KR20130027596A - Ｍｅｆ 유전자로 형질전환된 마우스 및 이의 용도 - Google Patents

Ｍｅｆ 유전자로 형질전환된 마우스 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MEF 유전자로 형질전환된 마우스에 관한 것으로, 보다 자세하게는 골모세포 특이적으로 MEF(Myeloid Elf-1 like factor)가 과발현되는 형질전환 마우스, 이의 제조방법 및 상기 형질전환 마우스를 이용하여 골다공증 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 형질전환 마우스는 골모세포에 의한 골 형성이 억제되고 파골세포에 의한 골 흡수가 촉진되어, 골다공증의 생물학적 특성 연구와 골다공증 약제 개발을 테스트하는 동물 모델로 이용될 수 있다.

Description

ＭＥＦ 유전자로 형질전환된 마우스 및 이의 용도{Mouses transformed with MEF gene and usage thereof}
본 발명은 MEF 유전자로 형질전환된 마우스에 관한 것으로, 보다 자세하게는 골모세포 특이적으로 MEF(Myeloid Elf-1 like factor)가 과발현되는 형질전환 마우스, 이의 제조방법 및 상기 형질전환 마우스를 이용하여 골다공증 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
골(bone) 역동적인 기관으로, 골 개조는 성체의 생존 기간 내내 일어난다. 골모세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골 흡수 간의 평형이 골 질량을 안정적인 수준으로 유지시킨다. 전사 인자는 특정 DNA 서열에 결합하고 이를 통해 DNA에서 mRNA로의 유전 정보 전사를 조절하는 단백질이다. 이는 단독 또는 다른 단백질과 함께 복합체로 특정 유전자에 대한 RNA 폴리머라제의 결합을 촉진 또는 차단함으로써 작용한다. 골 개조에는 많은 종류의 전사 인자가 관여하고 이들 인자 일부의 부족 혹은 과발현은 심각한 문제를 유발할 수 있다.
전사 인자 Ets 패밀리는 세포의 증식, 분화 및 세포 사멸에 필수적인 유전자의 발현을 조절한다. 일부 Ets 전사 인자가 골 발달을 조절하는 것으로 알려져 있다. 조류의 E26 레트로바이러스로부터 동정된 Ets 수립 멤버인 Ets1은 증식하는 전골모세포(preosteoblastic cells)에서 발현되는 것으로 알려져 있다. Ets2는 분화되고 성숙된 골모세포에서 발현된다.
Ets 전사 인자 패밀리의 멤버인 MEF(Myeloid elf-1 like factor)는 본래 사람 거핵구(megakaryocytic) 백혈병 세포주로부터 분리되었다. MEF는 중심 Ets DNA 결합 도메인을 포함하고 있고 다양한 골수성(myeloid) 백혈병 세포주, 정상 사람 조혈 조직 및 비조혈 조직에서 발현된다. MEF는 Ets 단백질의 elf-1/E74 패밀리의 멤버이고 Elf-1과 유사한 DNA 결합 성질을 가지고 있다. Ets 도메인에 있는 85개 아미노산 중 80개는 MEF 및 Elf-1 단백질에서 동일하다. MEF는 림프구, 골수세포 및 상피세포에서 인터루킨-8 및 사람 베타-디펜신 2(human beta-defensin 2)와 같은 유전자를 전사적으로 활성화시킨다.
본 발명자는 MEF 유전자의 생체내 기능을 규명하기 위하여, MEF 유전자를 골모세포 특이적으로 발현하는 MEF로 형질전환된 마우스를 확립한 후 상기 마우스를 미세 전산화 단층촬영과 조직학적, 조직형태학적, 면역조직화학적으로 분석한 결과, 골모세포에 의한 골 형성이 억제되고 파골세포에 의한 골 흡수가 촉진되어 골다공증 표현형이 나타남을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 한 관점은, 골모세포 특이적인 프로모터와 이의 조절을 받는 MEF 유전자를 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 마우스에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은, (1) 골모세포 특이적인 프로모터와 이의 조절을 받는 MEF 유전자를 포함하는 핵산 분자를 제조하는 단계; (2) 마우스로부터 수정란을 수득하는 단계; (3) 상기 수정란의 핵으로 상기 (1)의 핵산 분자를 이식하는 단계; (4) 상기 수정란을 암컷 마우스의 난관에 이식시키는 단계를 포함하는 골모세포 특이적으로 MEF 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 골모세포 특이적인 프로모터는 콜라겐 타입 1 프로모터인 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 MEF 유전는 플래그(Flag)-태그된(tagged)것이 바람직하다. 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 상기 이식은 미세주입(microinjection)에 의하는 것이 바람직하다.
