KR101586337B1 - Ｈｓｐ２７ 변이(ｓ１３５ｆ) 매개의 샤르코-마리-투스 질환 동물모델 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ＨＳＰ２７ 변이(Ｓ１３５Ｆ) 매개의 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 동물모델에 관한 것으로, 구체적으로 HSP27 단백질의 135번째 세린(serine)을 페닐알라닌(phenylalanine)으로 치환한 돌연변이형을 발현하는 벡터를 마우스의 수정란에 주입하고 상기 발현벡터를 갖는 마우스를 선별하여 이들 마우스에서 샤르코-마리-투스 질환의 표현형을 나타내는 것을 확인함으로써 샤르코-마리-투스 질환 치료제 후보물질의 효능평가에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

ＨＳＰ２７ 변이(Ｓ１３５Ｆ) 매개의 샤르코-마리-투스 질환 동물모델{Animal model for HSP27 mutation(S135F)-mediated Charcot-Marie-Tooth disease}
본 발명은 HSP27 변이(S135F) 매개의 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease) 동물모델에 관한 것이다.
신약과 새로운 치료기술의 개발에 있어서 동물모델을 이용한 실험은 인체를 대상으로한 연구에 선행되어야할 필수불가결한 단계이다. 그러나 인체질환의 종류가 수없이 많음에 비하여 이를 모방하는 동물모델의 종류는 극히 적으며, 이것은 신약과 새로운 치료기술의 개발에 있어서 커다란 제약요소로서 작용하고 있다. 질환 동물의 제작은 사용되는 방법에 따라 특징을 달리하는 다양한 종류가 만들어지며, 실험의 목적에 따라 각기 그 효용이 다르다. 현재까지 알려진 질환 모델동물 제작법을 크게 3가지로 구분해보면 전통적으로 자연발생적인 돌연변이종을 질환 모델로 개발하는 방법이 있었고, 후에 화학물질 투여나 인공세포주 이식 등 실험적 질환유발법이 개발되어 통용되어 왔으며, 분자유전학적 방법이 비약적으로 발전된 최근에는 유전자 이식에 의한 형질전환방법이 강력한 기술로써 각광을 받고 있다. 신약과 새로운 치료법 연구개발의 다양한 욕구를 충족시키기 위해서는 여러 가지 접근법에 의한 질환모델 제작법을 확보하고 이들 간의 협력을 통한 효과적인 모델동물 제작시스템을 수립하는 것이 매우 중요하다.
유전성 말초 신경병은 크게 유전운동감각신경병(hereditary motor and sensory neuropathy; HMSN), 유전운동신경병(herediatary motor neuropathy; HMN) 및 유전감각신경병(herediatary sensory neuropathy; HSN)의 3가지로 구분된다. 이 중 유전운동감각신경병이 대부분을 차지하며, 이는 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)으로 더 잘 알려져 있다. 샤르코-마리-투스 질환은 1886년에 프랑스인 샤르코(Charcot)와 마리(Marie), 그리고 영국인 투스(Tooth)에 의해 처음으로 알려졌고, 이들의 이름 첫 글자를 따서 CMT 질환이라고 흔히 불리고 있다. 샤르코-마리-투스 질환은 신경전도검사상 운동신경과 감각신경에 이상이 있는 모든 유전질환을 총칭하며, 희귀질환 중 가장 높은 발병 빈도(2,500명 중 1명)를 갖는다. 과거에는 하지 원위부의 근육위축으로 인하여 샴페인 병을 거꾸로 세운 듯한 다리 모양을 하는 질환으로 비교적 단순하게 인식되어 왔으나, 현재는 단일질환이라기보다는 하나의 질환군(syndrome)으로 인식되고 있다. 최근에는 CMT의 새로운 발병 기전들이 많이 밝혀져서 병태 생리학적 연구뿐만 아니라 복잡한 임상형과 유전형의 분류에 큰 도움을 주었다.
