CN111944768A - 一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中的应用 - Google Patents

一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中的应用。本发明所述的一种耐热型口蹄疫重组病毒株，命名为rM10，其是由SEQ ID NO.1所示的感染性cDNA通过病毒拯救获得的。实验证明，该重组病毒株的衣壳完全裂解的温度比野生毒株病毒的高，表明该拯救获得的口蹄疫重组病毒株rM10比野生毒株更耐热。本发明的提出为进一步推进热稳定性疫苗的研究和应用，为重大疫病防控及彻底净化提供了技术支持。同时本发明的提出为制备稳定性口蹄疫疫苗奠定了基础。

Description

一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中 的应用
技术领域
本发明涉及一种耐热型口蹄疫重组病毒株，还涉及由该病毒株制成的灭活疫苗及其应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)感染引起的猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大经济损失，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须上报的传染病之首。
口蹄疫的流行、暴发严重影响我国乃至全球畜牧养殖业发展及农畜产品的流通贸易，并造成巨大的经济损失。国家中长期动物疫病防治规划中将口蹄疫确定为首位限期免疫净化防控的病种。
目前为止，传统灭活疫苗免疫是口蹄疫防控的重要手段之一。口蹄疫病毒衣壳呈现热不稳定性，容易受温度及其他环境因素的影响。病毒的低稳定性导致其快速解离，使其免疫原性发生改变，从而降低了其作为疫苗而引起机体的免疫反应，限制其生产和应用，这也是目前商业化疫苗冷链运输和储藏的主要原因之一。但冷链运输和储藏费用在疫苗成本中占很大比重，因此，解决口蹄疫病毒及相应疫苗稳定性问题备受关注。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种耐热型口蹄疫重组病毒。
本发明的目的之二在于提供一种耐热型口蹄疫灭活疫苗及其制备方法。
本发明的目的之三在于提供所述的灭活疫苗在防治口蹄疫中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明将O型FMDV O/BY/CHA/2010细胞毒(GenBank Accession No：JN998085.1)在特定温度下灭活99.99％，将处理样品复苏至与原病毒液相似滴度后再反复多次处理，筛选出具有耐热性的病毒株(M3、M9、M10)，并进一步鉴定了与病毒衣壳热稳定性相关的关键氨基酸。结果显示，病毒经过反复热处理筛选后其完全灭活温度具有一定的提高，且筛选出的热稳定毒株的灭活百分比比野毒株低。PaSTRY试验(Particle Stability ThermalRelease Assay)进一步证实热稳定性毒株衣壳完全裂解的温度比野生(WT)毒株高。表明通过反复热处理后筛选到了具有一定耐热性的口蹄疫病毒。将野生毒株和突变毒株在37℃处理，发现突变毒株病毒滴度比野生毒株具有较慢的降解速率，其中在37℃下处理8h后突变毒株(M3、M10)与野生毒株差异最为明显。将相同滴度的野生毒株和突变毒株(M3、M10)在37℃下处理8h后用BEI进行灭活，灭活后三倍浓缩，再与等体积的ISA-206乳化后免疫豚鼠，结果显示突变毒株免疫的豚鼠相比于野生毒株免疫的豚鼠产生了更高的中和抗体及和特异性抗体，通过淋巴细胞增殖试验得知突变毒株免疫的豚鼠组淋巴细胞增殖更加明显；攻毒保护试验显示突变毒株免疫的豚鼠组相(免疫保护率：75％)比较野生毒株免疫的豚鼠组(免疫保护率：50％)具有更高的免疫保护率，进一步说明了使用筛选得到的耐热毒株作为灭活疫苗能够产生更高的免疫保护能力。为进一步确定突变位点对病毒的耐热性影响，通过反向遗传学技术构建了耐热性突变病毒株的感染性cDNA克隆，拯救出具有突变位点的突变毒株，并对拯救得到的突变毒株进行了耐热性分析，从而得到具有耐热性的突变毒株。
在上述研究的基础上，首先，本发明提出了一种耐热型口蹄疫重组病毒株，命名为rM3，所述的重组病毒株是由SEQ ID NO.1所示的感染性cDNA序列通过病毒拯救获得的。
进一步的，本发明还公开了一种获得以上所述的重组病毒株的方法，其将含有SEQID NO.1所示的感染性cDNA序列的质粒转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系中，获得拯救后的重组病毒株rM3。
其中，优选的，所述的方法包括以下步骤：
(1)目的片段扩增
根据原始病毒株的序列人工合成5'UTR的5’端596bp的片段，并在其5'端引入限制性内切酶Not I和锤头状核酶cDNA序列，3’端加入BtgZ I限制性酶切位点，将该片段命名为A片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-A，其中所述的A片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
合成丁型肝炎病毒的核酶cDNA，在其5’端引入Aar I限制型内切酶位点和32个Poly(A)，3’端加入EcoR V位点，将该片段命名为D片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-D，其中所述的D片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
通过RNA提取试剂盒提取原始病毒株的总RNA，分别用引物BR，CR，进行反转录扩增cDNA，随后再分别用引物对BF和BR扩增两端含Aar I的片段B，用引物对CF和CR扩增两端含BtgZ I的片段C，分别克隆到pMD18-T载体，分别记为pT-B、pT-C；
引物序列如下：
BF：CACCTGC CGTTTTCATGAGAAATGGGACG
BR：TTATTCACCTGCTTGGCTTCCTTGTACTTGGCCGGG
CF：GCGATGCAAGTACAAGGAAGCCAAGGAATG
CR：TGCGATGGACCATGAAGGGGATAAAGGAAACGG GAAAAGCCCT
(2)突变位点引入
按照碧云天生物技术的QuickMutationTM基因定点突变试剂盒引入突变位点。具体如下：
以质粒pT-B为模板，用引物对M737F/M737R进行PCR扩增引入突变位点A737T，PCR反应结束后，直接在PCR反应体系中加入1μl DpnI酶，混匀后37℃孵育5min，DpnI消化后取5-10μl转化DH5α感受态细胞常规方法涂板培养，挑取3-5个克隆测序，将突变位点正确质粒命名为pT-m10B；
引物序列如下：
M737F：GCT GAC CCC GTG ACT A CCA CCG TTG AGA ATT
