CN113832091A - 一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌、其构建方法及应用 - Google Patents
一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌、其构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌、其构建方法及应用，其基因组中含有苏云金芽孢杆菌携带的天然Bt基因，以及通过同源重组整合在苏云金芽孢杆菌基因组中的外源CpTI基因，外源CpTI基因源于经过密码子优化的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI。本发明获得的苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Bt1.25‑CpTI，于2021年09月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61954。本发明的苏云金芽孢杆菌工程菌菌株中，Bt基因和CpTI基因协同表达，杀虫及抗虫效果均得到增强，有效拓宽生物农药的杀虫谱，能避免或延缓害虫耐受性的产生，提高生物农药防治害虫效果。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌、其构建方法及应用。
背景技术
Bt蛋白是由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)表达生成的晶体蛋白(crystal protein，简称Cry蛋白或Bt蛋白)。当Bt蛋白被目标昆虫取食后，在昆虫中肠的碱性环境中Bt蛋白会被降解为具有毒性的活性肽，并与昆虫中肠道上皮纹缘膜细胞上的特异受体相结合，引起细胞膜穿孔，破坏细胞渗透平衡，最终导致昆虫停止取食而死亡。
尽管Bt杀虫剂已成为世界上应用最广泛的微生物杀虫剂，但是其存在杀虫谱较窄和害虫易产生抗性的弊端，从而限制了Bt杀虫剂更广泛的应用。
表达Bt蛋白的苏云金芽孢杆菌是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物绿色农药，占据生物农药90％以上的市场份额，广泛用来防治各种农林害虫，因此，苏云金芽孢杆菌生物农药的研发引起了国内外的广泛关注。
然而，天然野生苏云金芽孢杆菌株往往存在杀虫谱窄、对多种害虫复合发生的控制效果较差、毒力低，对高龄害虫无效或持效期短，大面积单一制剂的反复应用会导致昆虫产生抗性等问题。
CPTI是一种植源性的抗虫蛋白，它可与昆虫消化道内的蛋白酶相互作用，形成酶-抑制剂复合物(Enzyme-Inhibitor，简称EI)，抑制了蛋白酶的消化活性；同时， EI复合物通过神经系统的反馈抑制，使昆虫产生厌食反应。
CPTI蛋白可能通过消化道进入昆虫的血淋巴系统，严重干扰昆虫的褪皮过程，最终造成昆虫的发育不良直至死亡。抗虫谱检测表明，CPTI蛋白几乎对所有测试的主要农业害虫都有抑制作用，包括大部分的鳞翅目害虫和部分鞘翅目害虫，抗虫谱极广。由于CPTI蛋白直接作用于昆虫的消化酶，具有不易产生抗药性的特点，因此它已成为目前除Bt蛋白外使用最为广泛的杀虫蛋白。
随着对苏云金芽孢杆菌分子生物学和分子遗传学的深入研究，构建具有优良性能的重组菌株成为国内外微生物农药发展的重要研究方向，目前国内外尚未见能同时表达Bt和CPTI双价杀虫蛋白的Bt重组菌株的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌、其应用及构建方法，该菌株基因组中含有天然Bt基因及通过同源重组整合在基因组的外源 CpTI基因，不含抗生素选择标记基因，Bt基因和CPTI基因协同表达，杀虫及抗虫效果均得到增强，有效拓宽生物农药的杀虫谱，能避免或延缓害虫耐受性的产生，提高生物农药防治害虫效果。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其基因组中含有苏云金芽孢杆菌携带的天然Bt基因，以及通过同源重组整合在所述苏云金芽孢杆菌基因组中的外源CpTI基因。
进一步，所述外源CpTI基因源于按照苏云金芽孢杆菌的密码子使用偏好经过密码子优化的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI。
优选地，所述外源CpTI基因通过温敏重组质粒同源重组整合至原始苏云金芽孢杆菌基因组中。
又，所述温敏重组质粒为携带人工合成外源CpTI基因整合片段的温度敏感型重组质粒，所述外源CpTI基因整合片段包括：人工合成的含有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)pLA强启动子、经过密码子优化的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI、苏云金芽孢杆菌T7终止子。
所述苏云金芽孢杆菌工程菌不含抗生素选择标记基因。
进一步，所述外源CpTI基因整合在苏云金芽孢杆菌基因组中的转座子基因IS231C位点上。
优选地，所述苏云金芽孢杆菌工程菌为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensisBt1.25-CpTI，分类学名称为Bacillus thuringiensis，于2021年09月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号5楼，保藏编号为GDMCC No：61954。
一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)按照苏云金芽孢杆菌的密码子使用偏好性，对豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI进行密码子优化；