지난 연구기간 동안 유전자 클로닝 기법으로 40개 이상의 유전운동감각신경병에 대한 유전자좌(locus)가 발견되었으며, 20개 이상의 원인 유전자가 밝혀졌다. 그러나 아직도 많은 유전운동감각신경병 환자들에서 이미 알려진 유전자좌와 연관성이 없음을 보여 앞으로도 50개 이상의 발병원인 유전자들이 더 있을 것으로 보고되고 있다. 따라서, 다양한 신경조직을 구성하는 요소들이 점차적으로 그 모습을 드러내고 있는 것으로 유전성 근육병의 종류가 많은 것처럼 유전성 신경병의 종류도 상당히 다양할 것으로 추정된다. 현재 유전운동감각신경병에서 가장 흔한 유형인 CMT1A에 대한 합리적이면서 잠재적인 약물치료법으로 오나프리스톤(onapriston), 아스코르빈산(ascorbic acid) 및 NT-3(neurotrophin-3) 등이 발표되어 진단뿐만 아니라 치료적 관점에서도 관심을 모으고 있다.
열충격 단백질(heat shock protein; HSP)은 분자 샤페론(molecular chaperone) 및 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)로 잘 알려져 있고, 대부분의 세포에서 발현되며 매우 잘 보존되어 있다. 또한 열충격 단백질은 아미노산 서열과 분자량에 따라서 다섯 가지 군으로 구분되는데, 100 ~ 110 kDa 군(family), 83 ~ 90 kDa 군, 66 ~ 78 kDa 군, 60 kDa 군, 15 ~ 30 kDa 군이 알려져 있다. HSP27은 소형(small) 열충격 단백질군에 속하며 근육 및 신경조직을 포함한 포유류의 조직에서 발현되며, 운동 뉴런과 감각 뉴런에서 풍부하게 존재한다.
HSP27은 세포 내에서 다양한 기능을 수행하는 단백질로 활성산소(free radical), 독소(toxins)와 같은 외부 환경적 요인에 대하여 스스로 군집을 형성하여 상기 스트레스에 대한 방어능력을 갖는 저분자량의 단백질이다.
이에 본 발명자들은 샤르코-마리-투스 질환에 대한 맞춤형 의료기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 샤르코-마리-투스 질환 환자들에서 수득한 시료에서 섬유아세포를 분리하여 HSP27 단백질에 135번째 세린(serine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 치환된 돌연변이형 HSP27(S135F) 단백질을 발현하는 발현벡터를 제조하였고, 상기 제조된 발현벡터를 수정란에 주입 후 대리모에 착상하여 상기 발현벡터를 게놈 DNA에 갖는 마우스를 선별하였다. 그 결과, HSP27(S135F) 돌연변이형 단백질을 발현하는 발현벡터를 갖는 마우스에서 샤르코-마리-투스 질환의 표현형을 나타내는 것을 확인하여, 상기 제작한 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델을 이용하여 샤르코-마리-투스 치료제 개발을 위한 선구물질 탐색 및 약물 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 ＨＳＰ２７ 변이(Ｓ１３５Ｆ) 매개의 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 동물모델, 이의 제조방법 및 이를 이용한 샤르코-마리-투스병 치료제 후보물질의 선별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HSP27 단백질의 아미노산 서열(서열번호 6)에서 N-말단(terminus)으로부터 135번째 아미노산인 세린(serine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이된 HSP27 돌연변이가 발현되는 발현벡터가 도입된 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 모델 마우스의 수정란을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한 형질전환 마우스를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 모델 마우스의 제조방법을 제공한다:
1) HSP27 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단(terminus)으로부터 135번째 아미노산인 세린(serine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이된 HSP27 돌연변이가 발현되는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 HSP27 돌연변이가 발현되는 발현벡터를 마우스의 수정란에 도입하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 제조된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 마우스를 수득하는 단계.
