)(VP2Y98F)。利用基因合成技术合成含FMDVVP2Y98F的约1134bp的基因序列(SEQ ID No.9)，其中含该突变的克隆质粒命名为pUC/VP2Y98F。将pUC/VP2Y98F两质粒分别用Bam H I和Bss H II内切酶消化，回收约1134bp的目的片段，并将其连入用同样内切酶消化的质粒pOMQ-Z123中(该质粒在已公开专利CN102614507A中报道过)，得到半长重组质粒pBF。将pBF半长质粒送金唯智生物技术有限公司，用引物OZ1725(+)和OZ3004(-)进行序列测定验证插入序列的的正确性，引物序列见表1。
测序正确的质粒pBF用SpeⅠ和BglⅡ限制性内切酶消化后分别回收约5400bp的目的片段，并将其插入用同样酶消化的实施例1中制备的pSK-Z4线化质粒中，得到全长重组质粒pQEB(pQEB重组质粒的突变示意图见图1)。
对比例3
将pOMQ-Z123质粒用SpeⅠ和BglⅡ内切酶消化后回收约5400bp的目的基因，并将其插入用同样酶消化的pSK-Z4质粒中，得到对照全长质粒pQED。
实施例2
上述制备的pQEA、pQEB、pQEC和pQED重组质粒用Spe I和PstI进行酶切鉴定，结果切出与预期大小相符的目的条带(838bp，4000bp和6528bp)(见图2)。将酶切鉴定正确的重组质粒送金唯智生物技术有限公司，用引物OZ1725(+)、OZ3004(-)(具体序列见表1)进行序列测定，验证构建质粒的正确性。结果表明构建的重组质粒均含预期的突变修饰。pQEA、pQEB、pQEC和pQED质粒的VP2核苷酸序列分别见SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12和SEQ ID No.13，其对应的氨基酸序列见SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.16和SEQ ID No.17。
实施例3
标记病毒的拯救
采用QIAGEN PlasmidMidi Kits按照说明书操作制备得到质粒pQEA、pQEB、pQEC和pQED，经Not I线化后用DNA片段回收试剂盒纯化回收pQEA、pQEB、pQEC和pQED作为转染模板。采用常规培养方法培养单层BSR/T7细胞生长至70％～80％，用脂质体LipofectamineTM2000介导转染回收的pQEA、pQEB、pQEC和pQED，具体操作方法见按照操作说明书。转染后6h加入2mL含8％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司)，置37℃，5％CO2培养箱中继续培养，观察细胞出现致细胞病变的情况。
结果：pQEA、pQEB、pQEC和pQED质粒在转染BSR/T7细胞60h后均出现典型的致细胞病变(cytopathogenic effct,CPE)，即纤维状分布的细胞变大、变圆，成葡萄状分布。转染72h后收获细胞，反复冻融2～3次后，在BHK-21上连续传代，-70℃传以下保存各代病毒备用。pQEA、pQEB、pQEC和pQED质粒拯救的基因工程病毒分别命名为O/rV-1、O/rV-2、O/rV-3和O/rV(作为亲本病毒)。
实施例3
重组病毒的鉴定
1、RT-PCR鉴定
取转染的上清分别用RNAasy Mini Kit提取细胞毒总RNA，用引物OZ1725(+)\OZ3004(-)引物对RT-PCR分别扩增拯救病毒含突变修饰的基因片段，纯化回收后送上海桑尼有限公司测序，验证重组病毒的正确性。
测序结果表明：O/rV-1、O/rV-2、O/rV-3重组病毒均含有预期的突变，说明本发明成功构建了含VP2蛋白预期突变修饰的FMD重组病毒。
2、间接免疫荧光
BHK-21单层细胞生长至70％～80％满时，分别接种亲本病毒O/rV和重组病毒O/rV-1、O/rV-2和O/rV-3用抗3A的单抗3A24间接免疫荧光检测FMDV 3A蛋白的表达。其中3A单抗3A24在文献《口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定》，中国兽医科学2010,40(04):331-336中公开过。具体步骤为：(1)接种病毒的细胞37℃孵育6h后弃培养液，PBS(0.01mol/LpH值7.2)漂洗3次后加入4％冰冷的多聚甲醛室温固定30min；(2)PBS漂洗3次，加入5％BSA室温封闭30min；(3)PBS漂洗3次后分别加入1:500稀释的3A24和3BX，37℃孵育1h；(4)PBS漂洗5次，加入1:100稀释的FITC标记的山羊抗小鼠的IgG二抗，37℃孵育1h；(5)PBS漂洗5次，加入0.5ug/ml DAPI(PBS配制)染色10min，PBS洗5次，去除多余的DAPI，置共聚焦荧光显微镜下拍照，同时设正常细胞对照。
结果表明突变病毒O/rV-1、O/rV-2、O/rV-3和亲本病毒O/rV感染BHK-21细胞后用3A单抗作用均能看到可见的绿色荧光，对照细胞3A单抗作用看不到可见的绿色荧光(见图3)，表明本发明成功构建了突变的FMDV。
3、电镜
在BHK-21细胞中分别增殖200mL四个病毒，冻融2～3次后，加二乙烯亚胺(BEI)灭活，在4℃条件下6000rpm离心40min，收集病毒上清，在4℃条件下45000rpm离心3h，沉淀加500μLNET缓冲液重悬，负染后电镜观察。结果O/rV-1、O/rV-2，O/rV-3病毒和亲本病毒O/rV一样，直径约为25nm、球形的口蹄疫病毒粒子(图4)。
4、拯救病毒的遗传稳定性分析