2)合成CpTI基因整合片段，其包括苏云金芽孢杆菌基因组整合位点转座子IS231C基因的上游同源臂序列、密码子优化后的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)pLA强启动子、T7终止子和苏云金芽孢杆菌基因组整合位点转座子IS231C基因的下游同源臂序列，并根据基因克隆需要，加入限制性内切酶位点；
3)将步骤2)得到的CpTI基因整合片段插入温敏重组质粒的限制性内切酶位点之间，得到携带CpTI基因的重组表达质粒；
4)将步骤3)得到的重组表达质粒转化到甲基化缺陷的大肠杆菌感受态细胞中，提取重组质粒；
5)将步骤4)提取所得重组质粒电转化到对鳞翅目或鞘翅目害虫高毒力野生Bt 菌株感受态细胞中，筛选阳性转化子；
6)挑选步骤5)中筛选得到的阳性转化子，于37-43℃培养以去除温敏重组质粒，筛选后得到去除红霉素抗性基因的重组表达工程菌株Bt-CpTI。
优选地，步骤2)中，经过密码子优化后的CpTI基因具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述地衣芽孢杆菌pLA强启动子的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
又，步骤2)中，所述上游同源臂序列的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游同源臂序列的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述T7终止子的具体核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
进一步，所述CpTI基因整合片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
又，步骤3)中，所述温敏重组质粒为pMAD质粒，获得的携带CpTI基因的重组表达质粒为pMAD-CpTI，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供所述双价杀虫苏云金芽孢杆菌工程菌在生物农药中的应用。
一种包含所述双价杀虫苏云金芽孢杆菌工程菌的组合物。
优选地，所述组合物为生物农药制剂。
本发明中，将外源CpTI基因转入Bt菌基因组中，构建高效、广谱的重组杀虫蛋白和重组Bt工程菌株，其中的天然Bt基因为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 基因组中编码杀虫晶体蛋白的基因，表达Cry蛋白，对鳞翅目害虫有具有强烈毒杀作用；CpTI是一种天然的对人畜无害的蛋白酶抑制剂，其抗杀虫范围广，对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎所有农业害虫都有杀伤作用，由于该抑制剂作用于害虫体内胰蛋白酶的活性中心，而酶的活性中心在进化上是高度保守的，因此，可排除害虫通过突变对CpTI基因产生耐受性的可能，这种与Bt杀虫蛋白杀虫机理不同的杀虫基因CpTI 与Bt杀虫基因在植物中的同时表达，从理论上不仅可以扩大杀虫谱，提高杀虫效果，而且可大幅度减缓棉虫对转基因植物产生抗性的速度。
本发明中，对豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI进行密码子优化，密码子优化是基于苏云金芽孢杆菌的密码子使用偏好进行的，选用地衣芽孢杆菌的PLA启动子，将外源的CpTI基因整合到Bt菌染色体中，向苏云金芽孢杆菌中转入CpTI基因后， Bt杀虫基因和CpTI基因具有协同表达增强作用，可以扩大苏云金芽孢杆菌的杀虫谱，提高杀虫活性。
本发明中，利用转座子将外源的CpTI基因整合到Bt菌染色体中，解决外源基因容易丢失的问题，外源CpTI基因整合在苏云金芽孢杆菌基因组中的转座子基因 IS231C位点上，该序列在基因组中有17个拷贝，可以提高外源的CpTI基因表达强度，更有利于构建杀虫毒力强，杀虫范围广，害虫不易产生抗性的重组工程菌，避免或延缓害虫耐受性的产生。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用不同类型杀虫蛋白之间的增效作用，将豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI同源重组至苏云金芽孢杆菌中，使Bt杀虫基因和CpTI基因在苏云金芽孢杆菌中协同表达，创制了可以同时表达Bt和CPTI的双价杀虫蛋白苏云金芽孢杆菌工程菌，达到Bt生物农药粉剂的国家标准。
本发明中，Bt杀虫基因和CpTI基因具有协同表达增强作用，杀虫及抗虫效果均得到增强，有效拓宽生物农药的杀虫谱，杀虫能力较强，得到的重组菌株对鳞翅目和鞘翅目昆虫有显著杀虫活性，且害虫不易产生抗性，能避免或延缓害虫耐受性的产生，提高生物农药防治害虫效果，构建高效遗传工程杀虫剂。
本发明中，将密码子优化的外源CpTI基因接入温敏型质粒中，进而转化苏云金芽孢杆菌基因组中，温度敏感型质粒在高温下无法自主复制，传代后子代细胞中将不再含有温敏型质粒，因此，通过温度控制，得到的重组菌株去除了抗生素抗性的选择标记基因，有效解决了苏云金芽孢杆工程菌环境释放的安全性问题，有利于苏云金芽孢杆工程菌生物农药的大规模应用和推广。
附图说明
图1为本发明实施例中重组菌株Bt-CpTI的构建示意图，其中，pMAD是温敏型表达载体，BamHI和NcoI是限制性内切酶位点，CpTI是经过密码子优化的外源基因， pMAD-CPTI是重组表达质粒，Bt1.25-CpTI是基因组中整合了CpTI基因的苏云金芽孢杆菌菌株。