아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법을 제공한다:
1) 피검물질을 본 발명의 형질전환 마우스에 투여하는 단계;
2) 단계 1)의 피검물질을 투여한 형질전환 마우스에서 HSP27 돌연변이 유전자 또는 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및
3) 피검물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여, HSP27 돌연변이 유전자 또는 단백질의 발현수준을 유의적으로 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명은 ＨＳＰ２７ 변이(Ｓ１３５Ｆ) 매개의 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 동물모델에 관한 것으로, 구체적으로 HSP27 단백질의 135번째 세린(serine)을 페닐알라닌(phenylalanine)으로 치환한 돌연변이형을 발현하는 벡터를 마우스의 수정란에 주입하고 상기 발현벡터를 갖는 마우스를 선별하여 이들 마우스에서 샤르코-마리-투스 질환의 표현형을 나타내는 것을 확인함으로써 상기 제작한 샤르코-마리-투스 질환 동물 모델은 샤르코-마리-투스 치료제 개발을 위한 선구물질 탐색 및 약물 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HSP27 단백질의 돌연변이형(S135F) 발현벡터를 제조하는 방법을 나타내는 도이다.
A: 환자 시료에서 HSP27 단백질을 PCR로 증폭,
B: 상기 증폭된 HSP27 단백질을 pGEM-T 벡터에 클로닝,
C: pGEM-T 벡터에 클로닝된 HSP27 단백질을 pcDNA3.1(+)에 클로닝,
D: 발현벡터에 삽입된 HSP27 단백질의 S135F 돌연변이 확인, 및
E: HSP27(S135F) 단백질의 발현확인(-1: 클론 1, -3: 클론 3, -4: 클론 4).
도 2는 HSP27(S135F) 발현벡터를 주입한 수정란에서 얻은 마우스의 게놈 DNA에 상기 주입된 발현벡터를 갖는 마우스를 선별하는 것을 나타내는 도이다.
도 3은 HSP27(S135F) 단백질을 발현하는 마우스를 나타내는 도이다.
도 4는 로타로드 시험을 나타내는 도이다.
도 5는 1세대 마우스의 암수의 로타로드(rotarod) 시험을 통한 하지근력을 평가한 도이다.
도 6은 선별된 1세대 마우스의 새끼를 대상으로 하지근력을 로타로드 시험을 통한 하지근력을 평가한 도이다.
도 7은 악력(grip strength) 시험을 나타내는 도이다.
도 8은 선별된 1세대 마우스의 새끼를 대상으로 악력 시험을 통한 하지근력을 평가한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HSP27 단백질의 아미노산 서열(서열번호 6)에서 N-말단(terminus)으로부터 135번째 아미노산인 세린(serine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이된 HSP27 돌연변이가 발현되는 발현벡터가 도입된 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 모델 마우스의 수정란을 제공한다.
상기 HSP27 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 135번째 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로 변이된 HSP27 돌연변이는 서열번호 1로 기재되는 염기서열이 암호화된 아미노산을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 돌연변이를 얻기 위하여 HSP27 유전자에서 세린을 암호화하는 코돈인 TCC를 페닐알라닌을 암호화하는 코돈인 TTC 또는 TTT로 치환하는 것이 바람직하고, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, TTC로 치환하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한 형질전환 마우스를 제공한다.
상기 형질전환 마우스는 본 발명의 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한, HSP27 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 135번째 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로 변이된 HSP27 돌연변이가 발현되는 마우스로, 샤르코-마리-투스 질환이 유발된 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 본 발명의 형질전환 마우스는 통상의 형질전환 마우스의 제조방법을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 환자 시료로부터 HSP27 mRNA를 수득하였고, 이를 PCR로 증폭하여 S135F 돌연변이형을 제조하였다(도 1A 참조). 또한, 상기 증폭된 HSP27(S135F) 단백질을 발현벡터에 클로닝하였고(도 1C 참조), 이를 DNA 염기서열 분석을 통해 135번째 세린이 페닐알라닌으로 치환되었음을 확인하였으며(도 1D), 상기 HSP27(S135F) 발현벡터를 세포주에 형질감염하여 HSP 단백질의 발현을 확인하였다(도 1E).