将FMDV按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察每代病毒出现95％CPE的时间。结果P4代以后三突变病毒出现95％CPE时间稳定在10-12h左右，与亲本病毒基本一致。取突变病毒的不同代细胞毒，提取总RNA后用OZ1490(+)/OZ3980(-)引物(具体序列见表2)进行RT-PCR扩增，测序验证P1蛋白的遗传稳定性。结果表明：O/rV-1病毒第4代VP293F存在，传至第8代VP293F回复为S，O/rV-2病毒第4代VP298F存在，第6代病毒98F回复为Y，O/rV-3病毒第4代93F和98F存在，第8代VP293F回复为S，98F在病毒第8代以及传至20代仍然稳定存在。
表2 OZ1490(+)/OZ3980(-)引物的核苷酸序列信息表
| 引物名称 | 核酸序列 | 序列 |
| OZ1490(+) | gacaagaccacgccgtatt | SEQIDNo.18 |
| OZ3980(-) | tgcatctggttgatggtgtc | SEQIDNo.19 |
表3 重组病毒的遗传稳定性
注：“N”表示没有氨基酸的突变。
4、重组病毒一步生长曲线
因重组病毒O/rV-1和O/rV-2分别传至第8代和第6代引入的93F和98F均发生了回复突变，故本发明只对O/rV-3进行研究。将第8代O/rV-3病毒(只含Y98F)和亲本病毒O/rV分别做10系列稀释，然后将不同稀释度病毒分别接种长满的单层BHK-21细胞(200ul/孔，6孔板)，置于37)，置于培养箱，每10min摇动一次，1h后加入2mL黄芪胶混合液(一份2×MEM，一份1.2％黄芪胶，1％血清)静止培养，48h后吸弃培养液，用PBS洗涤1～2次后，加入固定液(50％丙酮+50％甲醇)室温固定30min后结晶紫染色1h，清水冲洗后观察病毒的噬斑表型并计算每个病毒的噬斑形成单位(PFU/ML)。将第8代重组病毒和亲本病毒以2×106病毒感染量接种长满的单层BHK-21细胞(25mL培养瓶)，吸附1h后弃接种的病毒液，用MEM洗2次后，加5ml MEM培养基置于37基置于CO2培养箱继续培养。接种后4h、8h、12h、16h和20h收取样品，反复冻融3次后在BHK-21单层细胞上(96孔板)，按照常规方法测定病毒的滴度(TCID50)(实验进行2次重复)，绘制病毒的一步生长曲线。结果表明：第8代含VP298F的重组病毒O/rV-3与亲本病毒具有相似的一步生长曲线，结构蛋白VP2Y98F的突变没有明显影响O/rV-3病毒的复制(见图5)。
5、重组病毒热诱导的失活实验：
为了验证O/rV-3病毒的热稳定性，将5×105PFU/mL第8代O/rV-3和亲本病毒O/rV分别置于42℃条件下处理0、15min、30min、45min、60min、120min、180min和240min和49℃条件下处理15min，30min，45min，60min。然后收集样品并置于冰上，用如上的噬斑法检测剩余感染性病毒的百分比和重组病毒的灭活率(用斜率计算，灭活率越低表示重组病毒的热稳定性越高)。实验结果表明O/rV-3和O/rV在42℃处理4小时后的灭活率分别为0.0044、和0.0052min-1(见图6)。在49℃处理1小时后他们的灭活率分别为0.009和0.014min-1(见图7)。O/rV-3在42℃条件下处理4小时和49℃条件下处理1小时后剩余感染性病毒粒子也显著高于亲本病毒在同样条件下处理后剩余感染性的病毒粒子(见图8和图9)。这些结果表明和亲本病毒O/rV相比，含VP298F的O/rV-3病毒的热稳定性显著提高。
6、重组病毒酸诱导的失活实验
为了进一步检测O/rV-3病毒的稳定性，各取10μL(5×105PFU/mL)的第8代O/rV-3和亲本病毒O/rV与300μLPBS(pH值6.0)混合均匀，室温放置15min，30min，45min，60min后加入100μL的1M Tris溶液(pH为7.6)进行中和；然后将中和后的病毒用蚀斑法测定每个样品酸处理后的病毒失活率以及剩余感染性病毒的百分比。结果表明两病毒在pH＝6.0处理60min后，亲本病毒O/rV的失活率为0.0038min-1，O/rV-3病毒的失活率为0.0028min-1(见图10)，且O/rV-3病毒剩余感染性粒子的百分数显著高于亲本病毒剩余感染性粒子的百分数。说明和亲本病毒相比，含VP298F的O/rV-3病毒不仅具有好的耐热性，而且耐酸能力也显著提高。
实施例4
灭活疫苗的制备
1、重组病毒的增殖，灭活和纯化
100％长满的单层BHK-21细胞(分与75mL细胞瓶)，向其中加入18ml的接毒液和2ml的第8代O/rV和O/rV-3病毒液，37℃继续培养，待95％细胞出现典型的细胞病变效应时收获病毒液。收集的病毒液中以10mL/L的量加入TritonX-100，室温摇震10min，4℃6000rpm离心30min去除细胞碎片，收集的病毒上清，用5mmol BEI(Sigma公司)28℃灭活28h。灭活后的病毒抗原按照常规方法浓缩纯化。
2、疫苗配制
将浓缩纯化的灭活抗原(抗原)和佐剂配制疫苗，配方如下：“抗原/佐剂/抗原”双相佐剂型。灭活病毒液与201佐剂(法国SEPPIC)混合乳化。灭活抗原与201佐剂的体积比为46：54，振荡配制的疫苗置4～8℃保存。
3、疫苗免疫原性分析
开始实验设计时，在O/rV-3病毒VP2中同时引入了两个点突变93F和98F，但在病毒传代过程中，仅保留了98F，该位点位于口蹄疫O型病毒的5个抗原位点之外。因此推测该位点的突变不会影响病毒的抗原性。为了证实这一推测，将田间临床健康猪(口蹄疫结构蛋白抗体滴度小于1：6，3ABC抗体为阴性)8头，平均分为2组，每组4头，一组免疫2μg/mL含98F的O/rV-3病毒制备的灭活疫苗，另一组免疫2μg/mL O/rV亲本病毒制备的灭活疫苗。免疫后第7、14、21、28和35天采血，测定免疫猪产生的病毒中和抗体(VirusNeutralizingAntibodyTiter，VNT)。中和抗体测定的具体步骤如下：采集的血清56℃灭活30min后，用PBS做系列倍比稀释；然后用200TCID50的病毒分别与等体积不同稀释度的抗体混合，37℃温箱孵育1h；然后在上述抗体-病毒混合液中分别接种100μL的BHK-21细胞，每个滴度设8孔重复，于37℃5％CO2培养箱中继续培养，每日观察细胞，72h判定结果，并按Reed-Muench法计算抗体的中和滴度，即能保护50％BHK-21细胞不出现CPE的血清抗体的稀释浓度。