M737R：AATTCTCAACGGTGGTAGTCACGGGGTCAGC
(3)全长cDNA的构建
用限制性内切酶Not I和BtgZ I酶切pUC-A，回收A片段；用AarI酶切pT-m10B回收m10B片段；用BtgZ I酶切pT-C，回收C片段；用Aar I和EcoR V酶切pUC-D，回收D片段，分别用琼脂糖凝胶纯化，用T4 DNA连接酶将A、m10B、C、D四个片段连接为全长感染性cDNA，并克隆至pVAX的Not I和EcoR V位点，得到含有全长感染性cDNA克隆的重组质粒命名为prM10，其中所含有的全长感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(4)将prM10质粒转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系中，获得拯救后的重组病毒株rM10。
其中，优选的，所述的原始病毒株为O型FMDV O/BY/CHA/2010株细胞毒，GenBankAccession No：JN998085.1。
更进一步的，本发明还提出了所述的耐热型口蹄疫重组病毒株在制备耐热型口蹄疫灭活疫苗中的用途。
一种耐热型口蹄疫灭活疫苗，其由本发明所述的耐热型口蹄疫重组病毒株以及佐剂组成。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明将口蹄疫病毒液反复多次热处理后，获得具有一定耐热性的突变毒株，并确定了决定耐热性的关键氨基酸位点。同时对通过反向遗传学技术构建了突变病毒株的感染性cDNA克隆，拯救出具有突变位点的突变毒株，并对拯救得到的突变毒株进行了耐热性分析，从而得到具有耐热性的突变毒株。本发明的提出为进一步推进热稳定性疫苗的研究和应用，为重大疫病防控及彻底净化提供技术支持。同时本发明为制备稳定性口蹄疫疫苗奠定了基础。
附图说明
图1为O型FMDV O/BY/CHA/2010细胞毒完全灭活温度及时间点的确定；
图2为热处理病毒复苏；
图3为升高温度热处理T1毒株复苏，A为病毒滴度曲线，B为噬斑试验结果；
图4为筛选毒株与原始毒株完全灭活温度比较；
图5为野生毒株与突变毒株37℃灭活试验；
图6为衣壳蛋白热解离试验；
图7为拯救毒株产生的CPE；
图8为rM3、rM9、rM10的间接免疫荧光结果；
图9为野生毒株、rM3、rM9、rM10衣壳蛋白热解离试验；
图10为特异性抗体水平检测，A为未进行热处理抗原产生的特异性抗体水平，B为37℃热处理8h后的抗原产生的特异性抗体水平；
图11为中和抗体水平检测，A为未进行热处理抗原产生的中和抗体水平，B为37℃热处理8h后的抗原产生的中和抗体水平；
图12为淋巴细胞增殖检测；
图13为豚鼠攻毒保护率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1耐热型口蹄疫病毒的筛选
1.病毒完全灭活的温度和时间点的确定。
用BHK-21细胞对O型FMDV O/BY/CHA/2010细胞毒(GenBank Accession No：JN998085.1)用常规方法进行传代，当细胞病变达到80％时，收取病毒液，-80℃反复冻融三次后用0.22um滤器过滤，经病毒蚀斑试验确定病毒滴度达到1.0×10-7/0.1ml，将病毒液分别于37℃、40℃、45℃、50℃、52℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃处理60min或30min，确定O/BY/CHA/2010细胞毒完全灭活的温度及时间点(图1)。结果表明O/BY/CHA/2010细胞毒在58℃处理60min或61℃处理30min后病毒滴度达到0，表明O/BY/CHA/2010细胞毒在上述两种情况下完全灭活。
2.耐热型口蹄疫病毒的筛选和纯化
将99.99％的O/BY/CHA/2010病毒完全灭活(57℃处理60min或60℃处理30min)，再将处理过的病毒液进行10倍梯度稀释(100、10-1、10-2等)。将稀释过的病毒液加入六孔板中，每孔500μl。将六孔板放置37℃，5％CO2细胞培养箱中培养1h。弃去病毒液，用无血清的DMEM洗两次，向六孔板中加入预先配置的黄芪胶溶液2ml，放置37℃，5％CO2培养箱中培养两天。两天后弃去六孔板中液体，用无血清的DMEM洗六孔板两次。用1ml枪头挑取空斑周围的细胞，置于10ml无血清的DMEM培养基中。放置-80℃反复冻融三次，用0.22um滤器过滤。然后将10ml病毒液加入已经铺好BHK-21细胞的96孔培养板中，每孔100μl。向96孔板中加入含有4％FBS的DMEM，使FBS的终浓度为2％，置于5％CO2培养箱中培养两天，用显微镜观察有单个CPE的孔挑取出来进行连续传代。待病毒滴度与初始病毒滴度接近或一致时，在相同条件下对筛选病毒进行反复处理，直至病毒液的滴度有明显的提高，该毒株命名为T1代(图2)。
为了进一步提高筛选毒株的耐热性，将T1代病毒的滴度恢复至与野生毒株滴度一致后，在59℃处理60min或62℃处理30min(热处理温度提高2℃)，同T1代病毒相同的筛选纯化方法获得T2代筛选毒株(图3A)，从病毒噬斑试验可以看出，61℃30min和58℃60min处理的原始毒株已完全灭活(图3B)。T1代筛选毒株在60℃30min和57℃60min处理后病毒达到了99.99％的灭活(图3B)。将T1毒株在59℃处理60min或62℃处理30min(热处理温度提高2℃)仍有部分病毒存活(图3B)，且处理后的病毒滴度于在57℃处理60min或60℃处理30min的病毒滴度有所提升，进一步表明该方法筛选的毒株较原始毒株有明显的耐热性。
3.单克隆毒株的测序
将T2毒株通过蚀斑试验挑取的单克隆毒株复苏后提取RNA，反转录后对P1基因测序，结果发现有三株(命名为M3、M9、M10)病毒与野生(WT)毒株相比有氨基酸位点突变，其中M3的突变位点为V342I、A737T、K807E、T898I，M9的突变位点为K769Q、A803V、D809E、Y365H，M10的突变位点为A737T。
4.热稳定毒株(M3、M9、M10)的热稳定性评估
将筛选毒株和原始毒株分别在逐渐升高温度的情况下处理30min，将热处理过的样品用蚀斑试验检测病毒滴度。结果如图4，从图中可以看出M3、M9、M10毒株的完全灭活温度比野生毒株均有一定的提高，进一步说明了筛选的毒株具有了一定的热稳定性。
在37℃条件下将野生毒株和筛选毒株分别处理2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h。样品经蚀斑试验测定滴度，发现突变毒株病毒滴度比野生毒株具有较慢的降解速率，其中在37℃下处理8h后突变毒株与野生毒株差异最为明显(图5)。