본 발명의 형질전환 마우스는 기탁번호 KCTC11820BP로부터 발생된 마우스인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 관점은, (a) 본 발명에 따른 골모세포 특이적으로 MEF 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에 골다공증 후보 물질을 투여하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 후보 물질을 투여한 마우스에서 골다공증과 상관 관계가 있는 지표 값을 측정하는 단계 및 (c) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 지표 값을 유의하게 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 골모세포 특이적으로 MEF를 과발현하는 MEF 형질전환 마우스는 골모세포에 의한 골 형성이 억제되고 파골세포에 의한 골 흡수가 촉진되어, 골다공증의 생물학적 특성 연구와 골다공증 약제 개발을 테스트하는 동물 모델로 이용될 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 MEF 형질전환 마우스를 생성하는데 이용된 유전자 작제물을 간략하게 나타낸 것이다.
도 1b는 형질전환 마우스로 MEF의 삽입 여부를 PCR을 통해 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 야생형(WT) 및 형질전환(TG) 마우스 상완골에서 MEF의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 WT 및 TG 마우스의 상완골에서 MEF의 발현을 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 1e는 WT 및 TG 마우스의 여러 조직에서 MEF mRNA의 발현을 확인한 결과를 것이다.
도 1f는 WT 및 TG 마우스의 시간 경과에 따른 체중 변화를 나타낸 것이다.
도 2a는 WT 및 TG 마우스의 대퇴골에 대한 미세 전산화 단층촬영 이미지를 나타낸 것이다.
도 2b는 WT 및 TG 마우스의 대퇴골에 대한 조직형태학적 지표 나타낸 것이다(BMD: 골 무기질 밀도, BV/TV: 소주골 대 골 부피 비, Tb.Th: 소주골 두께, Tb.N: 소주골 수, Tb.Sp: 소주골 분리).
도 3은 WT 및 TG 마우스에 대한 조직학적 및 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것이다(A & B: H&E 염색 결과, C & D: 폴리클로날 항-MEF로의 면역조직화학적 분석 결과, E & F: 지방세포에 특이적인 Oil Red O 염색 결과, G & H: 파골세포에 특이적인 TRAP 염색 결과).
도 4a는 WT 및 TG 마우스의 요추에 대한 von Kossa 염색을 통해 광화 정도를 나타낸 것이다.
도 4b는 WT 및 TG 마우스의 요추에 대한 조직형태학적 지표를 나타낸 것이다.
도 4c는 WT 및 TG 마우스의 대퇴골에 대하여 칼세인 이중 표지한 것이다.
도 4d는 WT 및 TG 마우스의 대퇴골에 대한 칼세인 이중 표지를 통해 표지 간 거리 및 면적을 나타낸 것이다.
도 5a는 골 대사와 연관된 유전자의 발현에 대한 MEF의 영향을 RT-PCR을 통해 나타낸 것이다.
도 5b는 Mab21-L1의 발현과 이에 의해 발현이 억제되는 OPN 및 OC에 대한 MEF의 영향을 나타낸 것이다.
도 6a는 MEF로 형질전환된 골모세포의 배양 배지에서 골수세포의 파골세포로의 분화 정도를 나타낸 것이다.
도 6b는 MEF로 형질전환된 골모세포의 배양 배지에서 골수세포의 파골세포로의 분화 정도를 TRAP 염색으로 확인한 것이다.
도 6c는 MEF로 형질전환된 골모세포에서 시간 경과에 따른 파골세포형성인자 OPG 및 RANKL의 발현 양 변화를 나타낸 것이다.
본 발명의 한 관점은, 골모세포 특이적인 프로모터와 이의 조절을 받는 MEF(Myeloid Elf-1 like factor) 유전자를 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 마우스에 관한 것이다.
본 발명은 골모세포 특이적으로 MEF 단백질이 과발현되는 형질전환 동물에 관한 것으로 본 발명에서 용어 '형질전환 동물'이란 골모세포내 MEF 단백질 수준이 야생형(wild type) 동물의 수준에 비하여 증가되도록 형질의 변형이 유도된 동물을 의미하고, MEF 단백질을 발현하는 핵산분자(예, 벡터)를 세포내 유입함으로써 형질전환을 유도할 수 있다.
본 발명에서, 상기 '골모세포 특이적인 프로모터'는 골모세포에서 우세하게 발현을 유도할 수 있는 프로모터이면 어떠한 프로모터이든 무방하나, 타입 I 콜라겐 프로모터가 특히 바람직하다.