또한, 상기 제작된 HSP27(S135F) 발현벡터를 마우스 수정란에 주입하고 대리모에 착상하여 얻어진 마우스에서 상기 HSP27(S135F) 발현벡터를 갖는 마우스를 선별(도 2 참조)하여 로타로드 및 악력 시험을 통해 상기 제작된 HSP27(S135F) 돌연변이 마우스가 야생대조군과 비교하여 하지근력이 현저히 감소하므로써(도 5, 도 6 및 도 8 참조) 샤르코-마리-투스 환자의 표현형을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 HSP27(S135F) 매개의 샤르코-마리-투스 질환 동물모델은 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 모델 마우스의 제조방법을 제공한다:
1) HSP27 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단(terminus)으로부터 135번째 아미노산인 세린(serine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이된 HSP27 돌연변이가 발현되는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 HSP27 돌연변이가 발현되는 발현벡터를 마우스의 수정란에 도입하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 제조된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 마우스를 수득하는 단계.
상기 단계 1)의 HSP27 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단(terminus)으로부터 135번째 아미노산인 세린(serine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이된 HSP27 돌연변이는 서열번호 1로 기재되는 염기서열이 암호화된 아미노산인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 돌연변이를 얻기 위하여 HSP27 유전자에서 세린을 암호화하는 코돈인 TCC를 페닐알라닌을 암호화하는 코돈인 TTC 또는 TTT로 치환하는 것이 바람직하고, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, TTC로 치환하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 발현벡터는 CMV 프로모터(promoter)를 포함하는 것이 바람직하며, 포유류 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 HSP27(S135F) 매개의 샤르코-마리-투스 질환 동물모델이 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법을 제공한다:
1) 피검물질을 본 발명의 형질전환 마우스에 투여하는 단계;
2) 단계 1)의 피검물질을 투여한 형질전환 마우스에서 HSP27 돌연변이 유전자 또는 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및
3) 피검물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여, HSP27 돌연변이 유전자 또는 단백질의 발현수준을 유의적으로 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계.
상기 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 형질전환 마우스는 본 발명의 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한, HSP27 단백질의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 135번째 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로 변이된 HSP27 돌연변이가 발현되는 마우스로, 샤르코-마리-투스 질환이 유발된 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 본 발명의 형질전환 마우스는 통상의 형질전환 마우스의 제조방법을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 단계 2)의 유전자 발현수준은 RT-PCR법, 실시간 RT-PCR법, 마이크로어레이법, 노던 블랏(northern blotting), 유전자 발현의 연속 분석법(SAGE, serial analysis of gene expression) 및 RNase 보호분석법(RNase protection assay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 단백질 발현수준은, 웨스턴 블랏(western blotting), 효소-면역화학 검출법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 HSP27(S135F) 매개의 샤르코-마리-투스 질환 동물모델이 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> HSP27 ( S135F ) 발현벡터의 제조
<1-1> HSP27 단백질의 S135F 돌연변이 형질을 발현하는 벡터의 제조
본 발명의 샤르코-마리-투스병을 유도하는 HSP27 단백질의 돌연변이 형질을 발현하는 발현벡터를 제작하였다.
구체적으로, 샤르코-마리-투스로 진단된 환자 유래의 섬유아세포에서 RNeasy 미니키트(RNeasy minikit, QIAGEN, 독일)를 사용하여 제조사의 설명서대로 mRNA를 추출하여 슈퍼스크립트 역전사효소 키트(Superscript reverse transcriptase kit, Invitrogen, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하기 프라이머를 이용하여 PCR 증폭(94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초, 35 사이클)하여(도 1A) pGEM-T Easy벡터(promega, 미국)에 클로닝(cloning)하였다(도 1B).