取野生毒株和筛选毒株细胞培养液各100ml，-80℃反复冻融3次，3000rpm，4℃离心10min，去细胞碎片分离上清。上清液用核酸酶处理后用0.22μm滤膜过滤，随后将样品用截留分子量为100KD的超滤浓缩管，在4℃3000rpm离心浓缩，使终体积为200μl。使用SYPROOrange蛋白探针在qPCR仪中检测病毒衣壳蛋白的裂解情况。反应体系：病毒样品4μg，SYPROOrange蛋白探针2μl。设置qPCR程序：初始温度25℃，持续1min后增加1℃直到95℃，实时检测荧光信号。从结果可以看出突变毒株的最大峰值相比野生毒株明显向右偏移，说明突变毒株的衣壳完全裂解的温度比野生毒株病毒的高，图中可以看出WT(Tm＝64℃)、M3(Tm＝68℃)、M9(Tm＝66.5℃)、M10(Tm＝68.5℃)。其中M3和M10比野生毒株的Tm有明显升高，进一步说明筛选毒株比野生毒株更稳定(图6)。
实施例2病毒拯救以及耐热性评估实验
为进一步确定突变位点对病毒衣壳稳定性的影响，通过反向遗传操作技术制备了含上述突变位点的病毒感染性cDNA，并对拯救出的病毒衣壳进行耐热性评估。
1.目的片段扩增
根据原始病毒株的序列人工合成5'UTR的5’端596bp的片段，并在其5'端引入限制性内切酶Not I和锤头状核酶cDNA序列，3’端加入BtgZ I限制性酶切位点，将该片段命名为A片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-A，其中所述的A片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
合成丁型肝炎病毒的核酶cDNA，在其5’端引入Aar I限制型内切酶位点和32个Poly(A)，3’端加入EcoR V位点，将该片段命名为D片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-D，其中所述的D片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
通过RNA提取试剂盒提取原始病毒株的总RNA，分别用引物BR，CR，进行反转录扩增cDNA，随后再分别用引物对BF和BR扩增两端含Aar I的片段B，用引物对CF和CR扩增两端含BtgZ I的片段C，分别克隆到pMD18-T载体，分别记为pT-B、pT-C；
引物序列如下：
BF：CACCTGC CGTTTTCATGAGAAATGGGACG
BR：TTATTCACCTGCTTGGCTTCCTTGTACTTGGCCGGG
CF：GCGATGCAAGTACAAGGAAGCCAAGGAATG
CR：TGCGATGGACCATGAAGGGGATAAAGGAAACGG GAAAAGCCCT
2.突变位点引入
按照碧云天生物技术的QuickMutationTM基因定点突变试剂盒引入突变位点。具体如下：
以质粒pT-B为模板，用引物对M342F/M342R、M737F/M737R、M807F/M807R和M898F/M898R进行PCR扩增引入突变位点V342I、A737T、K807E、T898I，制备突变型质粒pT-m3B；用引物对M365F/M365R、M769F/M769R、M803F/M803R、M809F/M809R进行PCR扩增引入突变位点Y365H、K769Q、A803V、D809E，制备突变型质粒pT-m9B；用引物对M737F/M737R进行PCR扩增引入突变位点A737T，制备突变型质粒pT-m10B；PCR反应结束后，直接在PCR反应体系中加入1μl DpnI酶，混匀后37℃孵育5min。DpnI消化后取5-10μl转化DH5α感受态细胞常规方法涂板培养，挑取3-5个克隆测序，以确认突变位点是否正确。
引物序列如下：
M342F：CTT GAG ACC AGA GTT A TCC AGG CGG AAC GGT
M342R：ACC GTT CCG CCT GGA T AAC TCT GGT CTC AAG
M737F：GCT GAC CCC GTG ACT A CCA CCG TTG AGA ATT
M737R：AATTCTCAACGGTGGTAGTCACGGGGTCAGC
M807F：GTG GCA GTG AAA CAC A AGG GGG ACC TTA CCT
M807R：AGGTAAGGTCCCCCTTGTGTTTCACTGCCAC
M898F：AAG CCA CTC GGG TGA T AGA ACT GCT GTA CCG
M898R：CGGTACAGCAGTTCTATCACCCGAGTGGCTT
M365F：ATCCGTTCGGACGGTGCCACTTGTTGGAGCTCC
M365R：GGAGCTCCAACAAGTGGCACCGTCCGAACGGAT
M769F：GTGAAAGTCACACCACAAGACTCAATAAATGTATTGGACC
M769R：GGTCCAATACATTTATTGAGTCTTGTGGTGTGACTTTCAC
M803F：CTGATCTAGAGGTGGTAGTGAAACACGAGGGGGA
M803R：TCCCCCTCGTGTTTCACTACCACCTCTAGATCAG
M809F：GAAACACGAGGGGGAGCTTACCTGGGTGCCA
M809R：TGGCACCCAGGTAAGCTCCCCCTCGTGTTTC
3.全长cDNA的构建
用限制性内切酶Not I和BtgZ I酶切pUC-A，回收A片段；用AarI酶切pT-B、pT-m3B、pT-m9B、pT-m10B回收B、m3B、m9B、m10B片段；用BtgZ I酶切pT-C，回收C片段；用Aar I和EcoRV酶切pUC-D，回收D片段，分别用琼脂糖凝胶纯化，用T4 DNA连接酶将A、B或m3B或m9B或m10B、C、D四个片段连接为全长感染性cDNA，并克隆至pVAX的Not I和EcoR V位点，所的含全长感染性cDNA克隆的重组质粒分别命名为prWT，prM3，prM9，prM10。其中prM10感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.重组病毒的拯救
将上述质粒分别转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系中，观察是否产生细胞病变效应(CPE)，若无CPE则进行盲传，将突变病毒M3、M9、M10的RNA拯救获得的病毒分别记为rM3,rM9,rM10。结果显示毒株rM3,rM9,rM10均观察到CPE(图7)。
为进一步确证拯救病毒的特异性，进行了间接免疫荧光(IFA)试验。所用一抗为O型FMDV兔抗血清，二抗为FITC标记的山羊抗兔抗体，细胞核用DAPI染色。结果显示拯救的病毒感染BHK-21细胞后能够和兔抗FMDV抗体产生特异性反应，拯救的病毒反应原性良好(图8)。
为了确证拯救病毒是遗传稳定性，对rM3、rM9、rM10连续传10代，并进行测序，结果显示突变位点稳定存在。
为进一步确验证拯救病毒的耐热性能，用PaSTRy法对野生毒株、rM3、rM9、rM10进行了热稳定性评估。结果显示突变毒株的最大峰值相比野生毒株明显向右偏移，说明突变毒株的衣壳完全裂解的温度比野生毒株病毒的高，图中可以看出野生毒株(Tm＝64℃)、rM3(Tm＝67℃)、rM9(Tm＝65℃)、rM10(Tm＝67℃)，其中rM3和rM10与野生毒株的Tm有明显升高(图9)，表明拯救的rM3、rM9、rM10比野生毒株更耐热，同时rM3、rM9、rM10的氨基酸突变位点影响FMDV的热稳定性。