본 발명에서, 상기 'MEF 유전자'는 MEF 단백질을 발현하는 모든 유전자, 그의 기능적인 단편 및 결손, 치환 , 부가 등에 의한 돌연변이에 의하여도 MEF 단백질의 특성을 가지는 돌연변이체 MEF 단백질을 코딩하는 유전자가 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 MEF 유전자는 플래그(Flag)-태그된(tagged)것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 '핵산 분자'는 골모세포 특이적인 프로모터 및 MEF 유전자와 함께 폴리아데닐화 시그널(poly-adenylation signal)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리아데닐화 시그널은 소 글로빈의 폴리아데닐화 시그널인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 '핵산 분자'는 재조합 발현 벡터일 수도 있다. 본 발명에서 벡터란 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하기 위한 수단을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소를 목적에 따라 다양하게 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유 하는숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은, (1) 골모세포 특이적인 프로모터와 이의 조절을 받는 MEF 유전자를 포함하는 핵산 분자를 제조하는 단계; (2) 마우스로부터 수정란을 수득하는 단계; (3) 상기 수정란의 핵으로 상기 (1)의 핵산 분자를 이식하는 단계; (4) 상기 수정란을 암컷 마우스의 난관에 이식시키는 단계를 포함하는 골모세포 특이적으로 MEF 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 제조방법에 관한 것이다.
상기 단계 (2)에서, 마우스로부터 수정란의 수득은 마우스에 성선자극 호르몬을 투여하여 과배란을 유도하여 달성할 수 있다. 여기서, 성선자극 호르몬은 배란 유도(pregnant mare's serum gonadotropin, PMSG) 또는 난포 자극(human chorionic gonadotropin, HCG) 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 단계 (3)에서, 핵산 분자는 당업계에 주지된 각종 형질전환 방법에 따라 동물의 염색체 내로 삽입될 수 있다. 이러한 형질전환 방법의 예를 들면, 동물의 수정란에 핵산 분자를 미세주입(microinjection)하는 방법 또는 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또는 상기 핵산 분자를 수컷 마우스의 정자핵에 주입한 다음 이를 암컷 마우스의 난자핵과 결합시켜 수정란을 만든 뒤 이를 대리모 마우스에 착상시키는 방법을 이용할 수도 있다. 본 발명에서 핵산 분자의 수정란으로의 이식은 미세주입에 의하는 것이 바람직하다.
본 발명의 형질전환 마우스는 기탁번호 KCTC11820BP의 수정란으로부터 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의해 확립된 형질전환 마우스에서 소주골의 수가 줄어들고, 피질골이 얇아지고 덜 발달된 양상을 보여 주었으며, 조직 내 무기질 비율이 감소되었다. 또한, 골 밀도와 골형성 속도에 있어서도 대조군(야생형)보다 감소된 양상을 보여주었다. TRAP 염색을 통해 파골세포의 수가 증가된 것도 확인되었다. 결론적으로 MEF는 골모세포에 의한 골 형성을 억제하고 간접적으로 파골세포를 활성화시킴으로써 골 흡수를 용이하게 하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 형질전환 마우스는 골다공증의 생물학적 특성 연구와 골다공증 약제를 스크리닝하는 동물 모델로 이용될 수 있다.
본 발명에서 동물 모델 또는 질환 모델은 사람의 질병과 유사한 특정 질환을 가지고 있어서 병인을 규명하고, 병태를 확인할 수 있는 연구 대상이 될 수 있는 모델이 되는 동물을 의미한다. 동물 모델로서 사용하기 위한 동물은, 인간에서와 같은 효과를 예측할 수 있으며, 쉽게 만들 수 있고, 재현성이 있다. 또한, 인간질병의 병인과 같거나 유사하게 진행되어야 한다. 따라서, 인간과 같은 포유류 척추 동물이면서, 장기 등의 체내 구조, 면역체계, 체온 등이 유사하고, 골다공증 질환을 앓는 동물이 동물 모델로서 적합하다. 이런 동물은 바람직하게는 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 래빗, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 포유류이고, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 설치류이다. 특히, 마우스는 소형동물로 번식력이 우세하고, 사양관리가 쉽고, 질병에 강하며, 유전적으로 균일하고 다양한 종류가 개발되었고, 사람에서 발생하는 질병과 같거나 유사한 증상을 보이는 동물의 생산이 가능하여, 인간의 질병을 연구하는데 가장 많이 이용되고 있다.
본 발명의 또 다른 관점은, (a) 본 발명에 따른 골모세포 특이적으로 MEF 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에 골다공증 후보 물질을 투여하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 후보 물질을 투여한 마우스에서 골다공증과 상관 관계가 있는 지표 값을 측정하는 단계; 및 (c) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 지표 값을 유의하게 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 단계 (a)의 후보 물질로는 예를 들면, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산)이나 염기(예, 유기산 등)의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.