结果显示含VP2Y98F的O/rV-3病毒和亲本病毒O/rV制备的疫苗免疫动物后在不同时间产生的中和抗体水平相似(P>0.05)，表明VP2Y98F的突变没有影响突变病毒的抗原性(见图12)。
4、重组疫苗的保存期试验
为了研究耐热重组病毒制备疫苗的稳定性，将含VP2Y98F的O/rV-3和O/rV病毒制备的疫苗置于4℃保存1、3和6月后分别免疫10只成年的豚鼠，每只豚鼠免疫0.5μg/mL。免疫28天后采血，分离血清后用如上所述的方法测定每只动物产生的中和抗体。实验结果显示O/rV-3病毒疫苗在4℃冷藏1、3和6月后免疫豚鼠所产生的平均中和抗体均明显高于O/rV病毒疫苗免疫豚鼠所产生的抗体(P<0.01)(见图13)。表明含VP2Y98F重组病毒O/rV-3制备的疫苗稳定性显著高于亲本病毒O/rV制备疫苗的稳定性，从而使该疫苗中146S的有效抗原含量明显高于亲本病毒制备疫苗中146S的抗原含量，在机体内诱导了高的中和抗体的产生，提高了疫苗的免疫效力。综上：本发明利用基因工程技术构建的含VP2S93F和VP2Y98F的O型FMD嵌合病毒(O/rV-1和O/rV-2)在传代过程中，容易发生回复突变(第8代和第6代已回复)，不适合发展具有耐热特性的口蹄疫疫苗。推测原因可能是在结构蛋白VP2的93和98位引入单个氨基酸的突变(S93F和Y98F)容易引起病毒粒子结构的不稳定，使病毒在传代过程中容易发生回复，不适合做耐热疫苗毒株。而构建的含VP2S93F和Y98F FMD嵌合病毒(O/rV-3)虽然在传代过程中93F发生了回复，但98F仍能稳定存在，说明两个氨基酸的突变有利于病毒结构的稳定，在传代过程中不易发生回复突变。
O/rV-3病毒(含VP298F)的耐热和耐酸特性的研究结果表明含VP298F的O/rV-3的耐热性和耐酸性均显著高于亲本病毒(O/rV)；O/rV-3病毒制备的疫苗在4℃保存1、3和6月后免疫动物产生的平均中和抗体均显著高于亲本病毒免疫动物产生的中和抗体。因此本发明构建的含VP2Y98F的O/rV-3病毒适合做优质的FMD疫苗候选毒株，用于我国口蹄疫的有效防控。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种热稳定口蹄疫O型重组病毒及其制备方法和应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 1
Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr
1 5 10 15
Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val
20 25 30
Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val Ser Gly Pro Asn Thr
35 40 45
Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys Thr
50 55 60
His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe Gly Arg Cys His Met
65 70 75 80
Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr Gly Ser Leu Thr Asp
85 90 95
Ser Phe Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Thr Ala Val
100 105 110
Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu
115 120 125
Leu Cys Ser Ile Asn Lys Arg Glu Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro
130 135 140
His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Thr Val
145 150 155 160
Pro Tyr Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Val His Lys Pro
165 170 175
Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Asn Asn Glu
180 185 190
Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Asn Val
195 200 205
Tyr Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu
210 215
<210> 2
<211> 654
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 2
gacaaaaaga cagaggaaac taccctcctc gaggaccgca ttctcaccac ccgcaacgga 60
cacacgacct cgacaaccca gtcgagcgtc ggggtgacgt acgggtatgc aacagctgag 120