5.动物试验
将相同滴度(107TCID50/0.1ml)的野生毒株和突变毒株(rM3、rM10)在37℃下处理8小时后用BEI灭活，灭活后三倍浓缩，再与等体积的ISA-206乳化后免疫豚鼠，同时设未热处理对照。免疫当天记作d 0。分别在d 0、d 7、d 14、d 21、d 28采集豚鼠血液，按常规方法检测中和抗体、特异性抗体、淋巴细胞增殖情况，d 28对试验动物进行攻毒，观察疫苗的免疫保护率。
免疫动物免疫后均产生了高水平的特异性抗体和中和抗体，没有进行热处理的抗原诱导产生的抗体水平没有明显的差异(图10A和图11A)，37℃热处理8h的抗原诱导产生的抗体水平与未处理的抗原相比有所降低(图10B和图11B)，但rM3 8h和rM10 8h的抗体水平比WT 8h明显高。说明了37℃热处理的抗原含量有所下降，最终导致产生的抗体水平有所降低，同时rM3和rM10在经过37℃热处理8h后的抗原含量比WT高，进一步说明了rM3和rM10比WT更耐热。
分离免疫豚鼠脾淋巴细胞后，通过MTS试剂盒检测脾淋巴细胞增值情况，用灭活的FMDV抗原和ConA刺激，rM3和rM10实验组比WT组的增值指数高(图12)，进一步说明了rM3和rM10比WT更耐热。
通过对免疫的各组实验动物攻毒检测抗原的免疫保护效率发现，阴性对照组保护率为0；未进行热处理的抗原组即WT 0h、rM3 0h、rM10 0h保护率均能达到100％；而37℃热处理8h的突变毒株组rM3 8h和rM10 8h组保护率为75％；37℃热处理8h的WT组的保护率为50％，说明各毒株在在37℃处理8h处理后免疫保护效应会有相应的降低，同时rM3 8h和rM10 8h的免疫保护效率比WT 8h的高(图13)，也表明了rM3和rM10比WT更耐热。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中的应用
<160>3
<170>Patent-In 3.5
<210>1
<211> 8237
<212>DNA
<213>Foot-and-mouth disease virus
<400>1
ttgaaaaggg gcgctagggt ttcaccccta acatgccaac gacagctcct gcgttgcact 60
ccacacttac gtctgtgcgc gcgcgggaac cgatggactt tcgttcaccc acctgcagcc 120
ggactcacgg caccgcgtgg ccattttagc tggactgagc ggacgaacgt cgcttgcgca 180
cctcgcgtga tcgactagta ctcttaacac tccgcctatt tggtcgttag cgctgtcctg 240
ggcactcctg ctgggggccg ttcgacgctc tacggtctcc cccccccgcg acaaactacg 300
gtgatggggc cgcttcgtgc gagccgatcg cctggtgtgt ttcggttgtc actcgaagcc 360
cgcctttcac cccccccccc cccccccccc ccccccccct aaagtactac cgtcgctccc 420
gacgttaaag ggaggtaacc acaagatttg cgccttcttg tccgaagtta gagggctgta 480
accgcaaact ttgaaccgcc tttcccggcg ttaacgggat gtaatcacaa gatggacctt 540
catccggaag taaaacggca acttacacag tttttgcccg ttttcacgag aaatgggacg 600
tcagcgcacg aaacgcgcag tcgcttgagg aggacttgta caaacacgac tcacacaggt 660
tcccacaact gacacaaaac gtgcaacttg aaatcccgcc tggtctttcc aggtctagag 720
gggtgacact ttgtactgtg attgactcca cgctcggccc actggcgagt gttagtagta 780
gtactgttgc ttcgtagcgg agcatggtgg ccgtgggact ccctccttgg taacaaggac 840
ccacggggcc gaaagccacg tctcaggacc caccatgtgt gcaaccccag cacggcaact 900
ttaccacgaa aaccacttta aggtgacact gaaactggta ctcaaccact agtgacaggc 960
taaggatgcc cttcaggtac cccgaggtaa cacgcgacac tcaggatctg agaaggggat 1020
tggggcttct gtaaaagcgc ccagtttaaa aagcttctat gcctgaatag gcgaccggag 1080
gccggcgcct ttccttaact atcactgcta acatgaacac agctggttgt tttatcgctt 1140
tgttgtacgc catcagagag ataaaaacac gactgttttc aacgacacag gaagaaatgg 1200
aattcacact ttacaacggt gagaagaaga tcttctactc caggcccaac aaccacgaca 1260
actgttggct gaacgccatc cttcagctgt tcaggtacgt cgatgaacct ttcttcgact 1320
gggtatatga atcacctgaa aacctcaccc ttgaggcgat cagacaactg gagaacatta 1380
ctggttttga gctgcacgag ggtggcccgc ccgccctcgt catttggaac atcaaacact 1440
tgctccacac cgggatcggc accgcctcgc gacccagcga ggtgtgcatg gtggacggca 1500
cggacatgtg cctggctgac ttccacgctg gcatcttcct gaaaggacag gaacacgccg 1560
tgtttgcctg cgtcacctcc aacgggtggt acgcgatcga cgacgaagaa ttctacccct 1620
ggacgccaga tccgtccgac gtgctggtct ttgtcccgta cgatcaagaa ccacttaatg 1680