상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 경구투여, 정맥주사, 스와빙(swabing), 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 등이 이용 가능하나, 실험 동물의 증상, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적절히 선택할 수 있다. 또한 후보 물질의 투여량은 투여 방법, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적절히 선택할 수 있다.
상기 골다공증과 상관 관계가 있는 지표 값은 골 조직형태학적 지표일 수 있으며, 상기 지표에는 소주골 대 골 부피 비 (ratio of trabecular bone to bone volume, BV/TV), 소주골 수 (trabecular number, Tb.N), 골 무기질 밀도(Bone mineral density, BMD), 소주골 두께 (trabecular thickness, Tb.Th), 소주골의 분리(trabecular separation, Tb.Sp)) 중 적어도 하나일 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1. 골 특이적 Col1α1-MEF 형질전환 마우스의 생성
트랜스 유전자는 다음과 같이 제조하였다. 마우스의 타입 I 콜라겐 프로모터의 2.3-kb 절편을 이용하여 골모세포 특이적으로 사람 MEF 유전자를 발현시켰다. pcDNA 3.1 벡터에 서브클론된(subcloned) 플래그-MEF(Kim YJ et al. 2007 J Cell Physiol 211(1):253-60)로부터 NheI 및 XhoI에 의해 5' 말단에 플래그(flag)가 태그된(tagged) MEF를 암호화하는 cDNA를 잘라내어 2.3-kb 마우스 타입 I 콜라겐 프로모터와 β-글로빈을 포함하는 pBluescript II KS(+) 벡터로 소의 글로빈 폴리-아데닐화 시그널과 동시에 도입하였다. Col1α1-MEF라 명명한 프로모터와 코딩 서열(5.2-kb 트랜스 유전자 서열)을 포함한 전체 삽입물을 BssH II 제한효소로 소화시켜 상기 플라스미드로부터 분리하였다. 정제된 Col1α1-MEF 트랜스 유전자의 마우스 수정란 전핵(pronucleus)으로의 주입은 Macrogen Inc.(Seoul, Korea)에 의해 이루어졌다. 이렇게 수득된 수정란은 'C57BL/6-Tg(Col1a1-MEF)11-JYC/KDB'라 임의 명명하고, 한국생명공학연구원내 유전자은행(KCTC)에 12월 3일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC11820BP를 부여받았다. 모든 동물 실험은 경북대학교의 실험동물 운용위원회의 허가를 받은 후 수행되었다.
1-2. 세포 배양
골모세포 MC3T3-E1 세포를 1.5 x 105 세포/ml의 밀도로 플레이팅하고, 하룻밤 배양한 후 Lipofectamin Plus reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 제조업자의 설명문에 따라 형질감염하였다. RT-PCR 분석을 위해, pcDNA3.1 또는 MEF 발현 벡터로 지정된 시간 동안 형질감염하고 세포로부터 mRNA를 추출하였다. 프로모터 에세이를 위해, 각 형질감염 에세이는 OPN(osteopontin) 또는 OC(osteocalcin) 프로모터에 의해 조절되는 리포터 유전자를 포함하는 pcDNA3.1 또는 Mab21-L1 발현 벡터 1㎍으로 수행되었다. 형질감염 3시간 후 배지를 교체한 다음 세포를 추가로 24시간 동안 배양한 후 회수하였다. 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
1-3. RT-PCR 분석
Col1α1-MEF로 형질전환된(TG) 마우스 및 야생형(WT) 마우스의 상완골(humerus)로부터 TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA 1mg을 RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Glen Burine, MD)를 이용하여 역전사하였다. MEF의 mRNA 발현 양을 측정하기 위해, 다음 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다: MEF 센스 5'-GCTCATCTTCAGCCACTTCC-3'(서열번호: 1), MEF 안티센스 5'-CACACTAGGCTCAGCCATCA-3'(서열번호: 2). 각 시료의 정량화된 RNA 발현은 mGAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)로 표준화되었다.