图2-6为本发明实施例中鉴定重组菌株Bt1.25-CpTI的PCR扩增示意图，其中，Bt1.25为保藏于广东省微生物菌种保藏中心、保藏号为GDMCC 1.25的原始苏云金芽孢杆菌；图2为采用引物IS231C-F/R进行PCR扩增的结果，图3为采用引物Bt-F/R 进行PCR扩增的结果；图4为采用引物pMAD-F/R进行PCR扩增的结果，图5为采用引物CPTI-F/R进行PCR扩增的结果，图6为采用引物CPTI2-F/R进行扩增的结果。
图7为本发明实施例中的Bt菌发酵上清液的SDS-PAGE分析，其中1-4：原始苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis subsp.galleriae菌株Bt1.25；5-8：重组菌株 Bt1.25-CpTI。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
为了描述简便，有时会将某种蛋白比如Bt与其编码基因名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场景表示不同的物质，本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于Bt，用于描述晶体蛋白的功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该蛋白的基因。
实施例中使用的原始苏云金芽孢杆菌为Bacillus thuringiensissubsp.galleriae，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC 1.25。
所述天然Bt基因为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)基因组中含有的编码 Bt杀虫蛋白的基因。Bt蛋白，也称Cry蛋白，是由苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)表达生成的晶体蛋白(crystal protein，Cry)
所述整合是指通过在重组质粒上构建苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis座子基因IS231C位点的同源臂序列，使重组质粒与Bacillus thuringiensis基因组中的对应IS231C同源臂序列发生同源重组，将重组质粒中CpTI基因片段(其长度为1514bp) 替换基因组转座子基因IS231C位点(其长度为1449bp)。
材料和方法：
实施例中的全基因人工合成、引物合成及测序皆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例中的一般分子生物学实验，例如质粒构建、限制性内切酶酶切反应、连接反应、感受态细胞制备、转化、培养基配制等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京， 2002)进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板，及供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行，必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠。LB固体培养基另添加20g/L琼脂粉。红霉素抗性LB培养基中添加的红霉素工作浓度为10μg/mL。
实施例
1.人工合成CpTI基因整合片段
通过GeneBank下载豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因(CpTI)，登录号：EU088405。依据苏云金芽孢杆菌的密码子偏好性，通过ExpOptimizer软件 (https://www.novopro.cn/tools/codon-optimization.html)对CpTI基因进行密码子优化，得到优化后CpTI序列，如SEQ ID No.1所示。
IS231C基因同源臂序列设计参考苏云金芽孢杆菌YBT-1502菌株的IS231C基因作为参考。
根据同源重组与基因表达所需的元件，串联包括转座子IS231C基因上游同源臂序列(500bp，如SEQ ID NO.3所示)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)pLA 强启动子序列(如SEQ ID NO.2所示)、密码子优化的CpTI基因编码序列、T7终止子序列(如SEQ IDNO.5所示)、转座子IS231C基因下游同源臂序列(500bp，如 SEQ ID NO.4所示)，得到CpTI基因整合片段。
为了便于基因克隆操作，加入了四个限制性内切酶位点BamHⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ和NcoⅠ，上述串联DNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，最终人工合成的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
2.构建基因组整合表达CpTI的重组质粒的
根据图1的途径，使用限制性内切酶BamHⅠ/NcoI(购自TAKARA)对上述如SEQ IDNO.6所示的CpTI基因整合片段和温敏型质粒pMAD(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)进行双酶切，载体与目的片段的回收产物采用T4连接酶(购自 TAKARA)22℃过夜连接，得到重组表达质粒pMAD-CpTI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