gggaatggaa agcaagggtt cagagacggc tcaagggagc cggacaatcc agtccggcta 1740
ctgggtcaca gaaccaatca ggcaacaccg ggagtatcat caacaattac tacatgcagc 1800
agtaccagaa ctccatggac acccaacttg gtgacaatgc tatcagcgga ggctccaacg 1860
agggatccac agacacaacc tccacccaca caaccaacac tcagaacaat gactggtttt 1920
caaagttggc cagctctgcc ttcagcggtc ttttcggcgc cctcctcgcc gataagaaaa 1980
ccgaggagac cactcttctc gaggaccgca tcctcaccac ccgaaacgga cacaccacct 2040
cgacaaccca gtcgagtgtt ggcataacgc acgggtacgc aacagctgag gattttgtga 2100
acgggccaaa cacctctggt cttgagacca gagttgtcca ggcggaacgg ttctttaaaa 2160
cccacctgtt cgactgggtc accagtgatc cgttcggacg gtgctacttg ttggagctcc 2220
cgactgacca caaaggtgtc tacggcagcc tgaccgactc atacgcctac atgagaaacg 2280
gttgggatgt tgaggtcacc gctgtgggga atcagttcaa cggaggctgc ctactggtgg 2340
ccatggtgcc tgaactttgt tccatcgagc ggagagagct gttccagctt acgctcttcc 2400
cccaccagtt catcaacccc cggacgaaca tgacagccca catcaaggtg ccctttgttg 2460
gcgtcaaccg ttacgatcag tacaaggtac acaagccgtg gacccttgtg gttatggtcg 2520
tagccccact gactgtcaac accgaaggcg ctccgcagat caaggtgtat gccaacatcg 2580
cacccaccaa cgtgcacgtc gcgggtgagt tcccttccaa agaggggatt ttccctgtgg 2640
cctgtagcga cggttatggc ggcttggtga caactgaccc aaagacggct gaccccgttt 2700
acggcaaagt gttcaacccc ccccgcaaca tgttgccggg gcggttcacc aacctcctgg 2760
acgtggctga ggcttgcccc acgtttctgc acttcgatgg tgacgtaccg tatgtgacca 2820
ctaagacgga ttcggacagg gtgctcgcac aatttgactt gtctttggca gcaaaacaca 2880
tgtcaaacac cttccttgca ggtcttgccc agtactacac gcagtacagc ggcaccgtca 2940
acctgcactt catgttcaca ggtcccactg acgcgaaagc gcgttacatg attgcgtatg 3000
cccctccggg catggagccg cccaaaacac ctgaggctgc tgctcactgc attcacgcag 3060
agtgggacac gggtctgaac tcaaagttta ccttttccat cccctacctc tcggcggctg 3120
attacgcgta caccgcgtct gacgctgctg agaccacaaa tgttcaggga tgggtctgct 3180
tatttcaaat aacacacggg aaagctgagg gtgacgctct tgtcgtgctg gccagtgctg 3240
gcaaagactt tgagctgcgc ctgcctgtgg acgctcggca acagaccact tcgacgggcg 3300
agtcggctga ccccgtgact accaccgttg agaattacgg tggcgagaca caggtccaga 3360
ggcgccacca cacagacgtc tcattcatat tggacagatt tgtgaaagtc acaccaaaag 3420
actcaataaa tgtattggac ctgatgcaga ccccctccca caccctagta ggggcgctcc 3480
tccgcactgc cacttactat ttcgctgatc tagaggtggc agtgaaacac gagggggacc 3540
ttacctgggt gccaaatgga gcacctgaag cagccttgga caacaccacc aacccaacgg 3600
cgtaccataa ggcgccgctt actcggcttg cattgcccta cacggcacca caccgtgttt 3660
tggccaccgt ttacaacggg aactgcaaat acgccggggg ctcactgccc aacgtgagag 3720
gcgatctcca agtgctggct cagaaggcag cgaggccgct gcctacttct ttcaactacg 3780
gtgccatcaa agccactcgg gtgacagaac tgctgtaccg catgaagagg gccgagacgt 3840
actgtcctcg gcccctcttg gctgttcacc cgagtgcggc cagacacaaa cagaaaatag 3900
tggcgcctgt aaagcagtcc ttgaactttg atctgctcaa gttggcaggg gacgtggagt 3960
ccaaccctgg gcccttcttc ttctctgacg tcaggtcaaa cttcaccaaa ctggtggaaa 4020
ccatcaacca gatgcaagag gacatgtcaa caaaacacgg acccgacttt aaccggttgg 4080
tatcagcgtt tgaggaattg gccgctgggg tgaaagccat caggaccggc ctcgacgagg 4140
ccaaaccctg gtacaagctc atcaagctcc tgagccgctt gtcatgcatg gccgctgtag 4200
cagcacggtc caaggaccca gtccttgtgg ctatcatgct ggctgacacc ggtcttgaga 4260