Forward(서열번호 2): 5'-atgaccgagcgccgcgtccccttct-3', 및
Reverse(서열번호 3): 5'-ttacttggcggcagtctcatcgg-3'.
상기 제작된 S135F 돌연변이가 유발된 HSP27 유전자의 서열을 확인한 후, CMV 프로모터(promoter)를 가진 pcDNA3.1(+)(invitrogen, 미국)(도 1C)에 EcoRI 제한효소를 사용하여 클로닝하여 pcDNA3.1(+) HSP27(S135F) 발현벡터를 제조하였다.
그 결과, 도 1D에 나타난 바와 같이 DNA 염기서열 확인을 통하여 135번째 S가 F로 돌연변이 되었음을 확인하였다(도 1D).
<1-2> HSP27 ( S135F ) 단백질의 발현 확인
상기 실시예 <1-1>의 방법으로 제작된 HSP27(S135F)의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 제작된 HSP27(S135F) 발현 벡터[pcDNA3.1(+) HSP27(S135F)]를 HEK293 세포주(ATCC에서 구입)에 형질감염(transfection)하고 24시간 후, 상기 세포주를 PBS로 씻어내고 1 x RIPA 완충액을 이용하여 용균(lysed)시켜 추출된 단백질을 BCA 방법을 이용하여 정량하였다. 그리고 동량의 단백질을 전기영동하여 분리하고, 이를 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane, Amersham Biosciences, 영국)으로 이동시켰다. 단백질의 불특정 결합을 막기 위하여, 0.1% 트윈 20(Tween 20)이 포함된 PBS에 5% 무지방 우유(fat-free milk)를 사용하였고, 1차 항체인 항-HSP27 항체(Santa cruz biotechnology, 미국)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 5분 간격으로 세 번 세척하고, 2차 항체[항-염소 IgG-HRP(anti-goat IgG-HRP), Santa cruz, 미국)를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 막은 ECL(Pierce, Rockford, IL, USA) 방법을 사용하여 현상하였다.
그 결과, 도 1E에 나타난 바와 같이 HEK293 세포주에서 HSP27(S135F) 단백질이 유의적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 1E).
< 실시예 2> 마우스모델의 제조
상기 <실시예 1>의 방법으로 제작된 HSP27(S135F)를 발현하는 pcDNA3.1(+) HSP27 발현벡터 및 C57BL/6NCrliOri 마우스(오리엔트 바이오, 한국)를 이용하여 마우스 모델을 제조하였다.
구체적으로, 우선 수정란(zygote)을 준비하기 위해 암컷 마우스에 PMSG 및 hCG 호르몬 주사를 48시간 간격으로 주사하여 과배란 유도를 하고, 수컷 마우스와의 교미를 유도하였다. 다음날 아침, 질전(vaginal plug)을 확인하여 교배 유무를 확인하였고, 질전이 있는 암컷 마우스의 난관으로부터 수정란을 채란하였다. 상기 채란된 수정란에 현미경 및 마이크로 피펫(micro pippet)을 이용하여 수정란의 투명대와 세포질을 통과하도록 하여 HSP27(S135F)를 발현하는 벡터를 주입한 후, DNA가 주입된 수정란 중 생존한 것을 선별하여 대리모의 난관에 이식하였다. 이식 19일 후, 정상분만을 통하여 총 72마리의 마우스를 수득하였다. 그런 다음 하기의 프라이머를 사용하여 PCR(94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초, 35 사이클)을 수행하여 마우스 게놈 DNA에 HSP27(S135) 발현벡터가 삽입된 마우스를 선별하였다.
Forward2(서열번호 4): 5'-gacgtcaatgggagtttgtttt-3', 및
Reverse2(서열번호 5): 5'-gagatgtagccatgctcgtcct-3'.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 HSP27(S135F)를 발현하는 12마리의 마우스를 선별하였고(도 2), 이들 마우스에서 샤르코-마리-투스병이 발생한 것을 확인하였다.