通过热激转化方法，将pMAD-CpTI质粒转入到甲基化基因dam、dcm缺陷的大肠杆菌宿主JM110(购自上海唯地生物技术有限公司)感受态中，在含有红霉素抗性的LB培养基上筛选转化子，提取转化子质粒，通过BamHⅠ/NcoI双酶切鉴定。
3.双价杀虫苏云金芽孢杆菌工程菌的构建
将步骤2中提取的重组表达质粒pMAD-CpTI电转化到Bt菌感受态细胞中，电击条件是：电压2.5KV，电阻1000Ω，电容25μF，电转化杯直径为4mm，电击12s。
通过重组表达质粒pMAD-CpTI和Bt菌感受态细胞基因组中IS231C同源臂序列，质粒与基因组发生同源重组，重组后位于重组表达质粒上的CpTI基因片段整合到野生Bt菌基因组中，得到重组表达工程菌株Bt1.25-CpTI。
将工程菌Bt1.25-CpTI的培养温度从37℃升高到42℃，在LB液体培养基中连续传代，从每一代培养物中取适量菌液在LB平板划线培养，挑取单菌落同时点接在LB 平板和LB红霉素抗性平板。
在LB平板正常生长，而在LB红霉素抗性平板上无法生长的菌株，即为去除含有红霉素抗性选择标记的pMAD质粒的工程菌Bt-CpTI-pre。
对Bt-CpTI-pre工程菌进行菌落PCR验证，所用引物及PCR反应体系如表1-表 2：
表1 PCR使用的引物
表2
| 反应成分 | 用量(μL) |
| 2×TaqMasterMix | 10.0 |
| 上游引物F(10mM) | 1.0 |
| 下游引物R(10mM) | 1.0 |
| DNA模板 | 1.0 |
| ddH<sub>2</sub>O | 7.0 |
| Total | 20.0 |
PCR反应程序设定为：
以IS231C-F/R为上、下游引物时：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃30s， 72℃5min，30个循环。
以Bt-F/R、CPTI-F/R或PMAD-F/R为上、下游引物时：95℃5min；95℃30s， 55℃30s，72℃45s，72℃5min，30个循环。
以CPTI2-F/R为上、下游引物时：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min， 72℃5min，30个循环。
使用1.0％(1.0g/100mL)琼脂糖凝胶对上述PCR产物进行电泳验证，结果见图 2-6，采用引物IS231C-F/R进行PCR扩增，发现野生菌株可以扩增得到271bp的目的条带，表明野生菌株染色体中含有转座子基因IS231C(图2)；采用引物Bt-F/R进行 PCR扩增，发现重组质粒pMAD-CpTI和重组菌株Bt1.25-CpTI均可以扩增得到521bp 目的条带，表明CpTI基因成功克隆到温敏型质粒pMAD中，并且已经转化进菌株 Bt1.25中(图3)；采用引物pMAD-F/R进行PCR扩增，发现重组菌株Bt1.25-CpTI 无法扩增得到494bp目的条带，表明重组菌株Bt-CpTI中已经没有游离态重组质粒 pMAD-CpTI(图4)；采用引物CPTI-F/R进行PCR扩增，发现重组菌株Bt1.25-CpTI 可以得到452bp和554bp两条目的条带，表明CpTI基因成功整合到野生菌株Bt1.25 部分转座子IS231C基因序列中(图5)；采用引物CPTI2-F/R发现重组菌株Bt1.25-CpTI 可以得到752bp目的条带，表明CpTI基因成功整合到野生菌株Bt1.25转座子中(图 6)。
上述结果初步表明，CpTI基因已经准确整合到原始菌株的染色体上转座子IS231C位置，并且重组菌株Bt1.25-CpTI生长状态正常，CpTI基因可以稳定遗传。
4.对PCR产物进行测序验证，得到工程菌Bt1.25-CpTI。
将得到的工程菌接种于LB液体培养基，以200rpm，30℃培养，将培养得到的 24-60h的发酵液于高速低温离心机4℃，12000rpm离心10min离心后取菌体沉淀，用 Ph7.8的PBS磷酸缓冲液重悬，将重悬后的样品以60％功率，超声破碎10min(8s pulse on/4s pulseoff)，破碎后的样品经4℃，12000rpm离心10min，将上清液进行 12％SDS-PAGE电泳(参见图7)。
根据图7的电泳结果，在约37KDa和67KDa处有蛋白表达，此大小与CpTI和 BT蛋白的氨基酸大小基本一致，即认为CpTI和BT蛋白正常表达。
将重组菌株Bt1.25-CpTI进行生物保藏，即苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis Bt1.25-CpTI，分类学名称为Bacillus thuringiensis，于2021年09月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61954。
5.杀虫活性分析
将Bt1.25-CpTI发酵菌液进行真空干燥，粉碎得到Bt1.25-CpTI粉剂，将其掺入二化螟幼虫饲料中，以原始菌株苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis subsp.galleriae作为对照，以进行杀虫活性分析(表3)。
表3杀虫试验分析
由表3计算得出，重组工程菌和原始菌株的半致死浓度(LC50)分别为4.34μg 蛋白/g饲料和5.82μg蛋白/g饲料，95％置信区间分别为2.42-7.78和2.92-11.58，重组工程菌的半致死量明显下降，表明重组工程菌对二化螟幼虫毒杀效果更强。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌、其构建方法及应用
<130> 2111157
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 324
<212> DNA
<213> 豇豆(Vigna unguiculata Linn. Walp.)