1-4. 실시간 PCR
형광계 실시간 PCR는 DNA Engine OPTICON? 2 system (MJ Research, Waltham, MA)로 SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용하여 수행되었다. 분석을 위해, 데이터는 외부 표준에 대한 카피 수(copy number)로 표현하였다(101~106 카피 수). 다음의 마커 유전자별 프로모터가 이용되었다: osteoprotegerin (OPG), 5'-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3'(서열번호: 3) 및 5'-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3'(서열번호: 4); RANKL, 5'-AGCCGAGACTACGGCAAGTA-3'(서열번호: 5) 및 5'-GCG CTCGAAAGTACAGGAAC-3'(서열번호: 6); Mab21-L1, 5'-TGACACGAGCGAAGTGAAAC-3'(서열번호: 7) 및 5'-AGTGGCACTCC TTGGACAAC-3'(서열번호: 8). 정량을 위해, 마우스의 내부 GAPDH가 각 시료의 표준화를 위한 기준으로 이용되었다. 실시간 PCR 분석 결과는 각 시료별로 2 반복에 대한 평균 값으로 나타내었다.
1-5. 단백질 분리 및 웨스턴 블롯 분석
TG 및 WT 마우스의 상완골로부터 10% SDS를 포함하는 RIPA 완충액을 이용하여 단백질을 추출하였다. 불용성 물질은 4℃에서 12,000 xg로 20분 동안 원심분리하여 제거하였다. 20mg의 단백질을 SDS-PAGE(dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분리하고, 완충액(48 mM Tris, 39 mM glycine, and 20% methanol) 내에서 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달하였다. 이 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 건조 우유를 함유한 트리스로 완충된 식염수(TBS, 0.2 M Tris, pH 7.4, 1.5 M NaCl)으로 블로킹하였다. 블롯을 1:1,000으로 희석한 래비트 폴리클로날 Elf4/MEF (Abcam, Cambridge, UK)로 하룻밤 동안 4℃에서 정치배양하였다. 그리고, 블롯을 0.05% Tween 20을 함유한 TBS로 세척한 후 항-래비트 IgG 호스라디쉬 퍼옥시다제가 결합된 이차 항체(1:1,000)로 실온에서 1시간 동안 정치배양하였다. 단백질 밴드는 ECL 검출(Amersham)에 의해 가시화하였다.
1-6. 시험관내 파골세포 분화
6주령 ICR 마우스의 경골 및 대퇴로부터 골수세포를 분리하여 가습된 배양기(공기 중 5% CO2)에 37℃에서 배양하였다. 배양 24시간 후에 비접착 세포를 histopaque gradient centrifuge에서 원심하여 골수유래 대식세포(bone marrow-derived macrophage (BMM) cells)를 회수하였다. 파골세포 형성 실험을 위해, BMM 세포를 100 ng/mL RANKL 및 30 ng/mL M-CSF의 존재에서 10% FBS를 포함하는 α-MEM 또는, pcDNA 3.1 또는 MEF 안정적인 MC3T3-E1로 48시간 동안 배양된 배지를 10, 20 또는 30%로 포함하는 α-MEM 배지에서 배양하였다.
1-7. 분화된 BMM에서 TRAP 염색 및 활성화
TRAP 염색을 위해, 고정된 세포를 제조업자의 설명문에 지시된 바에 따라 6.76mM 소듐 타르트레이트, 0.12 mg/ml 나프톨(naphtol) AS-MX 포스페이트 및 0.07 mg/ml Fast Garnet GBC Base 용액을 포함하는 0.1M 아세테이트 용액(pH 5.0)으로 처리하였다. 둘 이상의 핵을 가진 TRAP 양성인 다핵 세포를 스코어링하였다. TRAP 활성을 측정하기 위해, 세포를 고정한 다음 37℃에서 10분 동안 100 ㎕의 포스파타제 기질 용액(3.7 mM p-nitrophenyl phosphate and 10 mM sodium tartrate in 50 mM citrate buffer, pH 4.6)으로 정치배양하였다. 정치배양 후, 효소 반응 혼합물을 다른 플레이트로 옮기고, 반응을 0.1N NaOH 100 ㎕로 종결시켰다. 405nm에서 흡광도를 ELISA 리더(BioRad; Hercules, CA)를 이용하여 측정하였다.
1-8. 골에 대한 면역조직화학적 및 조직형태학적(histomorphometric) 분석
TG 및 WT 마우스 유래 대퇴골과 상완골의 골 시료를 면역조직화학적 분석을 위해 통상의 프로토콜에 따라 준비하였다(Park HJ et al. 2008 J Proteome Res 7(3):1138-50). 피부와 근육을 제거한 후 마우스의 뒷다리 및 앞다리를 4%(v/v) 파라포름알데히드로 24시간 동안 고정한 후 2 내지 4주간 PBS에 녹인 0.5M EDTA에서 탈석회화하였다. 탈석회화된 표본을 파라핀에 포매한 후 근위 골간단에서 5 ㎛로 시상 절단하였다. 절편을 탈파라핀화한 후 재수화하고 래비트 항-FLAG 폴리클로날 항체(Cell Signaling, Boston, USA) 및 래비트 항-MEF 폴리클로날 항체(Abcam, Cambridge, UK)에 노출하였다. 면역조직화학적 분석을 제조업자의 설명문에 따라 수행하였다. TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 이용하여 파골세포의 수를 정량하였다.