ttctggacag cacatttgtc gtgcagaaaa tctccgactc cctctccagt ctctttcacg 4320
tgccggcccc cgtcttcagt ttcggagctc cgattctgct agccgggttg gtcaaggtcg 4380
cctcgagctt cttccggtcc acacccgagg atctcgagag agcagagaaa cagctcaaag 4440
cacgtgacat caatgacatc ttcgccattc tcaagaacgg cgagtggctg gtcaagttga 4500
tcctagccat ccgcgactgg attaaagcat ggatcgcctc agaagagaag tttgtcacca 4560
tgacagactt ggtgcctggc atccttgaaa agcagcggga cctcaacgac ccggccaagt 4620
acaaggaagc caaggaatgg ctcgacaacg cgcgccaaac gtgtttgaag agcgggaacg 4680
tccacattgc caacctgtgc aaagtggtcg ccccagcacc gagcaagtcg agacctgaac 4740
ccgtggtcgt gtgcctccgc ggcaaatccg gtcagggtaa gagtttcctt gcgaacgtgc 4800
tggcacaagc catctctacc cactttaccg gcaggactga ctcagtttgg tactgtccgc 4860
cagaccctga ccacttcgac ggttacaacc agcagaccgt tgttgtgatg gatgatttgg 4920
gccagaatcc cgacggcaag gacttcaagt acttcgccca gatggtctcg accacggggt 4980
tcatcccgcc catggcttca cttgaggaca aaggcaagcc tttcaacagc aaagtcatca 5040
ttgccaccac caacctgtac tcgggcttca ccccgagaac catggtgtgc cccgatgcgc 5100
tgaaccgaag gtttcacttt gacattgacg tgagtgccaa ggacgggtac aaaattaaca 5160
acaaattgga cataaccaaa gctctcgagg acacccacgc caaccctgtg gcaatgttcc 5220
aatacgactg tgcccttctc aacggcatgg ccgttgaaat gaagagaatg caacaagaca 5280
tgttcaaacc ccagccgcct ctgcagaaca tataccaact tgtgcaagag gtgattgacc 5340
gggtcgagct ccacgagaaa gtgtcgagcc acccgatttt caagcagatc tcaattcctt 5400
cccaaaagtc agtgctgtat ttcctcattg agaaaggcca acacgaagca gcaattgaat 5460
tctttgaggg gatggtccat gactccatca aggaagagct ccgacccctc atccaacaga 5520
catcatttgt caagcgcgcc ttcaagcgcc tgaaggaaaa ctttgagatt gttgccctat 5580
gtttgactct catggcaaac atagtgatca tgatccgcga gactcgcaag agacagcaga 5640
tggtggatga tgcagtgaat gagtacatcg agaaagcaaa cgtcaccaca gatgacaaga 5700
ctcttgacga ggcggaaaag aaccctctag agactagcgg tgccagcact gttggtttca 5760
gagagagaac tctcccggga cacaaggtgg gtgatgacgt gaactccgag cccgcccacc 5820
ccggggatga gcaaccacaa gctgaaggac cctacgccgg accactcgag cgccagagac 5880
ctctgaaagt gagagccaag ctgccacagc aggagggacc ttacgccggt ccgatggaga 5940
gacagaaacc actgaaagtg aaagcgaaag ccccggtcgt gaaggaagga ccttacgagg 6000
gaccggtgaa gaagcctgtc gctttgaaag tgaaagctaa gaacttgatc gtcactgaga 6060
gtggtgctcc cccgaccgac ttgcaaaaga tggtcatggg taacaccaag cccgttgagc 6120
tcatactcga cgggaagaca gtagccatct gctgtgctac tggagtattt ggcactgcct 6180
acctcgtgcc tcgtcatctt ttcgctgaga agtacgacaa gatcatgttg gacggtagaa 6240
ccatgacaga cagtgactac agagtgtttg agtttgagat taaagtaaaa ggacaggaca 6300
tgctctcaga cgctgcgctc atggtgctgc accgtgggaa ccgcgtgaga gacatcacga 6360
aacactttcg tgacacagca agaatgaaga aaggcacccc cgtcgttggt gtgatcaaca 6420
acgctgacgt cgggagactg attttctcag gtgaggccct cacctacaag gacattgtag 6480
tgtgcatgga tggagacacc atgccgggcc tatttgccta caaagccgcc accaaggctg 6540
gctactgcgg gggagccgtc cttgctaagg atggagccga cacattcatc gttggcactc 6600
actctgcagg tggcaatgga gttgggtact gctcatgcgt atccagatcc atgctccaaa 6660
aaatgaaggc acacatcgac cctgaaccac accacgaggg gttgatcgtt gacaccagag 6720
atgtggaaga gcgcgtgcac gtcatgcgca aaaccaagct tgcacctacc gtggcacacg 6780
gtgtgttcaa ccctgagtac ggccccgctg ccttgtccaa caaggacccg cggctgaatg 6840