< 실험예 1> HSP27 을 발현하는 마우스의 행동평가를 통한 샤르코 -마리- 투스병 의 표현형 확인
<1-1> 로타로드 ( rotarod ) 시험을 통한 마우스의 하지근력 측정
상기 <실시예 2>에서 제조된 마우스가 샤르코-마리-투스병의 표현형을 확인하기 위하여 행동평가 시험인 로타로드 시험을 수행하였다(도 4).
구체적으로, 로타로드 시험을 위해 2 m/s의 속도로 움직이는 로타로드에 마우스를 위치시킨 후, 버티는 시간을 측정하였고, 시험을 하기 전 마우스의 적응을 위해 1주일 동안 총 3회의 연습시간을 주었으며, 기록 측정 당일은 1분간의 사전 연습시간을 주었고, 이후 매주 1회씩 기록을 측정하였다. 기록을 로타로드 위에서는 최장 7분까지 측정하였고, 7분 미만의 기록을 그대로 기입하되, 3분 미만일 경우 총 3회의 기회를 주어 가장 좋은 기록을 기록하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 총 12마리의 1세대 마우스를 대상으로 암수를 구분하여 생후 5개월부터 주 1회씩 3개월간 조사하여 평균값을 표시하였고, 이중에서 M11 및 M26에서 샤르코-마리-투스 환자와 동일한 표현형이 나타난 것을 확인하였다(도 5).
또한, 상기 선별된 1세대 마우스인 M11 및 M26의 새끼에서 생후 5개월부터 주 1회씩 총 10주간 로타로드를 통하여 하지근력을 측정한 결과, 하기 도 6에 나타난 바와 같이 하지근력이 야생 마우스와 비교하여 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
<1-2> 악력( grip strength ) 시험을 통한 마우스의 근력 측정
상기 실험예 <1-1>에서 선별된 M11 및 M26의 새끼를 대상으로 샤르코-마리-투스병의 표현형을 확인하기 위하여 행동평가 시험인 악력 시험을 수행하였다(도 7).
구체적으로, 악력시험은 악력 시험기에 부착된 네트에 네발 모두 순간적으로 붙잡는 힘을 측정기가 감지하여 g-포스(g-force) 단위로 표시하였다. 측정 전에 3회의 연습기회를 주었고, 측정 당일 총 3회를 수행하여 이의 평균을 기록하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 야생 마우스와 비교하여 HSP27(S135F) 돌연변이인 HSP27-S135F 마우스의 하지근력이 현저히 떨어진 것을 확인하였고(도 8), 이는 상기 실험예 <1-1>의 로타로드 실험결과와 일치하는 것을 확인하였다.
<110> CHONG KUN DANG PHARMACEUTICAL CORP. (C)SAMSUNG FOUNDATION <120> Animal model for HSP27 mutation(S135F)-mediated Charcot-Marie-Tooth disease <130> 14P-01-62 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 655 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttctgagca gacgtccaga gcagagtcag ccagcatgac cgagcgccgc gtccccttct 60 cgctcctgcg gggccccagc tgggacccct tccgcgactg gtacccgcat agccgcctct 120 tcgaccaggc cttcgggctg ccccggctgc cggaggagtg gtcgcagtgg ttaggcggca 180 gcagctggcc aggctacgtg cgccccctgc cccccgccgc catcgagagc cccgcagtgg 240 ccgcgcccgc ctacagccgc gcgctcagcc ggcaactcag cagcggggtc tcggagatcc 300 ggcacactgc ggaccgctgg cgcgtgtccc tggatgtcaa ccacttcgcc ccggacgagc 360 tgacggtcaa gaccaaggat ggcgtggtgg agatcaccgg caagcacgag gagcggcagg 420 acgagcatgg ctacatcttc cggtgcttca cgcggaaata cacgctgccc cccggtgtgg 480 accccaccca agtttcctcc tccctgtccc ctgagggcac actgaccgtg gaggccccca 540 tgcccaagct agccacgcag tccaacgaga tcaccatccc agtcaccttc gagtcgcggg 600 cccagcttgg gggcccagaa gctgcaaaat ccgatgagac tgccgccaag taaag 655 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward <400> 2 atgaccgagc gccgcgtccc cttct 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse <400> 3 ttacttggcg gcagtctcat cgg 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward2 <400> 4 gacgtcaatg ggagtttgtt tt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse2 <400> 5 gagatgtagc catgctcgtc ct 22 <210> 6 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser Leu Leu Arg Gly Pro Ser Trp 1 5 10 15 Asp Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro His Ser Arg Leu Phe Asp Gln Ala 20 25 30 Phe Gly Leu Pro Arg Leu Pro Glu Glu Trp Ser Gln Trp Leu Gly Gly 35 40 45 Ser Ser Trp Pro Gly Tyr Val Arg Pro Leu Pro Pro Ala Ala Ile Glu 50 55 60 Ser Pro Ala Val Ala Ala Pro Ala Tyr Ser Arg Ala Leu Ser Arg Gln 65 70 75 80 Leu Ser Ser Gly Val Ser Glu Ile Arg His Thr Ala Asp Arg Trp Arg 85 90 95 Val Ser Leu Asp Val Asn His Phe Ala Pro Asp Glu Leu Thr Val Lys 100 105 110 Thr Lys Asp Gly Val Val Glu Ile Thr Gly Lys His Glu Glu Arg Gln 115 120 125 Asp Glu His Gly Tyr Ile Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Tyr Thr Leu 130 135 140 Pro Pro Gly Val Asp Pro Thr Gln Val Ser Ser Ser Leu Ser Pro Glu 145 150 155 160 Gly Thr Leu Thr Val Glu Ala Pro Met Pro Lys Leu Ala Thr Gln Ser 165 170 175 Asn Glu Ile Thr Ile Pro Val Thr Phe Glu Ser Arg Ala Gln Leu Gly 180 185 190 Gly Pro Glu Ala Ala Lys Ser Asp Glu Thr Ala Ala Lys 195 200 205

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 1) 서열번호 6으로 표시되는 열충격 단백질27(Heat Shock Protein27; HSP27)의 아미노산 서열에서 N-말단(terminus)으로부터 135번째 아미노산인 세린(serine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변이된 단백질의 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 변이된 단백질의 발현벡터를 마우스의 수정란에 도입하는 단계; 및
    3) 단계 2)에서 제조된 수정란을 대리모의 난관에 이식하여 형질전환 마우스를 수득하는 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 모델 마우스의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 HSP27의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 135번째 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로 변이된 단백질은 서열번호 1로 기재되는 염기서열에 의해 암호화된 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 샤르코-마리-투스 질환 모델 마우스의 제조방법.
  6. 제 4항의 제조방법으로 제조된 샤르코-마리-투스 질환 모델 마우스로서, HSP27의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 135번째 아미노산인 세린이 페닐알라닌으로 변이된 단백질을 발현하는 마우스.
  7. 1) 피검물질을 제 4항의 형질전환 마우스에 투여하는 단계;
    2) 단계 1)의 피검물질을 투여한 형질전환 마우스에서 HSP27 돌연변이 유전자 또는 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및
    3) 피검물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여, HSP27 돌연변이 유전자 또는 단백질의 발현수준을 유의적으로 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 HSP27 돌연변이는 서열번호 1로 기재되는 염기서열에 의해 암호화된 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 유전자 발현수준은 RT-PCR법, 실시간 RT-PCR법, 마이크로어레이법, 노던 블랏(northern blotting), 유전자 발현의 연속 분석법(SAGE, serial analysis of gene expression) 및 RNase 보호분석법(RNase protection assay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질 발현수준은, 웨스턴 블랏(western blotting), 효소-면역화학 검출법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 샤르코-마리-투스 질환 예방 및 치료제 후보물질 선별방법.



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