<400> 1
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<210> 2
<211> 140
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 2
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<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.galleriae)
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<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.galleriae)
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<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.galleriae)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcaagatca tctatccctg ttatatcaag cgatacagag aaacacccgt ataataacaa 1380
aggttttaat ccgcctgttt accctactaa agaaaaatgg ccggaaatcc catcgatatg 1440
agaagaaaac tatctttgat attatgggtg ttgtctatga gtataatgga ttgagaaaac 1500
aaaagaaacc atgg 1514
<210> 7
<211> 11117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaattaattc tcatgtttga cagcttatca tcgattcaca aaaaataggc acacgaaaaa 60
caagttaagg gatgcagttt atgcatccct taacttactt attaaataat ttatagctat 120
tgaaaagaga taagaattgt tcaaagctaa tattgtttaa atcgtcaatt cctgcatgtt 180
ttaaggaatt gttaaattga ttttttgtaa atattttctt gtattctttg ttaacccatt 240
tcataacgaa ataattatac ttttgtttat ctttgtgtga tattcttgat ttttttctac 300
ttaatctgat aagtgagcta ttcactttag gtttaggatg aaaatattct cttggaacca 360
tacttaatat agaaatatca acttctgcca ttaaaagtaa tgccaatgag cgttttgtat 420
ttaataatct tttagcaaac ccgtattcca cgattaaata aatctcatta gctatactat 480
caaaaacaat tttgcgtatt atatccgtac ttatgttata aggtatatta ccatatattt 540
tataggattg gtttttagga aatttaaact gcaatatatc cttgtttaaa acttggaaat 600
tatcgtgatc aacaagttta ttttctgtag ttttgcataa tttatggtct atttcaatgg 660
cagttacgaa attacacctc tttactaatt caagggtaaa atggcctttt cctgagccga 720
tttcaaagat attatcatgt tcatttaatc ttatatttgt cattatttta tctatattat 780
gttttgaagt aataaagttt tgactgtgtt ttatattttt ctcgttcatt ataaccctct 840
ttaatttggt tatatgaatt ttgcttatta acgattcatt ataaccactt attttttgtt 900
tggttgataa tgaactgtgc tgattacaaa aatactaaaa atgcccatat tttttcctcc 960
ttataaaatt agtataatta tagcacgagc tctgataaat atgaacatga tgagtgatcg 1020
ttaaatttat actgcaatcg gatgcgatta ttgaataaaa gatatgagag atttatctaa 1080
tttctttttt cttgtaaaaa aagaaagttc ttaaaggttt tatagttttg gtcgtagagc 1140
acacggttta acgacttaat tacgaagtaa ataagtctag tgtgttagac tttatgaaat 1200
ctatatacgt ttatatatat ttattatccg gaggtgtagc atgtctcatt caattttgag 1260
ggttgccaga gttaaaggat caagtaatac aaacgggata caaagacata atcaaagaga 1320
gaataaaaac tataataata aagacataaa tcatgaggaa acatataaaa attatgattt 1380
gattaacgca caaaatataa agtataaaga taaaattgat gaaacgattg atgagaatta 1440
ttcagggaaa cgtaaaattc ggtcagatgc aattcgacat gtggacggac tggttacaag 1500
tgataaagat ttctttgatg atttaagcgg agaagaaata gaacgatttt ttaaagatag 1560
cttggagttt ctagaaaatg aatacggtaa ggaaaatatg ctgtatgcga ctgtccatct 1620
ggatgaaaga gtcccacata tgcactttgg ttttgtccct ttaacagagg acgggagatt 1680
gtctgcaaaa gaacagttag gcaacaagaa agactttact caattacaag atagatttaa 1740
tgagtatgtg aatgagaaag gttatgaact tgaaagaggc acgtccaaag aggttacaga 1800
acgagaacat aaagcgatgg atcagtacaa gaaagatact gtatttcata aacaggaact 1860
gcaagaagtt aaggatgagt tacagaaggc aaataagcag ttacagagtg gaatagagca 1920
tatgaggtct acgaaaccct ttgattatga aaatgagcgt acaggtttgt tctctggacg 1980
tgaagagact ggtagaaaga tattaactgc tgatgaattt gaacgcctgc aagaaacaat 2040
ctcttctgca gaacggattg ttgatgatta cgaaaatatt aagagcacag actattacac 2100
agaaaatcaa gaattaaaaa aacgtagaga gagtttgaaa gaagtagtga atacatggaa 2160
agaggggtat cacgaaaaaa gtaaagaggt taataaatta aagcgagaga atgatagttt 2220
gaatgagcag ttgaatgtat cagagaaatt tcaagctagt acagtgactt tatatcgtgc 2280
tgcgagggcg aatttccctg ggtttgagaa agggtttaat aggcttaaag agaaattctt 2340
taatgattcc aaatttgagc gtgtgggaca gtttatggat gttgtacagg ataatgtcca 2400
gaaggtcgat agaaagcgtg agaaacagcg tacagacgat ttagagatgt agaggtactt 2460
ttatgccgag aaaacttttt gcgtgtgaca gtccttaaaa tatacttaga gcgtaagcga 2520
aagtagtagc gacagctatt aactttcggt tgcaaagctc taggattttt aatggacgca 2580
gcgcatcaca cgcaaaaagg aaattggaat aaatgcgaaa tttgagatgt taattaaaga 2640
cctttttgag gtcttttttt cttagatttt tggggttatt taggggagaa aacatagggg 2700
ggtactacga cctcccccct aggtgtccat tgtccattgt ccaaacaaat aaataaatat 2760
tgggttttta atgttaaaag gttgtttttt atgttaaagt gaaaaaaaca gatgttggga 2820
ggtacagtga tagttgtaga tagaaaagaa gagaaaaaag ttgctgttac tttaagactt 2880
acaacagaag aaaatgagat attaaataga atcaaagaaa aatataatat tagcaaatca 2940