마우스를 희생시키기 6 및 2일 전에 칼세인(calcein, 30 mg/kg 체중)을 복강내 주입하였다. 탈석회화된 척추 및 대퇴를 통상의 프로토콜에 따라 불안정화된 MMA(methylmethacrylate)로 포매하였다(Erben RG 1997 J Histochem Cytochem 45(2):307-13). 탈석회화된 대퇴는 원위 골간단부터 중간(midshaft) 영역까지 5 ㎛ 두께로 시상 절단하였다. 조직형태학적 지표는 동일 영역에서 골 부피로 계산되었고 BioQuant osteo II Image Analysis System Version 8.00.20 (BioQuant Image Analysis Corp, Nashville, TN)을 이용하여 측정하였다. 칼세인 표지는 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscope)을 이용하여 가시화하고, 조직형태학적 분석은 kappa Image Base control 2.3.5 software (KAPPA opto-electronics, GmbH, Gleichen, Germany)를 이용하여 피질골 구획에서 수행되었다.
1-9. 미세 전산화 단층촬영(Micro-computerized tomography (CT)) 분석
TG 및 WT 마우스의 경골에 대한 미세-CT 분석을 수행하여 소주골과 피질골에서의 차이를 확인하였다. 6주령으로 연령이 일치된 3쌍의 마우스를 분석하였다. 파라필름으로 감싼 대퇴골을 Skyscan 1172 micro-CT scanner 상에 수직으로 세우고, 10 Megapixel digital X-ray camera로 100 kV microfocus X-ray source를 이용하여 스캔(5.9 microns with a voxel resolution of 6.9 μm2)을 수행하였다. 대퇴골의 고해상 이미지는 Skyscan 3D-creator software를 이용하여 3D polygonal resampling하였고, 대상 소주 영역에 대한 형태학적 지표는 Skyscan CT-Analyser (version 1.6.1)를 이용하여 계산하였다.
실시예 2: 결과
2-1. Col1α1-MEF TG 마우스의 골 조직에서 MEF 발현
MEF의 골 형성 억제제로서의 생체내 기능을 연구하기 위해, 마우스 타입 I 콜라겐 (Col1α1) 프로모터 2.3kb 절편(도 1a)을 이용하여 골모세포 특이적 형질전환 마우스를 생성하였다. PCR 유전형 분석(genotyping)을 통해 Col1α1-MEF 트랜스유전자의 삽입을 보이는 형질전환된 파운더(founder) 4개 라인(라인 3, 11, 12 및 16)을 동정하였다(도 1b). TG 마우스에 삽입된 트랜스 유전자의 존재는 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅으로 확인하였다(도 1c 및 1d). 실험 초기 단계로서, 성체 TG 및 WT 마우스 조직으로부터 RNA를 수득하여 MEF의 mRNA 발현양을 RT-PCR을 기반으로 평가하였다. TG 마우스의 골에서 MEF mRNA가 발현되었다. MEF 발현이 다른 TG 및 WT 마우스 기관에서는 검출되지 않았다. MEF mRNA는 TG 마우스의 결장에서 미량 발현되었지만, 그의 발현은 골 조직에서 현저하였다(도 1e). 관찰 9주까지 WT 및 TG 마우스 간 체중에서 유의적인 차이는 없었다(도 1f).
2-2. Col1α1-MEF TG 마우스에서 골 질량의 감소
골 구조를 분석하기 위해, 6주령 TG 및 WT 마우스의 대퇴골 이미지를 Skyscan 1172 micro-CT 스캐너로 획득하였다. 골 구조는 6주령 TG 및 WT 마우스의 3개 라인으로부터 분리된 대퇴골의 특정 영역에서 평가하였다(각각 n= 3). Col1α1-MEF TG 마우스로부터 분리된 대퇴골은 WT 마우스의 한배 새끼에 비해 피질골은 얇고 소주골은 적었다(도 2a).