gacttcgtga gcgggcccaa cacctctggt cttgagacca gggttgtcca ggccgaacgg 180
ttcttcaaaa cccacttgtt cgactgggtc accagtgacc cgtttggacg gtgccacatg 240
ttggagctcc cgactgacca caaaggcgtc tacggcagcc taaccgactc gttcgcgtat 300
atgaggaacg gttgggacgt tgaagtcacc gcggtgggaa accagttcaa cggaggctgc 360
ttgttggtgg caatggtacc agagctttgt tccatcaaca agagagagct gtaccagctc 420
acacttttcc cccaccagtt cattaaccca cggacgaaca tgacggcaca catcactgtg 480
ccctacgttg gcgtcaacag gtacgaccaa tacaaggtgc ataaaccctg gacccttgtt 540
gtcatggtcg tggccccctt gacggtcaac aatgagggtg ctccgcaaat caaggtgtat 600
gccaacatcg cccccaccaa cgtttacgtt gcgggtgaat tcccttccaa ggag 654
<210> 3
<211> 654
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
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<210> 4
<211> 654
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
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<210> 5
<211> 1134
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 5
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gcaaagcaca tgtcgaacac tttcctcgcg ggtcttgccc agtattacac acagtacagc 1080
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taacaactac tacatgcagc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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gacttcgtga gcgggcccaa cacctctggt cttgagacca gggttgtcca ggccgaacgg 180
ttcttcaaaa cccacttgtt cgactgggtc accagtgacc cgtttggacg gtgccacatg 240
ttggagctcc cgactgacca caaaggcgtc tacggcagcc taaccgactc gttcgcgtat 300
atgaggaacg gttgggacgt tgaagtcacc gcggtgggaa accagttcaa cggaggctgc 360
ttgttggtgg caatggtacc agagctttgt tccatcaaca agagagagct gtaccagctc 420
acacttttcc cccaccagtt cattaaccca cggacgaaca tgacggcaca catcactgtg 480
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gtcatggtcg tggccccctt gacggtcaac aatgagggtg ctccgcaaat caaggtgtat 600
gccaacatcg cccccaccaa cgtttacgtt gcgggtgaat tcccttccaa ggag 654
<210> 12
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr
1 5 10 15
Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val
20 25 30
Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val Ser Gly Pro Asn Thr
35 40 45
Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys Thr
50 55 60
His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe Gly Arg Cys His Met
65 70 75 80
Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr Gly Phe Leu Thr Asp
85 90 95
Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Thr Ala Val
100 105 110
Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu
115 120 125
Leu Cys Ser Ile Asn Lys Arg Glu Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro
130 135 140
His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Thr Val
145 150 155 160
Pro Tyr Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Val His Lys Pro
165 170 175
Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Asn Asn Glu
180 185 190
Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Asn Val
195 200 205
Tyr Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu
210 215
<210> 15
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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65 70 75 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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210 215
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacaagacca cgccgtatt 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgcatctggt tgatggtgtc 20
Claims (8)
1.一种热稳定口蹄疫O型重组病毒，其特征在于，以O/rV病毒株为基本病毒株，包括结构蛋白VP2第98位酪氨酸突变为苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的热稳定口蹄疫O型重组病毒，其特征在于，突变后的结构蛋白VP2的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
3.根据权利要求2所述的热稳定口蹄疫O型重组病毒，其特征在于，突变后的结构蛋白VP2的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
4.权利要求1～3任意一项所述热稳定口蹄疫O型重组病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用基因合成技术合成含突变后的结构蛋白VP2第93位丝氨酸和98位酪氨酸突变均为苯丙氨酸的核苷酸序列，插入pUC质粒中，得到pUC/VP2S93F+Y98F；
所述结构蛋白VP2第93位和98位氨基酸均突变为苯丙氨酸的核苷酸序列为SEQ IDNo.5；
2)将所述pUC/VP2S93F+Y98F或pOMQ-Z123用Bam H I和Bss H II酶消化，得到含VP2突变片段或线性pOMQ-Z123；
3)将所述步骤2)得到的含VP2突变片段和线性pOMQ-Z123连接，得到pBG；
5)将所述步骤3)中的pBG或pSK-Z4用Spe I和Bgl II酶消化，回收5400bp目的片段或线性pSK-Z4；
6)将所述步骤5)中5400bp目的片段和线性pSK-Z4连接，得到pQEC；
7)将所述步骤6)中的pQEC转染至单层BSR/T7细胞，培养，收获和冻融细胞，收集病毒；
8)将步骤7)收集的病毒传代培养8代以上，得到热稳定口蹄疫O型重组病毒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中Bam H I和Bss H II酶消化的条件为37℃。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中Spe I和Bgl II酶消化的条件为37℃。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)或步骤5)中连接用酶为T4连接酶，所述连接的条件为16℃过夜连接。
8.权利要求1～3任意一项所述热稳定口蹄疫O型重组病毒或权利要求4～7任意一项所述制备方法制备的热稳定口蹄疫O型重组病毒在热稳定口蹄疫O型灭活疫苗生产中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910147243.0A CN109810954A (zh) | 2019-02-27 | 2019-02-27 | 一种热稳定口蹄疫o型重组病毒及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN201910147243.0A CN109810954A (zh) | 2019-02-27 | 2019-02-27 | 一种热稳定口蹄疫o型重组病毒及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109810954A true CN109810954A (zh) | 2019-05-28 |
Family
ID=66607668
Family Applications (1)
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2019
- 2019-02-27 CN CN201910147243.0A patent/CN109810954A/zh active Pending
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