gatgcaaccg gtattctaat aaaaaaatat gcaaaggagg aatacggtgc attttaaaca 3000
aaaaaagata gacagcactg gcatgctgcc tatctatgac taaattttgt taagtgtatt 3060
agcaccgtta ttatatcatg agcgaaaatg taataaaaga aactgaaaac aagaaaaatt 3120
caagaggacg taattggaca tttgttttat atccagaatc agcaaaagcc gagtggttag 3180
agtatttaaa agagttacac attcaatttg tagtgtctcc attacatgat agggatactg 3240
atacagaagg taggatgaaa aaagagcatt atcatattct agtgatgtat gagggtaata 3300
aatcttatga acagataaaa ataattaaca gaagaattga atgcgactat tccgcagatt 3360
gcaggaagtg tgaaaggtct tgtgagatat atgcttcaca tggacgatcc taataaattt 3420
aaatatcaaa aagaagatat gatagtttat ggcggtgtag atgttgatga attattaaag 3480
aaaacaacaa cagatagata taaattaatt aaagaaatga ttgagtttat tgatgaacaa 3540
ggaatcgtag aatttaagag tttaatggat tatgcaatga agtttaaatt tgatgattgg 3600
ttcccgcttt tatgtgataa ctcggcgtat gttattcaag aatatataaa atcaaatcgg 3660
tataaatctg accgatagat tttgaattta ggtgtcacaa gacactcttt tttcgcacca 3720
gcgaaaactg gtttaagccg actgcgcaaa agacataatc gataagcttt aatgcggtag 3780
tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca ggcaccgtgt atgaaatcta acaatgcgct 3840
catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc ataggcttgg ttatgccggt 3900
actgccgggc ctcttgcggg atcgaggcct ttagcatatt atgttgccaa ctgtcggaac 3960
gagacttctc taaaccttcc cggcttcatc atgctctctt aacactgcta catcaacccc 4020
ttgaatcctc aattcacctc ctcgaaaaca tttcccatca atcatattct ggtatatctt 4080
atcttctggc agtgacagcg tcacttcgta atcattatga ttgatgataa tcaaatactt 4140
ccattcatca gtctctcttt gttgcacctc tacattttca gctacttcaa gaatgggatt 4200
aatatgatgt ttagcgaaaa cctgttctaa aagcctgcct aaataattac tatctggata 4260
agtaccgacg taaatcccct ctcctttacc gtagcagtta cgtgtaaccg ccggaagtcc 4320
tgcataccaa tcccccttaa atgtcgctag aggttctgcc ccttctaatc ggattatgtc 4380
cgcccacgtc gtacaatcat attccccatc gttactatat attttgttta cctttgtttc 4440
tgggtatggt acaaattcct caacaaaaat ccccaaaata tctcgcagag gaccaggata 4500
tccgcctaga tgtacacggt cattttcatc tacaatgcca ctgaagaaac tgacaatcaa 4560
agtgccaccg ttagcaacaa attgccgtaa gttttcatct tctccctctt taaccatata 4620
taacattgga gcaataacta ctttgtattt tgttagatca tcagatggcc ttacaaaatc 4680
gacagcaata ttacgtttat ataattccct ataataagct tcaactatag gaatatatct 4740
tagtttatta tgtggtttgg aacttagttc gacagcccac cagttttccc aatcaaaaat 4800
gatcgcgacc tctgccttga ttctagatcc gaccaaacaa tctaactttt tcagctcttg 4860
ccctaactgt gtaacttccc tataaattct attattctcg ttcaaaaagt ggggcaccat 4920
tgcaccgtgg aatttttcag ctcctgctct actttgacgc cactggaaaa acataatacc 4980
atctgcacca cgggcaatag ttgcataact ccatagacgc attacacctg gcggttttgg 5040
aacattaata tcgcgccagt taacatgtga ggttacctgc tccatcaaaa taaacggttg 5100
accttttctt aaactacgca taaggtcatt catcatggcg tgctgaattg gcaagccctc 5160
tctgggatca ggatatgagt cccatgtcac aatatctaca tgctgagccc attgaaaata 5220
gtttaacggt ttgaatgaac ccatgaaatt agttgatact ggaatatctg gtgttacctc 5280
acgtaaaatt tccttttctg ttaaaaacaa cttgagaatt gagtcattca taaaacggta 5340
gtaatcaagt tcttgggatg gattaataaa agttggtgcc tttctagggg gattaatttc 5400
atcccaatga ttgtatcgct gtccccaaaa gtttgtaccc caacgttcat ttaattcatc 5460
gattgtttta tatctttcct ttagccactt tctaaacgcg acagcacaat tctcacaaaa 5520
acacttggaa acgtgacatg catactcatt attaacatgc cacattttga gtgccggatg 5580
atttttatac cgttctgcta tagccctcac aagtctcttt atgtgcgtaa ttaattgagg 5640
atgattagga caataatgtt gtctactgcc aaacgagaga atgacaccgc tttcatcgat 5700
cggcaaagaa tctggatact tttttacaaa ccaagctgga gtagttgcag tcgccgtccc 5760
caagttaata taaacaccgt ggtcatatag tatatctata accttgtcta gccattcaaa 5820
gtcgaacact ccatcagacg gttcgatctt gctccaactg aaaatcccta aagatactaa 5880
attcaccccc gctttttgca tcaacttagc atcttcatac caaatttcct ctggccattg 5940
ctctgggtta taatctcctc cgtaacaaat tgaggataac acattcataa ttattccccc 6000
tagctaattt tcgtttaatt ataaattaag ttaaaattta ggtacctacg taggatcgat 6060
ccgatcctta attatattat agtcccaata taatcattta tcaactcttt tacacttaaa 6120
tttcctaata tttgtaaata tttttttgaa taaaaaaatc tagctaatgt tacgttacac 6180
attaactaga cagatctatc gatgcatgcc atggtttctt ttgttttctc aatccattat 6240
actcatagac aacacccata atatcaaaga tagttttctt ctcatatcga tgggatttcc 6300
ggccattttt ctttagtagg gtaaacaggc ggattaaaac ctttgttatt atacgggtgt 6360
ttctctgtat cgcttgatat aacagggata gatgatcttg aatcatccca attgctttat 6420
attcgcttag ttctcttttg tgcttttgca acagaagttg gcgcatctta aacatcgtgg 6480
aagaacatat aaaaatggca atgagttttc catacacatg gcattctaat cgctcttgtt 6540