골 형태학적 지표는 Skyscan CT-Analyser (version 1.6.1)를 이용하여 성장판으로부터 2 내지 3mm의 소주 영역에서 계산하였다. 소주골 대 골 부피 비 (BV/TV) 및 소주골 수 (Tb.N)는 WT 마우스에 비해 TG 마우스에서 현저하게 감소되었다(도 2b). 골 무기질 밀도(BMD)와 소주골 두께 (Tb.Th)는 TG 마우스에서 약간 감소되었다. 소주골 수는 현저히 감소되고 소주골 두께는 약간 감소된 반면, 소주골의 분리(trabecular separation (Tb.Sp))는 증가되었다. 골 부피를 조직 부피(TV)에 대해 표준화하였을 때 6주령의 Col1α1-MEF TG 마우스에서는 WT 한배 새끼에 비해 BV가 64% 감소되었다(도 2b). 피질의 BV/TV(%)와 두께도 WT 마우스에 비해 TG 마우스에서 감소되었다. 미세 전산화 단층촬영 결과 Col1α1-MEF TG 마우스에서의 골 형성은 골모세포의 기능 결함과 MEF 과발현에 의한 골 대사의 변화 때문에 미성숙됨을 보여주었다.
2-3. Col1α1-MEF TG 마우스에서 골 형성 감소와 골 흡수의 증가
정상 골화 과정에서, 골 흡수 파골세포에 의한 기질 분해와 골 형성 골모세포에 의한 골 광화는 밀접하게 연관되어 있다. 앞선 실시예에서는 골 형성과 개조에 대한 MEF의 생체내 영향을 확인하기 위해, Col1α1-MEF TG 마우스에 대한 조직학적 및 면역조직학적 분석을 수행하였다.
H&E 염색 결과, WT 마우스에 비해 Col1α1-MEF TG 마우스에서 대퇴골과 경골의 피질골이 더 얇고 덜 발달하였다. 소주골 또한 TG 마우스에서 덜 발달하였다(도 3a 및 3b). 마우스의 내인성 Mef와 사람의 외인성 MEF를 모두 검출할 수 있는 항-MEF 폴리클로날 항체로 면역조직화학 염색한 결과, WT 마우스에 비해 6주령의 Col1α1-MEF TG 마우스로부터 분리된 대퇴골의 골단 및 연골내 영역에서 MEF 발현이 증가됨을 보여주었다(도 3c 및 3d). 골 조직의 지방세포에 대한 Oil Red O 염색 결과, WT 마우스에 비해 Col1α1-MEF TG 마우스의 골 조직의 일차 소주 및 골수에서 더 많은 지방 방울이 축적되었으며(도 3e 및 3f), 이는 MEF가 지방세포의 분화 또는 증식에 관여함을 의미한다. 파골세포에 대한 TRAP 염색 결과, WT 마우스에 비해 6주령의 Col1α1-MEF TG 마우스로부터 분리된 대퇴골의 골단 및 연골내 영역에서 TRAP 파골세포의 수가 증가됨을 보여주었다(도 3g 및 h). 이러한 결과는 Col1α1-MEF TG 마우스에서 보이는 골 질량의 감소와 불규칙적인 피질 및 소주골 구조를 나타내는 골다공증(osteopenic) 표현형이 골모세포의 분화 감소 및 파골세포에 의한 골 흡수 증가에 의해 유발됨을 보여준다.
2-4. Col1α1-MEF TG 마우스에서 골모세포 기능의 감소
조직형태학적 분석을 위해, 탈석회화된 요추와 경골에 대해 von Kossa 염색을 수행하였다. 3개의 TG 마우스 라인과 야생형 한배 새끼에 대해 6주령에서 BV가 분석되었다. Col1α1-MEF TG 마우스에서, 요추에 대해 von Kossa 염색한 결과 소주골의 광화가 감소되고, 경골 또한 소주골의 질량은 낮아지고 피질골은 얇아짐을 확인하였다(도 4a 및 데이터 미도시). 요추에 대한 조직형태학적 분석은 소주골 부피(BV)가 감소되고 BV를 조직 부피에 대해 표준화하였을 때 WT 한배 새끼에 비해 6주령의 TG 마우스에서 33.9%까지 감소함을 보여주었다(도 4b).
MEF가 골모세포 기능에 미치는 영향을 분석하기 위해, 골모세포 활성 척도인 BFR(bone forming rate)를 TG 및 WT 마우스에서 칼세인 이중 표지로 검사하였다. BFR은 8주령의 TG 마우스의 대퇴골에서 2.8배 감소되어, Col1α1-MEF TG 마우스의 생체내 골모세포의 기능적 결함을 보여주었다(도 4c 및 4d). 이러한 모든 결과는 MEF가 골모세포 활성을 억제함으로써 골 형성을 억제함을 입증한다. 조직형태학적 분석은 MEF 과발현이 골다공증(osteopenic) 표현형으로 이어짐을 보여준다.