agggagttgt cctcgatgag gtcatcttct ccaaacacaa gggggacaca aagatgtcac 6900
cggaagacaa agcgctgttc cgccgctgcg ctgccgacta cgcgtcgcgt cttcacagcg 6960
tgctgggtac agcaaatgcc ccattgagca tctacgaggc cattaaaggc gttgacggac 7020
tcgacgccat ggaaccagac acagcgcctg gccttccctg ggcactccag gggaaacgcc 7080
gcggcgcgct gattgacttc gagaacggca ctgtcggacc cgaagtccag gctgccttgg 7140
agctcatgga gaaaagagaa tacaagtttg cctgtcagac cttcctgaag gacgaaattc 7200
gcccgatgga aaaagtacgt gccggcaaga cgcgcatcgt cgatgttttg cctgttgaac 7260
acattcttta caccaggatg atgattggca gattttgtgc tcaaatgcac tcaaacaacg 7320
gaccacaaat tggatcagcg gtcggttgta atcctgatgt tgattggcaa agatttggca 7380
cacacttcgc ccaatacaga aacgtgtggg atgtggacta ttcggccttt gatgctaacc 7440
actgtagtga tgcaatgaac atcatgtttg aggaggtgtt tcgcacagac tttggtttcc 7500
acccgaatgc tgagtggatt ctgaagaccc tcgtgaacac ggaacacgcc tatgagaaca 7560
aacgcattac agttgaaggt ggaatgccgt ccggctgttc cgcaaccagc atcatcaaca 7620
caattctgaa caacatctac gtgctctacg cgctgcgtag acactatgag ggagttgagc 7680
tggacactta caccatgatc tcctacggag acgacatcgt ggttgctagt gattatgact 7740
tggactttga ggctctcaag ccccacttta aatctcttgg tcaaaccatt actccagctg 7800
acaaaagcga caaaggtttt gttcttggtc actccattac cgatgtcact ttcctcaaaa 7860
gacacttcca catggattat ggaactgggt tttacaaacc tgtgatggct tcgaagaccc 7920
tcgaggctat cctctccttt gcacgccgtg ggaccataca ggagaagttg atctccgtgg 7980
cagggctcgc cgtccactct ggacctgacg agtaccggcg tctcttcgag cccttccagg 8040
gtctctttga gattccaagc tacagatcac tttacctgcg ttgggtgaac gccgtgtgcg 8100
gtgacgcata atctctcaga tgtcacaatt ggcagaaaga ctctgaggcg agcgacgccg 8160
taagggtgaa aagcctgaaa gggcttttcc cgtttccttt atcccaaaaa aaaaaaaaaa 8220
aaaaaaaaaa aaaaaaa 8237
<210> 2
<211> 658
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
gcggccgcgt ctctctgatg aggccgaaag gccgaaaacc cggtatcccg ggttcattga 60
aaaggggcgc tagggtttca cccctaacat gccaacgaca gctcctgcgt tgcactccac 120
acttacgtct gtgcgcgcgc gggaaccgat ggactttcgt tcacccacct gcagccggac 180
tcacggcacc gcgtggccat tttagctgga ctgagcggac gaacgtcgct tgcgcacctc 240
gcgtgatcga ctagtactct taacactccg cctatttggt cgttagcgct gtcctgggca 300
ctcctgctgg gggccgttcg acgctctacg gtctcccccc cccgcgacaa actacggtga 360
tggggccgct tcgtgcgagc cgatcgcctg gtgtgtttcg gttgtcactc gaagcccgcc 420
tttcaccccc cccccccccc cccccccccc ccccctaaag tactaccgtc gctcccgacg 480
ttaaagggag gtaaccacaa gatttgcgcc ttcttgtccg aagttagagg gctgtaaccg 540
caaactttga accgcctttc ccggcgttaa cgggatgtaa tcacaagatg gaccttcatc 600
cggaagtaaa acggcaactt acacagtttt tgcccgtttt cacgagaaat ggcatcgc 658
<210>3
<211>138
<212>DNA
<213> artificial sequence
<400>3
cacctgcttt atcccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatgg ccggcatggt 60
cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca acattccgag gggaccgtcc cctcggtaat 120
ggcgaatggg acgatatc 138

Claims (6)

1.一种耐热型口蹄疫重组病毒株，命名为rM10，其特征在于，所述的重组病毒株是由SEQ ID NO.1所示的感染性cDNA通过病毒拯救获得的。
2.一种获得权利要求1所述的重组病毒株的方法，其特征在于是将含有SEQ ID NO.1所示的感染性cDNA的质粒转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系中，获得拯救后的重组病毒株rM10。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)目的片段扩增