tgatagtttg ccaatgatga atttgaaata gagatttcca cgttttaaat atgatttcga 6600
tctgccagcg gagggagtaa aaatcatgga tttgttccat cggaaccact tcccaaggcg 6660
tattcgtaac atatatgttg atacccgtta atcgtttact cttttctgaa aatggaattc 6720
gacatgatta ccagatctgc agcaagcttt tattcatcat cttcatctct agatttacat 6780
ggtttataac aaaaatctgc aatatctaaa catctacatt ttcctggcat acttcttgta 6840
cacatacaag atttacatgc actatgacaa ctatttaatc taatatctgt acaatgacat 6900
tgtggtggaa tactttttgt acaaatacaa ctatcacaac atggttcact actttcactt 6960
ggttcatctg aagagtcgtc atgatgatta cttcctaaat gatttaaatc cattgctgct 7020
gttgttactc ctactaaaaa taatactaat acacatactt ttaataccat catgattctc 7080
acctcctaga acgggcaaac tatcgaaatt ttcctataat ttagaattga ctcgccgttc 7140
cagtcaaatt atactataag tacatcaaga aatcgacaaa aaattataaa ttttctagga 7200
ggtggaatat gtcgacattt tttccaggac ctacctggaa gtttaaaaac tgtccgctgt 7260
gtaagtcata ttctaattga atcttgatac ctgcagtttg tgcacaacca cctgacccag 7320
gatatacatg tgctaaatgt ttcggtactt ggaaaatcgt cgcatctaaa atacggattc 7380
gttgaaaata cgtgagtgct gcacttgaaa tggctgatgt tttacaaagt ttacttttcc 7440
ataatgcaga aaaaatatat ttcaaaaatt caaccgcttt tttatcaaag cgtttattga 7500
gtccttctgg actcataaga gtgcctgtgg cggcgtgtaa ttgactgcat agtcgaacga 7560
gagaatcact cgctgtacgt tgactgaccc agatacatat ggtagctaat tcatttcctg 7620
aaaactttcg ttttcttttt acaaaaccta attctttagc gagttcttcc aaaagagaag 7680
gggttaaatg acgatacagc tcttcagaaa atagttggat ccgatatcgc ccgacgcgag 7740
gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg atgcccgcgt 7800
tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt caaggatcgc 7860
tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct gatcgtcacg gcgatttatg 7920
ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc ctataccttg 7980
tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc tgaatggaag 8040
ccggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc aattcttgcg 8100
gagaactgtg aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata tccatcgcgt ccgccatctc 8160
cagcagccgc acgcggcgca tctcgggcag cgttgggtcc tggccacggg tgcgcatgat 8220
cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa 8280
tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg 8340
agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc 8400
agcgccctgc accattatgt tccggatctg catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg 8460
aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc 8520
ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc 8580
atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat 8640
gaacagaaat tcccccttac acggaggcat caagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt 8700
aacatggccc gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg 8760
gacgcggatg aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac 8820
cgcagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 8880
gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 8940
tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 9000
gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 9060
ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 9120
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 9180
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 9240
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 9300
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 9360
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 9420
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 9480
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 9540
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 9600
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 9660
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 9720
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 9780
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 9840
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 9900
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 9960
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 10020
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 10080
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 10140
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 10200
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 10260
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 10320
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg 10380