2-5. MEF 과발현된 마우스에서 하향 조절된 골 마커 유전자
골 대사는 골모세포형성과 파골세포형성의 커플링에 의해 조절되기 때문에, 전자의 비정상적인 과정은 후자의 과정에 영향을 미친다. Col1α1-MEF TG 마우스에서 MEF의 역할을 규명하기 위해, 골과 연관된 인자의 발현양을 실시간 PCR을 이용하여 평가하였다. 골 형성 마커인 ALP, 타입 I 콜라겐 및 Osterix의 mRNA 발현양은 MEF 과발현 마우스에서 상당히 감소되었다(도 5a). 두 개의 파골세포형성 조절인자 RANKL/OPG의 발현도 WT 마우스에서 보다 TG에서 더 높았다. 또한, MEF에 의해 조절되는 다운스트림 전사 리프레서(repressor)인 Mab21-L1의 mRNA 발현은 TG 마우스의 장(long) 골에서 증가되었다(도 5b). 더 나아가, Mab21-L1의 과발현은 osteopontin 및 osteocalcin의 프로모터 활성을 억제하였다(도 5b). 이러한 결과는 MEF가 부분적으로 Mab21-L1 전사 리프레서의 전사 조절을 통해 골 형성 인자의 발현을 억제함을 보여준다.
2-6. MEF 과발현에 의한 파골세포형성의 변화
앞서 파골세포 활성이 증가되므로, 파골세포의 분화가 MEF를 발현하는 골모세포에 의해 분비되는 분자에 의해 영향을 받는지 조사하였다. 골수 단핵구의 파골세포로의 분화는 MEF를 과발현하는 MC3T3-E1 세포의 조건화 배지에 의해 증가되었다(도 6a 및 b). 또한, MEF가 MEF를 발현하는 MC3T3-E1 세포에서 RANKL/OPG에 영향을 미치는지 조사하기 위해, MEF 과발현 세포에서 OPG 및 RANKL의 mRNA 발현 변화를 시간 의존적인 방식으로 확인하였다(도 6c). OPG 발현은 MEF 형질감염 48시간 후 약간 증가되었다. RANKL 양은 MEF 형질감염 24시간 후 증가되었다. MEF가 골모세포에서 RANKL 발현을 어떻게 상향조절하는지 추가 조사가 필요하지만; 이러한 결과는 골모세포에서 MEF의 강한 발현은 RNAKL을 포함한 파골세포형성 인자를 생산함을 보여준다.
한국생명공학연구원 KCTC11820BP 20101203
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Mouses transformed with MEF gene and usage thereof <130> 求?1.52P <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gctcatcttc agccacttcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cacactaggc tcagccatca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctgcctggga agaagatcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttgtgaagct gtgcaggaac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agccgagact acggcaagta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcgctcgaaa gtacaggaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgacacgagc gaagtgaaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agtggcactc cttggacaac 20

Claims (10)

  1. 골모세포 특이적인 프로모터와 이의 조절을 받는 MEF 유전자를 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 마우스.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 골모세포 특이적인 프로모터는 타입 1 콜라겐 프로모터인 것을 특징으로 하는 형질전환된 마우스.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 MEF 유전는 플래그(Flag)-태그된(tagged)것임을 특징으로 하는 형질전환된 마우스.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산 분자를 소 글로빈의 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 마우스.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 형질전환 마우스는 기탁번호 KCTC11820BP로부터 발생되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 마우스.
  6. (1) 골모세포 특이적인 프로모터와 이의 조절을 받는 MEF 유전자를 포함하는 핵산 분자를 제조하는 단계; (2) 마우스로부터 수정란을 수득하는 단계; (3) 상기 수정란의 핵으로 상기 (1)의 핵산 분자를 이식하는 단계; (4) 상기 수정란을 암컷 마우스의 난관에 이식시키는 단계를 포함하는 골모세포 특이적으로 MEF 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 단계 (3)에서 이식은 미세주입(microinjection)에 의하는 것임을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 단계 (4)의 수정란은 기탁번호 KCTC11820BP로 기탁된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 기탁번호 KCTC11820BP의 수정란.
  10. (a) 제 1항에 따른 형질전환 마우스에 골다공증 후보 물질을 투여하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 후보 물질을 투여한 마우스에서 골다공증과 상관 관계가 있는 지표 값을 측정하는 단계 및 (c) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 지표 값을 유의하게 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법.
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KR20140120835A (ko) * 2013-04-02 2014-10-14 주식회사 종근당 Ｈｓｐ２７ 변이(ｓ１３５ｆ) 매개의 샤르코-마리-투스 질환 동물모델
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