根据原始病毒株的序列人工合成5'UTR的5’端596bp的片段，并在其5'端引入限制性内切酶Not I和锤头状核酶cDNA序列，3’端加入BtgZ I限制性酶切位点，将该片段命名为A片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-A，其中所述的A片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
合成丁型肝炎病毒的核酶cDNA，在其5’端引入Aar I限制型内切酶位点和32个Poly(A)，3’端加入EcoR V位点，将该片段命名为D片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-D，其中所述的D片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
通过RNA提取试剂盒提取原始病毒株的总RNA，分别用引物BR，CR，进行反转录扩增cDNA，随后再分别用引物对BF和BR扩增两端含AarI的片段B，用引物对CF和CR扩增两端含BtgZ I的片段C，分别克隆到pMD18-T载体，分别记为pT-B、pT-C；
引物序列如下：
BF：CACCTGC CGTTTTCATGAGAAATGGGACG
BR：TTATTCACCTGCTTGGCTTCCTTGTACTTGGCCGGG
CF：GCGATGCAAGTACAAGGAAGCCAAGGAATG
CR：TGCGATGGACCATGAAGGGGATAAAGGAAACGG GAAAAGCCCT
(2)突变位点引入
按照碧云天生物技术的QuickMutationTM基因定点突变试剂盒引入突变位点，具体如下：
以质粒pT-B为模板，用引物对M737F/M737R进行PCR扩增引入突变位点A737T，PCR反应结束后，直接在PCR反应体系中加入1μl DpnI酶，混匀后37℃孵育5min，DpnI消化后取5-10μl转化DH5α感受态细胞常规方法涂板培养，挑取3-5个克隆测序，将突变位点正确质粒命名为pT-m10B；
引物序列如下：
M737F：GCT GAC CCC GTG ACT A CCA CCG TTG AGA ATT
M737R：AATTCTCAACGGTGGTAGTCACGGGGTCAGC
(3)全长cDNA的构建
用限制性内切酶Not I和BtgZ I酶切pUC-A，回收A片段；用AarI酶切pT-m10B回收m10B片段；用BtgZ I酶切pT-C，回收C片段；用Aar I和EcoR V酶切pUC-D，回收D片段，分别用琼脂糖凝胶纯化，用T4 DNA连接酶将A、m10B、C、D四个片段连接为全长感染性cDNA，并克隆至pVAX的Not I和EcoR V位点，得到含有全长感染性cDNA克隆的重组质粒命名为prM10，其中所含有的全长感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(4)将prM10质粒转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系中，获得拯救后的重组病毒株rM10。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的原始病毒株为O型FMDV O/BY/CHA/2010株细胞毒，GenBank Accession No：JN998085.1。
5.权利要求1所述的耐热型口蹄疫重组病毒株在制备耐热型口蹄疫灭活疫苗中的用途。
6.一种耐热型口蹄疫灭活疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的耐热型口蹄疫重组病毒株以及佐剂组成。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103160473A (zh) * 2011-12-13 2013-06-19 北京微谷生物医药有限公司 用于拯救麻疹病毒的组合物、试剂盒、用途及方法
CN103266091A (zh) * 2012-07-30 2013-08-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用
WO2014036735A1 (zh) * 2012-09-10 2014-03-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 鸭病毒性肠炎病毒疫苗株作为表达载体在制备预防鸡形目禽类疾病的重组病毒疫苗中的应用
CN109321535A (zh) * 2018-10-24 2019-02-12 扬州大学 一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株
CN109810954A (zh) * 2019-02-27 2019-05-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种热稳定口蹄疫o型重组病毒及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103160473A (zh) * 2011-12-13 2013-06-19 北京微谷生物医药有限公司 用于拯救麻疹病毒的组合物、试剂盒、用途及方法
CN103266091A (zh) * 2012-07-30 2013-08-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用
WO2014036735A1 (zh) * 2012-09-10 2014-03-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 鸭病毒性肠炎病毒疫苗株作为表达载体在制备预防鸡形目禽类疾病的重组病毒疫苗中的应用
CN109321535A (zh) * 2018-10-24 2019-02-12 扬州大学 一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株
CN109810954A (zh) * 2019-02-27 2019-05-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种热稳定口蹄疫o型重组病毒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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关洪鑫等: "稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞系的建立", 《中国兽医科学》 *

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