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 10440
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 10500
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 10560
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 10620
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata 10680
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 10740
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 10800
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 10860
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 10920
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 10980
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 11040
ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 11100
ggccctttcg tcttcaa 11117
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacatttgga acagattgct tag 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttttatttca tacgtttgtc ctg 23
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgcaaagga ggaatacg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atctacaccg ccataaac 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgccacagg cactatta 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgctgctgt tgttactcct ac 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacttccag gtaggtcc 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcgtttact cttttctg 18
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgacatttt ttatgaatct tt 22
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cattgctgct gttgttactc ctac 24
Claims (15)
1.一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其基因组中含有苏云金芽孢杆菌携带的天然Bt基因，以及通过同源重组整合在所述苏云金芽孢杆菌基因组中的外源CpTI基因。
2.根据权利要求1所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述外源CpTI基因源于按照苏云金芽孢杆菌的密码子使用偏好经过密码子优化的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI。
3.根据权利要求1或2所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述外源CpTI基因通过温敏重组质粒同源重组整合至苏云金芽孢杆菌基因组中。
4.根据权利要求3所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述温敏重组质粒为携带人工合成外源CpTI基因整合片段的温度敏感型重组质粒，所述外源CpTI基因整合片段包括：人工合成的含有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)pLA强启动子、经过密码子优化的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI、苏云金芽孢杆菌T7终止子。
5.根据权利要求3所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌工程菌不含抗生素选择标记基因。
6.根据权利要求1所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述外源CpTI基因整合在苏云金芽孢杆菌基因组中的转座子基因IS231C位点上。
7.根据权利要求1-6任一项所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌工程菌为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Bt1.25-CpTI，于2021年09月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61954。
8.一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)按照苏云金芽孢杆菌的密码子使用偏好性，对豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI进行密码子优化；
2)合成CpTI基因整合片段，其包括苏云金芽孢杆菌基因组整合位点转座子IS231C基因的上游同源臂序列、密码子优化后的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因CpTI、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)pLA强启动子、T7终止子和苏云金芽孢杆菌基因组整合位点转座子IS231C基因的下游同源臂序列，并根据基因克隆需要，加入限制性内切酶位点；
3)将步骤2)得到的CpTI基因整合片段插入温敏重组质粒的限制性内切酶位点之间，得到携带CpTI基因的重组表达质粒；
4)将步骤3)得到的重组表达质粒转化到甲基化缺陷的大肠杆菌感受态细胞中，提取重组质粒；
5)将步骤4)提取所得重组质粒电转化到对鳞翅目或鞘翅目害虫高毒力野生Bt菌株感受态细胞中，筛选阳性转化子；
6)挑选步骤5)中筛选得到的阳性转化子，于37-43℃培养以去除温敏重组质粒，筛选后得到去除红霉素抗性基因的重组表达工程菌株Bt-CpTI。
9.根据权利要求8所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤2)中，经过密码子优化后的CpTI基因具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述地衣芽孢杆菌pLA强启动子的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求8所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤2)中，所述上游同源臂序列的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游同源臂序列的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述T7终止子的具体核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
11.根据权利要求8所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述CpTI基因整合片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
12.根据权利要求8所述表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤3)中，所述温敏重组质粒为pMAD质粒，获得的携带CpTI基因的重组表达质粒为pMAD-CpTI，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
13.如权利要求1所述双价杀虫苏云金芽孢杆菌工程菌在生物农药中的应用。
14.包含如权利要求1所述双价杀虫苏云金芽孢杆菌工程菌的组合物。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物为生物农药制剂。
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| CN115725627A (zh) * | 2022-09-05 | 2023-03-03 | 沈阳农业大学 | 一种构建重组杀虫大肠杆菌以表达杀蚊毒蛋白的方法 |
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2021
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